Summary
Även om avföringskulturen för Campylobacter är oprecis, anses det fortfarande vara guldmyntfoten för identifiering. Metoder för att bestämma gränsen för upptäckt och överlevnad i transportmedia av C. jejuni i mänsklig avföring beskrivs och jämförs med en ny immunoassay med bättre noggrannhet.
Abstract
En kultur från mänsklig avföring för diagnos av Campylobacter-baseradtarmsjukdom tar flera dagar, en väntan som beskattar läkarens och patientens mod. En kultur är också benägna att falska negativa resultat från slumpmässig förlust av lönsamhet under provhantering, överväxt av andra fekal flora, och dålig tillväxt av flera patogena Campylobacter arter på traditionella medier. Dessa problem kan förvirra kliniska beslut om patientbehandling och har begränsat området från att svara på grundläggande frågor om Campylobacter tillväxt och infektioner. Vi beskriver ett förfarande som uppskattar den nedre gränsen för bakterienummer som kan detekteras med en kultur och en metod för att kvantifiera överlevnad c. jejuni i media som används för transport av denna bräckliga organism. Att känna till denna information, blir det möjligt att fastställa kliniskt relevanta detektionströsklar för diagnostiska tester och ta itu med ostuderade frågor om huruvida icke-symptomatisk kolonisering är utbredd, om samtidig infektion med andra enteric patogener är vanligt, eller om bakteriell belastning korrelerar med symtom eller allvarliga och sviter. Studien inkluderade också testning av 1.552 prospektivt insamlade patienten diarré fekal prover som ursprungligen klassificerades av konventionell kultur och ytterligare testas av ett nytt enzym immunoassay. Positiva och diskreta exemplar kontrollerades sedan av fyra molekylära metoder för att tilldela sann positiv eller sann negativ status. De fem icke-kulturmetoderna visade fullständig enighet om alla 48 positiva och åtskilda exemplar, medan kulturen felidentifierade 14 (28 %). De exemplar som felaktigt identifierades av kultur ingår 13 falska negativa och 1 falskt positivt prov. Detta grundläggande protokoll kan användas med flera Campylobacter spp. och kommer att tillåta antalet Campylobacter bakterier som producerar symtom på gastroenterit hos människor som skall fastställas och för prevalensen som skall uppdateras.
Introduction
Usa Centers for Disease Control (CDC) publicerade nyligen att Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) övervakningsprogram rapporterade 9.723 fall av laboratoriediagnostiserade Campylobacter infektioner i 20181. Det är en 12-procentig ökning av Campylobacters fallrapporter över 2015−20171. Över hela världen, Campylobacter spp. är bland de vanligaste bakteriella tarminfektioner2. Ändå misstänks antalet Campylobacter-baseradetarmsjukdomar som uppstår varje år vara underrapporterade3. Denna underskattning är förutsägbar eftersom de flesta patienter kan återhämta sig med endast måttligt obehag och ingen medicinsk behandling. Men för patienter med allvarligare symtom eller som löper högre risk för allvarlig sjukdom, och som sedan söker vård, avföring kultur är den vanligaste metoden för att bedöma om Campylobacter är den patogen som orsakar deras nöd4.
För Campylobacter spp., avföring kultur är särskilt besvärligt. De vanligaste patogena organismerna, C. jejuni, C. coli, C. upsaliensis och C. lari, är mikroaerofila5. Detta innebär att bakterierna kommer att dö slumpmässigt, okänd hastighet när de utsätts för luft. Tiden mellan provinsamling och kulturupplägg blir därmed en okontrollerad variabel i förmågan att upptäcka livskraftiga Campylobacter spp. av kultur.
För direkt kultur av fekal prover, den långsamma tillväxten av Campylobacter är också ett problem. Campylobacter kolonier är mycket små även efter 48 h inkubation och kan lätt täckas av konkurrerande organismer i fekal matris. Plattor som innehåller antibiotika som de flesta stammar av C. jejuni och C. coli är resistenta används ofta, eftersom antibiotika hämmar tillväxten av många (men inte alla) konkurrerande fekalbakterier, vilket möjliggör bättre visualisering av Campylobacter kolonier6. Men andra Campylobacter arter som C. lari och C. upsaliensis är känsliga för några av dessa antibiotika, och antingen växa dåligt eller inte alls. Detta bidrar till underrapportering av Campylobacter infektioner från dessa antibiotikakänsliga arter7.
Det finns en tredje anledning till varför en kultur för Campylobacter kan vara felaktig. Bakterierna, när de betonas, kan förbli livskraftiga men kan bli "icke-odlingsbara"8. Detta innebär per definition att kulturen inte kommer att upptäcka de bakterier som finns i provet. Hur ofta detta inträffar är inte känt8.
Med tanke på dessa potentiella problem med kultur, använde vi flera jämförelse referensmetoder så att felaktiga kulturresultat inte gjorde en enda jämförelse analys verkar felaktig9. De odlingsmetoder som användes (t.ex. Campylobacter-selektivaplattor, transportmedium, gasgenererande påsar) valdes eftersom de används i stor utsträckning i kliniska laboratorier för avföringsprovkultur10.
De kulturprotokoll som beskrivs här utvecklades eftersom det lägsta antalet Campylobacter jejuni som kunde upptäckas av kultur i mänsklig avföring inte var känt. Även uppskattningar har publicerats för antal koloni bildande enheter (CFU) som finns i fjäderfä avföring11,dessa resultat kan inte likställas med mänsklig avföring, som Campylobacter spp. är commensals i kycklingar, och inte orsaka diarré. Denna grundläggande information behövs för att fastställa antalet Campylobacter bakterier som kommer att producera symtom på gastroenterit hos människor och att jämföra virulens mellan stammar eller arter.
Protocol
1. Uppräkning av Campylobacter i krystat mänskliga fekalprover
OBS: Alla steg utförs med steril teknik och material på en disponibel skyddsplåt i en desinficerad laminär flödessäkerhetshuv.
VARNING: Live Campylobacter är smittsam och kan orsaka sjukdom, inklusive diarré. Använd handskar, en labbrock och skyddsglasögon när du hanterar bakterier. Munrör. Kassera allt material som har kontaktat bakterier i rätt biohazard behållare.
- Tillväxt av bakteriekultur
- Få stammar av C. jejuni (ATCC-33560) eller C. coli (ATCC 33559)(Tabell över material)som torkade eller frysta kulturer och rehydrera eller tina bakterier enligt tillverkarens anvisningar. Strimla rehydrerade bakterier på en Campylobacter-specifikagar platta för att starta kulturen. Inkubera plattan 48 h vid 37 °C i en anaerob burk som innehåller en mikroaerob atmosfär gasgenererande påse.
- Följande dag, förbereda 100 ml brain-heart infusion (BHI) tillväxt buljong som innehåller 0,5% trypticase, 0,5% proteas pepton, 0,0125% natriumpyruvat och 0,0125% natriumbisulfit.
- Förminska BHI-buljongen genom att täcka kolven löst och placera den i en anaerob burk med en påse som kommer att producera en mikroaerofil miljö. Låt buljongen prereduceöver natt vid 37 °C. På samma sätt prereduce Campylobacter-specifikaplattor som ska användas för koloni räknas i steg 1.1.10 och 1.2.2.
- Eftersom Campylobacter är känsliga för luft, samla alla material innan inokulera buljong och inte söla medan du hanterar kulturer. När du är redo att vaccinera, tillsätt fetala nötkreatur serum (FBS) till prereducerad buljong till 4% av den totala volymen. Behåll 1 ml förminskad buljong för att fungera som ett ämne i mätningar av optisk densitet vid 600 nm (OD600).
- Ta bort 3 ml prereducerad buljong som innehåller FBS och använd buljong för att skrapa startplattan som innehåller Campylobacter-kulturen. Skrapa försiktigt plattan med en inokulerande slinga och överför sedan bakterieslammet till ett sterilt rör.
- Inokulera 100 ml prereducerad buljong med cirka 3 ml bakteriell slam och inkubera med måttlig skakning vid 115 varv/min vid 37 °C i en anaerob burk som innehåller en gasgenererande påse.
- Övervaka tillväxten av bakterierna spektrofotometriskt genom grumlighet vid OD600. Använd den reserverade buljongen som tom. Om den anaeroba burken öppnas, byt ut den gasgenererande påsen.
- Stoppa buljonginkubationstiden efter 48−72 h eller innan OD600-värdet når ~0,4.
OBS: Denna OD600 motsvarar vanligtvis 107 till 108 CFU/ ml. Se tabell 1 för typiska resultat. - För att fastställa antalet bakterier i ren lagerkultur, utföra åtta 10-faldigutspädningsserie på 100 μL buljong i 900 μL utspädningsbuffert (Tabell över material). Efter det att buljongen på 100 μL har avlägsnats för den första utspädningen, returnerar kolven till anaerob burk med färsk gasgenererande dospåse för att invänta användning i tillsatt fekal pool.
- Använd sterila pläteringspärlor för att sprida 100 μL av10-5 till 10-7 utspädningar på dubbla prereducerad Campylobacter-specifikaplattor från steg 1.1.3. Etikettplattor med utspädning som används, placera dem i en andra anaerob burk med gasgenererande påse och inkubera vid 37 °C för 48−72 h.
OBS: Se figur 1 och figur 2 för utspädningsschema och fotografier av kolonier. - Efter tillväxt, välj plattan med mellan 30−300 kolonier att räkna. Utnyttja räkningarna för att bestämma CFU/ mL för beståndet buljong kultur med hjälp av ekvation 1:
CFU/mL i lager = Genomsnittligt antal kolonier på valda (duplicerade) analysplattor ÷ (mL-pläterad x utspädning av plattan) [Ekvation 1]
- Beredning och uppräkning av krystat kliniska fekalprover
- Omedelbart efter att plattorna för analytiska värden bereds i steg 1.1.10, gör en andra uppsättning lagerbuljongspädningar genom att förbereda 10 seriella 2-faldiga utspädningar från buljongbuljongen och en Campylobacter-negativ fekal pool (NFP). Till exempel förbereda den första utspädningen genom att blanda lika volymer buljong och NFP (t.ex. 0,1 ml vardera) och göra efterföljande utspädningar genom att överföra en angiven volym buljong och NFP-blandning till ett rör med en lika utsedd volym NFP. Tillsätt en kontrollplatta med buljong som innehåller ingen Campylobacter läggas till fekal poolen för att identifiera icke-Campylobacter kolonier.
- Gör NFP från avidentifierade, diarré patient övervakning exemplar eller friska givare avföring som tidigare har testats och visat sig vara Campylobacter-negativmed metoder såsom en Campylobacter enzym immunoassay och 16S rRNA qPCR.
- T-streak 10 μL av varje Campylobacter/avföringutspädning på dubbla prereducerad Campylobacter-specifikaagarplattor. Placera plattori den anaeroba burken med en gasgenererande påse och inkubera vid 37 °C för 48 ± 2 h.
- Undersök de streckade plattorna visuellt för kolonier som liknar dem från rena Campylobacter kulturer.
Obs: Den tredje kvadranten är vanligtvis där dessa kommer att hittas. Se figur 1 och figur 2 för utspädningsschema och bilder av kolonistorlek, färg och morfologi. - Välj flera Campylobacter-liknandekolonier och Gram fläck. Använda mikroskopi med en oljenedsänkning lins, undersöka ett tunt streckat område för gramnegativa böjda, spiral eller cigarrformade små bakterier.
OBS: Campylobacter är gramnegativa och kräver grundläggande fuchsin som en motfläck (i stället för den typiska safranin) som ska visualiseras korrekt. Klassiska mås-bevingade bakterier kan ses men är inte ett krav. Se figur 2 för representativ mikrograf. - Om någon av de duplikatplattorna vid en viss utspädning har 1 eller fler Campylobacter kolonier närvarande, anser att utspädning fekal-kultur positiva.
- Tänk på den sista utspädningen som innehåller en synlig Campylobacter-liknandegramnegativ koloni gränsen för kulturdetektering. Använd ekvation 2 för att beräkna CFU/ml för den positiva utspädningen i det kliniska fekalprovet:
CFU/mL i fekalt prov = Analytisk CFU/ml ÷ Utspädning med sista positiva kolonin [Ekvation 2]
Se tabell 2 för typiska resultat.
- Omedelbart efter att plattorna för analytiska värden bereds i steg 1.1.10, gör en andra uppsättning lagerbuljongspädningar genom att förbereda 10 seriella 2-faldiga utspädningar från buljongbuljongen och en Campylobacter-negativ fekal pool (NFP). Till exempel förbereda den första utspädningen genom att blanda lika volymer buljong och NFP (t.ex. 0,1 ml vardera) och göra efterföljande utspädningar genom att överföra en angiven volym buljong och NFP-blandning till ett rör med en lika utsedd volym NFP. Tillsätt en kontrollplatta med buljong som innehåller ingen Campylobacter läggas till fekal poolen för att identifiera icke-Campylobacter kolonier.
2. LönsamhetSbestämning av Campylobacter lagras i transportmedia
- Blanda 1 ml Campylobacter buljongkultur (steg 1.1.8) med 1 ml NFP och förbered 10 dubbla dubbla seriella utspädningar i NFP. Späd ytterligare varje utspädning ytterligare 1:4 i Cary-Blair media, precis som ett kliniskt prov som bereds i transportmedia behandlas.
- Förvara de 20 utspädningsrören och en negativ kontroll i Cary-Blair-medium i utjämnade rör vid 2−8 °C för 96 timmar och räkna kolonier från varje utspädning som inträffar vid tiden noll och var 24:e gång. För koloniräkning, prova buljongen:fekalrör och setup fekal kultur för koloniräkning av varje utspädning, i duplicera.
- Varje dag platta 10 μL delar av fekal utspädningar på Campylobacter-selektivagar och inkubera vid 37 °C för 48 h, som beskrivs ovan i steg 1.1.9−1.2.7.
- Utför ett samtidig analytiskt antal av det ursprungliga bakteriebeståndet (från steg 1.1.8 eller ett nyodlat buljonglager) enligt beskrivningen ovan (steg 1.1.9−1.1.11). Beräkna CFU/ml för det ursprungliga bakteriebeståndet (Ekvation 1) för att beräkna koncentrationen av bakterier i transportmedieprovet och dess utspädningar (Ekvation 2).
3. Icke-kultur analyser för att kontrollera kulturresultat
- Använd en enzymimmunoanalys (MA) som ger minimala falska positiva resultat12 och utför enligt anvisningarna för paketskär för att verifiera odlingsresultaten.
- Använd en molekylär analys som kan upptäcka 16S rRNA genen eller annan gen av ett brett spektrum av Campylobacter arter13. Bekräfta att den molekylära analysen reagerar med arter som C. upsaliensis eller C. lari som växer dåligt på standard antibiotikainnehållande agar14. Följ tillverkarens anvisningar för extraktion av DNA från fekalprover och utför testet.
OBS: Dubbelriktad DNA-sekvensering av 16S-ampliconen kan användas för att bekräfta arten av Campylobacter i ett positivt prov. Artspecifik PCR (se tabell 3 för målgener) kan också användas för att identifiera arter som förekommer i diskreta eller positiva exemplar15.
Representative Results
Att identifiera Campylobacter spp. kolonier bland konkurrerande fekal flora kräver skarp syn och betydande bedömning. Det lägsta antalet kolonier som kan upptäckas av kultur har inte studerats, även om prover från patienter har uppskattats att hysa 106−109 CFU/ml16,17. Patientprover kan dock inte användas kvantitativt eftersom det inte finns någon oberoende metod för att fastställa korrekta bakterienummer. För att övervinna denna begränsning görs två samtidiga mätningar med ett bakterielager. Ett test används för visuell detektion av Campylobacter kolonier från seriella utspädningar av beståndet bakterier i en fekal matris, simulera kliniska exemplar; den andra används analytiskt för att kvantifiera cfu/ml som finns i den bakterielagerkultur som används för tillsatt (figur 2A).
Detektionströsklarna för Campylobacter kommer inte att definieras värden. Detta är att vänta eftersom varje fekal matris är komplex och unik, och tillväxten av bakterier är varierande. En viktig parameter för framgång är att identifiera de exakta storlekskolonierna bland den konkurrerande fekalfloran. En representativ platta av spetsad avföringsodling visas i figur 2C och figur 2D. Den negativa kontrollplattan utan tillsatt Campylobacter är viktig för att identifiera annan fekal flora. Gram färgning många kandidater tränar också ögat att skilja rätt blanka kolonier och den mellanliggande rosa färgen på fuchsin-färgade gramnegativa bakterier och bekräftar morfologi av bakterierna i de valda kolonierna (figur 2B). Sju oberoende experiment utfördes, med 5 C. jejuni och 2 C. coli buljonger, och gav trösklar som överlappade och sträckte sig från 0,3−5 x 106 CFU/ml. Se tabell 2 för typiska data. Detektionsgränserna i genomsnitt 2 x 106 för C. jejuni och 1,2 x 106 CFU/ml för C. coli. Detta tyder på att kulturen sannolikt kan upptäcka ~ 1−2 x 106C. jejuni eller C. coli per gram fekal exemplar på standard antibiotika-innehållande Campylobacter-specifikagar som används av många kliniska laboratorier. Det finns flera specialiserade agarer med olika antibiotika som kan ge olika trösklar för koloniupptäckt. De metoder som beskrivs här bör uppmuntra mer kvantitativa och jämförande studier för att förbättra kulturens noggrannhet och bredda mångsidigheten hos nya medier. Till exempel räknades 152 kolonier på de första 10-5 plattan och 144 kolonier på den andra 10-5 plattan. Genomsnittet mellan de två plattorna är 148 kolonier. Plattorna vaccinerades med 0,1 ml (100 μL) av 10-5 utspädning, vilket genom ekvation 1 motsvarar 148 x 106 (14,8 x 107) CFU/mL i den rena kulturen lager. När fekal utspädningar gjordes, var kulturen spetsadi negativ fekal pool på en 1:1 förhållande. Därför, genom ekvation 2, den första punkten (plattan "a") på fekal kurva motsvarar 14,8 x 107 dividerat med 2 och motsvarar 7,4 x 107 CFU/ml. Detta "a" rör används för att göra 9 ytterligare utspädningar. I figur 1, den sista utspädningen med en synlig gram-negativ koloni med Campylobacter-liknandemorfologi är på tallrik "g". Detta motsvarar 1,1 x 106 CFU/ml för den fekalodlade odlingströskeln för detektion i det här exemplet.
Även om bibehållen lönsamhet är nyckeln till kulturens noggrannhet, är det problematiskt att behålla lönsamheten hos Campylobacter spp. under hantering och leverans av prover från patienter till kliniker till referenslaboratorier. Typisk förvaring är att kyla prover i vanliga täckta rör med luftexponering och utan speciell atmosfär. Prover i transportmedia (även kallade konserverade prover) tros ha bättre överlevnad, men det finns få rapporter som ger kvantitativa data18.
Kombinationen av analytiska och krydda provmetoder som visas ovan användes igen för att få lönsamhet och överlevnadstid uppskattningar av C. jejuni i transportmedia. En bakteriell lagerbuljong användes för att förbereda tio dubbla 2-faldiga till 1024-faldiga provutspädningar i fekal matris. Den ursprungliga buljongen konstaterades av analysräknandet att ha en koncentration på 4,8 x 107 CFU/ml. På plattor gjorda på dag 0 upptäcktes C. jejuni (2 dagar senare) på plattan strimmig med 32-faldig utspädning, motsvarande 1,5 x 106 CFU/ml. Men på plattorna efter kylning av Cary Blair fekal prov i 24 timmar, endast 2-faldig utspädning (motsvarande 2,4 x 107 CFU /ml) växte synliga kolonier. Ingen ytterligare förlust av lönsamhet sågs ut till 96 timmar, när studien stoppades. Denna förlust av lönsamhet motsvarar en 16-faldig (94%) förlust av kulturerbara organismer på mindre än 24 timmar och visar att även med kylning, avföring i Cary Blair medium med mindre än 107 CFU/ ml C. jejuni kan missas av kultur.
I motsats till kulturresultaten upptäckte MEKT förekomsten av C. jejuni vid 256-faldig utspädning vid den första tidpunkten och under hela 4 dagars testperiod. C. jejuni detektionströskeln för denna MADD med hjälp av spetsiga fekalprover är 8,4 x 104 CFU/ml. Denna tröskel är lägre än fekal kultur och möjliggör mer känslig och stabil upptäckt av C. jejuni.
För att testa förmågan hos kulturen att upptäcka Campylobacter spp. i en verklig klinisk miljö, 1.552 kliniska avföring exemplar kännetecknades av 6 förfaranden: fekal kultur, en ny immunoassay för Campylobacter spp., och 4 molekylära metoder. Alla prover samlades in och klassificerades ursprungligen av konventionell kultur vid 3 laboratorier i USA, och dubbelkollades sedan av MA. Alla kulturpositiva eller MA/kultur-discrepant exemplar kontrollerades sedan av de molekylära metoderna12. Exemplar tilldelades en verkligt positiv eller sann negativ status baserat på resultaten av de 5 icke-odlingsmetoderna. De fem icke-kulturmetoderna visade fullständig enighet om alla 48 positiva och åtskilda exemplar, medan kultur felidentifierade 14 (28 %). De exemplar som felaktigt identifierades av kultur ingår 13 falska negativa och 1 falskt positivt prov.
Figur 1: System för samtidig beredning av analytiska och spetsade fekalprover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Identifiering av C. jejunikolonier från rena och fekala kulturer. (A) Fotografi av C. jejuni kolonier från ren bakteriekultur efter 72 timmar inkubation. (B)Gramfläck av C. jejuni från ren bakteriekultur, oljenedsänkning 400x förstoring. (C) Fotografi av C. jejuni-positivspetsad fekal kultur efter 48 h inkubation. (D)Förstorat område i rutan i(C),10x förstoring. Vita pilar indikerar pin-point storlek gramnegativa C. jejuni kolonier. Den svarta pilspetsen indikerar en koloni som är något större, gram-positiv, och inte C. jejuni. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Kulturer | OD600 @ T0 | OD600 @ T Final1 | Slutlig CFU/ml |
| C. jejuni | 0.146 | 0.321 | 1,28 x 107 |
| C. coli (c. coli) | 0.245 | 0.508 | 4,50 x 108 |
Tabell 1: Typisk tillväxt och CFU/mL av C. jejuni- och C. coli-aktier. 1C. jejuni kultur stoppades efter 48 h inkubation. C. coli kultur stoppades efter 54 h av inkubation.
| Utspädningsrör för spetsat fekalprov | Antal Campylobacter-liknande kolonier | Antal gramnegativa kolonier1 | Kultur positivt? | Beräknat CFU/ml av spetsat prov | |
| C. jejuni (1,28 x 108 CFU/ml lager) | (2-faldig) a | Tät | nd2 | Ja | 6,40 x 107 |
| (4 gånger) b | 20+ | Nd | Ja | 3,20 x 107 | |
| (8 gånger) c | 4-10 | Nd | Ja | 1,60 x 107 | |
| (16 gånger) d | Nd | Ja | 8,00 x 106 | ||
| (32 gånger) e | Nd | Ja | 4,00 x 106 | ||
| (64 gånger) f | 1-3 | 1 av 2 | Ja | 2,00 x 106 | |
| (128 gånger) g | 2 av 3 | Ja | 1,00 x 106 | ||
| 3(256 gånger) h | 1 av 2 | Ja | 5,00 x 105 | ||
| (512 gånger) i | 0 av 1 | Nej | 2,50 x 105 | ||
| (1024 gånger) j | 0 | Nd | Nej | Nfp | |
| C. coli (4,50 x 108 CFU/ml lager) | (2-faldig) a | Tät | Nd | Ja | 2,25 x 108 |
| (4 gånger) b | Nd | Ja | 1,13 x 108 | ||
| (8 gånger) c | 50+ | Nd | Ja | 5,63 x 107 | |
| (16 gånger) d | 30+ | Nd | Ja | 2,81 x 107 | |
| (32 gånger) e | 10+ | Nd | Ja | 1,41 x 107 | |
| (64 gånger) f | 3-8 | Nd | Ja | 7,03 x 106 | |
| (128 gånger) g | Nd | Ja | 3,52 x 106 | ||
| 3(256 gånger) h | 1-3 | 1 av 3 | Ja | 1,76 x 106 | |
| (512 gånger) i | 0 av 1 | Nej | 8,79 x 105 | ||
| (1024 gånger) j | 0 | Nd | Nej | Nfp |
Tabell 2: Typiskt antal kolonier på plattor av spetsiga fekalprover. 1 Gram negationkolonier bland Campylobacter-gilla kolonier, 2nd = inte beslutsam, 3Data i fetstil indikerar sist realitetutspädning.
| Arter | Genmål |
| C. jejuni | Hipo |
| C. coli (c. coli) | cadF (cadF) |
| C. upsaliensis | cpn60 (cpn60) |
| C. lari (c. lari) | cpn60 (cpn60) |
| C. helveticus | cpn60 (cpn60) |
| C. foster | cpn60 (cpn60) |
| C. hyointestinalis | cpn60 (cpn60) |
| C. concisus | cpn60 (cpn60) |
Tabell 3: Gener som är användbara för detektion av enskilda Campylobacter arter qPCR.
Discussion
De kulturmetoder som beskrivs här bygger på enkla, allmänt använda tekniker och material som finns i de flesta laboratorier10. Det är kombinationen av analytiska och krystat prover som ger ny information om en kliniskt relevant detektionströskel för fekalkulturer. Dessutom stärker bedömningen av kulturresultat med 5 separata analyser de slutsatser som Campylobacter fekal kultur misidentifierar en betydande del av patientens exemplar. MEN och molekylära analyser är användbara som kontroller eftersom de är baserade på en annan princip (antigen interaktion med antikroppar vs DNA förstärkning) och, viktigast av allt, inte förlita sig på livskraft bakterier. Observera att MA-analysen som används för dessa studier är väl validerad och har visat sig helt överens med 4 molekylära tester12.
Kultur av Campylobacter spp. är särskilt besvärande, med känslighet rapporteras variera ror från 60−76%19,20, och så tydligt från dess ~ 30% graden av underlåtenhet att upptäcka sant-positiva exemplar här. Personalen kan förvänta sig att kontroll Av MA och molekylära tester ofta kommer att ge positiva resultat när kulturdata är negativa.
Det mest kritiska steget i protokollet är identifiering av pin-point kolonier bland konkurrerande fekal flora. Det är inte ovanligt, eftersom utspädningar nära detektionströskeln, har alternerande noll- och icke-nollkoloniräkningsuppskattningar (t.ex. 2, 0, 1, 0, 0). Det är viktigt att inse att kulturtrösklar kommer att vara en rad koncentrationer, inte en specifik CFU/ ml. Ändå jämför uppskattningen av ~ 1 x 106 CFU / ml avföring som en lägre gräns för kultur upptäckt väl med rapporter om att infekterade människor skjul 106 till 109Campylobacter per gram avföring21. Förändringar i antibiotika eller agar plattor och variationer oundvikliga i enskilda fekal prover kommer utan tvekan att ändra tröskelvärden. Detta protokoll bör möjliggöra förbättringar i tillväxtmedier.
Denna första information om en gräns för odlingsdetektering gör det möjligt att fastställa kliniskt relevanta trösklar för diagnostiska tester, och lägger den mikrobiologiska grund som behövs för att ta itu med ostuderade frågor om icke-symtomatisk vagn22,23 av Campylobacter, eller om bakteriell belastning korrelerar med symtom eller allvarliga sviter.
Disclosures
Författarna är anställda vid TECHLAB, Inc. som producerar QUIK CHEK™ kit som används som jämförelsepartner i den här artikeln.
Acknowledgments
Dessa studier finansierades av TECHLAB, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anaerobic 3.5L Jar | Thermo Fisher | HP0031A | |
| AnaeroGRO Campylobacter Selective Agar | Hardy Diagnostics | AG701 | |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD Biosciences | 237500 | |
| Bacto Protease Peptone | Life Technologies Corp | 211684 | |
| Basic Fuchsin | Fisher Scientific | B12544 | |
| BBL Trypticase Peptone | Life Technologies Corp | 211921 | |
| C. coli Type strain | ATCC | 33559 | |
| C. jejuni Type strain | ATCC | 33560 | |
| CampyGen gas generating system sachet | Thermo Fisher | CN0025A | |
| Campylobacter QUIK CHEK | TechLab, Inc. | T5047 / T31025 | |
| Cary-Blair transport medium | Fisher Scientific | 23-005-47 | |
| Coli Roller Sterile plating beads | Millipore Sigma | 71013 | |
| Dilution Buffer | Anaerobe Systems | AS-908 | |
| Fetal bovine serum | Equitech-Bio, Inc | SFBM30 | |
| Sodium bisulfite | Sigma-Aldrich | 243973 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 |
References
- CDC. Annual Summaries of Foodborne Outbreaks. , Available from: https://www.cdc.gov/fdoss/annual-reports/index.html (2018).
- Kaakoush, N. O., Castaño-Rodríguez, N., Mitchell, H. M., Man, S. M. Global Epidemiology of Campylobacter Infection. Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 687-720 (2015).
- Pitkanen, T. a, H, M. L. Global Water Pathogen Project. Rose, J. B., Jimenez-Cisneros, B. , UNESCO (2017).
- Fitzgerald, C., et al. Multicenter Evaluation of Clinical Diagnostic Methods for Detection and Isolation of Campylobacter spp. from Stool. Journal of Clinical Microbiology. 54 (5), 1209-1215 (2016).
- Kirkpatrick, B. D., Tribble, D. R. Update on human Campylobacter jejuni infections. Current Opinion in Gastroenterology. 27 (1), 1-7 (2011).
- CDC. Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food - Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 2006-2013. Morbidity and Mortality Weekly Report. 63, 328-332 (2014).
- Jaime, A. L., et al. Campylobacter upsaliensis: Another Pathogen for Consideration in the United States. Clinical Infectious Diseases. 34 (11), 59-60 (2002).
- Bullman, S., O'Leary, J., Corcoran, D., Sleator, R., Lucey, B. Molecular-based detection of non-culturable and emerging campylobacteria in patients preseting with gastroenteritis. Epidemiology and Infection. 140, 684-688 (2012).
- Giltner, C. L., Saeki, S., Bobenchik, A. M., Humphries, R. M. Rapid Detection of Campylobacter Antigen by Enzyme Immunoassay Leads to Increased Positivity Rates. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 618-620 (2013).
- M'ikanatha, N. M., et al. Culturing stool specimens for Campylobacter spp., Pennsylvania, USA. Emerging Infectious Disease. 18, 484-487 (2012).
- Al Amri, A., Senok, A. C., Ismaeel, A. Y., Al-Mahmeed, A. E., Botta, G. A. Multiplex PCR for direct identification of Campylobacter spp. in human and chicken stools. Journal of Medical Microbiology. 56 (10), 1350-1355 (2007).
- Buss, J. E., et al. Campylobacter culture fails to correctly detect Campylobacter in 30% of positive patient stool specimens compared to non-cultural methods. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38, 1087-1093 (2019).
- Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
- Couturier, B. A., Hale, D. C., Couturier, M. R. Association of Campylobacter upsaliensis with Persistent Bloody Diarrhea. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3792-3794 (2012).
- Chaban, B., Musil, K. M., Himsworth, C. G., Hill, A. K. Development of cpn60-Based Real-Time Quantitative PCR Assays for the Detection of 14 Campylobacter Species and Application to Screening of Canine Fecal Samples. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3055-3061 (2009).
- Allos, B., Blaser, M. J. Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th ed. Mandell, G. L., Bennett, J. E., Dolin, R. , Churchill Livingstone. 2793-2802 (2009).
- Anderson, N. W., Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. Comparison of the BD MAX Enteric Bacterial Panel to Routine Culture Methods for Detection of Campylobacter, Enterohemorrhagic Escherichia coli (O157), Salmonella, and Shigella Isolates in Preserved Stool Specimens. Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1222-1224 (2014).
- Wasfy, M., Oyofo, B., Elgindy, A., Churilla, A. Comparison of preservation media for storage of stool samples. Journal of Clinical Microbiology. 33 (8), 2176-2178 (1995).
- Bessède, E., Delcamp, A., Sifre, E., Buissonniere, A., Mégraud, F. New Methods for Detection of Campylobacters in Stool Samples in Comparison to Culture. Journal of Clinical Microbiology. 49 (3), 941-944 (2011).
- Bessède, E., et al. Evaluation of the Diagnostic Accuracy of Two Immunochromatographic Tests Detecting Campylobacter in Stools and Their Role in Campylobacter Infection Diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 56 (4), (2018).
- Shane, A. L., et al. Infectious Diseases Society of America Clinical Practice Guidelines for the Diagnosis and Management of Infectious Diarrhea. Clinical Infectious Diseases. 65 (12), 1963-1973 (2017).
- Toledo, Z., Simaluiza, R. J., Astudillo, X., Fernández, H. Occurrence and antimicrobial susceptibility of thermophilic Campylobacter species isolated from healthy children attending municipal care centers in Southern Ecuador. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 59, 77-77 (2017).
- Lee, G., et al. Symptomatic and asymptomatic Campylobacter infections associated with reduced growth in Peruvian children. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (1), 2036 (2013).
