Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الكشف عن البكتيريا المقيمة في الانسجه في المثانة الخزعات من قبل rRNA الفلورية 16S في الموقع التهجين

Published: October 18, 2019 doi: 10.3791/60458
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, University of Texas at Dallas, 2Department of Urology, University of Texas Southwestern Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

هذا البروتوكول هو للكشف عن غير منحازة من البكتيريا المرتبطة الانسجه في الخزعات المريض بواسطة rRNA 16S في التهجين الموضعي والمجهر البؤري.

Abstract

يمكن ان يوفر تصور تفاعل البكتيريا مع الأسطح المخاطية المضيفة والانسجه رؤية قيمه في أليات التسبب في المرض. في حين ان تصور مسببات الامراض البكتيرية في النماذج الحيوانية للعدوى يمكن ان يعتمد علي سلالات بكتيرية مصممه للتعبير عن البروتينات الفلورية مثل GFP ، فان تصور البكتيريا داخل الغشاء المخاطي للخزعات أو الانسجه التي يتم الحصول عليها من المرضي البشريين يتطلب طريقه غير متحيزة. هنا ، نقوم بوصف طريقه فعاله للكشف عن البكتيريا المرتبطة بالانسجه في أقسام الخزعة البشرية. يستخدم هذا الأسلوب الفلورسنت في الموقع التهجين (FISH) مع فلوريسسينتلي المسمي المسبار العالمي اوليغكليوكليوتيد ل 16S rRNA لتسميه البكتيريا المرتبطة بالانسجه داخل أقسام خزعة المثانة المكتسبة من المرضي الذين يعانون من المتكررة عدوي المسالك البولية. من خلال استخدام المسبار العالمي لل rrna 16s ، يمكن الكشف عن البكتيريا دون معرفه مسبقه من الأنواع ، أجناس ، أو الخصائص البيوكيميائية ، مثل عديد السكاريد (lps) ، التي ستكون مطلوبه للكشف عن طريق التجارب المناعية. نحن وصف بروتوكول كامل ل 16S rRNA الأسماك من تثبيت الخزعة إلى التصوير عن طريق المجهر البؤري. ويمكن تكييف هذا البروتوكول للاستخدام في اي نوع من الانسجه تقريبا ويمثل أداه قويه لتصور غير متحيز من التفاعلات البكتيرية المضيفة ذات الصلة سريريا في انسجه المريض. وعلاوة علي ذلك ، باستخدام الأنواع أو المجسات الخاصة بالأجناس ، يمكن تكييف هذا البروتوكول للكشف عن مسببات الامراض البكتيرية المحددة داخل انسجه المريض.

Introduction

المسالك البولية ، التي تتكون من مجري البول والمثانة والحالب والكلي يتعرض باستمرار للبكتيريا التي تشكل ميكروبيوم البولية ، فضلا عن الغازية المسببة للامراض البولية ، مثل الامراض البولية الجرثومية e. القولونية (upec) ، من الجهاز الهضمي 1،2. طبقه من المخاط الرطب تتكون من الغليكوسامينوجليكانز ولوحه غير نفاذه من البروتينات البولية الغليكولاتيد التي تم التعبير عنها علي سطح الخلايا السطحية تشكل حاجزا يحمي بشكل روتيني ظهاره المثانة من الغزو من قبل المنضمين بكتيريا3،4. اثناء عدوي المسالك البولية (UTI) ، يتم إزعاج هذه الحواجز أو تدميرها ، مما يسهل التعلق بظهاره المثانة وغزوها من قبل البكتيريا المسببة للامراض البولية5،6. وقد كشف العمل في نماذج murine ان العديد من البكتيريا المسببة للامراض البولية بما في ذلك upec ، klebsiella الرئوية، والمكورات المعوية البرازيه يمكن ان تشكل المجتمعات الخلوية المتماثلة (الحاويات الوسيطة) داخل سيتوتوبلاسما من الخلايا السطحية الخزانات داخل الخلية الهادئة (qirs) ضمن الخلايا الظهاريه الانتقالية7،8،9. علي الرغم من ان UPEC قد تم التعرف عليها داخل سفك الخلايا الظهاريه من المرضي UTI الإنسان ، والتفاعل من مسببات الامراض البولية مع الغشاء المخاطي المثانة في البشر لم يسبق تصوره10.

قمنا بتكييف تقنيه مشتركه ، مضانه في التهجين الموضعي (FISH) ، للكشف عن البكتيريا داخل الغشاء المخاطي لخزعات المثانة التي تم الحصول عليها من المرضي بعد سن إلياس الذين خضعوا لتنظير المثانة بالكهرباء من التهاب الأوتار الثلاثية (CEFT) للمتقدمين أداره المضادات الحيوية الحرارية المتكررة UTI11. باستخدام مسبار عالمي ل rRNA 16S, كنا قادرين علي الكشف بموضوعيه الأنواع البكتيرية المرتبطة بالغشاء المخاطي المثانة من المرضي UTI المتكررة وتحديد موقفهم داخل جدار المثانة12. وقد تم تصميم المسبار النيوكليوتيد العالمي 16S rRNA لاستهداف منطقه المحمية من البكتيريا 16S rRNA13، الذي يتوافق مع المواقع 388-355 من القولونية rrna 16S. وقد تم التحقق من تسلسل rrna 16s والتدافع التحقيق سابقا ونشرت للاستخدام في الجهاز الهضمي الماوس14,15. ويرد وصف لمتواليات وخصائص التحقيقات في الجدول 1. من الضروري استخدام قسمين متسلسلين في هذا البروتوكول ، أحدهما لمسبار rRNA 16S والاخر لمسبار التدافع ، ليكون قادرا علي التمييز بين الاشاره الصحيحة والخلفية كظهاره المثانة ، والكولاجين والايلاستين المعرض التلقائي16 . في هذا البروتوكول ، تم تصميم rRNA 16S والتدافع التحقيقات مع الفلورسنت اليكسا فلور 488 التسميات علي حد سواء في 3 ' و 5 ' تيرميني عن طريق N-هيدروكسيسكالنجيد (نهس) استر الروابط لزيادة اشاره الفلورسنت.

علي الرغم من انه تم تطوير هذا البروتوكول لاستخدامه علي أقسام خزعة المثانة البشرية ، فانه يمكن تكييفه بسهوله للاستخدام علي الأقسام المضمنة في البارافين من اي نسيج يعتقد ان البكتيريا تقيم فيه. علي عكس التجارب مناعي التي تستهدف المستضدات محدده (علي سبيل المثال ، lipopolysساكاريد) علي سطح البكتيريا ، وهذا الأسلوب لا يتطلب اي معرفه مسبقه من المستضدات التي أعربت عنها البكتيريا المرتبطة بالانسجه10،17 . استخدام المسبار العالمي لل rRNA 16S يسمح الكشف غير متحيزة لجميع الأنواع البكتيرية داخل العينة ولكن لا يسمح تحديد هويتهم. لتحديد التعرف علي البكتيريا المكتشفة ، يجب استخدام الأنواع أو الكائنات الخاصة بالجنس أو النوع 16S أو 23S rRNA. هذا البروتوكول لن يكشف أيضا عن مسببات الامراض الفطرية ، مثل المبيضات الbicans، المرتبطة بالانسجه المضيفة. للكشف عن مسببات الامراض الفطرية ، 28S أو 18S rRNA تحقيقات يجب ان تستخدم18.

Protocol

تمت الموافقة علي بروتوكول الدراسة من قبل واتباع المبادئ التوجيهية للجنة السلامة المؤسسية للسلامة البيولوجية والكيميائية التابعة للمركز الطبي لجنوب غرب المدينة دالاس و UT. تمت الموافقة علي استخدام الخزعات من المواد البشرية في هذا البروتوكول واتبعت المبادئ التوجيهية لمجالس المراجعة المؤسسية لل UT دالاس والمركز الطبي الجنوبي الغربي. جميع الافراد المعنيين بجمع الخزعات ومعالجتها لديهم حماية المادة البشرية الحالية (HSP) وتدريب HIPPA.

1. اعداد الانسجه للتثبيت وتضمين البارافين

ملاحظه: أخذت الخزعات من النساء الراضيات اللواتي يخضعن لتنظير المثانة مع المعالجة الكهربائية للتهاب الأوتار الثلاثي للاداره المتقدمة للعدوى المتكررة بالمسالك البولية (روتي). يتم تعريف روتي علي انها 3 UTIs في فتره 12 شهرا. تم اجراء عمليه جمع الخزعات في غرفه العمليات بينما كان المريض تحت التخدير بعد الحصول علي موافقه المريض المستنيرة لكل بروتوكول UTSW الهجرة ستو 082010-016. وتم ترميز جميع العينات وإلغاء تحديدها قبل التجريب.

  1. الحصول علي كوب بارد (~ 1 مم3) خزعة من المثانة الثلاثية مع ملقط المسالك البولية عن طريق منظار المثانة مرنه ووضع فورا في كريوفيال 2 مل معقمه تحتوي علي 1.5 مل من 4 ٪ v/v بارافورمالدهيد (PFA) أعدت في 1x الفوسفات معقمه مخزنه المالحة (الاذاعه التلفزيونية).
    ملاحظه: يمكن اجراء 4 ٪ PFA في 1X التلفزيونية مقدما وتخزينها في-20 درجه مئوية حتى الحاجة.
  2. إصلاح الخزعة لمده 6 ساعات في درجه حرارة الغرفة أو 16-24 ساعة في 4 درجه مئوية.
    ملاحظه: يجب ان تحسب مده التثبيت استنادا إلى حجم عينه الانسجه وينبغي تجنب الإفراط في التثبيت. لا ينصح باستخدام غلوتارالديهيد كمثبت لأنه يقدم الفلورية التلقائية.
  3. في غطاء المحرك المعقم أو السلامة البيولوجية ، قم بازاله التثبيت بواسطة السحب واستبدله ب1.5 مل من المعقم 1x. الحفاظ علي العينات في 4 °C ليلا أو علي الفور اجراء معالجه الانسجه وتضمين البارافين19.
  4. استخدام ميكروتومي معقمه لمقطع كتل الانسجه في سماكه 5 ميكرون والتمسك الأقسام الانسجه البارافين لرسوم الشرائح المجهر الزجاج. وهناك ما لا يقل عن اثنين من الشرائح لكل خزعة ستكون مطلوبه لبروتوكول rRNA الأسماك 16S.
    ملاحظه: يجب ان تكون انسجه الخزعة متقاطعة سيكتيونالي مرتبه بالنسبة لمستوي القطع من أجل ضمان التصور للطبقات البولية في جميع الأقسام. وتجدر الاشاره أيضا إلى ان سمك القسم ينبغي ان يكون الأمثل للكشف عن البكتيريا المجتمع. قد تكون هناك حاجه إلى ارق المقاطع أو أخذ عينات من الأقسام التسلسلية المتعددة في حاله العدوى حيث تكون البكتيريا المقيمة في الانسجه شحيحه للغاية (علي سبيل المثال ، < 1 بكتيريا مقيمه في الانسجه لكل خليه من خلايا الثدييات ال1,000ه).

2. مضان في الموقع التهجين مع العالمية المسبارات rRNA 16S

ملاحظه: مطلوب شريحتين لكل خزعة. هناك حاجه شريحة واحده للتحقيق rRNA 16S العالمية وشريحة واحده لمسبار التحكم مع تسلسل تدافعت. وهذا مهم لتمييز الاشاره الحقيقية من اشاره الخلفية اثناء المجهر نظرا لان ظهاره المثانة هي لصناعه السيارات في الفلورسنت في قنوات متعددة. بالاضافه إلى التحقيق التدافع ، وحجب مع 0.1 ٪ السودان الأسود B قبل المتصاعدة قد يقلل من الخلفية التلقائية المتاصله في الانسجه20.

  1. اعداد الكواشف وغطاء الدخان
    1. نظف غطاء الدخان الفارغ (أو خزانه السلامة البيولوجية المجهزة بشكل مناسب) مع 70% الايثانول.
    2. اعداد العازلة التهجين تتالف من 0.9 M كلوريد الصوديوم (NaCl) ، 20 مم تريس-HCl (pH 7.2) ، 0.1 ٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) في 10 مل من المياه المعقمة المصفاة.
      ملاحظه: ويمكن اعداد المياه المعقمة المصفاة عن طريق تمرير المياه المقطرة الاوتوكلاف من خلال فلتر 0.22 μM. ويمكن تخزين عازل التهجين في درجه حرارة الغرفة ، ولكن قد يعجل المخزون من الحل. إذا كانت المخزونات الصربية تعجل ، يسخن المحلول في حمام مياه 50 درجه مئوية قبل الاستخدام.
    3. اعداد ما لا يقل عن 100 مل كل من 95 ٪ و 90 ٪ الايثانول في المياه المعقمة المصفاة في غسلها ، وزجاجات الاوتوكلاف.
    4. حل فلوريسسينتلي المسمية المجسات بالتجميد في 10 ملم تريس-HCl (pH 8.0) و 1 مم ايثيل لينديبيناتيتاياستيك حمض (أدتا) المخزن المؤقت (TE) أعدت في فلتر-تعقيم النيوداز المياه الحرة إلى تركيز نهائي من 100 μM. اعداد تخفيف 1 μM في المخزن المؤقت TE للاستخدام في هذا البروتوكول. تخزين كل من 100 μM المخزون المركز و 1 μM الأسهم التي أعيد تشكيلها في-20 درجه مئوية محمية من الضوء.
      ملاحظه: لا تذوب فلوريسسينتلي المسمية المجسات في الماء. التخزين المؤقت مطلوب لمنع التحلل المائي للسندات استر الدائرة الخاصة بالدائرة الخاصة بالدائرة الخاصة بالمسبار النوكليوتيد.
    5. تنظيف الجرار Coplin خمسه مع 70 ٪ الايثانول ، والسماح لتجف ، والتسمية علي النحو التالي: الأول ، اكسيليينيس الثاني ، 95 ٪ EtOH ، 90 ٪ EtOH ، ddH2O ، وملء مع 100 مل من الحل المناسب. سيساعد هذا في تجنب الارتباك في الخطوات اللاحقة.
  2. الانسجه البارافينيزيشنه والاماهه
    1. في غطاء المحرك ، ضع شريحتين لكل خزعة في حامل منزلق عمودي.
    2. وضع الرف الشريحة العمودية في الجرة الاكزيينات انا Coplin (التي تحتوي علي 100 mL من اكسيليينات) لمده 10 دقيقه.
    3. أزاله رف الشريحة من اكسيليينات انا ولطخه الجزء السفلي علي منشفه ورقيه لأزاله اكسيليينات الزائدة. ضعيه في برطمان الكوبلين الثاني لمده 10 دقائق.
      ملاحظه: لا تعمل أبدا مع اكسيليينات خارج غطاء الدخان المعتمد.
    4. أعاده ترطيب أقسام الانسجه التي يتم غسلها في الايثانول المتعاقب (95% و 90%) لمده 10 دقيقه كل في الجرار Coplin المسمي علي التوالي.
      ملاحظه: خلال هذه المرحلة ، الحارة التهجين العازلة إلى 50-56 درجه مئوية في حمام مائي
    5. أزاله رف الشريحة من 90 ٪ الايثانول يغسل ، لطخه الجزء السفلي علي المناشف الورقية لأزاله الايثانول الزائد ، ووضع في ddH2o coplin جره تحتوي علي 100 mL من فلتر-تعقيم ddh2س لمده 10 دقيقه.
    6. في انتظار غسل ddH2س ، تمييع التحقيقات إلى 10 نانومتر في التهجين العازلة لخلق حل تلطيخ. اعداد 150 μL من حل تلطيخ لكل شريحة.
      ملاحظه: حماية تلطيخ الحل من الضوء عن طريق التفاف الأنابيب في رقائق ألومنيوم وتخزينها في درج. عند العمل مع فلوريسسينتلي المسمي التحقيقات علي السطح ، والنظر في إيقاف الأضواء العلوية عندما تكون قادره. التحقيقات المخففة في التهجين العازلة لا ينبغي ان يعاد استخدامها.
  3. التهجين والتلطيخ المضاد
    1. اعداد غرفه الترطيب لكل التحقيق عن طريق وضع الغارقة ، تكوم كيمبليد والمياه المعقمة إلى خزان P1000 تلميح مربع. ضع خرطوشه حامل الطرف في الأعلى-وهذا هو المكان الذي ستجلس فيه الشرائح.
      ملاحظه: من المهم استخدام غرفه الترطيب لمنع أجزاء الخزعة من التجفيف اثناء التهجين. وتجدر الاشاره إلى ان غرف المرطب المتاحة تجاريا مصممه للحفاظ علي جو مستقر ورطب. ومع ذلك ، فان التقنية المفصلة هنا تتحكم بشكل كاف في الرطوبة بتكلفه اقل بكثير.
    2. أزاله الشرائح من رف الشريحة ووضع علي منشفه ورقيه جديده (الانسجه الجانب الأعلى). استخدام Kimwipe لتجفيف الشريحة. كن حذرا لمجرد الداب بلطف بالقرب من (وليس علي) قسم الخزعة إلى الفتيل بعيدا المياه. باستخدام القلم مسعور ، رسم الحدود حول قسم الخزعة ووضع الشريحة الانسجه-الجانب حتى في غرفه الترطيب.
      ملاحظه: العمل بسرعة بحيث الانسجه لا تجف قبل التهجين.
    3. وضع غرفه الترطيب في مجموعه حاضنه إلى 50 درجه مئوية. ماصه 50-150 μL من محلول تلطيخ مباشره علي راس الانسجه بحيث يتم تعبئة المستطيل الذي ادلي به الحدود مسعور حول الانسجه. كن حذرا لعدم أضافه الكثير من الحل كما لتجاوز الحدود مسعور. اغلق المربع برفق.
    4. احتضان بين عشيه وضحيها (~ 16 ساعة) في 50 درجه مئوية في الظلام. إذا كانت الحاضنة لديها نافذه ، وتغطيتها مع رقائق ألومنيوم لخلق بيئة مظلمة.
      ملاحظه: مطلوب درجه حرارة التهجين تحت درجه حرارة ذوبان المسبار الأسماك للاشاره موثوق بها. 50 درجه مئوية هو درجه الحرارة المثلي للتحقيق rRNA العالمي 16S ولكن قد لا يكون الأمثل لتحقيقات أخرى.
    5. في صباح اليوم التالي ، واعداد ما لا يقل عن 500 مل من المخزن المؤقت يغسل تتالف من 0.9 M NaCl ، 20 مم تريس-HCl (pH 7.2) في ddH2O وتصفيه-تعقيم في زجاجه معقمه مع فلتر زجاجه فراغ. يسخن إلى 50-56 درجه مئوية في حمام مائي.
    6. أزاله الشرائح من غرف الترطيب والفتيل بعناية بعيدا اي حل التهجين المتبقية مع Kimwipe. ضع الشرائح في رف تلطيخ عمودي.
    7. ضع الرف تلطيخ في جره كوبلين غير شفافة تحتوي علي 100 مل من المخزن المؤقت للغسيل قبل التسخين لمده 10 دقائق. إذا كانت الجرارات الكوبلين غير معتمة (علي سبيل المثال ، الزجاج) ، ضعها في الظلام اثناء خطوات الحضانة-ربما تحت مربع أو في درج.
    8. كرر الخطوة الغسيل مرتين مع المخزن المؤقت غسل الطازجة في الجرار Coplin الجديدة.
    9. خلال خطوات الغسيل ، واعداد مضاد للبقع عن طريق تمييع 100 ميكروغرام/مل حل الأسهم من Hoechst 33342 1:1000 في المخزن المؤقت للغسيل. إلى نفس الأنبوب ، أضافه راصات القمح الجرثومية اليكسا-555 (WGA) إلى تركيز نهائي من 5μg/mL و اليكسا-555 Phمسبوك إلى تركيز نهائي من 33 nM. يخزن في الظلام حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
      ملاحظه: Hoechst ، اليكسا-555 WGA ، و اليكسا-555 Phسبائك الحمض النووي التسمية ، mucin/أوروبلاكينس ، و actin ، علي التوالي ، ويمكن تخزينها علي المدى الطويل في الظلام في تعليمات الشركة المصنعة. يمكن تخصيص تسميات الفلورسنت المستخدمة للمسابر والبقع المضادة لمجموعات الفلاتر المتاحة لاستخدام المجهر.
    10. أزاله الشرائح من غسل الماضي والفتيل بلطف بعيدا الزائدة غسل العازلة مع Kimwipe. وضع الشرائح الانسجه-الجانب حتى علي منشفه ورقيه وأضافه 50-150 μL من مكافحه وصمه عار مباشره علي راس الانسجه بحيث يتم تعبئة الحدود مسعور ، ولكن ليس تفيض. تغطيه ما يصل إلى أربع شرائح مع كريوبوكس واحتضان لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
    11. وضع الجانبين مره أخرى في رف تلطيخ وغسل أكثر مرتين في الجرار Coplin مع المخزن المؤقت غسل الطازجة ، لمده 10 دقيقه لكل منهما.
    12. جفف الشرائح جيدا بعد الغسيل الأخير وضع الانسجه جانبا علي منشفه ورقيه تحت اعلي كريوبوكس. اضغط قطره واحده من وسائل الاعلام المتصاعدة مباشره علي راس الانسجه. ضعي برفق شفه ذات حجم مناسب (ستعتمد علي حجم الخزعة) في الأعلى. اضغط برفق علي اي فقاعات لأنها سوف تتداخل مع التصوير والسماح للغطاء انزلق الشرائح لعلاج بين عشيه وضحيها في الظلام.
    13. في اليوم التالي ، ختم حواف المشبك إلى الشريحة مع طبقه خفيفه من طلاء الأظافر واضحة. السماح لتجف لمده 10 دقيقه في الظلام ومن ثم تخزين في الظلام في 4 درجه مئوية للمجهر البؤري.

3. التصور من الأسماك rRNA 16S بواسطة المجهر البؤري

ملاحظه: بالنسبة لهذا البروتوكول ، يتم تحقيق أفضل النتائج مع المجهر البؤري الضوئي بالليزر مع أهداف 63x و 100x. مطلوب مجموعات مرشح السليم لتصور Hoechst ، اليكسا-488 ، و اليكسا-555 فلوري. ومع ذلك ، يمكن استخدام المجهر الفلورسنت القياسية إذا لم يكن هناك منظار بؤري مركزي غير متوفر. هذا البروتوكول هو لمسح الليزر المجهر البؤري.

  1. التبديل علي المجهر البؤري وبرامج الكمبيوتر المرتبطة المجهر لكل تعليمات الشركة المصنعة.
  2. تحميل الشريحة وتصور مع 10x الهدف في القناة الزرقاء (DAPI/Hoechst). ركز بعناية حتى تصبح النوى مرئية.
  3. بمجرد التركيز ، تغيير الهدف إلى ارتفاع التكبير (63x أو 100x). يضاف الزيت فوق زلة الغطاء. أعاده التركيز مع الهدف الجديد ، والتاكد من ان العدسة الموضوعية تاتي في اتصال مع النفط مع التركيز.
    ملاحظه: استخدم التركيز البؤري الدقيق فقط عند التكبير العالي (63x أو 100x). وينبغي استخدام النفط فقط لهدف النفط.
  4. بسرعة تقييم كل شريحة من خلال العين قطعه في الأخضر (eGFP/اليكسا-488) قناه لتحديد الشرائح التي هي الأسماك الايجابيه والتي هي الأسماك السلبية.
    ملاحظه: فمن الأفضل إذا تم هذا التقييم الاولي/التهديف اعمي من قبل فرد منفصل للحد من التحيز التجريبية.
  5. لصوره الخزعات الملونة ، تبدا مع شريحة الأسماك الايجابيه والتبديل إلى وضع التصور الكمبيوتر. حدد 405 (Hoechst) ، 488 (اليكسا-488) ، 555 (اليكسا-555) القناات. تعيين ثقب الدبوس باستخدام أطول قناه الطول الموجي ، في هذه الحالة 555. العثور علي المستوي البؤري الصحيح لتصور البكتيريا المسمية في قناه 488. دون تغيير المستوي البؤري ، قم بتعيين المكسب وطاقة الليزر والازاحه لكل قناه بحيث لا تكون الاشاره مشبعه ، ولا يتم تصحيح الخلفية بشكل مفرط. الحصول علي الصورة في جميع القناات الثلاث.
    ملاحظه: استخدم نفس الإعدادات للقناه 488 لصوره كل شريحة في تجربه. قوه الليزر قد تتطلب التكيف في القناات 405 و 555 إذا كان المستوي البؤري الأمثل للرؤية البكتيرية التغييرات بين الحقول.
  6. كرر علي حقول اضافيه حتى الحصول علي صور من سطح الظهاريه بأكمله.
    ملاحظه: قد تضطر إلى تغيير المستوي البؤري قليلا لتصور البكتيريا المسمية في مجالات مختلفه ، ولكن أبدا تغيير المكسب ، وقوه الليزر ، أو أزاحه للقناه 488 بين الحقول. إذا كان يعمل علي المجهر البؤري ، قد يكون من المفيد التقاط المكدس Z بحيث يمكن تحليل التوطين ثلاثي الابعاد للبكتيريا داخل الانسجه.
  7. معالجه الصور وقياس البكتيريا المسمية داخل أو المرتبطة بالانسجه باستخدام ImageJ أو برامج مماثله. ويوصي بالحد الأدنى من معالجه الصور (علي سبيل المثال ، تقسيم/دمج القناات وتحويلها إلى ملفات صور) ، علي الرغم من انه قد يتم اجراء تصحيح الخلفية إذا لزم الأمر. يجب ان تظل كافة التصحيحات أو التعديلات الأخرى متناسقة بين الصور.

Representative Results

تم تحسين البروتوكول للكشف غير المتحيز عن البكتيريا المرتبطة بالغشاء المخاطي للمثانة في أقسام خزعة المثانة المضمنة في البارافين. ويصور الشكل 1 الرسوم البيانية المنسقة التمثيلية من تجربه تستخدم هذا البروتوكول في أجزاء من خزعة المثانة التي يتم الحصول عليها من النساء المصابات بعدوي المسالك البولية المتكررة. وقد تم تهجين القسمين التسلسليين اما مع rRNA العالمية 16S (ألواح العلوية) أو التدافع (لوحات اقل) مجسات. أخذت صور من نفس المنطقة من النسيج والبكتيريا (الأخضر) واضحة بوضوح في الانسجه التهجين مع التحقيقات rRNA 16S وليس مع مسبار التدافع. ويمثل الشكل 2 نتيجة ايجابيه زائفه. يتم الكشف عن اشاره المقابلة الكولاجين الفلورسنت أو والايلاستين في القناات 405 و 488 في كل من rRNA 16S والتدافع السبر التهجين المقاطع خزعة تسليط الضوء علي اهميه دائما باستخدام التدافع مسبار السيطرة.

التحقيق تسلسل Tm فلوروفوري الصله
العالمي 16S rRNA 5 '-GCTGCCTCCC
GTAGGAGT-3 '		 54.9 اليكسا-488 (5 ' و 3 ') استر
التدافع 5 '-ACTCCTACGG
GAGGCAGC-3 '		 Na اليكسا-488 (5 ' و 3 ') استر

الجدول 1: تسلسل المسبار السمكي وخصائصه. Tm يشير إلى ذوبان درجه الحرارة والدائرة الخاصة للصحة هو اختصار ل N-هيدروكسيسكالنجيد.

Figure 1
الشكل 1: الرسوم البيانية المنسقة التمثيلية للأسماك العالمية لل rRNA والتدافع في خزعة المثانة البشرية. يتم تسميه actin و Mucin باللون الأحمر ، وتسمي النوى الخلوية باللون الأزرق ، والبكتيريا باللون الأخضر. يتم الكشف عن البكتيريا المرتبطة بالانسجه فقط مع المسبار 16SrRNA وليس التدافع. الصور الملتقطة بالتكبير 63x. شريط مقياس = 20 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الرسوم البيانية المحورية التمثيلية للفلورية الخضراء الايجابيه الزائفة في خزعة المثانة البشرية. يتم تسميه actin و الميوسين باللون الأحمر ، وتسمي النوى الخلوية باللون الأزرق ، والبكتيريا ومكونات الفلورسنت التلقائي لمصفوفة خارج الخلية (علي سبيل المثال ، الكولاجين والايلاستين) هي الخضراء. ويلاحظ الفلورية الخضراء مع كل من rRNA 16S والتدافع تحقيقات تشير إلى نتيجة ايجابيه كاذبه. تؤخذ الصور في التكبير 63x. شريط مقياس = 20 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Discussion

هنا ، ونحن وصف بروتوكول للكشف عن البكتيريا المرتبطة بالانسجه في الخزعات المثانة البشرية من قبل الجيش النيبالي الريبي 16S FlSH. ويمكن تكييف هذا البروتوكول بسهوله لأخذ الخزعات الماخوذه من الانسجه الأخرى ، مثل الجهاز الهضمي أو الجلد ، ويمكن ان يمتد إلى الانسجه التي تحصد من مجموعه متنوعة من الكائنات الحية النموذجية الثدييات. ويمكن أيضا تكييف البروتوكول الموصوف هنا لاستخدام تثبيت متعدد (علي سبيل المثال ، formalin ، الايثانول ، ميثاكارن) وتقنيات اعداد الانسجه (مثل البارافين أو الراتنج جزءا لا يتجزا ، والانسجه الباكية). المزدوج المسمي العالمي 16S rRNA المسبار يسمح للكشف عن غير متحيزة من جميع الأنواع البكتيرية الموجودة داخل الانسجه ، ويمكن ان توفر نظره قيمه في كيفيه مسببات الامراض والميكروبات تتفاعل مكانيا مع الأسطح المخاطية في المرض وصحية الدول. استخدام الموارد مثل probeBase ، PhylOPDb أو أداه PROBE_DESIGN لحزمه البرمجيات ارب لاختيار أو تصميم الأنواع أو أجناس الخاصة 16S أو 23S التحقيقات rRNA ، ويمكن تكييف هذا البروتوكول للكشف عن الأنواع البكتيرية محدده أو أجناس داخل الانسجه15،21،22. وثمة اتجاه هام في المستقبل لهذه الطريقة هو تعدد الإرسال باستخدام الأنواع-أو التحقيقات الخاصة بالأجناس المسمية بمختلف ، فلوبهورس منفصلة لتقييم التنوع الميكروبي داخل الغشاء المخاطي للمثانة.

القيد الأساسي لهذه الطريقة للاستخدام علي العينات البشرية هو توافر الانسجه البيولوجية. ان موافقه مجلس المراجعة المؤسسية وموافقه المريض المستنيرة مطلوبه للحصول علي الخزعات والتعاون المباشر مع الطبيب الذي يؤدي الاجراء ضروري لجمع العينات المثلي والوصول إلى البيانات الوصفية للمريض. الاجراء CEFT نفسه يدمر ظهاره المثانة لذلك كنا قادرين علي تبرير خزعة من هذه المناطق قبل الاجراء. مطلوب لهذا البروتوكول غطاء الدخان أو خزانه السلامة الاحيائيه المجهزة بشكل مناسب بسبب استخدام الاكزينات السامة في خطوه المغادرين والحاجة إلى الحفاظ علي بيئة معقمه طوال الاجراء. المجهر الفلورسنت ، ويفضل ان يكون التنسيق ، مع 63x أو 100x الهدف ومجموعات مرشح المناسبة لتصور Hoechst ، اليكسا-555 ، و اليكسا-488 مطلوب لهذا البروتوكول. وقد تم تصوير النتائج التمثيلية المبينة في الشكل 1 باستخدام المجهر البؤري الضوئي بالليزر. وينبغي ان المجاهر المسح بالليزر مماثله إنتاج صور قابله للمقارنة. هذا البروتوكول محدود بقدرته علي الكشف عن البكتيريا المرتبطة بالانسجه فقط وليس ، علي سبيل المثال ، الفطريات. مجسات محدده الفطرية 18S أو 28S rRNA يجب ان تستخدم لتحديد مسببات الامراض الفطرية داخل الانسجه18.

وتشمل الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول الحفاظ علي بيئة معقمه طوال العملية وضمان ان الانسجه لا تجف بين التهجين وتلطيخ الخطوات. إذا كان النسيج يجف اثناء العملية ، قد تكون الاشاره مبلله أو قد يسقط النسيج من الشريحة اثناء خطوه الغسيل. كما انه من المهم دائما استخدام قسمين تسلسليين لهذا البروتوكول-أحدهما لمسبار rRNA 16S والاخر لمسبار التدافع. بدون هذه السيطرة ، قد يكون من الصعب جدا التمييز بين الإيجابيات الزائفة والبيانات التي تم الحصول عليها قد لا تكون مفيده أو غنيه بالمعلومات. إذا تم تكييف هذا البروتوكول للاستخدام مع مسبار آخر غير المسبار العالمي لل rRNA 16S ، يجب توخي الحذر لاختيار درجه حرارة التهجين المناسبة ، تقريبا 5 درجه مئوية اقل من ذوبان درجه الحرارة المتوقعة من المسبار. للحفاظ علي كثافة الاشاره ، يجب ان لا يتعرض النسيج للضوء لفترات طويلة من الزمن بعد ان تمت أضافه المسبار ويجب الا يتعرض لفرط العرض اثناء المجهر. أخيرا, اثناء مجهريه الضبط نفسه للقناه يماثل إلى ال [فلوفيبور] مترافق إلى السمكة تحقيق ينبغي كنت أبقيت متسقة بين التجريبية ([16 س] [ررنا] تحقيق) وتحكم (يتبارى تحقيق) منزلقات. يعتبر تصور العلاقة المكانية للبكتيريا داخل الأسطح المخاطية للانسجه المستمدة من المريض أمرا بالغ الاهميه لفهم وبناء فرضيات ذات صله سريريا حول تفاعلات المضيف-الممرض الكامنة وراء الامراض المعدية.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

ونود ان نشكر كيم أورث ومارزا دي سوزا سانتوس علي المشورة المتعلقة بالمراسم وأماندا اريوت للحصول علي الدعم الفني. وكان هذا العمل مدعوما جزئيا من قبل سيسيل h. وأيدا الأخضر كرسي في علوم علم الاحياء النظم التي عقدتها ك

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa-555 Phalloidin Invitrogen A34055 Staining Actin
Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA) Invitrogen W32464 Staining Mucin
Bottle top filters Fisher Scientific 09-741-07 Sterilization
Coplin Jar Simport M900-12W Deparaffinization/washing
Coverslips Fisher Scientific 12-548-5M Microscopy
Ethanol Fisher Scientific 04-355-224 Rehydration
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate Fisher Scientific S311-500 TE
Frosted Slides Thermo Fisher Scientific 12-550-343
Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate Invitrogen H21492 Staining Nucleus
Hydrophobic marker Vector Laboratories H-4000 Hydrophobic barrier
Kimwipes Fisher Scientific 06-666-11
Oil Immersol 518 F Fisher Scientific 12-624-66A Microscopy
Paraformaldehyde (16%) Thermo Scientific TJ274997 Fixation
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen P36934 Mounting medium
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10 Hybridization buffer/PBS
Sodium Dodecyl Sulphate Fisher Scientific BP166-500 Hybridization buffer
Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate Fisher Scientific S373-500 PBS
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate Fisher Scientific S369-500 PBS
Syringe VWR 75486-756 Sterilization
Tris-HCl Fisher Scientific BP152-5 TE/Hybridization buffer
Xylene Fisher Chemical X3P-1GAL Deparaffinization
0.22 μm syringe filter Fisher Scientific 09-754-29 Sterilization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abraham, S. N., Miao, Y. The nature of immune responses to urinary tract infections. Nature Reviews Immunology. 15 (10), 655-663 (2015).
  2. Wolfe, A. J., et al. Evidence of uncultivated bacteria in the adult female bladder. Journal of Clinical Microbiology. 50 (4), 1376-1383 (2012).
  3. Grist, M., Chakraborty, J. Identification of a mucin layer in the urinary bladder. Urology. 44 (1), 26-33 (1994).
  4. Wu, X. R., Kong, X. P., Pellicer, A., Kreibich, G., Sun, T. T. Uroplakins in urothelial biology, function, and disease. Kidney International. 75 (11), 1153-1165 (2009).
  5. Ingersoll, M. A., Albert, M. L. From infection to immunotherapy: host immune responses to bacteria at the bladder mucosa. Mucosal Immunology. 6 (6), 1041-1053 (2013).
  6. Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 269-284 (2015).
  7. Lewis, A. J., Richards, A. C., Mulvey, M. A. Invasion of Host Cells and Tissues by Uropathogenic Bacteria. Microbiology Spectrum. 4 (6), (2016).
  8. Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PLoS One. 8 (12), (2013).
  9. Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and Immunity. 76 (7), 3337-3345 (2008).
  10. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), e329 (2007).
  11. Hussain, S. A., Alhalabi, F., Zimmern, P. E. Long-term efficacy of fulguration of trigonitis for recurrent urinary tract infections in women. Urological Science. 26 (3), 197-201 (2015).
  12. De Nisco, N. J., et al. Direct Detection of Tissue-Resident Bacteria and Chronic Inflammation in the Bladder Wall of Postmenopausal Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Journal of Molecular Biology. , (2019).
  13. Amann, R. I., et al. Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Applied and Environmental Microbiology. 56 (6), 1919-1925 (1990).
  14. Vaishnava, S., et al. The antibacterial lectin RegIIIgamma promotes the spatial segregation of microbiota and host in the intestine. Science. 334 (6053), 255-258 (2011).
  15. Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D586-D589 (2016).
  16. Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
  17. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14170-14175 (2006).
  18. Frickmann, H., Lakner, A., Essig, A., Poppert, S. Rapid identification of yeast by fluorescence in situ hybridisation from broth and blood cultures. Mycoses. 55 (6), 521-531 (2012).
  19. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  20. Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
  21. Ludwig, W., et al. ARB: a software environment for sequence data. Nucleic Acids Research. 32 (4), 1363-1371 (2004).
  22. Jaziri, F., et al. PhylOPDb: a 16S rRNA oligonucleotide probe database for prokaryotic identification. Database (Oxford). , (2014).

Tags

علم الاحياء إصدار 152 عدوي المسالك البولية المثانة التهجين في الموقع 16S rRNA البكتيريا المجهر البؤري التسبب
الكشف عن البكتيريا المقيمة في الانسجه في المثانة الخزعات من قبل rRNA الفلورية 16S في الموقع التهجين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neugent, M. L., Gadhvi, J., Palmer,… More

Neugent, M. L., Gadhvi, J., Palmer, K. L., Zimmern, P. E., De Nisco, N. J. Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (152), e60458, doi:10.3791/60458 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter