Summary
이 프로토콜은 16S rRNA에 의한 환자 생검에서 조직 관련 박테리아의 편견 없는 검출을 위한 것으로, 공초점 현미경 검사법에서.
Abstract
호스트 점막 표면 및 조직과 박테리아의 상호 작용의 시각화는 병인의 메커니즘에 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 감염의 동물 모형에 있는 세균성 병원체의 가시화는 GFP와 같은 형광성 단백질을 표현하기 위하여 설계된 세균성 긴장에 의지할 수 있는 동안, 인간 적인 환자에게서 얻은 생검 또는 조직의 점막 내의 박테리아의 가시화는 요구됩니다 편견없는 방법. 여기에서, 우리는 인간 생검 단면도에 있는 조직 관련 박테리아의 검출을 위한 능률적인 방법을 기술합니다. 이 방법은 재발성 으로 고통받는 환자에서 취득 한 방광 생검 섹션 내의 조직 관련 박테리아를 라벨에 16S rRNA에 대한 형광 표지 보편적 인 올리고 뉴클레오티드 프로브와 함께 situ 혼성화 (FISH)에서 형광을 이용합니다. 요로 감염. 범용 16S rRNA 프로브를 사용하여 면역형광 실험에 의해 검출에 필요한 종, 제네라 또는 리포폴리사카라이드(LPS)와 같은 생화학적 특성에 대한 사전 지식 없이 박테리아를 검출할 수 있습니다. 우리는 공초점 현미경 검사법에 의하여 화상 진찰에 생검 고정에서 16S rRNA 물고기를 위한 완전한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 거의 모든 유형의 조직에서 사용하도록 적응될 수 있으며 환자 조직에서 임상적으로 관련된 세균 숙주 상호 작용의 편견 없는 시각화를 위한 강력한 도구를 나타냅니다. 더욱이, 종 또는 제네라 특이적 프로브를 사용하여, 이 프로토콜은 환자 조직 내의 특정 세균성 병원체의 검출을 위해 적응될 수 있다.
Introduction
요도로 구성된 요로, 방광, 요관 및 신장은 요로에서 비뇨생식기 대장균 (UPEC)과 같은 요로 미생물군유전체뿐만 아니라 비뇨생식기 균을 침입하는 박테리아에 지속적으로 노출됩니다. 1,2. 글리코사미노글리칸으로 구성된 수화 점액층과 표면 세포 표면에 발현된 당화 로플라킨 단백질의 불투과성 플라크는 부착물의 침입으로부터 방광 상피를 일상적으로 보호하는 장벽을 형성합니다. 박테리아3,4. 요로 감염(UTI) 동안, 이러한 장벽은 방해되거나 파괴되어, 비뇨생식기 균5,6에의한 방광 상피의 부착 및 침입을 용이하게 한다. 뮤린 모델에서 의약연구는 UPEC, Klebsiella 폐렴,및 엔테로코커스 대변을 포함한 많은 비뇨생식기 균이 피상세포의 세포질 내에서 복제세포 내 커뮤니티(IBC)를 형성할 수 있다는 것을 밝혀내고, 과도상 피세포내의 정지성 세포 내 저장소 (QIRs)7,8,9. UPEC는 인간 UTI 환자에게서 창피 상피 세포 내에서 확인되었지만, 인간에 있는 방광 점막과 비뇨기과균의 상호 작용은 이전에10을구상하지 않았습니다.
우리는 일반적인 기술을 적응, situ 혼성화에 형광 (FISH), 첨단에 대한 삼조염의 전분화와 방광경검사를 받고 폐경 후 환자에서 얻은 방광 생검의 점막 내의 박테리아를 검출하기 위해 (CEFT) 항생제 내화성 재발 성 요로감염의 관리 11. 16S rRNA를 위한 보편적인 탐사기를 사용하여, 우리는 재발하는 UTI 환자의 방광 점막과 관련되었던 세균성 종을 객관적으로 검출하고 방광 벽12내의 그들의 위치를 결정할 수 있었습니다. 보편적 인 16S rRNA 뉴클레오티드 프로브는 이전에 대장균 16s rRNA의 위치 388-355에 해당하는 세균 16S rRNA13의보존 된 영역을 대상으로 설계되었습니다. 16S rRNA 및 스크램블 프로브 서열은 마우스 위장관14,15에사용하기 위해 이전에 검증되고 출판되었다. 프로브의 서열 및 특성은 표 1에설명되어 있습니다. 방광 상피, 콜라겐 및 엘라스틴 이형 16을 나타내기 때문에 실제 신호와 배경 신호를 구별할 수 있도록 이 프로토콜에서 두 개의 순차적 절편을 사용하는 것이 필수적입니다. . 이 프로토콜에서, 16S rRNA 및 스크램블 프로브는 형광 신호를 증가시키기 위해 N-hydroxysuccinimide (NHS) 에스테르 연계를 통해 3' 및 5' 테르미니 모두에 형광 알렉사 플루오르 488 라벨로 설계되었습니다.
이 프로토콜은 인간의 방광 생검 섹션에 사용하기 위해 개발되었지만, 박테리아가 상주하는 것으로 추정되는 모든 조직에서 파라핀 내장 섹션에 사용하기 위해 쉽게 적응 할 수 있습니다. 세균 표면에 특정 항원 (예를 들어, 리포폴리사카라이드)을 표적으로 하는 면역 조직 화학 실험과는 달리,이 방법은 조직 관련박테리아에의해 발현된 항원10,17에 의해 발현된 항원에 대한 사전 지식이 필요하지 않습니다. . 보편적 인 16S rRNA 프로브의 사용은 샘플 내에서 모든 세균 종의 편견 검출을 허용하지만, 자신의 정체성의 결정을 허용하지 않습니다. 검출된 박테리아, 종 또는 속 특이적 16S 또는 23S rRNA 프로브의 식별을 확인하려면 반드시 사용해야 합니다. 이 프로토콜은 또한 칸디다 알비칸스와같은 곰팡이 병원균을 검출하지 않습니다, 숙주 조직과 관련되었던. 곰팡이 병원균의 검출을 위해, 28S 또는 18S rRNA 프로브는18를사용해야합니다.
Protocol
연구 프로토콜은 UT 달라스와 UT 사우스 웨스턴 메디컬 센터의 기관 생물 안전 및 화학 안전 위원회의 지침에 의해 승인되고 따랐습니다. 이 프로토콜에 있는 인간 적인 과목에서 생검의 사용은 UT 달라스와 UT 사우스 웨스턴 의료 센터의 기관 검토 위원회의 지침에 의해 승인되고 따랐습니다. 생검 수집 및 처리와 관련된 모든 개인은 현재 인간 피험자 보호 (HSP) 및 HIPPA 교육을 받습니다.
1. 고정 및 파라핀 포함을위한 조직 준비
참고: 생검은 재발하는 요로 감염 (rUTI)의 고급 관리를 위한 삼중염의 전기 충치로 방광경 검사를 겪고 있는 여자를 동의에서 취했습니다. rUTI는 12개월 동안 3개의 요로틴으로 정의됩니다. 생검 수집은 환자가 UTSW IRB 프로토콜 STU 082010-016당 통보된 환자 동의를 얻은 후 마취하에 있는 동안 수술실에서 수행되었다. 모든 샘플은 실험 전에 코딩되고 비식별화되었습니다.
- 유연한 방광경을 통해 비뇨기과 민원으로 방광 삼각에서 생검을 얻고 1x 멸균 인산염 완충 식염수로 제조 된 4 % v / v 파라 포름 알데히드 (PFA)의 1.5 mL을 포함하는 멸균 2 mL 극저온에 즉시 넣습니다. (PBS)를 참조하십시오.
참고: 1x PBS에서 4% PFA를 미리 만들고 필요할 때까지 -20°C에서 보관할 수 있습니다. - 실온에서 6시간 동안 또는 4°C에서 16-24시간 동안 생검을 수정하십시오.
참고: 고정 기간은 조직 샘플의 크기에 따라 계산되어야하며 과잉 고정은 피해야합니다. 그것은 자가 불형을 소개로 고정제로 글루타랄데히드를 사용하는 것이 좋습니다. - 멸균 된 후드 또는 생체 안전 성 캐비닛에서 파이펫팅으로 고정제를 제거하고 멸균 1.5 mL의 멸균 1x PBS로 교체하십시오. 샘플을 밤새 4°C로 유지하거나 즉시 조직 처리 및 파라핀 을포함19를수행한다.
- 멸균 된 마이크로 토메를 사용하여 5 μm 두께의 조직 블록을 단면도하고 파라핀 조직 섹션을 충전 유리 현미경 슬라이드에 부착하십시오. 16S rRNA FISH 프로토콜에 대해 생검당 최소 2개의 슬라이드가 필요합니다.
참고: 생검 조직은 모든 단면도에 있는 비뇨기과 층의 가시화를 지키기 위하여 절단 평면에 상대하여 단면으로 배열되어야 합니다. 또한 단면 두께는 세균 성 지역 사회 검출을 위해 최적화되어야한다는 점에 유의해야합니다. 조직 상주 박테리아가 극단적으로 부족한 감염의 경우에 더 얇은 단면도 또는 다중 직렬 단면도의 샘플링은 요구될 수 있습니다 (예를 들면, 1,000 포유류 세포 당 조직 상주 박테리아).
2. 범용 16S rRNA 프로브를 통한 시투 혼성화에서형광
참고: 생검 당 2개의 슬라이드가 필요합니다. 범용 16S rRNA 프로브에는 하나의 슬라이드가 필요하고 스크램블 된 시퀀스를 가진 제어 프로브에는 하나의 슬라이드가 필요합니다. 이것은 방광 상피가 다중 채널에 있는 자동 형광이기 때문에 현미경 검사법 도중 배경 신호에서 실제 신호를 구별하기 위해 중요합니다. 스크램블 프로브 이외에, 장착 전에 0.1% 수단 블랙 B로 차단하면조직(20)에내재된 배경 자가형광을 감소시킬 수 있다.
- 시약 및 연기 후드의 준비
- 빈 연기 후드(또는 적절하게 장착된 생체 안전 캐비닛)를 70% 에탄올로 청소합니다.
- 멸균여과수 10 mL에서 0.9M 염화나트륨(NaCl), 20 mM Tris-HCl(pH 7.2), 0.1% 나트륨 도데실 황산염(SDS)으로 구성된 혼성화 완충액을 준비한다.
참고: 멸균 여과수는 0.22 μM 필터를 통해 오토클레이브 증류수를 통과시킴으로써 제조될 수 있다. 혼성화 버퍼는 실온에서 저장할 수 있지만 SDS는 용액에서 침전될 수 있습니다. SDS가 침전되면 사용하기 전에 50 °C 의 수조에서 용액을 따뜻하게 하십시오. - 세척된 오토클레이브 병에 멸균 여과된 물에 각각 95% 및 90% 에탄올을 각각 100mL 이상 준비합니다.
- 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 및 1 mM 에틸렌디아미네테트라 아세트산 (EDTA) 버퍼 (TE)에서 형광 표지 된 동결 성 프로브를 필터 멸균 뉴클레아제 자유물로 100 μM의 최종 농도로 용해하십시오. 이 프로토콜에 사용하기 위해 TE 버퍼에서 1 μM의 희석을 준비한다. 빛으로부터 보호되는 -20°C에서 100 μM 농축 스톡과 1 μM 스톡 재구성 프로브를 모두 보관하십시오.
참고: 형광표지 프로브를 물에 녹이지 마십시오. 완충은 뉴클레오티드 프로브에 불소 를 컨쥬게이팅하는 NHS 에스테르 결합의 가수 분해를 방지하기 위해 요구된다. - 70% 에탄올로 5 개의 코플린 항아리를 청소하고 다음과 같이 건조시키고 라벨을 붙일 수 있습니다 : 자일렌 I, 자일렌 II, 95 % EtOH, 90 % EtOH, ddH2O, 및 적절한 용액의 100 mL로 채웁니다. 이렇게 하면 이후 단계에서 혼동을 방지하는 데 도움이 됩니다.
- 조직 탈 파라핀화 및 재수화
- 후드에서 생검당 두 개의 슬라이드를 수직 슬라이드 랙에 넣습니다.
- 수직 슬라이드 랙을 자일렌 I 코플린 항아리(자일렌 100mL 포함)에 10분 동안 넣습니다.
- 슬라이드 랙을 자일렌 I에서 제거하고 종이 타월의 바닥을 얼룩지면 여분의 자일렌을 제거합니다. 자일렌 II 코플린 항아리에 넣고 10분 간 넣습니다.
참고: 인증된 연기 후드 외부에서 자일렌과 함께 작업하지 마십시오. - 연속적인 에탄올 세차에서 탈파라핀화된 조직 절편을 수화(95% 및 90%) 각각 10 분 동안 각각 코플린 항아리에 표시되어 있습니다.
참고: 이 단계에서, 수조에서 50-56 °C로 따뜻한 혼성화 버퍼 - 90% 에탄올 세척에서 슬라이드 랙을 제거하고 종이 타월바닥에 얼룩을 대고 여분의 에탄올을 제거하고 100 mL의 필터 멸균 ddH2O를포함하는 ddH2O Coplin 항아리에 10 분 동안 놓습니다.
- ddH2O 세척을 기다리는 동안, 프로브를 혼성화 완충액에서 10 nM으로 희석하여 염색 용액을 생성한다. 슬라이드당 염색 용액 150 μL을 준비합니다.
참고: 튜브를 알루미늄 호일로 감싸고 서랍에 보관하여 빛으로부터 염색 용액을 보호합니다. 벤치탑에 형광 표지가 부착된 프로브로 작업할 때는 가능하면 오버헤드 라이트를 끄는 것이 좋습니다. 하이브리드화 버퍼에서 희석된 프로브를 재사용해서는 안 됩니다.
- 혼성화 및 카운터 스테인링
- P1000 팁 박스의 저장소에 담그고 구겨진 킴스와이프와 멸균수를 배치하여 각 프로브에 가습 챔버를 준비합니다. 팁 홀더 카트리지를 맨 위에 놓습니다 - 슬라이드가 앉을 위치입니다.
참고: 가습 챔버를 사용하여 생검 섹션이 혼성화 중에 건조되는 것을 방지하는 것이 중요합니다. 시판되는 가습기 챔버는 안정적이고 습한 분위기를 유지하도록 설계되었습니다. 그러나 여기에 자세히 설명된 기술은 훨씬 적은 비용으로 습도를 충분히 제어합니다. - 슬라이드 랙에서 슬라이드를 제거하고 새 종이 타월(티슈 쪽 위쪽)에 놓습니다. 김와이프를 사용하여 슬라이드를 건조시면 됩니다. 생검 섹션 근처에서만 부드럽게 두드려 물을 심지 않도록 주의하십시오. 소수성 펜을 사용하여 생검 섹션 주위에 테두리를 그리고 슬라이드 조직 쪽을 가습 챔버에 올려 놓습니다.
참고: 조직이 혼성화되기 전에 건조되지 않도록 신속하게 작동하십시오. - 가습 챔버를 50°C로 설정된 인큐베이터에 놓습니다. 피펫 50-150 μL의 염색 용액은 조직 의 상부에 직접 하여 조직 주위의 소수성 테두리에 의해 만들어진 직사각형이 채워지게 한다. 소수성 테두리가 넘칠 때 너무 많은 용액을 추가하지 않도록 주의하십시오. 상자를 부드럽게 닫습니다.
- 어둠 속에서 50 °C에서 밤새 배양 (~16 h). 인큐베이터에 창문이 있는 경우 알루미늄 호일로 덮어 어두운 환경을 만듭니다.
참고: 신뢰할 수 있는 신호에는 FISH 프로브의 용융 온도 이하의 혼성화 온도가 필요합니다. 50°C는 범용 16S rRNA 프로브에 대한 최적의 온도이지만 다른 프로브에는 최적이 아닐 수 있습니다. - 다음 날 아침, ddH2O에서 0.9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.2)으로 구성된 적어도 500 mL의 세척 버퍼를 준비하고 진공 병 상판 필터가있는 멸균 병으로 필터 멸균하십시오. 수조에서 50-56 °C까지 따뜻하게 합니다.
- 가습 챔버에서 슬라이드를 제거하고 조심스럽게 킴 와이프와 남아있는 하이브리드 화 솔루션을 멀리 심지. 슬라이드를 수직 염색 랙에 놓습니다.
- 스테인링 랙을 10분 동안 미리 데운 세척 버퍼 100mL가 들어 있는 불투명 코플린 항아리에 넣습니다. 코플린 항아리가 불투명하지 않은 경우(예: 유리), 배양 단계(아마도 상자 밑이나 서랍)에서 어둠 속에서 놓습니다.
- 새로운 코플린 항아리에 신선한 세척 버퍼로 세척 단계를 두 번 반복합니다.
- 세척 단계에서, 호히스트 33342 1:1,000의 100 μg/mL 스톡 용액을 세척 버퍼에 희석하여 카운터 얼룩을 준비한다. 동일한 튜브에 알렉사-555 밀 배아 아글루티닌(WGA)을 5μg/mL의 최종 농도와 알렉사-555 팔로이드를 최종 농도33 nM에 첨가합니다. 사용할 준비가 될 때까지 어둠 속에서 보관하십시오.
참고: Hoechst, 알렉사-555 WGA, 및 알렉사-555 팔루이딘 라벨 DNA, 뮤신/요로플라킨, 및 액틴은 각각 제조사의 지시에 따라 암흑에 장기간 보관될 수 있다. 프로브 및 역스테인에 사용되는 형광 라벨은 현미경에 사용할 수 있는 필터 세트에 맞게 사용자 정의할 수 있습니다. - 마지막 세척에서 슬라이드를 제거하고 김슬키로 여분의 세척 버퍼를 부드럽게 제거합니다. 슬라이드 티슈 쪽을 종이 타월에 올려 놓고 50-150 μL의 카운터 얼룩을 조직 위에 직접 추가하여 소수성 테두리가 채워지지만 넘지 않도록합니다. 저온 상자 상단으로 최대 4 개의 슬라이드를 덮고 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.
- 측면을 다시 염색 랙에 넣고 신선한 세척 버퍼로 코플린 항아리에 두 번 더 씻고 각각 10 분 동안 씻으하십시오.
- 마지막 세척 후 슬라이드를 완전히 건조시키고 티슈 쪽을 저온 상자 상단 아래에 종이 타월에 올려 놓습니다. 티슈 바로 위에 마운팅 매체 한 방울을 짜내. 적절한 크기의 커버슬립(생검 크기에 따라 다릅니다)을 부드럽게 위에 놓습니다. 그들은 이미징을 방해하고 커버 미끄러진 슬라이드가 어둠 속에서 하룻밤 치료 할 수 있도록 부드럽게 어떤 거품을 누르십시오.
- 다음 날, 명확한 매니큐어의 가벼운 코트로 슬라이드에 커버 슬립의 가장자리를 밀봉. 어두운 환경에서 10 분 동안 건조 한 다음 공초점 현미경 검사를 위해 4 °C에서 어둠 속에서 보관하십시오.
- P1000 팁 박스의 저장소에 담그고 구겨진 킴스와이프와 멸균수를 배치하여 각 프로브에 가습 챔버를 준비합니다. 팁 홀더 카트리지를 맨 위에 놓습니다 - 슬라이드가 앉을 위치입니다.
3. 공초점 현미경 검사법에 의한 16S rRNA FISH의 시각화
참고: 이 프로토콜의 경우 63x 및 100x 목표를 가진 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. Hoechst, Alexa-488 및 Alexa-555 형광의 시각화를 위한 적절한 필터 세트가 필요합니다. 그러나, 표준 형광 현미경 검사법은 공초점 현미경을 유효하지 않는 경우에 이용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 위한 것입니다.
- 공초점 현미경과 제조업체 지침당 현미경과 관련된 컴퓨터 소프트웨어를 켭타십시오.
- 슬라이드를 로드하고 파란색(DAPI/Hoechst) 채널에서 10x 목표를 시각화합니다. 핵이 보일 때까지 신중하게 초점을 맞춥니다.
- 집중이 완료되면 목표를 높은 배율(63x 또는 100x)으로 변경합니다. 커버 슬립 위에 오일을 추가합니다. 새로운 목표에 다시 초점을 맞추고, 초점을 맞추면서 대물 렌즈가 오일과 접촉하는지 확인합니다.
참고: 높은 배율(63x 또는 100x)에서 미세한 초점만 사용하십시오. 오일은 오일 목표에만 사용해야 합니다. - 녹색(eGFP/Alexa-488) 채널의 눈 조각을 통해 각 슬라이드를 빠르게 평가하여 어떤 슬라이드가 FISH 양성이고 어떤 슬라이드가 FISH 음성인지 결정합니다.
참고: 이 초기 평가 /채점은 실험 적 편견을 줄이기 위해 별도의 개인에 의해 눈을 멀게하는 것이 가장 좋습니다. - 얼룩진 생검을 이미지화하려면 FISH 포지티브 슬라이드로 시작하여 컴퓨터 시각화 모드로 전환합니다. 405(Hoechst), 488(Alexa-488), 555(Alexa-555) 채널을 선택합니다. 이 경우 가장 긴 파장 채널을 사용하여 핀홀을 설정합니다(이 경우 555). 488 채널에서 표지된 박테리아의 시각화를 위한 올바른 초점 면을 찾습니다. 초점 평면을 변경하지 않고 각 채널에 대한 게인, 레이저 전력 및 오프셋을 설정하여 신호가 포화되지 않고 배경이 과도하게 보정되지 않도록 합니다. 세 채널 모두에서 이미지를 수집합니다.
참고: 실험의 모든 슬라이드를 이미지화하려면 488 채널에 대해 동일한 설정을 사용합니다. 레이저 파워는 필드 간에 세균 시각화를 위한 최적의 초점 평면이 변경되는 경우 405 및 555 채널에서 조정이 필요할 수 있습니다. - 전체 상피 표면의 이미지를 획득할 때까지 추가 필드에서 반복합니다.
참고: 다른 분야에서 표지된 박테리아를 시각화하기 위해 초점 평면을 약간 변경해야 할 수도 있지만 필드 간 488 채널에 대한 게인, 레이저 파워 또는 오프셋을 절대 변경하지 않을 수 있습니다. 공초점 현미경으로 작업하는 경우, Z-스택을 포착하여 조직 내의 박테리아의 3차원 국소화를 분석할 수 있도록 하는 것이 유익할 수 있다. - ImageJ 또는 유사한 소프트웨어를 사용하여 조직 내에서 또는 조직과 연관된 이미지를 처리하고 표지된 박테리아를 정량화합니다. 필요한 경우 배경 보정을 수행할 수 있지만 이미지의 최소한의 처리(예: 채널 분할/병합 및 이미지 파일로 변환)를 수행하는 것이 좋습니다. 모든 수정 또는 기타 변경은 이미지 간에 일관되게 유지되어야 합니다.
Representative Results
이 프로토콜은 파라핀 이함유 방광 생검 섹션에서 방광 점막과 관련된 박테리아의 편견 없는 검출을 위해 최적화되었습니다. 그림 1은 재발하는 요로 감염을 가진 여자에게서 장악한 방광 생검의 단면도에 이 프로토콜을 사용하여 실험에서 대표적인 공초점 현미경을 묘사합니다. 두 개의 직렬 섹션은 범용 16S rRNA(상부 패널) 또는 스크램블(하부 패널) 프로브와 혼성화되었습니다. 조직의 동일한 영역에서의 이미지를 촬영하고 박테리아 (녹색)는 스크램블 프로브가 아닌 16S rRNA 프로브와 혼성화 된 조직에서 명확하게 볼 수 있습니다. 도 2는 거짓 양성 결과를 나타낸다. 자동형광 콜라겐 또는 엘라스틴에 대응하는 신호는 16S rRNA 및 스크램블 프로브-혼성생검 섹션 모두에서 405 및 488 채널에서 검출되어 항상 스크램블 프로브 제어를 사용하는 것의 중요성을 강조한다.
| 프로브 | 시퀀스 | Tm | 플루오로포어 | 링크 |
| 범용 16S rRNA | 5'-GCTGCCTCCC 그태그가트-3' |
54.9 | 알렉사-488 (5' 및 3') | NHS 에스테르 |
| 출 격 | 5'-액트택 가그가카GC-3' |
Na | 알렉사-488 (5' 및 3') | NHS 에스테르 |
표 1: FISH 프로브 서열 및 특성. Tm은 용융 온도를 나타내고 NHS는 N-하이드록시수치니마이드의 약어입니다.
그림 1: 인간 방광 생검에서 보편적 인 16S rRNA 및 스크램블 프로브의 FISH의 대표적인 공초점 현미경 사진. 액틴과 뮤신은 적색으로 표시되고, 세포 핵은 파란색으로 표시되고, 박테리아는 녹색으로 표시되어 있습니다. 조직 관련 박테리아는 스크램블이 아닌 16SrRNA 프로브로만 검출됩니다. 63배 배율로 촬영한 이미지. 배율 막대 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 인간 방광 생검에서 가양성 녹색 자가형질의 대표적인 공초점 현미경. 액틴과 뮤신은 적색으로 표지되고, 세포핵은 청색으로 표지되고, 세포외 기질(예를 들어, 콜라겐 및 엘라스틴)의 박테리아 및 자가형광 성분은 녹색이다. 녹색 형광은 가양성 결과를 나타내는 16S rRNA 및 스크램블 프로브 둘 다로 관찰된다. 이미지는 63배 배율로 촬영됩니다. 배율 막대 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기서, 우리는 16S rRNA FlSH에 의한 인간 방광 생검에서 조직 관련 박테리아의 검출을 위한 프로토콜을 기술한다. 이 프로토콜은 위장관 또는 피부와 같은 다른 조직에서 채취한 생검에 쉽게 적응할 수 있으며 다양한 포유류 모델 유기체로부터 수확된 조직으로 확장될 수 있습니다. 여기서 설명된 프로토콜은 또한 다중 고정(예를 들어, 포르말린, 에탄올, 메타칸) 및 조직 제제 기술(예를 들어, 파라핀 또는 수지 내장, 및 저온 보존 조직)의 사용을 위해 적응될 수 있다. 이중 표지된 범용 16S rRNA 프로브는 조직 내에 존재하는 모든 세균 종의 편견 없는 검출을 허용하며 병원균과 미생물이 질병과 건강한 점막 표면과 공간적으로 상호 작용하는 방법에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 상태. 종 또는 제네라 특이적 16S 또는 23S rRNA 프로브의 선택 또는 설계를 위한 ARB 소프트웨어 패키지의 probeBase, PhylOPDb 또는 PROBE_DESIGN 도구와 같은 리소스를 사용하여 이 프로토콜은 특정 세균 종 또는 제네라의 검출을 위해 조정될 수 있습니다. 조직내 15,21,22. 이 방법에 대한 중요한 미래 방향은 방광 점막 내의 미생물 다양성의 평가를 위해 다른, 이산 플루오로포로 표지된 종 또는 제네라 특이적 프로브를 사용하여 다방산하는 것입니다.
인간 견본에 사용하기 위한 이 방법의 1 차적인 제한은 생검한 조직의 가용성입니다. 최적의 샘플 수집 및 환자 메타데이터에 대한 액세스를 위해 절차를 수행하는 임상의와의 직접 적인 협력을 위해 기관 검토 위원회 승인 및 통보된 환자 동의가 요구됩니다. CEFT 절차 자체는 방광 상피를 파괴하기 때문에 우리는 절차 의 앞에 이 지역의 생검을 정당화할 수 있었습니다. 탈파라핀화 단계에서 독성 자일렌을 사용하고 시술 전반에 걸쳐 멸균 환경을 유지해야 하기 때문에 이 프로토콜에 대해 연기 후드 또는 적절하게 장착된 생체 안전성 캐비닛이 요구된다. 이 프로토콜에는 Hoechst, Alexa-555 및 Alexa-488의 시각화를 위한 63x 또는 100x 객관적이고 적절한 필터 세트를 갖춘 형광 현미경, 바람직하게는 공초점이 필요합니다. 도 1에 도시된 대표적인 결과는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 이미지화되었다. 유사한 레이저 스캐닝 현미경은 유사한 이미지를 생성해야 합니다. 이 프로토콜은 조직 관련 박테리아만 을 검출하는 능력에 의해 제한되며, 예를 들어 곰팡이가 아닙니다. 진균 18S 또는 28S rRNA를 특이적 프로브는 조직18내의 곰팡이 병원체를 식별하기 위해 사용되어야 합니다.
이 프로토콜에 대한 중요한 단계는 절차 전반에 걸쳐 멸균 환경을 유지하고 조직이 혼성화 및 염색 단계 사이에 건조되지 않도록 하는 것을 포함합니다. 시술 도중 조직이 마르면 신호가 약해질 수 있으며, 세척 단계 동안 조직이 슬라이드에서 떨어질 수 있습니다. 또한 이 프로토콜에 대해 항상 두 개의 직렬 섹션을 사용하는 것이 중요합니다(하나는 16S rRNA 프로브용이고 다른 하나는 스크램블 프로브용). 이러한 제어가 없으면 거짓 긍정을 구별하기가 매우 어려울 수 있으며 얻은 데이터는 유용하거나 유익하지 않을 수 있습니다. 이 프로토콜이 범용 16S rRNA 프로브 이외의 프로브와 함께 사용하도록 적응되는 경우, 프로브의 예측된 용융 온도보다 약 5°C 낮은 적절한 혼성화 온도를 선택하도록 주의를 기울여야 합니다. 신호 강도를 유지하기 위해, 조직은 프로브가 추가 된 후 오랜 시간 동안 빛에 노출되어서는 안되며 현미경 검사법 중에 과다 노출되어서는 안됩니다. 마지막으로, 현미경 검사 법 동안 물고기 프로브에 공액된 형광공에 대응하는 채널에 대해 동일한 설정은 실험(16S rRNA 프로브)과 제어(scramble probe) 슬라이드 사이에 일관되게 유지되어야 한다. 환자 유래 조직의 점막 표면 내의 박테리아의 공간 적 관계를 시각화하는 것은 감염성 질병의 근본적인 호스트 병원체 상호 작용에 대한 임상적으로 관련된 가설을 이해하고 구축하는 데 중요합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 프로토콜 조언과 기술 지원에 대한 아만다 아루트김 오스와 마르셀 라 드 수자 산토스에게 감사드립니다. 이 작품은 K.P가 개최한 시스템 생물학 과학의 세실 H. 및 이다 그린 의자에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa-555 Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Staining Actin |
| Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Invitrogen | W32464 | Staining Mucin |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-741-07 | Sterilization |
| Coplin Jar | Simport | M900-12W | Deparaffinization/washing |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | Microscopy |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-224 | Rehydration |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311-500 | TE |
| Frosted Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen | H21492 | Staining Nucleus |
| Hydrophobic marker | Vector Laboratories | H-4000 | Hydrophobic barrier |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11 | |
| Oil Immersol 518 F | Fisher Scientific | 12-624-66A | Microscopy |
| Paraformaldehyde (16%) | Thermo Scientific | TJ274997 | Fixation |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Mounting medium |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | Hybridization buffer/PBS |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Fisher Scientific | BP166-500 | Hybridization buffer |
| Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | PBS |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher Scientific | S369-500 | PBS |
| Syringe | VWR | 75486-756 | Sterilization |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP152-5 | TE/Hybridization buffer |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL | Deparaffinization |
| 0.22 μm syringe filter | Fisher Scientific | 09-754-29 | Sterilization |
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