Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Real tid bioluminescence avbildning av notch signalering dynamik under Murine neurogenes

Published: December 12, 2019 doi: 10.3791/60455

Summary

Neurala Stem/progenitorceller uppvisar olika uttrycks dynamik av notch signalering komponenter som leder till olika resultat av cellulära händelser. Sådana dynamiska uttryck kan avslöjas genom realtidsövervakning, inte av statisk analys, med hjälp av en mycket känslig Mareld Imaging system som möjliggör visualisering av snabba förändringar i genuttryck.

Abstract

Notch signalering reglerar upprätthållandet av neurala stamceller/progenitorceller av cell-cell interaktioner. Komponenterna i notch signalering uppvisar dynamiskt uttryck. Notch signalering effektor Hes1 och notch ligand delta-like1 (Dll1) uttrycks i en oscillerande sätt i neurala stamceller/progenitorceller. Eftersom perioden av oscillatoriska uttrycket av dessa gener är mycket kort (2 h), är det svårt att övervaka deras cykliska uttryck. För att undersöka sådana snabba förändringar i genuttrycket eller proteindynamiken krävs snabba responsreportrar. På grund av dess snabba mognad kinetik och hög känslighet, den Mareld reporter luciferas är lämplig för att övervaka snabba genuttryck förändringar i levande celler. Vi använde en destabiliserat luciferas reporter för övervakning av arrangören aktivitet och en luciferas-smält reporter för visualisering av proteindynamik vid enkel cells upplösning. Dessa Mareld reportrar visar snabb omsättning och genererar mycket svaga signaler; Därför har vi utvecklat en mycket känslig Mareld Imaging system för att upptäcka sådana svaga signaler. Dessa metoder gör det möjligt för oss att övervaka olika gener uttrycks dynamik i levande celler och vävnader, som är viktig information för att hjälpa till att förstå de faktiska cellulära tillstånd.

Introduction

Däggdjurs hjärnan består av ett stort antal olika typer av nervceller och gliaceller. Alla celler genereras från neurala stamceller/progenitorceller (NPCs), som först föröka sig för att utöka deras antal, sedan börja differentiera till nervceller, och slutligen ge upphov till gliaceller1,2,3,4,5. När celler har differentierat till nervceller, de kan inte föröka sig eller ökar deras antal, och, därför, underhåll av NPC tills senare stadier är viktigt. Notch signalering via cell-cell interaktioner spelar en viktig roll för att upprätthålla NPCs6,7. Notch ligander interagera med membranprotein, notch, på ytan av angränsande celler och aktiverar notch protein. Efter aktiveringen, proteolys av notch protein uppstår, därmed släppa den intracellulära domänen av notch (NiCd) från cellmembranet i Nucleus8,9,10. I kärnan binder NICD till Promotorns regioner Hes1 och Hes5 (Hes1/5) och aktiverar uttrycket för dessa gener. Hes1/5 Tryck igen uttrycket av proneural gener Ascl1 och Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Eftersom proneural gener inducerar neuronala differentiering, Hes1/5 spela viktiga roller i att upprätthålla NPC. Dessutom, som proneural gener kan aktivera uttrycket av notch ligand delta-like1 (Dll1), Hes1/5 också trycka uttrycket av Dll1. Därför, uttrycket av Dll1 leder till angränsande celler är negativa för Dll1 via notch signalering. På detta sätt, celler hämmar angränsande celler från att följa deras samma öde, ett fenomen som kallas den laterala hämning8. I hjärnans utveckling, lateral hämning spelar en roll i att generera olika olika celltyper.

Real tids avbildning på singelcellsnivå avslöjar dynamiska uttryck av komponenterna i notch signalering i NPCs15,16,17. Notch signalering aktiverar uttrycket av Hes1, men Hes1 protein binder till sin egen promotor och ÅTERTRYCKER sitt eget uttryck. Dessutom är Hes1 ett extremt instabilt protein, som bryts ned av den ubiquitin-Proteasome vägen; Därför är repressionen av dess egna tillskyndare endast kortlivad och därefter börjar transkription igen. På detta sätt, uttrycket av Hes1 oscillerar på både transkription och translationella nivåer i en 2 h cykel18. Oscillatoriska uttrycket av Hes1, i sin tur, inducerar oscillerande uttrycket av nedströms målgener, såsom Ascl1, Neurog2, och Dll1, via periodiskt förtryck15,16,17,19. Medan proneural gener kan inducera neuronala differentiering, deras oscillatoriska uttryck är inte tillräckligt för neuronala differentiering; snarare deras ihållande uttryck är avgörande för neuronala differentiering. Det oscillatoriska uttrycket av proneural gener är viktigt för att upprätthålla NPC snarare än för att inducera neuronala differentiering14,15,16. Uttrycket av Dll1 oscillerar vid både transkription och translationella nivåer under olika morfogenes, såsom neurogenes och somitogenesis. Det dynamiska uttrycket av Dll1 är viktigt för den normala morfogenes och stadigt uttryck för Dll1 inducerar defekter i neurogenes och somitogenesis17. Dessa fynd visar den viktiga funktion som dynamiken i genuttryck och proteinkinetik har på regleringen av olika utvecklings händelser (dvs., olika uttrycks dynamik producerar olika utgångar i cellulära beteenden).

För att analysera dynamiken i notch signalering, är den statiska analysen av vävnader och celler otillräckliga eftersom de ständigt förändras. Real tids avbildning av enstaka celler är ett kraftfullt verktyg för att avslöja dynamiken i genuttryck. Det dynamiska uttrycket av notch signalmolekyler genomgår snabba cykliska svar under perioden 2-3 h. Detta snabba periodiska uttryck presenterar två svåra problem för realtids övervakningen: (1) molekylernas uttryck dämpas till låga nivåer, och (2) snabb omsättning kräver snabba svars reportrar. För att övervinna dessa problem, utvecklade vi tidigare en Mareld realtid Imaging Method20. Eftersom Mareld reporter har en högre känslighet och kortare mogning tid än fluorescerande reportrar, denna strategi gör att vi kan övervaka den snabba dynamiken i levande celler. Med Realtidsvisualisering fann vi att fler gener uppvisade ett dynamiskt uttryck än vi tidigare trott. Dessutom har antalet rapporter som visar uttryck och proteindynamik i levande celler och betydelsen av dessa dynamik i olika biologiska händelser ökat, vilket tyder på en grundläggande roll för dynamiken i genuttryck21,22.

I denna rapport beskriver vi ett sätt att visualisera uttrycket av notch ligand Dll1 i NPCs i både separerade kulturer och i kortikala segment kulturer. För att övervaka dynamiken i Dll1 transkription på enstaka cell nivåer, genererade vi dissocierade kulturer av NPC som härrör från den embryonala telencephalon av transgena möss som transporterar pDll1-UB-Fluc reporter, en Dll1 promotor driven destabiliserat luciferas reporter. För att övervaka Dll1 proteindynamik in vivo introducerade vi Dll1-Fluc fusion reporter i NPCs i cortex och visualiserade uttrycket av reportern i NPCs i kortikala segment kulturer. Real tid Imaging gjorde det möjligt för oss att fånga de olika funktionerna i genuttryck och proteindynamik i levande celler vid hög temporala upplösning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden inklusive djur försökspersoner har godkänts av institutionella djuromsorg och användning kommittén vid Institutet för Frontier Life och medicinska vetenskaper, Kyoto University.

1. bioluminescens reportrar

Obs: luciferas reporter är lämplig för att mäta den snabba dynamiken i Promotorns aktivitet genom att fixera nedbrytnings signalen. Dessutom möjliggör luciferas fusion reporter övervakning av proteindynamiken i den enskilda cellen. Båda typerna av reportrar är tillgängliga för mono-Layer kultur (dissociation kultur) och vävnad kultur (slice kultur) experiment.

  1. Reporter för övervakning Dll1 promotor aktivitet17
    Anmärkning: för att övervaka de snabba förändringarna i genuttryck, den snabba svar och instabil reporter är viktigt. Firefly luciferas (Fluc) visar snabb mognad jämfört med fluorescein reportrar. Eftersom ubiquitin smält luciferas reporter (UB-Fluc) visar snabb nedbrytning och snabb omsättning, är det mycket användbart att övervaka den dynamiska genuttrycket i levande celler20.
    1. Använd Dll1-driven destabiliserade luciferas reporter, och luciferas (pDll1-UB-Fluc, figur 1en övre panel), för att övervaka snabba förändringar i Dll1 uttryck på en transkriptionell nivå17.
    2. Generera en transgen mus linje redovisade pDll1-UB-Fluc för den stabila uttryck av denna reporter.
  2. Reporter för övervakning Dll1 protein Dynamics17.
    1. För generering av Knock-in möss, sätt luciferas cDNA i 3 ́ Termini i Dll1 Coding regionen så att Dll1-luciferas fusionsprotein uttrycks (Dll1-Fluc reporter, figur 1A, nedre panelen)17.
    2. Övervaka uttrycksdynamiken hos Dll1 på proteinnivåer genom att mäta luciferasaktiviteten.
    3. För övervakning Dll1 proteindynamik på vävnadsnivå, införa Dll1-Fluc reporter i NPCs i embryonala telencephalon genom in utero Electroporation.

2. bildsystem för bioluminescens

  1. Konstruera en Mareld Live-Imaging system med hjälp av en inverterad Mikroskop installeras med en mycket känslig, vattenkyld CCD-kamera. För att minska bullret och få hög känslighet, kyla kameran med kallt vatten som tillhandahålls av vatten cirkulationspumpen vid en optimerad temperatur på-90 ° c.
  2. För levande cell/vävnads avbildning, installera inkubations systemet, kontrollera temperaturen och blandad gas, till mikroskopet skede.
  3. För avbildning uttrycket av destabiliserade luciferas reporter, använda hög numerisk vinkel (na: 1,30) 40x Oil-Immersion objektiv. Arbetsavståndet för detta objektiv är 0,2 mm, det är tillgängligt för inte bara mono-skikt cellkultur men också slice kultur.
  4. För dubbel övervakning av luciferas och fluorescein reporter uttryck, installera LED-belysning enheten till ljusbanan i mikroskopet.
  5. Kontrollera tids fördröjnings avbildning med en programvara som är associerad med mikroskopet (t. ex. flerdimensionellt förvärvs program av MetaMorph programvara).
  6. Förbered hela systemet i ett mörkt rum, eftersom signalen från den destabiliserade luciferas reporter är mycket svag, och för att undvika yttre ljuset förhindra förvärvet.

3. neural Stem/progenitor cell (NPC) dissociation kulturer

  1. Beredning av kultur medier, diskmedel och reagenser för NPC dissociation Culture
    1. Förbered N2/B27-media för odling av neurala stamceller/progenitorceller med en slutlig koncentration av 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acetylcystein, 10 ng/mL bFGF och 50 U/mL penicillin/streptomycin i DMEM/F12-media.
    2. Förbered papain lösning för dissociation innehållande 7 U/mL papain, 0,006% DNase och 1 mM N-acetylcystein i EBSS media.
    3. Förbered 100 mm av Luciferin natrium lösning för Luminiscens Imaging. Späd 100 mM Luciferin-lösning i N2/B27-media till en slutlig koncentration av 1 mM.
      Obs: Luciferin visar Auto-fluorescein själv. I fallet med luciferase-Fluorescence Dual Imaging, särskilt EGFP, är det bättre att sänka koncentrationen av Luciferin till 0,5 mM.
    4. Coat en 35-mm glasbotten rätter (glas diameter 27-mm) med 40 μg/mL av poly-L-lysin (PLL) lösning för 1 h vid rumstemperatur. Efter inkubering, tvätta plattorna 3x med PBS och låt den torka.
  2. Dissektion av embryon och dissociation av NPC
    1. Efter euthanizing en gravid pDll1-UB-Luc transgena mus (embryonala dag 12,5 (E 12.5)) av CO2 kvävning och cervikal dislokation, skär genom buken och ta ut livmodern.
      Obs: forskare måste följa de förordningar och riktlinjer för djur forskningskommittén av deras institution. Om anestesi eller smärtlindring droger används, använda dem på rätt sätt.
    2. Överför livmodern i en 10 cm petriskål innehållande 25 mL iskall PBS. Ta ut embryon från livmodern i iskalla PBS, med hjälp av mikro saxar och fina pintrops.
    3. Klipp av huvudet på varje embryo med hjälp av sax och överföra den till 10 cm petriskålar som innehåller iskalla DMEM/F12. Avlägsna epidermis och brosk som omger hjärnan och överför hjärnan till 35 mm petriskål som innehåller iskall 3 mL N2/B27-media.
    4. Klipp av höger och vänster telencephalon från diencephalon (figur 1BA-f, C, D). Ta bort hjärnhinnorna som täcker ytan av telencephalon med fin tång (figur 1bi). Använda Fine pincett igen, ta ut den Dorso-laterala delen av cortex från telencephalon (figur 1BG, h, j-l E).
    5. Överför vävnaderna till nya 1,5 mL-rör med en P1000-pipett och avlägsna eventuellt extra medium med en P200-pipett. Tillsätt 0,1 mL papain lösning per hjärnvävnad (ett par i cortex). Efter 15 min inkubering vid 24 ° c, Pipettera proverna försiktigt 10 gånger med P1000 pipett. Inkubera proverna igen i 15 minuter vid 24 ° c.
    6. Pipettera försiktigt proverna 10 gånger med P1000 pipett. Centrifugera proverna i 3 min vid 400 x g och rumstemperatur (RT). Kassera supernatanten.
    7. Tillsätt 1 mL DMEM/F12-media till pelleten. Pipettera försiktigt 10 gånger med P1000 pipett. Centrifugera proverna i 3 min vid 400 x g och RT. Kassera supernatanten. Upprepa detta minst 2 gånger till.
    8. Tillsätt 0,5 mL N2/B27-material som innehåller 1 mM Luciferin till pelleten och blanda väl. Frö cellerna (1 x 106 celler) till en PLL-belagd glasbotten skålen. Odla cellerna i CO2 inkubator för 1 h. När cellerna följer skålen, tillsätt 2 mL N2/B27-media, innehållande 1 mM Luciferin.
  3. Visualisering av luciferas reporter uttryck i NPC dissociation Culture
    1. Starta luminiscens Live-Imaging-systemet innan du utför dissektion. För NPC kultur, ställa in temperaturen på scenen inkubator vid 37 ° c och ställa in inställningen av gasblandningen 20% O2,5% Co2.
    2. Sätt immersionsolja till objektivlinsen. Placera prov skålen på Mikroskop stadiet. Visa fältet manuellt och välj den bästa positionen och fokus för cellerna av intresse. Klicka på Live för att hämta testavbildningen.
    3. Kör Time-lapse förvärvet av 2-dimensionell (luminescence och Bright Field) förvärv för 24 h med flerdimensionella förvärvs program. Välj flerdimensionell förvärvs program och Ställ in anskaffnings inställningen enligt följande (steg 3.3.6).
    4. För inhämtande av luminiscens-bilder använder du följande kamerainställningar: låg överföringshastighet (50 kHz), 2 x 2/4 x 4 Binning, 10 min/5 min exponeringstid. För bild anskaffning med ljust fält använder du följande inställningar: mellanliggande överföringshastighet (1 MHz), 1 x 1 Binning och 100 MS exponeringstid.

4. i Utero-elektroporation

Anmärkning: Detta utförs för införandet av Dll1-Fluc reporter i neurala stamceller.

  1. Beredning av verktyg och reagenser för elektroporering
    1. Förbered mikro kapillärer för injektion av DNA i ventrikeln av den embryonala telencephalon. Sträck ett gräs kapillär med värme och skär och polera spetsen av den med polermaskin.
    2. Bered en blandning av DNA med färgämne (t. ex. Trypan Blue). Koncentrationen av varje DNA är 1 μg/μL i PBS och tillsätt färgen till en slutlig koncentration på 10%.
      Anmärkning: Använd blandningen av DNA för visualisering av Dll1 proteindynamik enligt följande: Dll1-Fluc (Dll1 protein reporter, figur 2E övre) och pEF-egfp (EF promotor driven egfp Expression Vector, figur 2E lägre), övervakning av lokalisering och morfologi av transfekterade celler.
    3. Förbered två typer av anestetika: 3,88 mg/mL pentobarbital och 0,12% av xylazin, i steril 1x PBS.
    4. Använd sterila instrument och kirurgiska handskar under drift.
  2. I Utero elektroporation
    1. Anesthetize en gång gravid ICR mus (E 12.5) genom intraperitoneal administrering av anestetika med 500 μL av 3,88 mg/mL pentobarbital och 500 μL av 0,12% xylazin.
      Anm.: forskarna måste följa regleringen av djurförsök. Om man behöver använda anestesi eller smärtlindring droger, använda dem på rätt sätt.
    2. Klipp håret och desinficera huden med kirurgisk skrubb.
    3. Kontrollera om bristen på tå nypa svar. När pedal reflex inte observeras, gör en 2-3 cm skär genom buken längs mittlinjen. Lägg Flor runt dissekerade delen och blöt Flor med varm PBS inte torka upp snittet. Ta ut rätt livmoder hornet försiktigt med ringformade tång och räkna antalet embryon.
    4. Injicera 1-2 μL av det blandade DNA i ventrikeln av telencephalon av embryon försiktigt med mikrokapillär.
      Obs: när injektionen är framgångsrik, kan man se den blå färgen på färgen över ytan av livmodern.
    5. Blöt livmodern och elektroden innan du ger spänningen pulser, och sedan hålla huvudet av ett embryo försiktigt. Ställ den positivt laddade elektroden på sidan av halvklotet, där DNA injicerades. Se till att villkoret för pulsen på elektroporation är 30-50 V för 50 ms, är intervallet av pulser 1 s (50 ms laddning och 950 MS icke-laddning). Ge 5 pulser till ett embryo och kontrollera att bubblor genereras från den negativt laddade elektroden.
      Anmärkning: se till elektrodens riktning: DNA införlivas i celler på sidan av positiv elektrod. Under denna procedur ska du inte flytta elektrodens position.
    6. Upprepa stegen 4.2.3-4.2.4 för andra embryon och returnera livmoder hornet till bukhålan. Utför samma ingrepp på embryona i vänster livmoder horn.
    7. Efter att sätta tillbaka den vänstra sidan, sutur snittet av en sidensutur (4-0) med en nål (17 mm). Innan du stänger snittet helt, sätta varm PBS i bukhålan
      Obs: intervallet mellan suturer är ca 2 mm.
    8. Efter avslutad kirurgi, Placera musen på en värmedyna för post anestesi återhämtning. Hus musen individuellt.
      Obs: forskare måste följa deras lokala instiutional reglering av djurförsök. Om man behöver använda smärtlindring droger, använda dem på rätt sätt.

5. beredning av segment kulturer i utvecklings barken och visualisering av luciferas reporter uttryck i kortikala skivor

  1. Beredning av kulturmedia och reagenser för slice kulturer i cortex
    1. Förbered berikad media för odling av kortikala skivor som innehåller 5% fetalt bovint serum och 5% Horse serum i N2/B27-media.
    2. Bubble 100% O2 gas genom DMEM/F12 media för dissektion och göra kortikala skivor.
      Anmärkning: för att använda syre gasen på ett säkert sätt, förvara O2 -cylindern i cylinder skåpet och övervaka syrehalten i luften med en syre koncentrations mätare.
    3. Späd 100 mM Luciferin natrium lösning i anrikat medium till en slutlig koncentration av 1 mM.
      Obs: Luciferin visar Auto-fluorescein själv. I fallet med dubbel avbildning av luciferase-fluorescens, särskilt EGFP, är lägre koncentration av Luciferin (0,5 mM) bättre.
    4. Ställ in flergasinkubatorn vid 37 ° c med 40% O2 och 5% Co2.
  2. Dissektion av embryon och undersökning av uttrycket av fluorescerande reporter
    1. Efter euthanizing den gravida mus som reportrar (e 13.5) införs genom in utero elektroporation (steg 4,2), skär genom buken och ta ut livmodern.
      Anm.: forskarna måste följa regleringen av djurförsök. Om du använder anestesi eller smärtlindring droger, använda dem på rätt sätt.
    2. Överför livmodern till en 10 cm petriskål innehållande PBS. Ta ut embryon från livmodern i PBS, med hjälp av mikro saxar och finpinps. Klipp av huvudet på varje embryo och överför till en 10 cm petriskål som innehåller DMEM/F12 Media bubblade med 100% O2 gas. Ta bort epidermis och brosk som omger hjärnan i DMEM/F12 media.
    3. Sätt hjärnan på locket på petriskål med ringformade tång och Ställ locket på fluorescens stereoskopiska Mikroskop skede. Kontrollera regionen av cortex uttrycker fluorescerande protein under excitation ljus (figur 2A, B).
    4. Överföra hjärnan till en silikon gummiskär bräda fylld med 30 mL DMEM/F12 Media bubblade med 100% O2 gas. Ta bort hjärnhinnorna som täcker ytan av den telencephalon av Fine forceps.
    5. Skär gränsen mellan mediala och laterala delen av dorsala telencephalon och separera i två halvklot med mikro kirurgisk kniv eller fin tång. Med hjälp av en mikro kirurgisk kniv, klippa cortex som ränder och göra kortikala skivor (figur 2C, D). Pipettera skivor med medium med pipett och överför dem till anrikat material i en 35 mm maträtt.
    6. Lägg skivorna på kulturen infogar i glasbotten rätter med berikade medier. Korrigera riktningen på skivor med hjälp av fin tång. Ställ in snittytan på skivorna till ytan av kultur insatsen. Ta bort extra mediet med en pipett. Inkubera skivorna i flergasinkubator som fastställts av 40% O2 och 5% Co2 vid 37 ° c i 30 min.
    7. Tillsätt 300 μL anrikat medium innehållande 1 mM Luciferin till utsidan av kulturen infoga i glaset botten skålen.
  3. Visualisering av luciferas reporter uttryck i slice kulturer
    1. Starta luminiscens Live-Imaging-systemet innan dissektion startas. Använd följande villkor för kortikala segment kulturer: 40% O2,5% Co2 och 37 ° c.
    2. Sätt immersionsolja till 40x objektiv. Sätt provet skålen till scenen i Mikroskop. Förvärva testbilden av fluorescerande och ställa in positionen och fokus planet till regionen av intresse under belysning av excitation ljus.
    3. Kör Time-lapse förvärvet av 3-dimentionella (luminescence, fluorescens och Bright Field) förvärv för 24 h (figur 2F-h). För inhämtande av luminiscens-bilder använder du följande kamerainställningar: låg överföringshastighet (50 kHz), 2x2/4x4-Binning, 10 min/5 min exponeringstid. För fluorescensen och det ljusa fältet bild förvärv, Använd följande inställningar: mellan-överföringshastighet (1 MHz), 1x1 Binning och 100 MS exponeringstid.

6. bildbehandling och analys

  1. Anslut varje bild och göra stacken bilder. Klicka på Importera bildsekvens från Arkiv -menyn (fil | Importera | Bildsekvens) och välj den mapp där de förvärvade bilderna sparas. Lägg några ord som finns i filnamn till kolumnen FIle namn innehåller.
  2. För att ta bort bullret från Cosmic Ray på Mareld bilder, tillämpa spikenoise filter plug-in av imagej/Fiji. Öppna stacken bilder och klicka på Spikenoise filter.
  3. Applicera Savitzky GOLAY temporal filter plug-in för att få tydlig dynamik reporter uttryck. Öppna stacken bilder och klicka Savitzky GOLAY temporal filter.
  4. Använd Z-Axelprofil plus plug-in för varje enskild cell för att mäta intensiteten i reporter uttryck. Markera cellerna och ange ROIs, region av intresse och klicka på Z-Axelprofil plus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Uttryck för generna Hes1/7 Exhibit 2 h svängning cykel i olika cellinjer och under somitogenesis. Dessutom är perioden av svängning mycket kort och både deras mRNAs och proteiner är extremt instabila med halveringstiden på cirka 20 min. Om du använder en långsam responsreporter, kan vi inte spåra sådana snabba dynamik, och om du använder en stabil reporter, det ackumuleras gradvis medan genuttrycket oscillerar. Således måste reportern snabbt brytas ned för att övervaka den snabba omsättningen av sådana cykliskt uttryckta gener. För att övervinna dessa problem, använde vi luciferas reporter för att övervaka det dynamiska uttrycket av oscillatorer. Eftersom Mareld reporter har en kort mogning tid och hög känslighet, det gör att vi kan övervaka den snabba dynamiken i Ultradian oscillatorer. Som en fluorescerande reporter, kan luciferas reporter övervaka uttrycket dynamik av ett protein genom att smältas till genen kodning sekvens (figur 1a, figur 2E och figur 3D). Luciferase-smält genprodukter uppvisar samma uttryck, omsättning och flyttning kinetik i celler som gör endogena proteiner. Dessutom, för att övervaka promotorn aktiviteten av oscillerande genen Dll1, använde vi och luciferas, en destabiliserad luciferas reporter (figur 1a och figur 3a)23, vars halveringstid är ca 10 min20. Med hjälp av olika typer av luciferas reportrar, genererade vi transgena möss eller knackade in möss för att få stabila uttryck för reportern i NPCs under neurogenes17. För att visualisera reporter uttryck på enstaka cell nivåer i vävnads kulturen är den spridda introduktionen av reportern att föredra. Således använde vi övergående transfektion av reportern gen i NPCs via in utero elektroporation (figur 2F-H). Den luciferas reporter system har använts inom cirkadiska rytmer att övervaka de dynamiska uttrycken för klockgener under en lång period (t. ex., 1 vecka), vilket tyder på att Luciferin (D-Luciferin), substratet av Firefly luciferas enzymet, är mycket stabil och har ingen toxicitet för levande celler24,25. Vi använder vanligtvis Luciferin i koncentrationer på 1 mM i media, vilket är tillräckligt för över natten levande cell avbildning. Dessutom gör det mikroskopiska avbildnings systemet att vi kan förvärva flerdimensionella bilder, ljusa fält bilder, fluorescensbilder och kemiluminiscensbilder (figur 2F-H och figur 3E).

Med hjälp av dessa villkor visualiserade vi uttrycken för olika Ultradian-klockgener, inklusive Hes1, Ascl1, Neurog2 och Dll1 (figurerna 2 och figur 3). Representativa resultat visas i figur 3. Reportern av Dll1 promotor aktivitet uppvisade oscillerande uttryck i NPCs härrör från telencephalon av Dll1-UB-Fluc reporter möss. Den destabiliserade luciferas-reportern (figur 3A) indikerade skarp upp-och nedreglering av uttrycket för Promotorns aktivitet (figur 3B, C). I detta fall, enstaka neurala progenitorceller visas en cirka 2,5 h svängning cykel med olika amplituder under loppet av 13 h (figur 3C). Den snabba svar luciferas reporter gör det möjligt för oss att fånga överföringdynamiken i notch signalering mellan två levande celler (figur 3D-F och kompletterande film S1). Vi förberedde två typer av DNA-blandningar: (1) Hes1 promotorn reporter (pHes1-UB-Luc) och egfp Expression Vector, och (2) Dll1 protein reporter (Dll1-Luc) och mcherry Expression Vector och transfekterade dem till NPC: er separat. Sedan samlades de två typerna av celler och co-odlade för att mäta uttrycket av reportrar i levande celler. Representativa resultat visas i figur 3E, F. Angränsande EGFP positiva celler redovisade Hes1 reporter och mCherry positiva celler uttrycker Dll1 protein reporter kontaktade varandra under observation. Hes1 reporter uttryck i en grön cell verkade börja om 60 min efter två celler kontakt (figur 3E, F). Detta föreslog att tidsfördröjningen för överföring av notch signalering mellan angränsande celler var ca 1 h. Dessutom, under signalöverföring, visade Dll1 protein Expression dynamisk flyttning i en röd cell (figur 3E).

Figure 1
Figur 1: dissektion av den embryonala mus hjärnan. (A) strukturen för luciferas reportrar, Dll1 promotorn reporter och Dll1 protein reporter. Bförfarande för dissektion. (a) sidovy över ett mus embryo. (b) klipp av huvudet tillsammans med den streckade linjen. (c) ta bort epidermis och brosk från gapet mellan telencephalon och midbrain. (d) skär den omgivande vävnaden längs mittlinjen mellan höger och vänster halvklot. (e) ta bort vävnaden från mittbrytningen till båda sidor. (f) den telencephalon och mellanhjärnan efter avlägsnande av den omgivande vävnaden. (g) separera telencephalon (Tel), mellanhjärnan (mid) och lukt Bulb (OB). (h) tvärsnitt av telencephalon, som visas i prickad linje i (g). (i) ta bort hjärnhinnorna som omger ytan av telencephalon. (j) separera telencephalon i två delar: mediala och laterala delen. (k) skär gränsen av cortex och ganglieblockerande Eminence (ge). (l) Dorso-lateral del av cortex används för dissociation kultur. (C) hjärnan vid embryonal dag 14 (E14), bestående av vänster (a) och höger (b) halvklot av telencephalon och mellanhjärnan (c). Dav-halvkloten separerade från mellanhjärnan. (E) en dissekerade halvklotet av telencephalon: den ventrolaterala delen av telencephalon inklusive ganglieblockerande eminenser (d), den dorsolaterala delen av telencephalon används för dissocierade kulturer och segment kulturer (E), den mediala delen av telencephalon (f) och hjärnhinnorna täcker ytan av hjärnan (g). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: att göra kortikala skivor av den embryonala telencephalon och visualisera Dll1 proteindynamik i den kortikala slice kulturer. A) kontroll av egfp-uttrycket med hjälp av fluorescensstereoskopiskt Mikroskop. Röd pil visar regionen av cortex uttrycker EGFP. Den vänstra hjärnhalvan (a), den högra hjärnhalvan (b) och mellanhjärnan (c). (B) prickade linjer indikerar konturerna av de hjärnregioner som visas i (a). (C) dissekerade cortex av dorsolateral telencephalon. Vita pilspetsar indikerar snitt kanterna. (D) kortikala skivor av Dorso-laterala telencephalon. (E) gen strukturer av reportrar för visualisering Dll1 proteindynamik i NPCs. Den Dll1 protein reporter, Dll1-Fluc (övre) infördes i NPCs med en EGFP Expression Vector (lägre) för att övervaka morfologi och migration av celler i kortikala skivor. (F-H) Tredimensionella bilder av Bright-Field (F), GFP-uttryck (G) och Mareld (H) i den kortikala segmentet. Den mareld Imaging system får spåra uttryck av luciferas och fluorescens reporter samtidigt. Skala staplar: 200 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: representativa data för visualisering och analys av det dynamiska uttrycket av Dll1 genen i NPC Culture. (A) rapportören konstruera för visualisering Dll1 uttryck på transkriptionella nivå, med hjälp av en destabiliserad luciferas reporter (UB-luciferas, och luciferas). (B) visualisering av uttrycket av Dll1 i en enda NPC med en Mareld reporter. Siffrorna i panelen visar de högsta punkterna i oscillatoriska uttrycket av Dll1 som motsvarar siffrorna i panel c.c) en tid kurs tomt i bioluminescens dissocierade NPC visas i (B), uppvisar den dynamiska uttrycket av Dll1. (D-F) Visualisering av uttrycket av Hes1 promotorn reporter och Dll1 protein reporter uttryckt i angränsande celler. D) strukturen hos Hes1 promotorn Activity reporter (PHes1-UB-Luc) och Dll1 protein reporter (Dll1-Luc). (E och F) Den egfp positiva cell redovisade Hes1 reporter (Cell1) och mcherry positiva cell redovisade Dll1 protein reporter (Cell2) var Co-odlade och luminiscens från båda typerna av reportrar mättes. Uttrycket av Hes1 reporter i den gröna cellen (cell1) verkade börja om 60 min efter de två cellerna kontaktade. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande film S1: visualisering av uttrycket av Hes1 promotorn reporter och Dll1 protein reporter uttryckt i angränsande celler, relaterade till figur 3D-3F. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ned.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Komponenterna i notch signalering visar oscillatoriska uttryck i Synchrony under somitogenesis men av Synchrony under neurogenes, vilket leder till svårigheterna att fånga uttrycket dynamik genom statisk analys i det senare fallet. Sålunda, realtid övervakning krävs för att avslöja uttrycket dynamik av notch signalering komponenter, såsom Hes1 och Dll1. Eftersom perioderna av uttrycken för Hes1 och Dll1 svängningar är extremt korta, är cirka 2-3 h, snabb respons och instabila reportrar krävs för att övervaka deras uttrycks dynamik. För detta ändamål har vi utvecklat Mareld reporter och Imaging system. Den mareld reporter luciferas visar snabb mognad kinetik och hög känslighet för att spåra den snabba omsättningen av sådana cykliska genuttryck. Den snabba omsättningen av reportrar leder till mycket svaga signaler genereras. För att upptäcka sådana svaga signaler från Mareld reportrar använder vi ett optimerat bildsystem för Mareld, inklusive en hög känslighet, vattenkyld CCD-kamera med en ultra-låg avläsning hastighet (50 kHz), vilket minskar bullret till ett minimum. Dessutom gör ett objektiv med hög numerisk bländare (N.A.) det möjligt för oss att samla in det ljus som frigörs från den destabiliserade luciferas-reportern till fullo. För att få en högre känslighet använder vi vanligtvis högre Binning (t. ex. 2 x 2, 4 x 4, 8 x 8) och håller slutaren att öppna under en lång tid (t. ex. 5-20 min). Eftersom signalen från luciferas reportrar är extremt svag, störningar av ljus från miljön utgör också ett problem i att upptäcka den svaga signalen: således måste Mikroskop rummet vara helt mörkt. Detta system gör det möjligt för oss att mäta dynamiska uttryck av Hes1 och Dll1 gener i NPCs i både transkriptionella och proteinnivåer (figur 3). Dessutom kan vi visualisera proteindynamiken i intracellulära flyttning med luciferas smält protein reportrar. Dessutom, med hjälp av snabb respons luciferas reporter, kan vi fånga överföringdynamiken i notch signalering och mäta tidsfördröjningen för signalöverföring mellan två levande celler (figur 3D-F och kompletterande film S1). Dessutom gör kombinationen av promotorn reporter (UB-luciferase reporter) och protein reporter (luciferase fusion) av en enda gen att vi kan mäta tidsfördröjningen mellan transkription och översättning av genen. På detta sätt flera Imaging av olika typer av luminiscens reportrar och fluorescens reporter finns att mäta tidsfördröjning/hastighet för biokemiska reaktioner.

Real tidsövervakning av genuttryck vid enkel cells upplösning har avslöjat att det finns variationer i uttrycksdynamiken hos samma gen. Vissa celler uttrycker Dll1/Neurog2 i oscillerande sätt, men andra visar ihållande mönster. Dessutom inducerar olika uttryck dynamik (oscillatoriska kontra stadig) olika utgångar i tillståndet av celler. Vad som verkar vara tydligt är att olika uttrycks dynamik påverkar cell beteenden på olika sätt, vilket tyder på att uttrycket Dynamics kodar mer information21,22,26,27,28,29,30,31,32. De statiska analyserna kan inte fånga dynamiken i genuttryck, och realtidsanalyser krävs för att förstå biologiska fenomen för att avslöja uttrycksdynamiken i cellulära händelser. Den strategi som vi introducerar här kan övervaka dynamiken i Ultradian oscillatorer under neurala utveckling vid hög temporala upplösning. Med denna metod fann vi att många fler gener uttrycks dynamiskt än vi tidigare trott, och vi kan spåra inte bara dynamiken i proteinuttryck utan också dynamiken i protein lokalisering i cellen vid hög temporala upplösning. Sådana dynamiska uttrycksmönster kan ha biologiska signifikanser som ännu inte har klarlagts.

Bioluminescence reportrar har en stor fördel i temporal upplösning och låg toxicitet för levande celler jämfört med fluorescensreportrar33. Men i motsats till färgvariationer i fluorescerande reportrar, det finns bara ett fåtal färger i Mareld reportrar, införande av en begränsning av antalet gener som kan övervakas samtidigt. Ändå, ökande antal variabla luciferas isoleras och klonas från olika varelser34,35, och med hjälp av en sådan mängd av luciferases, vi kommer att kunna samtidigt spåra flera gen uttrycks dynamik i en enda cell vid hög temporala upplösning. Den molekylära storleken på Firefly luciferas är större än fluorescensreportrar, som uppvisar vissa svårigheter med att konstruera reporter-smält proteiner för att övervaka proteindynamiken, men nyligen har en ny, mindre och ljusare luciferas klonas36, vilket skulle göra det möjligt för oss att visualisera proteindynamiken lättare än någonsin. Ett växande antal rapporter har nyligen visat olika typer av dynamik i genexpression och proteintranslokalisering i olika biologiska händelser21,22,26,27,28,29,30,31,32. Analyser av sådan dynamik i spatiotemporal reglering med hjälp av ett realtids övervakningssystem skulle bli allt viktigare för att fånga de faktiska cellerna och avslöja regleringen av cellulära system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga motstridiga ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi tackar Yumiko Iwamoto för att stödja produktionen av videon. Vi är också tacksamma för att Akihiro Isomura för diskussion och stöd för bildanalys, Hitoshi Miyachi för tekniska stöd för generering av transgena djur, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus medicinsk vetenskap), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) och OUIN kunitaki (Andor Japan) för teknisk support och diskussioner om Mareld Imaging system. Detta arbete stöddes av kärnforskning för Evolutionell vetenskap och teknik (JPMJCR12W2) (R.K.), Grant-in-Aid för vetenskaplig forskning om innovativa områden (MEXT 24116705 för H.S. och MEXT 16H06480 för R.K.), Grant-in-Aid för vetenskaplig forskning (C) (JSPS 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. och H.S.), och plattform för dynamiska förhållningssätt till levande system från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik, Japan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioluminescence Imaging System
Chilled water circulator (chiller) Julabo Model: F12-ED
Cooled CCD camera Andor Technology Model: iKon-M 934
Incubator system TOKAI HIT Model: INU-ONICS
Inverted microscope Olympus Model: IX81
Inverted microscope Olympus Model: IX83
LED illumination device CoolLED Model: pE1
MetaMorph MOLECULAR DEVICES Model: 40000
Mix gas controller Tokken Model: TK-MIGM OLO2
Objective lens Olympus Model: UPLFLN 40X O
Preparations for Dissection
Dissection microscope Nikon Model: SMZ-2B
Fluorescence stereoscopic microscope Leica Model: MZ16FA
Fine forceps DUMONT INOX No.5
Scissors, Micro scissors
Forceps
Ring-shaped forceps
10-cm plastic petri dish greiner 664160-013
35-mm plastic petri dish greiner 627160
PBS Nacalai Tesque 14249-24
DMEM/F12 invitrogen 11039-021
Reagents for NPC dissociation culture
B27 supplement invitrogen 12587-010
bFGF invitrogen 13256-029 Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS
D-luciferin Nacalai Tesque 01493-85 Stock solution: 100mM in 0.9% saline
DNase Worthington Biochemical Corporation LK003172 Stock solution: 1000U/ml in EBSS
EBSS Worthington Biochemical Corporation LK003188
Glass bottom dish IWAKI 3910-035
N2 supplement (100x) invitrogen 17502-048
N-acetyl-cystein Sigma A-9165-25G
Papain Worthington Biochemical Corporation LK003178 Stock solution: 7U/ml in EBSS
Penicillin/Streptmycine Nacalai Tesque 09367-34
Poly-L-lysine Sigma P-6281 40 mg/ml in DW
Preparations for in utero electroporation
50-ml syringe TERUMO 181228T
Electrode Neppagene 7-mm
Electroporator Neppagene CUY21 EDIT
Forceps
Gauzes Kawamoto co. 7161
Micro capillary Made in-house
PBS Nacalai Tesque 14249-24
Pentbarbital Kyoritsuseiyaku Somnopentyl
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Suture needle Akiyama MEDICAL MFG. CO F17-40B2
Xylazine Bayer Seractal
Preparations for Slice culture
10-cm plastic petri dish greiner 664160-013
35-mm plastic petri dish greiner 627160
Culture insert Millipore PICM01250
DMEM/F12 invitrogen 11039-021
Fetal Bovine Serum Sigma 172012-500ML
Fine forceps DUMONT INOX No.5
Forceps
Horse Serum Gibco 16050-122
Micro surgical knife Alcon 19 Gauge V-Lance
Multi-gas incubator Panasonic MCO-5MUV-PJ
N2/B27 media Made in-house ref. NPC dissociatioin culture
PBS Nacalai Tesque 14249-24
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Silicon rubber cutting board Made in-house

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
  2. Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Paridaen, J. T., Huttner, W. B. Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system. EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).
  5. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  6. Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. Notch signaling in vertebrate neural development. Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).
  7. Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks. Neuron. 69, 840-855 (2011).
  8. Bray, S. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
  9. Bray, S. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).
  10. Kopan, R., Ilagan, M. X. G. The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism. Cell. 137, 216-233 (2009).
  11. Ishibashi, M., et al. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).
  12. Ohtsuka, T., et al. Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation. The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).
  13. Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain. Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).
  14. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis. Development. 134, 1243-1251 (2007).
  15. Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors. Neuron. 58, 52-64 (2008).
  16. Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
  17. Shimojo, H., et al. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes and Development. 30, 102-116 (2016).
  18. Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
  19. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition. Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).
  20. Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).
  21. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342, 1193-1200 (2013).
  22. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152, 945-956 (2013).
  23. Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice. Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).
  24. Yamaguchi, S., et al. Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
  25. Kiyohara, Y. B., et al. The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).
  26. Behar, M., Hoffmann, A. Understanding the temporal codes of intra-cellular signals. Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).
  27. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
  28. Nelson, D. E., et al. Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression. Science. 306, 704-708 (2004).
  29. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
  30. Hansen, A. S., O'Shea, E. K. Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression. Molecular Systems Biology. 9, 704 (2014).
  31. Hansen, A. S., O'Shea, E. K. cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale. Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).
  32. Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo. Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).
  33. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: Progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
  34. Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay. Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).
  35. Nakajima, Y., et al. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, (2010).
  36. Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12, (2013).

Tags

Utvecklingsbiologi real tids avbildning bioluminescens Luciferase Oscillation notch signalering neurogenes
Real tid bioluminescence avbildning av notch signalering dynamik under Murine neurogenes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shimojo, H., Kageyama, R. Real-timeMore

Shimojo, H., Kageyama, R. Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis. J. Vis. Exp. (154), e60455, doi:10.3791/60455 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter