Summary
Denne protokol er for objektiv påvisning af vævs-associerede bakterier i patient biopsier af 16S rRNA in situ hybridisering og konfokal mikroskopi.
Abstract
Visualisering af samspillet mellem bakterier med Host slimhinde overflader og væv kan give værdifuld indsigt i mekanismer af patogenesen. Mens visualisering af bakterielle patogener i dyremodeller af infektion kan stole på bakteriestammer konstrueret til at udtrykke fluorescerende proteiner såsom GFP, visualisering af bakterier i slimhinden af biopsier eller væv opnået fra humane patienter kræver en upartisk metode. Her beskriver vi en effektiv metode til påvisning af vævs associerede bakterier i humane biopsi sektioner. Denne metode udnytter fluorescerende in situ-hybridisering (fisk) med et fluorercentligt mærket Universal oligonucleotid-sonde for 16S rRNA til at mærke vævs associerede bakterier i blære biopsi sektioner erhvervet fra patienter, der lider af recidiverende Urinvejsinfektion. Ved brug af en universel 16S rRNA-sonde kan bakterier påvises uden forudgående kendskab til arter, sleller eller biokemiske egenskaber, såsom lipopolysaccharid (LPS), som ville være påkrævet til påvisning ved immunofluorescens eksperimenter. Vi beskriver en komplet protokol for 16S rRNA fisk fra biopsi fiksering til Imaging af confokal mikroskopi. Denne protokol kan tilpasses til brug i næsten alle typer af væv og repræsenterer et kraftfuldt værktøj til den upartiske visualisering af klinisk relevante bakterie-vært interaktioner i patientens væv. Desuden kan denne protokol anvendes til påvisning af specifikke bakterielle patogener i patient vævet ved hjælp af arter eller SLA-specifikke sonder.
Introduction
Urinvejene, bestående af urinrøret, blæren, urinlederne og nyrerne er konstant udsat for bakterier, der omfatter urin-mikrobiome samt invaderende uropatogener, ligesom uropatogene E. coli (upec), fra mave-tarmkanalen 1,2. Et lag af hydreret Slim bestående af glycosaminoglycaner og en uigennemtrængelig plak af glykosyleret uroplakin proteiner udtrykt på overfladen af de overfladiske celler udgør en barriere, der rutinemæssigt beskytter blæreepitelet fra invasion af klæber bakterier3,4. Under urinvejsinfektion (UTI), er disse barrierer forstyrret eller ødelagt, lette fastgørelse til og invasion af blæreepitelet af uropatogene bakterier5,6. Arbejde i murine modeller har afsløret, at mange uropatogene bakterier, herunder UPEC, Klebsiella pneumoniae, og Enterococcus fæalis kan danne replikerende intracellulære samfund (IBCs) inden for cytoplasmaet af overfladiske celler og latent intracellulære reservoirer (qirs) inden for overgangs epiteliale celler7,8,9. Selv om UPEC er blevet identificeret i kaste epiteliale celler fra humane UTI patienter, interaktion af uropatogener med blære slimhinde hos mennesker havde ikke tidligere visualiseret10.
Vi tilpassede en fælles teknik, fluorescens in situ hybridisering (fisk), til at opdage bakterier i slimhinden i blære biopsier opnået fra postmenopausale patienter, der gennemgår Cystoskopi med elektro fulguration af trigonitis (CEFT) for den avancerede håndtering af antibiotika-refraktær recidiverende UTI11. Ved hjælp af en universel sonde til 16S rRNA, vi var i stand til objektivt at opdage bakteriearter forbundet med blære slimhinde af recidiverende UTI patienter og bestemme deres position i blæren væggen12. Den universelle 16S rRNA nucleotid sonde var tidligere designet til at målrette en bevaret region af bakteriel 16S rRNA13, som svarer til positioner 388-355 af E. coli 16S rRNA. 16S rRNA og scramble Probe sekvenser er tidligere blevet valideret og offentliggjort til brug i mus mavetarmkanalen14,15. Prøvenes sekvenser og egenskaber er beskrevet i tabel 1. Det er vigtigt at bruge to sekventielle sektioner i denne protokol, en for 16S rRNA Probe og en for scramble Probe, at være i stand til at skelne mellem true og baggrunds signal som blære epithelium, kollagen og elastin udviser autofluorescens16 . I denne protokol, 16S rRNA og scramble sonder blev designet med fluorescerende Alexa fluor 488 etiketter på både 3 ' og 5 ' Termini via N-hydroxysuccinimide (NHS) ester forbindelser for at øge fluorescerende signal.
Selv om denne protokol blev udviklet til brug på human blære biopsi sektioner, det kan let tilpasses til brug på paraffin-indlejrede sektioner fra ethvert væv, hvor bakterier menes at opholde sig. I modsætning til immun histokemi eksperimenter, der er rettet mod specifikke antigener (f. eks. lipopolysaccharid) på den bakterielle overflade, kræver denne metode ingen forudgående viden om antigener udtrykt ved vævs associerede bakterier10,17 . Brug af Universal 16S rRNA-sonden giver mulighed for objektiv påvisning af alle bakteriearter i prøven, men tillader ikke bestemmelse af deres identitet. For at bestemme identifikation af fundne bakterier, arter eller slægt-specifikke 16S eller 23S rRNA sonder skal anvendes. Denne protokol vil heller ikke afsløre svampe patogener, såsom Candida albicans, forbundet med værtsvæv. Til påvisning af svampe patogener skal 28S eller 18S rRNA-sonder anvendes18.
Protocol
Forsøgsprotokollen blev godkendt af og fulgt retningslinjerne fra de institutionelle biosikkerheds-og kemikalie sikkerheds komitéer i UT Dallas og UT Southwestern Medical Center. Brugen af biopsier fra mennesker i denne protokol blev godkendt af og fulgt retningslinjerne for de institutionelle Review bestyrelser i UT Dallas og UT Southwestern Medical Center. Alle personer involveret med biopsi indsamling og behandling har nuværende menneskelige emne beskyttelse (HSP) og HIPPA uddannelse.
1. vævs forberedelse til fiksering og paraffin indlejring
Bemærk: Biopsier blev taget fra samtykkende kvinder gennemgår Cystoskopi med elektro-fulguration af trigonitis for den avancerede behandling af recidiverende urinvejsinfektion (rUTI). rUTI er defineret som 3 UTIs i en 12-måneders periode. Biopsi samling blev udført i operationsstuen, mens patienten var under anæstesi efter at have indhentet informeret patientsamtykke per UTSW IRB-protokol STU 082010-016. Alle prøver blev kodet og de-identificeret før eksperimenter.
- Få en kold kop (~ 1 mm3) biopsi fra blæren trigone med urologiske pincet via fleksibelt cystoskop og Placer straks i en steril 2 ml cryovial indeholdende 1,5 ml 4% v/v PARAFORMALDEHYD (PFA) tilberedt i 1x steril fosfat bufferet saltvand (PBS).
Bemærk: 4% PFA i 1x PBS kan laves på forhånd og opbevares ved-20 °c, indtil det er nødvendigt. - Fix biopsi for 6 h ved stuetemperatur eller for 16-24 h ved 4 °C.
Bemærk: Fikserings varigheden bør beregnes på grundlag af vævs prøvens størrelse, og over-fiksering bør undgås. Det anbefales ikke at bruge glutaraldehyd som fiksering, da det introducerer autofluorescens. - I en steriliseret hætte eller et biosikkerhedskabinet fjernes fiksering ved pipettering og udskiftes med 1,5 mL steril 1x PBS. Opbevar prøverne ved 4 °C natten over, eller Udfør straks vævs behandling og paraffin indlejring19.
- Brug en steriliseret mikrotom til at dele vævs blokke ved 5 μm tykkelse og klæber paraffin vævs sektioner til opladede glasmikroskop slides. Der kræves mindst to dias pr. biopsi til 16S rRNA-fiske protokollen.
Bemærk: Biopsi væv bør være tværsnit arrangeret i forhold til skæring flyet for at sikre visualisering af urotheliale lag i alle sektioner. Det skal også bemærkes, at snittykkelse bør optimeres for bakteriel samfund opdagelse. Der kan være behov for tyndere sektioner eller prøveudtagning af flere serielle sektioner i tilfælde af infektioner, hvor vævs residente bakterier er ekstremt knappe (f. eks. < 1 vævs Resident bakterie pr. 1.000 pattedyrsceller).
2) Fluorescens in situ-hybridisering med Universal 16S rRNA-sonder
Bemærk: Der kræves to dias pr. biopsi. En slide er nødvendig for den universelle 16S rRNA-sonde og et dias til en kontrol sonde med en forvrænget sekvens. Dette er vigtigt for at skelne ægte signal fra baggrunds signalet under mikroskopi, da blæreepitelet er auto fluorescerende i flere kanaler. Ud over scramble Probe, blokering med 0,1% Sudan Black B før montering kan reducere baggrunds autofluorescens iboende i vævet20.
- Klargøring af reagenser og stinkhætte
- Rengør en tom stinkhætte (eller et passende biosikkerhedskabinet) med 70% ethanol.
- For at forberede hybridiserings bufferen, som består af 0,9 M natriumchlorid (NaCl), 20 mM Tris-HCl (pH 7,2), 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS) i 10 mL sterilt filtreret vand.
Bemærk: Sterilfiltreret vand kan fremstilles ved at passere autoklave destilleret vand gennem et 0,22 μM filter. Hybridiserings bufferen kan opbevares ved stuetemperatur, men SDS kan udløse fra opløsning. Hvis SDS bundfælder, opvarmer opløsningen i et 50 °C vandbad før brug. - Forbered mindst 100 ml hver af 95% og 90% ethanol i sterilt filtreret vand i vaskede, autoklaveres flasker.
- Fluorescentligt mærkede lyofiliserede sonder opløses i 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), der er fremstillet i filter steriliseret nuklease frit vand til en slutkoncentration på 100 μM. Klargør en fortynding på 1 μM i TE-buffer til brug i denne protokol. Opbevar både 100 μM koncentreret lager og 1 μM-rekonstituerede sonder ved-20 °C beskyttet mod lys.
Bemærk: Du må ikke opløse fluorescently mærkede Proder i vand. Buffering er nødvendig for at forhindre hydrolyse af NHS ester Bond konjugating fluoroforet til nucleotid sonde. - Rengør fem coplin krukker med 70% ethanol, lad det tørre, Mærk som følger: xylener I, xylener II, 95% EtOH, 90% EtOH, DDH2O, og fyld med 100 ml af den passende opløsning. Dette vil hjælpe med at undgå forvirring i senere trin.
- Vævs-de-paraffinisering og rehydrering
- Anbring to dias pr. biopsi i en lodret slide rist i hætten.
- Placer en lodret glide rist i xylener I Coplin jar (indeholdende 100 mL xylener) i 10 min.
- Fjern slide stativet fra xylener i og lad bunden på et papirhåndklæde for at fjerne overskydende xylener. Placer i xylener II coplin jar i 10 min.
Bemærk: Arbejd aldrig med xylener uden for en certificeret Røghætte. - Rehydrat afparaffinerede vævs sektioner i flere på hinanden følgende ethanolskyller (95% og 90%) for 10 min hver i henholdsvis mærket Coplin krukker.
Bemærk: I denne fase, varm Hybridiserings buffer til 50-56 °C i et vandbad - Fjern slide stativet fra 90% ethanol Wash, lad bunden på papirhåndklæder for at fjerne overskydende ethanol, og Placer i ddH2o coplin jar indeholdende 100 ml filter-steriliseret DDH2o i 10 min.
- Mens du venter på ddH2O vask, fortyndes proberne til 10 nm i hybridiserings buffer for at skabe Farvningsopløsningen. Forbered 150 μL farvningsopløsning pr. slide.
Bemærk: Beskyt Farvningsopløsningen mod lys ved at indpakke rørene i aluminiumsfolie og opbevare dem i en skuffe. Når du arbejder med fluorescently mærkede sonder på bordpladen, kan du overveje at slukke for ovenlys, når det er muligt. Sonder fortyndet i hybridiserings buffer bør ikke genbruges.
- Hybridisering og kontra farvning
- Forbered et befugtning kammer for hver sonde ved at placere gennemblødt, krøllet Kimwipe og sterilt vand til reservoiret af en P1000 spids boks. Placer spidsen holder patronen på toppen-det er her, diasene vil sidde.
Bemærk: Det er vigtigt at bruge et befugtning kammer for at forhindre biopsi sektioner fra udtørring under hybridisering. Det skal bemærkes, at kommercielt tilgængelige luftfugter kamre er designet til at opretholde en stabil, fugtig atmosfære. Den teknik, som er beskrevet her, kontrollerer imidlertid i tilstrækkelig grad luftfugtigheden væsentligt mindre. - Fjern diasene fra slide holderen, og Placer dem på et nyt papirhåndklæde (side opad). Brug en Kimwipe til at tørre diaset. Vær omhyggelig med kun forsigtigt at DAB nær (ikke på) biopsi afsnittet at væge væk vand. Brug en hydrofobe pen til at tegne en kant omkring biopsi afsnittet og Placer slide vævet side opad i befugtning kammeret.
Bemærk: Arbejd hurtigt, så vævene ikke tørrer ud før hybridisering. - Anbring befugtning i en inkubator, der er indstillet til 50 °C. Afpipetteres 50-150 μL af Farvningsopløsningen direkte på toppen af vævet, således at rektanglet, der er lavet af den hydrofobiske grænse omkring vævet, fyldes. Vær omhyggelig med ikke at tilføje for meget løsning til overløb den hydrofobiske grænse. Luk forsigtigt boksen.
- Inkuber natten over (~ 16 timer) ved 50 °C i mørket. Hvis inkubator har et vindue, dække det med aluminiumsfolie for at skabe et mørkt miljø.
Bemærk: En hybridiserings temperatur under Smeltetemperaturen af fiske sonden er påkrævet for pålideligt signal. 50 °C er den optimale temperatur for den universelle 16S rRNA-sonde, men er muligvis ikke optimal for andre sonder. - Den følgende morgen, Forbered mindst 500 mL vaskebuffer bestående af 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) i ddH2O og filter-Steriliser i en steril flaske med et vakuum flaske-Top filter. Varm til 50-56 °C i et vandbad.
- Fjern slidene fra de befugtning kamre og afvæm forsigtigt eventuelle resterende hybridiseringsvæske med en Kimwipe. Placer diasene i et lodret farvnings stativ.
- Anbring farvnings stativet i en uigennemsigtig Coplin-krukke, der indeholder 100 mL foropvarmet vaskebuffer i 10 minutter. Hvis Coplin-krukker ikke er uigennemsigtige (f. eks. glas), skal de placeres i mørke under inkubations trinene — måske under en kasse eller i en skuffe.
- Gentag vaske trinnet to gange med frisk vaskebuffer i nye Coplin-krukker.
- Under vaske trinene skal du tilberede modpletten ved at fortynde en 100 μg/mL stamopløsning af Hoechst 33342 1:1000 i vaskebuffer. Til samme rør tilsættes Alexa-555 hvedekim kold (WGA) til en endelig koncentration på 5 μg/ml og Alexa-555 phalloidin til en endelig koncentration på 33 nm. Opbevares i mørke, indtil de er klar til brug.
Bemærk: Hoechst, Alexa-555 WGA, og Alexa-555 Phalloidin label DNA, mucin/uroplakiner, og actin, henholdsvis og kan opbevares på lang sigt i mørke pr producentens anvisninger. Fluorescerende etiketter anvendes til sonder og kontra pletter kan tilpasses til filteret sæt til rådighed for mikroskopet, der skal anvendes. - Fjern slidene fra den sidste vask og afvæm forsigtigt overskydende vaskebuffer med en Kimwipe. Placer slides vævet-side op på et papirhåndklæde og tilsæt 50-150 μL Counter-Stain direkte på toppen af vævet, så den hydrofobiske grænse fyldes, men ikke overstrømmende. Dæk op til fire slides med en cryobox-top og Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Placer siderne tilbage i farvnings stativet og vask to gange mere i Coplin krukker med frisk vaskebuffer, i 10 minutter hver.
- Tør gliderne grundigt efter den sidste vask og Placer vævs siden op på et papirhåndklæde under en cryobox-top. Klem en dråbe af monterings mediet direkte på toppen af vævet. Placer forsigtigt en passende størrelse dækglas (vil afhænge af biopsi størrelse) på toppen. Tryk forsigtigt eventuelle bobler ud, da de vil forstyrre billeddannelse og tillade Cover-slippet glider til at helbrede natten i mørket.
- Den næste dag, forsegle kanterne af dækglas til diaset med et let lag af klar neglelak. Lad tørre i 10 minutter i mørke og derefter opbevares i mørke ved 4 °C for Konfokal mikroskopi.
- Forbered et befugtning kammer for hver sonde ved at placere gennemblødt, krøllet Kimwipe og sterilt vand til reservoiret af en P1000 spids boks. Placer spidsen holder patronen på toppen-det er her, diasene vil sidde.
3. visualisering af 16S rRNA fisk ved Konfokal mikroskopi
Bemærk: For denne protokol opnås de bedste resultater med en laser-scanning confokal mikroskop med 63x og 100x mål. Korrekt filter sæt til visualisering af Hoechst, Alexa-488, og Alexa-555 Fluorescens er påkrævet. Standard fluorescerende mikroskopi kan dog anvendes, hvis et Konfokal mikroskop ikke er tilgængeligt. Denne protokol er til en Laserscanning confokale mikroskop.
- Tænd for confokal mikroskop og den computer software, der er forbundet med mikroskopet i henhold til producentens anvisninger.
- Indlæs diaset, og Visualiser med 10x-målsætningen i den blå (DAPI/Hoechst) kanal. Fokuser forsigtigt, indtil kerner er synlige.
- Når fokuseret, ændre målet til høj forstørrelse (63x eller 100x). Tilsæt olie oven på Cover sedlen. Fokuser med det nye mål, og sørg for, at objektivlinsen kommer i kontakt med olien, mens du fokuserer.
Bemærk: Brug kun fint fokus ved høj forstørrelse (63x eller 100x). Olie bør kun anvendes til olie formål. - Hurtigt vurdere hver slide gennem øjet-brik i den grønne (eGFP/Alexa-488) kanal til at bestemme, hvilke dias er fisk positive, og som er fisk negative.
Bemærk: Det er bedst, hvis denne indledende vurdering/scoring gøres blændet af en separat person til at reducere eksperimentel bias. - For at billede de farvede biopsier, start med en fisk positiv slide og skifte til computer visualisering tilstand. Vælg kanalerne 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488), 555 (Alexa-555). Indstil pinhullet ved hjælp af den længste bølgelængde kanal, i dette tilfælde 555. Find det korrekte brændplan til visualisering af mærkede bakterier i 488-kanalen. Uden at ændre brændplanet, indstille Gain, laser magt, og offset for hver kanal, således at signalet ikke er mættet, og baggrunden er ikke over korrigeret. Erhverve billedet i alle tre kanaler.
Bemærk: Brug de samme indstillinger for 488-kanalen til at afbilde alle dias i et eksperiment. Laser strømmen kan kræve justering i 405-og 555-kanalerne, hvis det optimale brændplan for bakteriel visualisering skifter mellem felter. - Gentag på yderligere felter, indtil du erhverver billeder af hele epitelial overflade.
Bemærk: Det kan være, at du skal ændre brændplanet en anelse for at visualisere mærkede bakterier i forskellige felter, men aldrig ændre Gain, laser effekt eller forskydning for 488-kanalen mellem felter. Hvis du arbejder på et konfokalt mikroskop, kan det være informativt at fange en Z-stak, så den tredimensionale lokalisering af bakterierne i vævet kan analyseres. - Behandle billeder og kvantificere mærkede bakterier i eller forbundet med vævet ved hjælp af ImageJ eller lignende software. Minimal behandling af billederne anbefales (f. eks. opdeling/fletning af kanaler og konvertering til billedfiler), selvom baggrundskorrektion kan udføres, hvis det er nødvendigt. Alle rettelser eller andre ændringer skal være konsistente mellem billederne.
Representative Results
Protokollen er blevet optimeret til objektiv påvisning af bakterier forbundet med blære slimhinden i paraffin-indlejret blære biopsi sektioner. Figur 1 skildrer repræsentative konfokale mikrografer fra et eksperiment ved hjælp af denne protokol om afsnit af blære biopsier opnået fra kvinder med recidiverende urinvejsinfektion. To serielle sektioner blev hybridiseret med enten Universal 16S rRNA (øvre paneler) eller scramble (lavere paneler) sonder. Billeder fra samme område af vævet blev taget og bakterier (grøn) er tydeligt synlige i vævet hybridiseret med 16S rRNA sonder og ikke med scramble Probe. Figur 2 repræsenterer et falsk positivt resultat. Signal svarende til Auto luorescent kollagen eller elastin detekteres i 405-og 488-kanalerne i både 16S rRNA og scramble Probe-hybridiseret biopsi sektioner, der fremhæver vigtigheden af altid at bruge en scramble Probe kontrol.
| Sonde | Sekvens | Tm | Fluoroforet | Kobling |
| Universel 16S rRNA | 5 '-GCTGCCTCCC GTAGGAGT-3 ' |
54,9 | Alexa-488 (5 ' og 3 ') | NHS ester |
| Scramble | 5 '-ACTCCTACGG GAGGCAGC-3 ' |
Na | Alexa-488 (5 ' og 3 ') | NHS ester |
Tabel 1: fiske sonde sekvenser og karakteristika. TM indikerer smeltetemperatur og NHS er en forkortelse for N-hydroxysuccinimid.
Figur 1: repræsentative konfokale mikrografer af fisk af universel 16S rRNA og scramble sonde i en menneskelig blære biopsi. Actin og mucin er mærket med rødt, cellekerner er mærket i blåt, og bakterier i grøn. Væv-associerede bakterier detekteres kun med 16SrRNA sonde og ikke scramble. Billeder taget ved 63x forstørrelse. Skala bjælke = 20 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative konfokale mikrografer af falsk-positiv grøn autofluorescens i en menneskelig blære biopsi. Actin og mucin er mærket med rødt, cellekerner er mærket i blåt, og bakterier og Auto-luorescent komponenter i den ekstracellulære matrix (fx kollagen og elastin) er grønne. Grøn fluorescens observeres med både 16S rRNA og scramble sonder indikerer et falsk-positivt resultat. Billeder er taget ved 63x forstørrelse. Skala bjælke = 20 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Her beskriver vi en protokol til påvisning af vævs associerede bakterier i humane blære biopsier af 16S rRNA FlSH. Denne protokol kan let tilpasses til biopsier taget fra andre væv, såsom mave-tarmkanalen eller huden, og kan udvides til væv høstet fra en række pattedyr model organismer. Den her beskrevne protokol kan også tilpasses til anvendelse af multiple fiksering (f. eks. formalin, ethanol, methacarn) og vævs Præparations teknikker (f. eks. paraffin eller harpiks indlejret og kryopræserverede væv). Den dobbelt mærkede Universal 16S rRNA-sonde giver mulighed for objektiv påvisning af alle bakteriearter, som findes i vævet, og kan give værdifuld indsigt i, hvordan patogener og mikrobiota rumligt interagerer med slimhinde overflader i sygdom og sund Stater. Ved hjælp af ressourcer såsom probeBase, PhylOPDb eller PROBE_DESIGN-værktøjet i ARB-softwarepakken til udvælgelse eller design af arter eller slægter specifikke 16S eller 23S rRNA-sonder, kan denne protokol tilpasses til påvisning af specifikke bakteriearter eller slægter inden for vævs15,21,22. En vigtig fremtidig retning for denne metode er multiplexing ved hjælp af arter-eller genera-specifikke sonder mærket med forskellige, diskrete fluorophorer til evaluering af mikrobiel mangfoldighed i blæren slimhinde.
Den primære begrænsning af denne metode til brug på humane prøver er tilgængeligheden af biopsieret væv. Institutionel revision bestyrelsen godkendelse og informeret patientsamtykke er forpligtet til at opnå biopsier og direkte samarbejde med klinikeren udfører proceduren er nødvendig for optimal prøveindsamling og adgang til patientens metadata. CEFT-proceduren selv ødelægger blæreepitelet, så vi var i stand til at retfærdiggøre biopsi af disse områder før proceduren. Der kræves en stinkhætte eller et passende monteret biosikkerheds kabinet til denne protokol på grund af brugen af giftige xylener i afparaffinserings trinnet og behovet for at opretholde et sterilt miljø under hele proceduren. Et fluorescerende mikroskop, fortrinsvis Konfokal, med en 63x eller en 100x objektiv og passende filter sæt til visualisering af Hoechst, Alexa-555, og Alexa-488 er påkrævet for denne protokol. De repræsentative resultater i figur 1 blev afbildet ved hjælp af et laser scannings Konfokal mikroskop. Tilsvarende laser scannings mikroskoper bør producere sammenlignelige billeder. Denne protokol er begrænset af dens evne til kun at detektere vævs-associerede bakterier og ikke, for eksempel, svampe. Sonder specifikke svampe 18S eller 28S rRNA skal anvendes til at identificere svampe patogener i vævs18.
Kritiske trin til denne protokol omfatter opretholdelse af et sterilt miljø under hele proceduren og sikring af, at vævet ikke tørrer ud mellem hybridiserings-og farvnings trin. Hvis vævet tørrer ud under proceduren, kan signalet blive dæmpet, eller vævet kan falde ned fra diaset under et vaske trin. Det er også vigtigt altid at bruge to serielle sektioner til denne protokol – en til 16S rRNA-sonden og en til scramble-sonden. Uden denne kontrol kan det være meget vanskeligt at skelne falske positiver, og de indhentede data er muligvis ikke nyttige eller informative. Hvis denne protokol tilpasses til brug med en anden sonde end den universelle 16S-rRNA-sonde, skal der udvises forsigtighed ved valg af en passende hybridiseringstemperatur, ca. 5 °C lavere end sondens forventede smeltetemperatur. For at opretholde signal intensiteten må vævet ikke udsættes for lys i længere tid, efter at sonden er blevet tilsat, og må ikke være overeksponeret under mikroskopi. Endelig skal de samme indstillinger for kanalen, der svarer til fluoroforet konjugeret til fiske sonden, under mikroskopi holdes sammenhængende mellem eksperimentel (16S rRNA-sonde) og kontrol (scramble Probe) dias. Visualisering af det rumlige forhold mellem bakterier inden for slimhinde overflader af patient afledte væv er afgørende for at forstå og opbygge klinisk relevante hypoteser om vært-patogen interaktioner underliggende smitsomme sygdomme.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Kim Orth og Marcela de Souza Santos for protokol rådgivning og Amanda Arute for teknisk support. Dette arbejde blev delvist støttet af Cecil H. og Ida Green Chair i Systems Biology Science, som indehaves af K.P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa-555 Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Staining Actin |
| Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Invitrogen | W32464 | Staining Mucin |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-741-07 | Sterilization |
| Coplin Jar | Simport | M900-12W | Deparaffinization/washing |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | Microscopy |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-224 | Rehydration |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311-500 | TE |
| Frosted Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen | H21492 | Staining Nucleus |
| Hydrophobic marker | Vector Laboratories | H-4000 | Hydrophobic barrier |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11 | |
| Oil Immersol 518 F | Fisher Scientific | 12-624-66A | Microscopy |
| Paraformaldehyde (16%) | Thermo Scientific | TJ274997 | Fixation |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Mounting medium |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | Hybridization buffer/PBS |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Fisher Scientific | BP166-500 | Hybridization buffer |
| Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | PBS |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher Scientific | S369-500 | PBS |
| Syringe | VWR | 75486-756 | Sterilization |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP152-5 | TE/Hybridization buffer |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL | Deparaffinization |
| 0.22 μm syringe filter | Fisher Scientific | 09-754-29 | Sterilization |
References
- Abraham, S. N., Miao, Y. The nature of immune responses to urinary tract infections. Nature Reviews Immunology. 15 (10), 655-663 (2015).
- Wolfe, A. J., et al. Evidence of uncultivated bacteria in the adult female bladder. Journal of Clinical Microbiology. 50 (4), 1376-1383 (2012).
- Grist, M., Chakraborty, J. Identification of a mucin layer in the urinary bladder. Urology. 44 (1), 26-33 (1994).
- Wu, X. R., Kong, X. P., Pellicer, A., Kreibich, G., Sun, T. T. Uroplakins in urothelial biology, function, and disease. Kidney International. 75 (11), 1153-1165 (2009).
- Ingersoll, M. A., Albert, M. L. From infection to immunotherapy: host immune responses to bacteria at the bladder mucosa. Mucosal Immunology. 6 (6), 1041-1053 (2013).
- Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 269-284 (2015).
- Lewis, A. J., Richards, A. C., Mulvey, M. A. Invasion of Host Cells and Tissues by Uropathogenic Bacteria. Microbiology Spectrum. 4 (6), (2016).
- Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PLoS One. 8 (12), (2013).
- Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and Immunity. 76 (7), 3337-3345 (2008).
- Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), e329 (2007).
- Hussain, S. A., Alhalabi, F., Zimmern, P. E. Long-term efficacy of fulguration of trigonitis for recurrent urinary tract infections in women. Urological Science. 26 (3), 197-201 (2015).
- De Nisco, N. J., et al. Direct Detection of Tissue-Resident Bacteria and Chronic Inflammation in the Bladder Wall of Postmenopausal Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Journal of Molecular Biology. , (2019).
- Amann, R. I., et al. Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Applied and Environmental Microbiology. 56 (6), 1919-1925 (1990).
- Vaishnava, S., et al. The antibacterial lectin RegIIIgamma promotes the spatial segregation of microbiota and host in the intestine. Science. 334 (6053), 255-258 (2011).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D586-D589 (2016).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14170-14175 (2006).
- Frickmann, H., Lakner, A., Essig, A., Poppert, S. Rapid identification of yeast by fluorescence in situ hybridisation from broth and blood cultures. Mycoses. 55 (6), 521-531 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Ludwig, W., et al. ARB: a software environment for sequence data. Nucleic Acids Research. 32 (4), 1363-1371 (2004).
- Jaziri, F., et al. PhylOPDb: a 16S rRNA oligonucleotide probe database for prokaryotic identification. Database (Oxford). , (2014).
