Summary
Neurale stam/voorlopercellen vertonen verschillende expressie dynamiek van Inkeping signalering componenten die leiden tot verschillende uitkomsten van cellulaire gebeurtenissen. Een dergelijke dynamische uitdrukking kan worden onthuld door real-time monitoring, niet door statische analyse, met behulp van een zeer gevoelig bioluminescentie beeldvormings systeem dat visualisatie van snelle veranderingen in genexpressies mogelijk maakt.
Abstract
Inkeping signalering regelt het onderhoud van neurale stam/progenitorcellen door celcelinteracties. De componenten van Inkeping signalering vertonen dynamische expressie. Inkeping signalering Effector Hes1 en de inkeping ligand Delta-like1 (dll1-) worden uitgedrukt in een oscillerende manier in neurale stam/voorlopercellen. Omdat de periode van de oscillerende expressie van deze genen zeer kort is (2 uur), is het moeilijk om hun cyclische expressie te monitoren. Om zulke snelle veranderingen in de genexpressie of eiwit dynamiek te onderzoeken, zijn snelle respons verslaggevers vereist. Vanwege de snelle rijpings kinetiek en hoge gevoeligheid is de Bioluminescentie reporter plaats geschikt om snelle genexpressie veranderingen in levende cellen te monitoren. We gebruikten een gedestabiliseerde plaats reporter voor het bewaken van de organisator activiteit en een plaats-gesmolten reporter voor visualisatie van eiwit dynamica bij een enkele celresolutie. Deze bioluminescentie verslaggevers vertonen een snelle omzet en genereren zeer zwakke signalen; Daarom hebben we een zeer gevoelig bioluminescentie beeldvormings systeem ontwikkeld om dergelijke zwakke signalen te detecteren. Deze methoden stellen ons in staat om verschillende genexpressie dynamiek in levende cellen en weefsels te monitoren, wat belangrijke informatie is om de werkelijke cellulaire toestanden te helpen begrijpen.
Introduction
Het zoogdier brein bestaat uit een groot aantal verschillende soorten neuronen en gliacellen. Alle cellen worden gegenereerd uit neurale stam/voorlopercellen (npc's), die eerst prolifereren om hun getallen uit te breiden, dan beginnen te differentiëren in neuronen, en ten slotte geven aanleiding tot gliacellen1,2,3,4,5. Zodra cellen zijn gedifferentieerd in neuronen, ze kunnen niet vermenigvuldigen of hun aantallen te verhogen, en daarom, het onderhoud van Npc's tot latere stadia is belangrijk. Notch signalering via celcelinteracties speelt een belangrijke rol bij het handhaven van npc's6,7. Notch liganden interactie met het membraan eiwit, Inkeping, op het oppervlak van de naburige cellen en activeert de inkeping eiwit. Na activering komt proteolyse van Inkeping eiwit voor, waardoor het intracellulaire domein van Inkeping (NiCd) van het celmembraan in de Nucleus8,9,10wordt vrijgegeven. In de Nucleus bindt NICD aan de organisator regio's van Hes1 en Hes5 (Hes1/5) en activeert de expressie van deze genen. Hes1/5 Druk op de uitdrukking van de proneural genen Ascl1 en Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Omdat proneural genen neuronale differentiatie induceren, spelen Hes1/5 essentiële rollen bij het onderhouden van npc's. Bovendien, als proneural genen de uitdrukking van de inkeping ligand Delta-like1 (Dll1-) kunnen activeren, Hes1/5 ook onderdrukken de uitdrukking van dll1-. Daarom, de uitdrukking van Dll1-leidt tot de naburige cellen negatief voor Dll1-via inkeping signalering. Op deze manier, cellen remmen aangrenzende cellen van het volgen van hun zelfde lot, een fenomeen bekend als de laterale remming8. In de ontwikkelende hersenen speelt laterale remming een rol bij het genereren van verschillende celtypen.
Real-time beeldvorming op het niveau van één cel onthult dynamische expressies van de componenten van Inkeping signalering in npc's15,16,17. Notch signalering activeert de uitdrukking van Hes1, maar Hes1 eiwit bindt aan zijn eigen promotor en onderdrukt zijn eigen uitdrukking. Bovendien is Hes1 een extreem onstabiel eiwit, dat wordt aangetast door het ubiquitin-proteasome traject; Daarom is de onderdrukking van zijn eigen promotor slechts van korte duur en vervolgens begint de transcriptie opnieuw. Op deze manier, de uitdrukking van Hes1 schommelt op zowel de transcriptie en translationele niveaus in een 2 h cyclus18. De oscillerende uitdrukking van Hes1 induceert op zijn beurt de oscillerende expressie van de downstream-doel genen, zoals Ascl1, Neurog2 en dll1-, via periodieke repressie15,16,17,19. Terwijl proneural genen neuronale differentiatie kunnen induceren, is hun oscillerende expressie niet voldoende voor Neuronale Differentiatie; hun aanhoudende expressie is veeleer essentieel voor de neuronale differentiatie. De oscillerende expressie van proneural genen is belangrijk voor het onderhouden van npc's in plaats van voor het induceren van neuronale differentiatie14,15,16. De uitdrukking van dll1- oscilleert op zowel de transcriptie-als translationele niveaus tijdens verschillende morfogenese, zoals neurogenese en somitogenese. De dynamische expressie van dll1- is belangrijk voor de normale morfogenese en gestage expressie van dll1-induceert defecten in neurogenese en somitogenese17. Deze bevindingen tonen de belangrijke functie die de dynamiek van genexpressie en eiwit kinetiek heeft op de regulering van verschillende ontwikkelings gebeurtenissen (d.w.z. dat verschillende expressie dynamiek verschillende outputs in cellulair gedrag oplevert).
Voor het analyseren van de dynamiek van Inkeping signalering, de statische analyse van weefsels en cellen zijn onvoldoende omdat ze voortdurend veranderen. Real-time beeldvorming van enkele cellen is een krachtig hulpmiddel om de dynamiek in genexpressie te onthullen. De dynamische uitdrukking van inkepingen signalering moleculen ondergaan snelle cyclische reacties in de periode van 2-3 h. Deze snelle periodieke uitdrukking presenteert twee moeilijke problemen voor de real-time monitoring: (1) de uitdrukking van de moleculen wordt onderdrukt tot lage niveaus, en (2) snelle omzet vereist snelle respons Reporters. Om deze problemen te overwinnen, ontwikkelden we eerder een bioluminescentie real-time beeldvormings methode20. Omdat de Bioluminescentie reporter een hogere gevoeligheid en kortere rijpingstijd heeft dan fluorescerende reporters, stelt deze strategie ons in staat om de snelle dynamiek in levende cellen te monitoren. Met behulp van real-time visualisatie ontdekten we dat meer genen dynamische expressie vertoonden dan we eerder dachten. Daarnaast is het aantal rapporten met uitdrukking en eiwit dynamiek in levende cellen en de betekenis van deze dynamiek in verschillende biologische gebeurtenissen toegenomen, wat een fundamentele rol van de dynamiek in genexpressies21,22suggereert.
In dit rapport beschrijven we een manier om de uitdrukking van de inkeping ligand dll1-in npc's in zowel gezien culturen als in corticale segment culturen te visualiseren. Om de dynamiek van dll1- transcriptie op één celniveau te monitoren, genereerden we gezien culturen van npc's afgeleid van de embryonale telencephalon van transgene muizen met pDll1-UB-Fluc Reporter, een dll1-Promoter-gedreven gedestabiliseerde plaats Reporter. Om Dll1-proteïne dynamica in vivo te monitoren, introduceerden we de Dll1--Fluc Fusion reporter in Npc's in de cortex en visualiseerde de uitdrukking van de reporter in Npc's in corticale segment culturen. Real-time Imaging stelde ons in staat om de verschillende kenmerken van genexpressie en eiwit dynamiek in levende cellen te vangen met een hoge temporele resolutie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures, waaronder dierproef personen, zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van het Instituut voor grens leven en medische wetenschappen, de Universiteit van Kyoto.
1. bioluminescentie verslaggevers
Opmerking: de plaats reporter is geschikt voor het meten van de snelle dynamiek van de organisator activiteit door het degradatie signaal te fusing. Bovendien maakt de plaats Fusion reporter het mogelijk om de eiwit dynamiek in de enkele cel te bewaken. Beide soorten verslaggevers zijn beschikbaar voor mono-Layer cultuur (dissociatie cultuur) en weefselcultuur (slice Culture) experiment.
- Reporter voor monitoring Dll1-Promoter activiteit17
Opmerking: om de snelle veranderingen in genexpressie te monitoren, is de snelle respons en instabiele reporter essentieel. Firefly plaats (Fluc) toont snelle rijping in vergelijking met fluoresceïne Reporters. Omdat ubiquitine Fused plaats Reporter (UB-Fluc) snelle afbraak en snelle-omzet vertoont, is het zeer nuttig om de dynamische genexpressie in levende cellen20te monitoren.- Gebruik dll1-door de promotor gedreven gedestabiliseerd plaats Reporter, alomtegenwoordige plaats (pDll1-UB-Fluc, Figuur 1A bovenste paneel), om snelle veranderingen in dll1- expressie op een transcriptionele niveau17te monitoren.
- Genereer een transgene muis lijn die pDll1-UB-Fluc draagt voor de stabiele uitdrukking van deze Reporter.
- Reporter voor monitoring Dll1-Protein Dynamics17.
- Voor het genereren van knock-in muizen, steek de plaats cDNA in de 3 ' Termini van de dll1-coderende regio, zodat dll1--plaats fusie-eiwit wordt uitgedrukt (dll1--Fluc Reporter, Figuur 1A, onderste paneel)17.
- Bewaak de expressie dynamiek van dll1-op eiwit niveaus door het meten van de plaats-activiteit.
- Voor het monitoren van Dll1-eiwit dynamica op weefsel niveaus, introduceert de Dll1--Fluc reporter in Npc's in de embryonale telencephalon door in utero elektroporation.
2. bioluminescentie beeldvormings systeem
- Bouw een bioluminescentie Live-Imaging systeem met behulp van een omgekeerde Microscoop geïnstalleerd met een zeer gevoelige, watergekoelde CCD-camera. Om het lawaai te verminderen en een hoge gevoeligheid te verkrijgen, moet u de camera koelen met gekoeld water dat door de watercirculatie wordt geleverd bij een geoptimaliseerde temperatuur van-90 °C.
- Voor de Live Cell/weefsel beeldvorming installeert u het incubatie systeem, waarbij de temperatuur en het gemengde gas worden bestreden tot de Microscoop fase.
- Voor Imaging de uitdrukking van gedestabiliseerde plaats Reporter, gebruik hoge numerieke hoek (na: 1,30) 40x olie-onderdompeling objectief objectief. De werkafstand van deze lens is 0,2 mm, het is beschikbaar voor niet alleen mono-Layer celcultuur, maar ook segment cultuur.
- Voor dubbele bewaking van plaats en fluoresceïne reporter expressie, installeert u het LED-verlichtings apparaat op het lichtpad van de Microscoop.
- Bedien de time-lapse Imaging met een software die is gekoppeld aan de Microscoop (bijv. multidimensionaal acquisitie programma van MetaMorph software).
- Bereid het hele systeem in een donkere kamer, omdat het signaal van de gedestabiliseerde plaats reporter is zeer vaag, en om te voorkomen dat het vreemde licht te voorkomen dat de overname.
3. neurale stam/voorlopercellen (NPC) dissociatie culturen
- Bereiding van cultuur media, gerechten en reagentia voor NPC dissociatie cultuur
- Bereid N2/B27 media voor het kweken van neurale stam/voorlopercellen met een uiteindelijke concentratie van 1x N2, 1x B27, 1 mM N-Acetylcysteïne, 10 ng/mL bFGF en 50 U/mL Penicillair/streptomycine in DMEM/F12 media.
- Bereid papaïne oplossing voor dissociatie met 7 U/mL papaïne, 0,006% DNase en 1 mM N-Acetylcysteïne in EBSS media.
- Bereid 100 mM luciferine natrium oplossing voor luminescentie Imaging. Verdun 100 mM luciferine-oplossing in N2/B27-media tot een eindconcentratie van 1 mM.
Opmerking: luciferin toont auto-fluorescein zelf. In het geval van Luciferase-fluorescentie Dual Imaging, met name EGFP, het verlagen van de concentratie van luciferine tot 0,5 mM is beter. - Jas een 35-mm glasbodem gerechten (glazen diameter 27-mm) met 40 μg/mL poly-L-lysine (PLL) oplossing voor 1 uur bij kamertemperatuur. Na incubatie de platen 3x met PBS wassen en laten drogen.
- Dissectie van embryo's en dissociatie van Npc's
- Na euthanatatie van een zwangere pDll1-UB-Luc transgene muis (embryonale dag 12,5 (E 12.5)) door CO2 verstikking en cervicale dislocatie, snijd door de buik en haal de baarmoeder uit.
Let op: onderzoekers moeten de verordeningen en richtlijnen van de dierenonderzoekscommissie van hun instelling volgen. Als anesthesie of pijnbestrijding drugs worden gebruikt, gebruik ze goed. - Breng de baarmoeder in een 10 cm Petri schaaltje met 25 mL ijskoude PBS. Haal de embryo's uit de baarmoeder in ijskoude PBS, met behulp van een micro schaar en een fijne Tang.
- Knip het hoofd van elk embryo af met een schaar en breng het over naar 10 cm Petri schaaltjes met ijskoude DMEM/F12. Verwijder de epidermis en het kraakbeen rond de hersenen en breng de hersenen over naar 35 mm Petri schaaltje met ijskoude 3 mL N2/B27-media.
- Afgesneden van de linker en rechter telencephalon van diencephalon (Figuur 1BA-f, C, D). Verwijder de hersenvliezen die het oppervlak van telencephalon bedekken met behulp van een fijne Tang (Figuur 1bi). Met behulp van Fine Tang weer, neem het dorso-laterale deel van de cortex uit de telencephalon (Figuur 1BG, h, j-l E).
- Breng de weefsels over in nieuwe 1,5 mL tubes met behulp van een P1000 pipet en verwijder eventueel extra medium met een P200 pipet. Voeg toe 0,1 mL papaïne oplossing per hersenweefsel (een paar van de cortex). Pipetteer de monsters na 15 minuten incubatie bij 24 °C voorzichtig 10 keer met P1000 pipet. Inincuberen de monsters gedurende 15 minuten bij 24 °C.
- Pipetteer de monsters 10 keer zachtjes met P1000 pipet. Centrifugeer de monsters 3 min bij 400 x g en kamertemperatuur (RT). Gooi het supernatant weg.
- Voeg 1 mL DMEM/F12-medium toe aan de pellet. Pipetteer 10 keer zachtjes met P1000 pipet. Centrifugeer de monsters 3 min bij 400 x g en RT. Gooi het supernatant weg. Herhaal dit ten minste 2 keer.
- Aan de pellet, Voeg 0,5 mL N2/B27 media met 1 mM luciferine en meng goed. Zaai de cellen (1 x 106 cellen) naar een met PLL gecoate glazen bodem schotel. Kweek de cellen in de CO2 -incubator voor 1 uur. Zodra de cellen zich aan het gerecht hechten, voeg 2 mL N2/B27 media toe, bevattende 1 mM luciferin.
- Na euthanatatie van een zwangere pDll1-UB-Luc transgene muis (embryonale dag 12,5 (E 12.5)) door CO2 verstikking en cervicale dislocatie, snijd door de buik en haal de baarmoeder uit.
- Visualisatie van plaats reporter expressie in NPC dissociatie cultuur
- Start het luminescentie Live-Imaging systeem voordat u het dissectie uitvoert. Voor de NPC-cultuur stelt u de temperatuur van de stage incubator in op 37 °C en stelt u de instelling van het gasmengsel 20% O2,5% co2in.
- Zet de Dompel olie op de objectief lens. Plaats de monster schotel op de Microscoop. Bekijk het veld handmatig en kies de beste positie en de focus van de cellen van belang. Klik op Live om de testafbeelding te verkrijgen.
- Voer de time-lapse-acquisitie uit met 2-dimensionale (luminescentie-en Bright-veld) overnames voor 24 h met multidimensionaal acquisitie programma. Kies multidimensionaal acquisitie programma en stel de aanschaf instelling als volgt in (stap 3.3.6).
- Voor het verkrijgen van luminescentie beelden gebruikt u de volgende camera-instellingen: lage overdrachtssnelheid (50 kHz), 2 x 2/4 x 4 binning, 10 min/5 min belichtingstijd. Gebruik de volgende instellingen voor het verzamelen van heldere velden: tussenliggende overdrachtssnelheid (1 MHz), 1 x 1 binning en 100 MS belichtingstijd.
4. in utero elektroporation
Opmerking: dit wordt uitgevoerd voor de introductie van Dll1--Fluc reporter in de neurale voorlopercellen.
- Bereiding van gereedschappen en reagentia voor elektroporation
- Bereid micro capillairen voor de injectie van DNA in de ventrikel van het embryonale telencephalon. Strek een gras capillair met hitte en snijd en poets de punt ervan met de polijstmachine.
- Bereid een mengsel van DNA met kleurstof (bijv. Trypaan blauw). De concentratie van elk DNA is 1 μg/μL in PBS en voegt de kleurstof toe aan een uiteindelijke concentratie van 10%.
Opmerking: gebruik het mengsel van DNA voor visualisatie van Dll1-eiwit dynamica als volgt: Dll1--Fluc (Dll1-Protein Reporter, Figuur 2e Upper) en pEF-EGFP (EF-Promoter driven EGFP-expressie vector, Figuur 2e lager), monitoring van de locatie en morfologie van getransfunteerde cellen. - Bereid twee soorten anesthetica: 3,88 mg/mL van pentobarbital en 0,12% van xylazine, in steriele 1x PBS.
- Gebruik de steriele instrumenten en chirurgische handschoenen tijdens het bedrijf.
- In utero elektroporation
- Anesthetiseer een tijd zwangere ICR Mouse (E 12.5) door intraperitoneale toediening van anesthetica met 500 μL van 3,88 mg/mL pentobarbital en 500 μL 0,12% xylazine.
Opmerking: onderzoekers moeten de regulering van dierproeven volgen. Als men nodig heeft om anesthesie of pijnbestrijding drugs gebruiken, gebruik ze goed. - Knip het haar en Desinfecteer de huid met chirurgische scrub.
- Controleer of het gebrek aan teen pinch Response. Zodra de pedaal reflex niet wordt waargenomen, maakt u een 2-3 cm door de buik langs de middenlijn. Zet gauzes rond het ontleed gedeelte en Bevochtig de gauzes met warme PBS om de incisie niet op te drogen. Neem de rechter baarmoeder hoorn voorzichtig met ringvormige Tang en Tel het aantal embryo's.
- Injecteer voorzichtig met micro capillair 1-2 μL van het gemengde DNA in de ventrikel van de telencephalon van embryo's.
Opmerking: wanneer de injectie succesvol is, kan men de blauwe kleur van de verf over het oppervlak van de baarmoeder zien. - Bevochtig de baarmoeder en de elektrode voordat u de Spanningspulsen geeft en houd vervolgens het hoofd van een embryo zachtjes vast. Stel de positief geladen elektrode in op de zijkant van de hemisfeer, waarin het DNA is geïnjecteerd. Zorg ervoor dat de conditie van de puls van de elektroporation is 30-50 V voor 50 MS, het interval van de pulsen is 1 s (50 MS charge en 950 MS non-charge). Geef 5 pulsen aan één embryo en controleer of er bubbels worden opgewekt uit de negatief geladen elektrode.
Opmerking: Zorg ervoor dat de richting van de elektrode: DNA is opgenomen in de cellen aan de zijkant van de positieve elektrode. Verplaats de positie van de elektrode tijdens deze procedure niet. - Herhaal de stappen 4.2.3-4.2.4 voor andere embryo's en keer de baarmoeder hoorn terug naar de buikholte. Voer dezelfde procedure uit voor de embryo's in de linker baarmoeder hoorn.
- Na het terugplaatsen van de linkerkant, hechting van de incisie door een zijde hecht (4-0) met een naald (17 mm). Voordat de incisie volledig te sluiten, zet warme PBS in de buikholte
Opmerking: het interval tussen hechtingen is ongeveer 2 mm. - Na het beëindigen van de operatie, plaats de muis op een verwarmingskussen voor na anesthesie herstel. Huis de muis afzonderlijk.
Opmerking: onderzoekers moeten hun lokale instiutionele regulering van dierproeven volgen. Als men pijnstillers moet gebruiken, gebruik ze dan goed.
- Anesthetiseer een tijd zwangere ICR Mouse (E 12.5) door intraperitoneale toediening van anesthetica met 500 μL van 3,88 mg/mL pentobarbital en 500 μL 0,12% xylazine.
5. bereiding van segment culturen van de ontwikkelende cortex en visualisatie van plaats reporter expressie in de corticale schijfjes
- Bereiding van cultuur media en reagentia voor segment culturen van de cortex
- Bereid verrijkte media voor het kweken van corticale schijfjes met 5% foetaal runderserum en 5% paarden serum in N2/B27-media.
- Bubble 100% O2 gas via DMEM/F12 media voor dissectie en het maken van corticale segmenten.
Opmerking: om zuurstof gas veilig te gebruiken, bewaar de O2 cilinder in de cilinderkast en bewaak de zuurstofconcentratie in de lucht door een zuurstofconcentratie meter. - Verdun 100 mM luciferine natrium oplossing in verrijkte media tot een eindconcentratie van 1 mM.
Opmerking: luciferin toont auto-fluorescein zelf. In het geval van Luciferase-fluorescentie Dual Imaging, met name EGFP, is de lagere concentratie van luciferine (0,5 mM) beter. - Stel de multi-gas incubator in op 37 °C door 40% O2 en 5% Co2.
- Dissectie van embryo's en onderzoek van de uitdrukking van fluorescerende reporter
- Na euthanatatie van de zwangere muis waarop de verslaggevers (e 13.5) worden geïntroduceerd door in utero elektroporation (stap 4,2), snijd door de buik en haal de baarmoeder uit.
Opmerking: onderzoekers moeten de regulering van dierproeven volgen. Als met behulp van anesthesie of pijnbestrijding drugs, gebruik ze goed. - Breng de baarmoeder over naar een 10 cm Petri schaaltje met PBS. Haal de embryo's uit de baarmoeder in PBS, met behulp van een micro schaar en een fijne Tang. Knip het hoofd van elk embryo af en breng over naar een 10 cm Petri schaaltje met DMEM/F12 media met 100% O2 gas. Verwijder epidermis en kraakbeen rond de hersenen in DMEM/F12 media.
- Zet de hersenen op het deksel van de Petri schaal met ringvormige Tang en zet het deksel op de fluorescentie stereoscopische Microscoop fase. Controleer de regio van de cortex die fluorescerende eiwitten uitdrukt onder het excitatie lampje (Figuur 2A, B).
- Breng de hersenen over naar een Silicone rubber snijplank gevuld met 30 mL DMEM/F12 media borrelen met 100% O2 gas. Verwijder hersenvliezen die het oppervlak van de telencephalon bedekken met een fijne Tang.
- Snijd de grens tussen het mediale en laterale deel van de dorsale telencephalon en scheid in twee hersenhelften met behulp van micro chirurgisch mes of fijne Tang. Gebruik een micro chirurgisch mes, snijd de cortex zoals strepen en maak corticale schijfjes (Figuur 2C, D). Pipetteer segmenten met medium met behulp van pipetten en breng ze over naar verrijkte media in een schaal van 35 mm.
- Zet de plakjes op de cultuur inserts in de glazen bodem gerechten met verrijkte media. Corrigeer de richting van de segmenten met een fijne Tang. Stel het snijoppervlak van de segmenten in op het oppervlak van de kweek plaat. Verwijder de extra media met een pipet. Incureer de segmenten in multi-gas Incubator set door 40% O2 en 5% Co2 bij 37 °c gedurende 30 minuten.
- Voeg 300 μL verrijkte media met 1 mM luciferine toe aan de buitenkant van het kweekbakje in de glazen bodem schaal.
- Na euthanatatie van de zwangere muis waarop de verslaggevers (e 13.5) worden geïntroduceerd door in utero elektroporation (stap 4,2), snijd door de buik en haal de baarmoeder uit.
- Visualisatie van plaats reporter-expressie in segment culturen
- Start het luminescentie Live-Imaging systeem voordat u begint met het dissectie. Gebruik de volgende toestand van corticale segment culturen: 40% O2,5% co2 en 37 °c.
- Zet de Dompel olie op 40x objectief objectief. Zet de monster schotel in het stadium van de Microscoop. Verkrijg het testbeeld van fluorescentie en stel de positie en het scherpstel vlak in op het gebied van belang onder de verlichting van excitatie licht.
- Voer de time-lapse-acquisitie uit met 3-dimentionele acquisities (luminescentie, fluorescentie en helderveld) voor 24 uur (Figuur 2F-h). Voor het verkrijgen van luminescentie beelden gebruikt u de volgende camera-instellingen: lage overdrachtssnelheid (50 kHz), 2x2/4x4 binning, 10 min/5 min belichtingstijd. Gebruik voor het verzamelen van fluorescentie-en heldere velden de volgende instellingen: gemiddelde overdrachtssnelheid (1 MHz), 1x1-binning en 100 MS belichtingstijd.
6. beeldverwerking en-analyse
- Verbind elke afbeelding en maak de stapel afbeeldingen. Klik op Afbeeldingsvolgorde importeren in het menu bestand (bestand | Import | Afbeeldingsvolgorde) en kies de map waar de verkregen afbeeldingen worden opgeslagen. Zet enkele woorden in bestandsnaam naar de kolom van FIle naam bevat.
- Om het lawaai van kosmische straal op de Bioluminescentie beelden te verwijderen, past u de Spikenoise filter plug-in van imagej/Fiji toe. Open de stapel afbeeldingen en klik op Spikenoise filter.
- Apply Savitzky Golay temporele filter plug-in om duidelijke dynamiek van Reporter expressie te krijgen. Open de stapel afbeeldingen en klik op Savitzky Golay temporele filter.
- Om de intensiteit van de reporter expressie te meten, past u Z AXIS profile plus plug-in toe op elke afzonderlijke cel. Selecteer de cellen en stel ROIs, regio van belang in en klik op Z AXIS profile plus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uitdrukkingen van de genen Hes1/7 vertonen 2 uur oscillatie cyclus in verschillende cellijnen en tijdens de somitogenese. Bovendien is de periode van oscillatie zeer kort en zowel hun Mrna's en eiwitten zijn zeer onstabiel met de halfwaardetijd van rond 20 min. Als we een trage reactie reporter gebruiken, kunnen we dergelijke snelle dynamiek niet traceren en als we een stabiele reporter gebruiken, accuiteert deze geleidelijk, terwijl de genexpressie oscilleert. Zo moet de melder snel worden afgebroken om de snelle omzet van dergelijke cyclisch uitgedrukte genen te monitoren. Om deze problemen te overwinnen, gebruikten we plaats reporter om de dynamische uitdrukking van oscillatoren te bewaken. Omdat de Bioluminescentie reporter een korte rijpingstijd en een hoge gevoeligheid heeft, stelt het ons in staat om de snelle dynamiek van ultradian oscillatoren te bewaken. Net als een fluorescerende Reporter, de plaats reporter kan de uitdrukking dynamiek van een eiwit te bewaken door te worden samengesmolten tot de gencoding sequentie (Figuur 1a, Figuur 2E en Figuur 3D). Luciferase-gesmolten genproducten vertonen dezelfde uitdrukking, omzet en translocatie kinetiek in cellen als de endogene eiwitten. Bovendien, om de promotor activiteit van het oscillerende gen dll1-te monitoren, gebruikten we alomtegenwoordige plaats, een gedestabiliseerde plaats Reporter (Figuur 1a en Figuur 3a)23, waarvan de halfwaardetijd ongeveer 10 min20is. Met behulp van verschillende soorten plaats reporters, hebben we transgene muizen of klopte muizen gegenereerd om een stabiele uitdrukking van de reporter in npc's te verkrijgen tijdens neurogenese17. Om reporter expressie op single cell niveaus in weefselcultuur te visualiseren, is de verspreide introductie van Reporter de voorkeur. Zo gebruikten we voorbijgaande transfectie van het reporter-gen in Npc's via in utero-elektroporation (Figuur 2F-H). Het plaats reporter systeem is gebruikt op het gebied van circadiane ritmes om de dynamische expressies van klok genen gedurende een lange periode te monitoren (bijvoorbeeld 1 week), wat suggereert dat luciferine (D-luciferine), het substraat van het Firefly plaats-enzym, zeer stabiel is en geen toxiciteit heeft voor levende cellen24,25. Meestal gebruiken we luciferine in concentraties van 1 mM in de media, wat voldoende is voor de nachtelijke Live-celbeeldvorming. Bovendien stelt het beeldvormings systeem op basis van Microscoop ons in staat om de multidimensionale beelden, heldere veld afbeeldingen, fluorescentie beelden en chemiluminescentie beelden te verwerven (Figuur 2F-H en Figuur 3E).
Aan de hand van deze voorwaarden hebben we de uitdrukkingen van verschillende ultradian-klok genen gevisualiseerd, waaronder Hes1, Ascl1, Neurog2 en dll1- (figuren 2 en Figuur 3). Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 3. De melder van Dll1-Promoter activity vertoonde een oscillerende uitdrukking in Npc's, afgeleid van de telencephalon van Dll1--UB-Fluc reporter muizen. De gedestabiliseerde plaats-reporter(figuur 3A) wees op een scherpe en neer regulering van de uitdrukking van de organisator activiteit (Figuur 3B, C). In dit geval, enkele neurale voorlopercellen weergegeven een ongeveer 2,5 h oscillatie cyclus met verschillende amplitudes in de loop van 13 h (Figuur 3C). De snelle reactie plaats reporter stelt ons in staat om de transmissie dynamiek van Inkeping signalering tussen twee levende cellen (Figuur 3D-F en aanvullende film S1) vast te leggen. We bereidden twee soorten DNA-mengsels voor: (1) Hes1 Promoter Reporter (pHes1-UB-Luc) en EGFP Expression vector, en (2) Dll1-Protein Reporter (Dll1--Luc) en mCherry Expression vector en transfmaakten ze afzonderlijk in Npc's. Vervolgens hebben we de twee soorten cellen verzameld en samen gecultiveerde om de uitdrukking van verslaggevers in levende cellen te meten. Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 3E, F. Aangrenzende EGFP-positieve cellen met Hes1 reporter en mCherry-positieve cellen die Dll1-eiwit reporter tijdens observatie met elkaar hebben benaderd. Hes1 reporter expressie in een groene cel leek te beginnen over 60 min na twee cellen contact (Figuur 3E, F). Dit suggereerde dat de tijdvertraging voor de overdracht van Inkeping signalering tussen aangrenzende cellen ongeveer 1 uur was. Bovendien toonde Dll1-eiwit expressie tijdens de signaaloverdracht een dynamische translocatie in een rode cel (Figuur 3E).
Figuur 1: dissectie van de embryonale muis hersenen. (A) de structuur van plaats reporters, dll1-Promoter reporter en dll1-Protein Reporter. B) procedure van dissectie. a) de laterale weergave van een muis embryo. (b) Knip de kop af samen met de stippellijn. c) Verwijder de epidermis en het kraakbeen uit de kloof tussen de telencephalon en de midbrain. d) snijd het omringende weefsel langs de middenlijn tussen de rechter-en linkerhemisferen. (e) Verwijder het weefsel van de middelste breuk aan beide zijden. f) het telencephalon en het middenbrein na verwijdering van het omringende weefsel. g) scheid de telencephalon (Tel), de veroorzaakt (mid) en de olfactorische gloeilamp (Ob). h) doorsnede van de telencephalon, weergegeven in gestippelde lijn in (g). (i) Verwijder de hersenvliezen rond het oppervlak van het telencephalon. j) de telencephalon in twee delen scheiden: mediaal en lateraal deel. k) snijd de rand van de cortex en de ganglionische EMINENTIE (GE). l) dorso-laterale deel van de cortex wordt gebruikt voor dissociatie cultuur. C) de hersenen op embryonale dag 14 (E14), bestaande uit de linker (a) en rechter (b) hemisferen van de telencephalon en de veroorzaakt (c). D) de telencephalische hemisferen gescheiden van de midhersenen. E) één ontleed halfrond van het telencephalon: het ventrolaterale deel van de telencephalon inclusief de ganglionische eminenties (d), het dorsolaterale deel van de telencephalon gebruikt voor gezien culturen en segment culturen (E), het mediale deel van de telencephalon (f) en hersenvliezen die het oppervlak van de hersenen bedekken (g). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: het maken van de corticale schijfjes van het embryonale telencephalon en het visualiseren van dll1-eiwit dynamiek in de corticale segment culturen. A) controle van de uitdrukking van EGFP met behulp van fluorescentie stereoscopische Microscoop. Rode pijl toont de regio van de cortex uitdrukken EGFP. De linker hemisfeer (a), de rechter hemisfeer (b) en de middenhersenen (c). B) gestippelde lijnen geven de contouren van de in (A) vermelde hersengebieden aan. C) ontleed cortex van de dorsolaterale telencephalon. Witte pijlpunten geven de snijkanten aan. D) corticale schijfjes van de dorso-laterale telencephalon. E) genstructuren van verslaggevers voor het visualiseren van dll1-eiwit dynamiek in npc's. De Dll1-eiwit Reporter, Dll1--Fluc (Upper) werden geïntroduceerd in Npc's met een EGFP-expressie vector (lager) om de morfologie en migratie van cellen in de corticale plakjes te monitoren. (F-H) Driedimensionale beelden van helder-veld (F), GFP-expressie (G) en bioluminescentie (H) in het corticale segment. Het bioluminescentie beeldvormings systeem liet de uitdrukkingen van plaats en fluorescentie reporter gelijktijdig traceren. Schaal staven: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: representatieve gegevens voor visualisatie en analyse van de dynamische uitdrukking van het dll1--gen in de NPC-cultuur. (A) de reporter construct voor het visualiseren van dll1-expressie op het transcriptionele niveau, met behulp van een gedestabiliseerde plaats Reporter (UB-plaats, alomtegenwoordige plaats). (B) visualisatie van de uitdrukking van DLL1- in één NPC met een bioluminescentie Reporter. De getallen in het paneel tonen de piek punten van de oscillerende uitdrukking van dll1- die overeenkomt met de getallen in deelvenster c. (c) een tijdsverloop van de Bioluminescentie, de Dissociatieve NPC zoals weergegeven in (B), die de dynamische expressie van dll1-vertoont. (D-F) Visualisatie van de uitdrukking van Hes1 Promoter reporter en Dll1-Protein Reporter, uitgedrukt in de naburige cellen. (D) de structuur van Hes1 Promoter activity Reporter (PHes1-UB-Luc) en dll1-Protein Reporter (Dll1--Luc). (E en F) De EGFP-positieve cel met Hes1 Reporter (Cell1) en de mcherry positive Cell met dll1-Protein Reporter (Cell2) werden medegekweekt en de luminescentie van beide soorten verslaggevers werd gemeten. De uitdrukking van Hes1 reporter in de groene cel (Cell1) leek te beginnen over 60 min nadat de twee cellen gecontacteerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende film S1: visualisatie van de uitdrukking van Hes1 Promoter reporter en dll1-Protein Reporter, uitgedrukt in de naburige cellen, gerelateerd aan Figuur 3D-3F. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De componenten van Inkeping signalering tonen oscillerende uitdrukkingen in Synchrony tijdens somitogenese maar uit Synchrony tijdens neurogenese, wat leidt tot de moeilijkheden bij het vastleggen van de expressie dynamiek door statische analyse in het laatste geval. Real-time monitoring is dus vereist om de expressie dynamiek van Inkeping signalering componenten, zoals Hes1 en dll1-te onthullen. Omdat de perioden van de expressies van Hes1 en dll1- oscillaties extreem kort zijn, zijn er ongeveer 2-3 h, snelle respons en instabiele verslaggevers nodig voor het bewaken van hun expressie dynamiek. Voor dit doel hebben we de bioluminescence reporter en imaging systeem ontwikkeld. De Bioluminescentie reporter plaats toont een snelle rijpings kinetiek en een hoge gevoeligheid om de snelle omzet van dergelijke cyclische genexpressies te traceren. De snelle omzet van verslaggevers leidt tot zeer zwakke signalen die worden gegenereerd. Om dergelijke zwakke signalen te detecteren die door de Bioluminescentie reporters worden geproduceerd, gebruiken we een geoptimaliseerd bioluminescentie beeldvormings systeem, inclusief een zeer gevoelige, watergekoelde CCD-camera met een ultra-lage uitstroom snelheid (50 kHz), waardoor het geluid tot een minimum wordt beperkt. Bovendien stelt een hoge numerieke diafragma (N.A.) objectief lens ons in staat om het licht dat vrijkomt uit de gedestabiliseerde plaats Reporter, optimaal te verzamelen. Om een hogere gevoeligheid te verkrijgen gebruiken we meestal hogere binning (bijv. 2 x 2, 4 x 4, 8 x 8) en houden we de sluiter lang open (bijv. 5-20 min). Omdat het signaal van de verslaggevers van plaats zeer vaag is, vormt de interferentie van licht uit de omgeving ook een probleem bij het opsporen van het zwakke signaal: zo moet de Microscoop ruimte volledig donker zijn. Dit systeem stelt ons in staat om de dynamische expressies van Hes1 en Dll1-genen in Npc's te meten in zowel transcriptionele als eiwit niveaus (Figuur 3). Daarnaast kunnen we de eiwit dynamiek van intracellulaire translocatie visualiseren met plaats gesmolten eiwit Reporters. Bovendien, met behulp van de snelle reactie plaats Reporter, we kunnen de transmissie dynamiek van Inkeping signalering en meten van de tijdvertraging voor signaaloverdracht tussen twee levende cellen (Figuur 3D-F en aanvullende film S1). Bovendien stelt de combinatie van Promoter Reporter (UB-Luciferase Reporter) en Protein Reporter (Luciferase Fusion) van één gen ons in staat om de tijdsvertraging te meten tussen transcriptie en vertaling van het gen. Op deze manier is de meervoudige beeldvorming van verschillende soorten luminescentie verslaggevers en fluorescentie reporter beschikbaar om de tijdsvertraging/-snelheid voor biochemische reacties te meten.
In real-time monitoring van genexpressies bij een enkele celresolutie is gebleken dat er variaties zijn in de expressie dynamiek van hetzelfde gen. Sommige cellen Express Dll1-/Neurog2 op oscillerende wijze, maar anderen tonen aanhoudende patronen. Bovendien induceren de verschillende expressie dynamiek (oscillatory versus steady) verschillende outputs in de toestand van de cellen. Wat duidelijk lijkt te zijn, is dat verschillende expressie dynamiek het gedrag van cellen op verschillende manieren beïnvloedt, wat suggereert dat de Expression Dynamics meer informatie codeert21,22,26,27,28,29,30,31,32. De statische analyses kunnen de dynamiek in genexpressie niet vastleggen, en real-time analyses zijn nodig voor het begrijpen van biologische fenomenen om de expressie dynamiek in cellulaire gebeurtenissen te onthullen. De aanpak die we hier introduceren, kan de dynamiek van ultradian oscillatoren bewaken tijdens neurale ontwikkeling bij hoge temporele resolutie. Met deze methode ontdekten we dat veel meer genen dynamisch worden uitgedrukt dan we eerder hadden gedacht, en we kunnen niet alleen de dynamiek van eiwit expressie traceren, maar ook de dynamiek in eiwit lokalisatie in de cel bij hoge temporele resolutie. Dergelijke dynamische expressie patronen kunnen biologische significanties hebben die nog moeten worden opgehelderd.
Bioluminescentie verslaggevers hebben een groot voordeel in temporele resolutie en lage toxiciteit voor levende cellen in vergelijking met fluorescentie verslaggevers33. Echter, in tegenstelling tot de kleurvariaties in fluorescerende reporters, zijn er slechts enkele kleuren in bioluminescentie reporters, waarbij een beperking wordt opgelegd aan het aantal genen dat tegelijkertijd kan worden bewaakt. Niettemin, toenemende aantallen van variabele plaats worden geïsoleerd en gekloond van verschillende wezens34,35, en met behulp van een dergelijke verscheidenheid van luciferases, we zullen in staat zijn om gelijktijdig meerdere genexpressie dynamiek in een enkele cel te traceren met een hoge temporele resolutie. De moleculaire grootte van Firefly plaats is groter dan fluorescentie reporters, die een aantal moeilijkheden bij de bouw van Reporter-gesmolten eiwitten om de eiwit dynamiek te bewaken presenteert, maar onlangs, een nieuwe, kleinere en helderdere plaats is gekloond36, die ons zou toelaten om de eiwit dynamiek gemakkelijker dan ooit te visualiseren. Een groeiend aantal rapporten hebben onlangs verschillende soorten dynamiek in genexpressie en eiwit translocatie aangetoond in verschillende biologische gebeurtenissen21,22,26,27,28,29,30,31,32. Analyses van dergelijke dynamiek in spatiotemporele regulering met behulp van een real-time monitoringsysteem zou steeds belangrijker zijn om de werkelijke Staten van cellen te vangen en de regulering van cellulaire systemen te onthullen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen.
Acknowledgments
We danken Yumiko Iwamoto voor de ondersteuning van de productie van de video. We zijn ook Akihiro Isomura dankbaar voor de bespreking en ondersteuning van beeldanalyse, Hitoshi Miyachi voor technische ondersteuning voor het genereren van transgene dieren, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) en OUIN Kunitaki (Andor Japan) voor de technische ondersteuning en discussies van het bioluminescentie beeldvormings systeem. Dit werk werd gesteund door kernonderzoek voor Evolutionele wetenschap en technologie (JPMJCR12W2) (R.K.), subsidie-in-steun voor wetenschappelijk onderzoek op innovatieve gebieden (MEXT 24116705 voor H.S. en MEXT 16H06480 voor R.K.), subsidie-in-steun voor wetenschappelijk onderzoek (C) (JSPS 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. en H.S.), en platform voor dynamische benaderingen van het woon systeem van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioluminescence Imaging System | |||
| Chilled water circulator (chiller) | Julabo | Model: F12-ED | |
| Cooled CCD camera | Andor Technology | Model: iKon-M 934 | |
| Incubator system | TOKAI HIT | Model: INU-ONICS | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX81 | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX83 | |
| LED illumination device | CoolLED | Model: pE1 | |
| MetaMorph | MOLECULAR DEVICES | Model: 40000 | |
| Mix gas controller | Tokken | Model: TK-MIGM OLO2 | |
| Objective lens | Olympus | Model: UPLFLN 40X O | |
| Preparations for Dissection | |||
| Dissection microscope | Nikon | Model: SMZ-2B | |
| Fluorescence stereoscopic microscope | Leica | Model: MZ16FA | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Scissors, Micro scissors | |||
| Forceps | |||
| Ring-shaped forceps | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Reagents for NPC dissociation culture | |||
| B27 supplement | invitrogen | 12587-010 | |
| bFGF | invitrogen | 13256-029 | Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS |
| D-luciferin | Nacalai Tesque | 01493-85 | Stock solution: 100mM in 0.9% saline |
| DNase | Worthington Biochemical Corporation | LK003172 | Stock solution: 1000U/ml in EBSS |
| EBSS | Worthington Biochemical Corporation | LK003188 | |
| Glass bottom dish | IWAKI | 3910-035 | |
| N2 supplement (100x) | invitrogen | 17502-048 | |
| N-acetyl-cystein | Sigma | A-9165-25G | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LK003178 | Stock solution: 7U/ml in EBSS |
| Penicillin/Streptmycine | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P-6281 | 40 mg/ml in DW |
| Preparations for in utero electroporation | |||
| 50-ml syringe | TERUMO | 181228T | |
| Electrode | Neppagene | 7-mm | |
| Electroporator | Neppagene | CUY21 EDIT | |
| Forceps | |||
| Gauzes | Kawamoto co. | 7161 | |
| Micro capillary | Made in-house | ||
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Pentbarbital | Kyoritsuseiyaku | Somnopentyl | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Suture needle | Akiyama MEDICAL MFG. CO | F17-40B2 | |
| Xylazine | Bayer | Seractal | |
| Preparations for Slice culture | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| Culture insert | Millipore | PICM01250 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012-500ML | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Forceps | |||
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Micro surgical knife | Alcon | 19 Gauge V-Lance | |
| Multi-gas incubator | Panasonic | MCO-5MUV-PJ | |
| N2/B27 media | Made in-house | ref. NPC dissociatioin culture | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Silicon rubber cutting board | Made in-house |
References
- Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
- Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Paridaen, J. T., Huttner, W. B. Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system. EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. Notch signaling in vertebrate neural development. Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).
- Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks. Neuron. 69, 840-855 (2011).
- Bray, S. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
- Bray, S. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).
- Kopan, R., Ilagan, M. X. G. The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism. Cell. 137, 216-233 (2009).
- Ishibashi, M., et al. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).
- Ohtsuka, T., et al. Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation. The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).
- Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain. Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).
- Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis. Development. 134, 1243-1251 (2007).
- Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors. Neuron. 58, 52-64 (2008).
- Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Shimojo, H., et al. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes and Development. 30, 102-116 (2016).
- Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
- Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition. Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).
- Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).
- Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342, 1193-1200 (2013).
- Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152, 945-956 (2013).
- Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice. Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).
- Yamaguchi, S., et al. Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
- Kiyohara, Y. B., et al. The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).
- Behar, M., Hoffmann, A. Understanding the temporal codes of intra-cellular signals. Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
- Nelson, D. E., et al. Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression. Science. 306, 704-708 (2004).
- Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
- Hansen, A. S., O'Shea, E. K. Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression. Molecular Systems Biology. 9, 704 (2014).
- Hansen, A. S., O'Shea, E. K. cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale. Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).
- Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo. Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).
- Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: Progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
- Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay. Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).
- Nakajima, Y., et al. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, (2010).
- Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12, (2013).
