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Biology

सीटू हाइब्रिडाइजेशन में 16S आरएनए फ्लोरोसेंट द्वारा ब्लैडर बायोप्सी में ऊतक-निवासी बैक्टीरिया की जांच

Published: October 18, 2019 doi: 10.3791/60458
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, University of Texas at Dallas, 2Department of Urology, University of Texas Southwestern Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल रोगी बायोप्सी में ऊतक संबद्ध बैक्टीरिया का निष्पक्ष पता लगाने के लिए है 16S rRNA द्वारा situ संकरीकरण और confocal माइक्रोस्कोपी में.

Abstract

मेजबान म्यूकोसल सतहों और ऊतकों के साथ बैक्टीरिया की बातचीत का दृश्य रोगजनन के तंत्र में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। जबकि संक्रमण के पशु मॉडल में जीवाणु रोगजनकों के दृश्य ऐसे GFP के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इंजीनियर जीवाणु उपभेदों पर भरोसा कर सकते हैं, बायोप्सी या मानव रोगियों से प्राप्त ऊतक के mucosa के भीतर बैक्टीरिया के दृश्य की आवश्यकता है एक निष्पक्ष विधि। यहाँ, हम मानव बायोप्सी वर्गों में ऊतक संबद्ध बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन. इस विधि में एक फ्लोरोसेंट लेबल के साथ situ संकरीकरण (फिश) में फ्लोरोसेंट का इस्तेमाल 16S rRNA के लिए सार्वभौमिक ओलिगोन्यूक्लिओटाइड जांच के लिए मूत्राशय बायोप्सी वर्गों आवर्तक से पीड़ित रोगियों से प्राप्त के भीतर ऊतक संबद्ध बैक्टीरिया लेबल करने के लिए मूत्र पथ संक्रमण। एक सार्वभौमिक 16S RRNA जांच के उपयोग के माध्यम से, बैक्टीरिया प्रजातियों के पूर्व ज्ञान के बिना पता लगाया जा सकता है, वंश, या जैव रासायनिक विशेषताओं, जैसे lipopolysaccharide (LPS), कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों द्वारा पता लगाने के लिए आवश्यक होगा. हम confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के लिए बायोप्सी निर्धारण से 16S rRNA FISH के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल का वर्णन. इस प्रोटोकॉल ऊतक के लगभग किसी भी प्रकार में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और रोगी के ऊतकों में चिकित्सकीय प्रासंगिक जीवाणु-होस्ट बातचीत के निष्पक्ष दृश्य के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है. इसके अलावा, प्रजातियों या वंश-विशिष्ट जांचों का उपयोग करके, इस प्रोटोकॉल को रोगी के ऊतकों के भीतर विशिष्ट जीवाणु रोगजनकों का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

मूत्रमार्ग, मूत्राशय, मूत्रवाहिनी और गुर्दे से मिलकर मूत्र पथ लगातार बैक्टीरिया है कि मूत्र microbiome शामिल करने के साथ ही यूरोपैथोजनक ई. कोलाई (UPEC) की तरह, यूरोपैथोजेनिक ई. कोलाई (UPEC) की तरह, के संपर्क में लगातार है 1,2. हाइड्रेटेड श्लेष्म की एक परत जिसमें ग्लाइकोसामिनोग्लीकन्स और ग्लाइकोसिलेटेड यूरोप्लाकिन प्रोटीन का एक अपारगम्य पट्टिका होती है जो सतही कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त की जाती है, एक अवरोध बनाती है जो नियमित रूप से मूत्राशय उपकला को अनुलग्न द्वारा आक्रमण से बचाती है। बैक्टीरिया3,4. मूत्र पथ के संक्रमण (यूटीआई) के दौरान, इन बाधाओं को परेशान या नष्ट कर रहे हैं, uropathogenic बैक्टीरिया5,6द्वारा मूत्राशय उपकला के लगाव और आक्रमण की सुविधा. Murine मॉडल में काम से पता चला है कि कई uropathogenic बैक्टीरिया सहित UPEC, Klebsiella निमोनिया, और Enterococcus faecalis सतही कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य के भीतर प्रतिकृति intracellular समुदायों (आईबीसी) फार्म कर सकते हैं और संक्रमणकालीन उपकला कोशिकाओं के भीतर शांत इंट्रासेल्यूलर जलाशय (क्यूआईआर)7,8,9. यद्यपि यू पी पी सी की पहचान मानव यूटीआई रोगियों से शेड उपकला कोशिकाओं के भीतर की गई है , फिर भी मानव में मूत्राशय के श्लेष्म के साथ यूरोपैथोजेन्स की बातचीत को पहले से10कल्पना नहीं की गई थी .

हमने उन्नत के लिए ट्राइगोनिटिस (सीईएफटी) के इलेक्ट्रोफुलगुरेशन के साथ सिस्टोस्कोपी से गुजर ने पोस्टमेनोपॉज़ल रोगियों से प्राप्त मूत्राशय बायोप्सी के श्लेष्म के भीतर बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए एक आम तकनीक, सीटू हाइब्रिडाइजेशन (फिश) में फ्लोरोसेंट अनुकूलित किया। एंटीबायोटिक-रिफ्रैक्टरी आवर्ती यूटीआई11का प्रबंधन | 16S rRNA के लिए एक सार्वभौमिक जांच का उपयोग करना, हम निष्पक्ष आवर्ती यूटीआई रोगियों के मूत्राशय mucosa के साथ जुड़े जीवाणु प्रजातियों का पता लगाने और मूत्राशय की दीवार12के भीतर उनकी स्थिति का निर्धारण करने में सक्षम थे. सार्वभौमिक 16S RRNA न्यूक्लिओटाइड जांच पहले जीवाणु 16S rRNA13के एक संरक्षित क्षेत्र को लक्षित करने के लिए डिजाइन किया गया था, जो ई. कोलाई 16s RRNA के 388-355 पदों से मेल खाती है. 16S RRNA और हाथापाई जांच दृश्यों पहले मान्य किया गया है और माउस जठरांत्र संबंधी मार्ग14,15में उपयोग के लिए प्रकाशित . जाँचों के अनुक्रमों और गुणों का वर्णन सारणी 1में किया गया है। यह इस प्रोटोकॉल में दो अनुक्रमिक वर्गों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है, एक 16S rRNA जांच के लिए और एक हाथापाई जांच के लिए, मूत्राशय उपकला के रूप में सच और पृष्ठभूमि संकेत के बीच भेद करने में सक्षम होने के लिए, कोलेजन और elastin प्रदर्शन autofluorscence16 . इस प्रोटोकॉल में, 16S rRNA और हाथापाई जांच फ्लोरोसेंट एलेक्सा फ्लोर 488 लेबल के साथ डिजाइन किए गए थे दोनों पर 3' और 5' टर्मिनी के माध्यम से एन-hydroxysuccinimide (एनएचएस) एस्टर लिंकेज फ्लोरोसेंट संकेत बढ़ाने के लिए.

हालांकि इस प्रोटोकॉल मानव मूत्राशय बायोप्सी वर्गों पर उपयोग के लिए विकसित किया गया था, यह आसानी से किसी भी ऊतक जहां बैक्टीरिया रहते हैं माना जाता है से पैराफिन-एम्बेडेड वर्गों पर उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रयोगों के विपरीत जो जीवाणु सतह पर विशिष्ट एंटीजन (उदा., lipopolissaccharide) को लक्षित करते हैं, इस विधि के लिए ऊतक-संबद्ध बैक्टीरिया द्वारा व्यक्त एंटीजन के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता नहींहै 10,17 . सार्वभौमिक 16S RRNA जांच का उपयोग नमूने के भीतर सभी जीवाणु प्रजातियों के निष्पक्ष पता लगाने की अनुमति देता है, लेकिन उनकी पहचान के निर्धारण की अनुमति नहीं है. पता लगाया बैक्टीरिया की पहचान निर्धारित करने के लिए, प्रजातियों या जीनस-विशिष्ट 16S या 23S RNA जांच का इस्तेमाल किया जाना चाहिए. यह प्रोटोकॉल मेजबान ऊतक से जुड़े फंगल रोगजनकों, जैसे कैंडिडा एल्बिकन्सका भी पता नहीं लगाएगा। कवक रोगजनकों का पता लगाने के लिए, 28S या 18S RRNA जांच18इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

Protocol

अध्ययन प्रोटोकॉल द्वारा अनुमोदित किया गया था और यूटी डलास और यूटी दक्षिण पश्चिमी चिकित्सा केंद्र के संस्थागत जैव सुरक्षा और रासायनिक सुरक्षा समितियों के दिशा निर्देशों का पालन किया. इस प्रोटोकॉल में मानव विषयों से बायोप्सी के उपयोग को यूटी डलास और यूटी दक्षिण पश्चिमी चिकित्सा केंद्र के संस्थागत समीक्षा बोर्डों के दिशानिर्देशों के द्वारा अनुमोदित और पीछा किया गया था। बायोप्सी संग्रह और प्रसंस्करण के साथ शामिल सभी व्यक्तियों वर्तमान मानव विषय संरक्षण (HSP) और HIPPA प्रशिक्षण है.

1. फिक्सिंग और पैराफिन एम्बेडिंग के लिए ऊतक तैयारी

नोट: बायोप्सी आवर्तक मूत्र पथ संक्रमण (आरयूटीआई) के उन्नत प्रबंधन के लिए ट्राइगोनिटिस के इलेक्ट्रो-फुलगुरेशन के साथ सिस्टोस्कोपी से गुजर रही महिलाओं की सहमति से लिया गया था। RUTI को 12 महीने की अवधि में 3 यूटीआई के रूप में परिभाषित किया गया है। बायोप्सी संग्रह ऑपरेटिंग रूम में किया गया था, जबकि रोगी UTSW आईआरबी प्रोटोकॉल STU 082010-016 प्रति सूचित रोगी सहमति प्राप्त करने के बाद संज्ञाहरण के तहत किया गया था। सभी नमूनों कोडित और प्रयोग करने से पहले de-पहचान की गई थी.

  1. एक ठंडा कप ($1 मिमी3) मूत्राशय ट्राइगोन से लचीला सिस्टोस्कोप के माध्यम से यूरोलॉजिक बलप्स के साथ बायोप्सी प्राप्त करें और तुरंत एक बाँझ 2 एमएल क्रायोविएल में रखें जिसमें 4% वी/v पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) 1x बाँझ फॉस्फेट बफर ेड नमकीन में तैयार किया गया है। (पीबीएस)।
    नोट: 1x पीबीएस में 4% पीएफए अग्रिम में बनाया जा सकता है और जरूरत जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. कमरे के तापमान पर 6 एच के लिए बायोप्सी को ठीक करें या 4 डिग्री सेल्सियस पर 16-24 ज के लिए।
    नोट: ऊतक नमूने के आकार के आधार पर फिक्सेशन अवधि की गणना की जानी चाहिए और अधिक निर्धारण से बचा जाना चाहिए। यह एक स्थिर के रूप में glutaraldehyde का उपयोग करने की सलाह नहीं है के रूप में यह autofluorence परिचय.
  3. एक बाँझ हुड या जैव सुरक्षा कैबिनेट में, पाइपिंग द्वारा फिक्सेटिव को हटा दें और बाँझ 1x पीबीएस के 1.5 एमएल के साथ बदलें। नमूनों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें या तुरंत19को टिश्यू प्रोसेसिंग और पैराफिन को पूरा करें .
  4. 5 डिग्री मीटर मोटाई पर अनुभाग ऊतक ब्लॉक करने के लिए एक बाँझ microtome का प्रयोग करें और ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड चार्ज करने के लिए पैराफिन ऊतक वर्गों का पालन करें। बायोप्सी प्रति दो स्लाइड की एक न्यूनतम 16S rRNA FISH प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक हो जाएगा.
    नोट: बायोप्सी ऊतक पार अनुभागीय काटने विमान के सापेक्ष व्यवस्था की जानी चाहिए ताकि सभी वर्गों में यूरोथेलियल परतों के दृश्य सुनिश्चित करने के लिए. यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि अनुभाग मोटाई जीवाणु समुदाय का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. संक्रमण के मामले में कई सीरियल सेक्शनों या नमूने के नमूने की आवश्यकता हो सकती है जहां ऊतक-निवासी बैक्टीरिया बेहद दुर्लभ हैं (उदा., और 1 ऊतक-निवासी जीवाणु प्रति 1,000 स्तनधारी कोशिकाओं)।

2. यूनिवर्सल 16S RRNA जांच के साथ Situ हाइब्रिडाइजेशन में फ्लोरोसेंट

नोट: बायोप्सी प्रति दो स्लाइड की आवश्यकता है. एक स्लाइड सार्वभौमिक 16S rRNA जांच के लिए और एक स्लाइड एक हाथापाई अनुक्रम के साथ एक नियंत्रण जांच के लिए की जरूरत है. यह माइक्रोस्कोपी के दौरान पृष्ठभूमि संकेत से सही संकेत भेद के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि मूत्राशय उपकला कई चैनलों में ऑटो-फ्लोरोसेंट है। हाथापाई जांच के अलावा, बढ़ते से पहले 0.1% सूडान ब्लैक बी के साथ अवरुद्ध ऊतक20में निहित पृष्ठभूमि autofluorence कम कर सकते हैं .

  1. अभिकर्मकों और धूआं हुड की तैयारी
    1. 70% इथेनॉल के साथ एक खाली धूआं हुड (या उचित रूप से फिट जैव सुरक्षा कैबिनेट) को साफ करें।
    2. बंध्य फिल्टर किए गए पानी के 10 एमएल में 0.9 एम सोडियम क्लोराइड (NaCl), 20 एम एम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 7.2), 0.1% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) शामिल संकरीकरण बफर तैयार करें।
      नोट: स्टराइल-फिल्टर्ड जल को 0ण्22 डिग्री सेल्सियस फिल्टर के माध्यम से ऑटोक्लेवित आसुत जल को पार करके तैयार किया जा सकता है। संकरीकरण बफर कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन एसडीएस समाधान से वेग हो सकता है। यदि एसडीएस वेग, उपयोग करने से पहले एक 50 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में समाधान गर्म.
    3. धोया, autoclaved बोतलों में बाँझ फ़िल्टर किए गए पानी में कम से कम 100 एमएल प्रत्येक 95% और 90% इथेनॉल तैयार करें।
    4. 10 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 8.0) और 1 एमएम एथिलीनडिऐथिलीडिएन्ट्राऐसीटिक एसिड (ईडीटीए) बफर (टीई) में तैयार 10 0 एम ट्राइलफिल्ड क्लाइफिल्ड जांचको भंग करें। इस प्रोटोकॉल में उपयोग के लिए टीई बफर में 1 डिग्री सेल्सियस का कमजोर पड़ने की तैयारी करें। प्रकाश से सुरक्षित -20 डिग्री सेल्सियस पर 100 डिग्री सेल्सियस केंद्रित स्टॉक और 1 डिग्री सेल्सियस स्टॉक पुनर्गठित जांचों को स्टोर करें।
      नोट: पानी में फ्लोरोसेंट लेबल जांच भंग न करें। बफरिंग एन एच एस एस्टर बांड न्यूक्लिओटाइड जांच करने के लिए फ्लोरोफोर संयोजन के हाइड्रोलिसिस को रोकने के लिए आवश्यक है।
    5. 70% इथेनॉल के साथ साफ पांच Coplin जार, सूखी करने के लिए अनुमति देते हैं, लेबल के रूप में इस प्रकार है: xylenes मैं, xylenes द्वितीय, 95% EtOH, 90% EtOH, डीडीएच2हे, और उचित समाधान के 100 एमएल के साथ भरें. यह बाद के चरणों में भ्रम से बचने में मदद मिलेगी।
  2. ऊतक वि-पैराफिनाइजेशन और पुनर्जलीकरण
    1. हुड में, एक ऊर्ध्वाधर स्लाइड रैक में बायोप्सी प्रति दो स्लाइड रखें।
    2. 10 मिनट के लिए xylenes मैं Coplin जार (xylenes के 100 एमएल युक्त) में एक ऊर्ध्वाधर स्लाइड रैक प्लेस.
    3. xylenes मैं से स्लाइड रैक निकालें और अतिरिक्त xylenes को दूर करने के लिए एक कागज तौलिया पर नीचे धब्बा. 10 मिनट के लिए xylenes द्वितीय Coplin जार में रखें.
      नोट: कभी एक प्रमाणित धूआं हुड के बाहर xylenes के साथ काम करते हैं.
    4. लगातार इथेनॉल washes में deparaffinized ऊतक वर्गों को फिर से हाइड्रेट (95% और 90%) 10 मिनट के लिए क्रमशः में प्रत्येक कोपलिन जार लेबल.
      नोट: इस चरण के दौरान, गर्म हाइब्रिडाइजेशन बफर एक पानी के स्नान में 50-56 डिग्री सेल्सियस के लिए
    5. 90% इथेनॉल धोने से स्लाइड रैक निकालें, अतिरिक्त इथेनॉल को हटाने के लिए कागज तौलिए पर नीचे धब्बा, और डीडीएच2ओ कोपलिन जार में जगह है जिसमें 10 0 0 एमएल फिल्टर-स्टरलाइज़्ड डीडीएच2ओ के लिए 10 मिनट है।
    6. जबकि ddH2हे धोने के लिए इंतजार कर, धुंधला समाधान बनाने के लिए संकर बफर में 10 एनएम के लिए जांच पतला. प्रति स्लाइड धुंधला समाधान के 150 $L तैयार करें।
      नोट: एल्यूमीनियम पन्नी में ट्यूब लपेटकर और एक दराज में भंडारण द्वारा प्रकाश से धुंधला समाधान को सुरक्षित रखें। जब फ्लोरोसेंट के साथ काम कर रहे बेंचटॉप पर जांच लेबल, जब सक्षम ओवरहेड लाइट बंद करने पर विचार करें. संकरीकरण बफर में पतला जांच फिर से इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए.
  3. हाइब्रिडीकरण और काउंटर-स्टेनिंग
    1. एक P1000 टिप बॉक्स के जलाशय में भिगो, crumpled Kimwipe और बाँझ पानी रखकर प्रत्येक जांच के लिए एक humidifying कक्ष तैयार करें. शीर्ष पर टिप धारक कारतूस प्लेस - यह वह जगह है जहाँ स्लाइड बैठ जाएगा.
      नोट: यह संकरीकरण के दौरान बाहर सुखाने से बायोप्सी वर्गों को रोकने के लिए एक humidifying कक्ष का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध humidifier कक्षों के लिए एक स्थिर, आर्द्र वातावरण बनाए रखने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं. हालांकि, तकनीक यहाँ विस्तृत पर्याप्त रूप से कम लागत पर आर्द्रता को नियंत्रित करता है.
    2. स्लाइड रैक से स्लाइड निकालें और एक ताजा कागज तौलिया (ऊतक साइड अप) पर जगह है। स्लाइड को सुखाने के लिए एक Kimwipe का उपयोग करें। केवल धीरे के पास डब करने के लिए सावधान रहें (पर नहीं) बायोप्सी अनुभाग दूर पानी बात करने के लिए. एक हाइड्रोफोबिक कलम का उपयोग करना, बायोप्सी अनुभाग के चारों ओर एक सीमा आकर्षित और स्लाइड ऊतक साइड humidifying कक्ष में जगह है.
      नोट: जल्दी से काम करें ताकि ऊतक संकरीकरण से पहले सूख न सकें।
    3. humidifying कक्ष को 50 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक इनक्यूबेटर में रखें। पिपेट 50-150 डिग्री सेल्सियस दाग समाधान के सीधे ऊतक के शीर्ष पर इतना है कि ऊतक के आसपास hydrophobic सीमा द्वारा किए गए आयत भर जाता है. हाइड्रोफोबिक सीमा को ओवरफ्लो करने के लिए बहुत अधिक समाधान नहीं जोड़ने के लिए सावधान रहें। बॉक्स को धीरे से बंद करें।
    4. अंधेरे में 50 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ($ 16 ज)। यदि इनक्यूबेटर में एक खिड़की है, तो एक अंधेरे वातावरण बनाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ इसे कवर करें।
      नोट: FISH जांच के पिघलने के तापमान से नीचे एक संकरीकरण तापमान विश्वसनीय संकेत के लिए आवश्यक है। 50 डिग्री सेल्सियस सार्वभौमिक 16S rRNA जांच के लिए इष्टतम तापमान है, लेकिन अन्य जांच के लिए इष्टतम नहीं हो सकता है।
    5. अगले दिन सुबह, वॉश बफर के कम से कम 500 एमएल तैयार 0.9 एम NaCl, 20 एम एम Tris-HCl (पीएच 7.2) ddH2हे में शामिल है और फिल्टर एक वैक्यूम बोतल-टॉप फिल्टर के साथ एक बाँझ बोतल में बाँझ. एक पानी के स्नान में 50-56 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म।
    6. humidifying कक्षों से स्लाइड निकालें और ध्यान से दूर एक Kimwipe के साथ किसी भी शेष संकरीकरण समाधान बात. एक ऊर्ध्वाधर धुंधला रैक में स्लाइड प्लेस.
    7. एक अपारदर्शी Coplin जार में धुंधला रैक 10 मिनट के लिए पूर्व गर्म धो बफर के 100 एमएल युक्त रखें. यदि Coplin जार अपारदर्शी नहीं हैं (उदाहरण के लिए, कांच), उन्हें ऊष्मायन चरणों के दौरान अंधेरे में जगह - शायद एक बॉक्स के नीचे या एक दराज में.
    8. नए Coplin जार में ताजा धोने बफर के साथ दो बार धोने कदम दोहराएँ.
    9. धोने के चरणों के दौरान, Hoechst 33342 1:1,000 धोने बफर में एक 100 g/mL स्टॉक समाधान को कम करके काउंटर दाग तैयार करें। एक ही ट्यूब करने के लिए, एलेक्सा-555 गेहूं रोगाणु agglutinin (WGA) की एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ें 5g/mL और Alexa-555 Phaloidin 33 एनएम के एक अंतिम एकाग्रता के लिए. अंधेरे में स्टोर जब तक उपयोग के लिए तैयार है.
      नोट: Hoechst, Alexa-555 WGA, और Alexa-555 Phaloidin लेबल डीएनए, mucin/uroplakins, और actin, क्रमशः और निर्माता के निर्देशों के अनुसार अंधेरे में लंबी अवधि संग्रहीत किया जा सकता है. जांच और counterstains के लिए इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट लेबल माइक्रोस्कोप के लिए उपलब्ध फिल्टर सेट के लिए अनुकूलित किया जा सकता है इस्तेमाल किया.
    10. पिछले धोने से स्लाइड निकालें और धीरे से दूर एक Kimwipe के साथ अतिरिक्त धोने बफर बात. स्लाइड्स टिश्यू-साइड को एक पेपर तौलिया पर रखें और ऊतक के शीर्ष पर सीधे 50-150 डिग्री सेल्सियस प्रति-दाग जोड़ें ताकि हाइड्रोफोबिक बॉर्डर भर जाए, लेकिन ओवरफ्लो न हो। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एक क्रायोबॉक्स-टॉप और इनक्यूबेट के साथ चार स्लाइड तक कवर करें।
    11. किनारों को वापस धुंधला रैक में रखें और ताजा वॉश बफर के साथ कोपलिन जार में दो बार और धोएं, 10 मिनट प्रत्येक के लिए।
    12. पिछले धोने के बाद स्लाइड को अच्छी तरह से सुखाएं और एक क्रायोबॉक्स-टॉप के नीचे एक पेपर तौलिया पर टिश्यू-साइड रखें। सीधे ऊतक के शीर्ष पर बढ़ते मीडिया की एक बूंद निचोड़. धीरे से शीर्ष पर एक उचित आकार कवरलिप जगह (बायोप्सी आकार पर निर्भर करेगा)। वे इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप करते हैं और अंधेरे में रात भर इलाज करने के लिए कवर-स्लिप स्लाइड की अनुमति देगा के रूप में किसी भी बुलबुले बाहर धीरे से प्रेस।
    13. अगले दिन, स्पष्ट नेल पॉलिश के एक हल्के कोट के साथ स्लाइड करने के लिए कवरस्लिप के किनारों को सील करें। अंधेरे में 10 मिनट के लिए सूखने की अनुमति दें और फिर कॉनफोकल माइक्रोस्कोपी के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें।

3. Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा 16S rRNA FISH का दृश्य

नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, सबसे अच्छा परिणाम 63x और 100x उद्देश्यों के साथ एक लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त कर रहे हैं. Hoechst, Alexa-488, और Alexa-555 फ्लोरोसेंट के दृश्य के लिए उचित फिल्टर सेट की आवश्यकता है. हालांकि, मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी इस्तेमाल किया जा सकता है अगर एक confocal माइक्रोस्कोप उपलब्ध नहीं है. इस प्रोटोकॉल एक लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप के लिए है.

  1. निर्माता निर्देशों के अनुसार माइक्रोस्कोप से संबद्ध confocal माइक्रोस्कोप और कंप्यूटर सॉफ्टवेयर पर स्विच करें।
  2. स्लाइड लोड करें और नीले (DAPI/Hoechst) चैनल में 10x उद्देश्य के साथ कल्पना करें। ध्यान से ध्यान से ध्यान केंद्रित जब तक नाभिक दिखाई दे रहे हैं.
  3. एक बार ध्यान केंद्रित, उच्च आवर्धन (63x या 100x) के लिए उद्देश्य बदल जाते हैं। कवर स्लिप के शीर्ष पर तेल डालें। नए उद्देश्य के साथ Refocus, सुनिश्चित करें कि उद्देश्य लेंस तेल के साथ संपर्क में आता है, जबकि ध्यान केंद्रित कर रही है.
    नोट: केवल ठीक उच्च आवर्धन (63x या 100x) पर ध्यान केंद्रित का प्रयोग करें. तेल का उपयोग केवल तेल उद्देश्य के लिए किया जाना चाहिए।
  4. जल्दी से हरे रंग में आंख टुकड़ा के माध्यम से प्रत्येक स्लाइड का आकलन (eGFP/Alexa-488) चैनल जो स्लाइड FISH सकारात्मक हैं और जो FISH नकारात्मक हैं निर्धारित करने के लिए.
    नोट: यह सबसे अच्छा है अगर इस प्रारंभिक आकलन / स्कोरिंग प्रयोगात्मक पूर्वाग्रह को कम करने के लिए एक अलग व्यक्ति द्वारा अंधा किया जाता है।
  5. दाग बायोप्सी छवि के लिए, एक FISH सकारात्मक स्लाइड के साथ शुरू करने और कंप्यूटर दृश्य मोड में स्विच. 405 (Hoechst), 488 (एलेक्सा-488), 555 (एलेक्सा-555) चैनलों का चयन करें। इस मामले में 555, सबसे लंबे समय तक तरंगदैर्ध्य चैनल का उपयोग कर pinhole सेट करें। 488 चैनल में लेबल बैक्टीरिया के दृश्य के लिए सही फोकल विमान का पता लगाएं। फोकल विमान को बदलने के बिना, लाभ सेट, लेजर शक्ति, और प्रत्येक चैनल के लिए ऑफसेट इस तरह है कि संकेत संतृप्त नहीं है, और पृष्ठभूमि पर सुधार नहीं है. सभी तीन चैनलों में छवि प्राप्त करें.
    नोट: एक प्रयोग में हर स्लाइड छवि के लिए 488 चैनल के लिए एक ही सेटिंग्स का उपयोग करें. लेजर शक्ति 405 और 555 चैनलों में समायोजन की आवश्यकता हो सकती है अगर क्षेत्रों के बीच जीवाणु दृश्य परिवर्तन के लिए इष्टतम फोकल विमान.
  6. अतिरिक्त क्षेत्रों पर दोहराएँ जब तक पूरे उपकला सतह के चित्र प्राप्त.
    नोट: आप फोकल विमान थोड़ा बदलने के लिए विभिन्न क्षेत्रों में लेबल बैक्टीरिया कल्पना करने के लिए हो सकता है, लेकिन लाभ, लेजर शक्ति, या खेतों के बीच 488 चैनल के लिए ऑफसेट कभी नहीं बदल. यदि एक confocal माइक्रोस्कोप पर काम कर रहे हैं, यह जानकारीपूर्ण हो सकता है पर कब्जा करने के लिए एक $-स्टैक इतना है कि ऊतक के भीतर बैक्टीरिया के तीन आयामी स्थानीयकरण का विश्लेषण किया जा सकता है.
  7. प्रक्रिया छवियों और ImageJ या इसी तरह के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ऊतक के साथ जुड़े के भीतर लेबल बैक्टीरिया मात्रा. छवियों के न्यूनतम प्रसंस्करण की सिफारिश की है (जैसे, विभाजन / सभी सुधार या अन्य परिवर्तन छवियों के बीच संगत रहना चाहिए.

Representative Results

प्रोटोकॉल पैराफिन-एम्बेडेड मूत्राशय बायोप्सी वर्गों में मूत्राशय mucosa के साथ जुड़े बैक्टीरिया के निष्पक्ष पता लगाने के लिए अनुकूलित किया गया है। चित्र 1 आवर्ती मूत्र पथ के संक्रमण के साथ महिलाओं से प्राप्त मूत्राशय बायोप्सी के वर्गों पर इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक प्रयोग से प्रतिनिधि confocal micrographs दर्शाया गया है. दो धारावाहिक वर्गों या तो सार्वभौमिक 16S rRNA (ऊपरी पैनलों) या हाथापाई (कम पैनलों) जांच के साथ संकरित किया गया. ऊतक के एक ही क्षेत्र से छवियाँ ले जाया गया और बैक्टीरिया (हरा) 16S rRNA जांच के साथ संकर ऊतक में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं और नहीं हाथापाई जांच के साथ. चित्र 2 एक झूठे धनात्मक परिणाम का प्रतिनिधित्व करता है। autofluorescent कोलेजन या elastin के लिए इसी संकेत दोनों 16S rRNA और हाथापाई जांच-हाइब्रिड बायोप्सी वर्गों में 405 और 488 चैनलों में पाया जाता है हमेशा एक हाथापाई जांच नियंत्रण का उपयोग कर के महत्व पर प्रकाश डाला.

जांच अनुक्रम Tm फ्लोरोफोर संबंध
यूनिवर्सल 16S rRNA 5'-जीसीटीजीसीसीसी
GTAGGAGT-3'		 54.9 एलेक्सा-488 (5' और 3') एन एच एस एस्टर
संघर्ष 5'-ACTCCTACGG
GAGGC-3'		 ना एलेक्सा-488 (5' और 3') एन एच एस एस्टर

तालिका 1: मछली जांच दृश्यों और विशेषताओं। टी एम पिघलने के तापमान को इंगित करता है और एनएचएस एन-हाइड्रोक्सीसिसिनीमाइड के लिए एक संक्षिप्त नाम है।

Figure 1
चित्र 1: सार्वभौमिक 16S rRNA के FISH के प्रतिनिधि confocal micrographs और एक मानव मूत्राशय बायोप्सी में हाथापाई जांच. Actin और Mucin लाल रंग में लेबल कर रहे हैं, सेलुलर नाभिक नीले रंग में लेबल कर रहे हैं, और हरे रंग में बैक्टीरिया. ऊतक संबद्ध बैक्टीरिया केवल 16SrRNA जांच के साथ पता चला रहे हैं और नहीं हाथापाई. 63x आवर्धन पर ली गई छवियाँ. स्केल बार $ 20 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एक मानव मूत्राशय बायोप्सी में झूठी सकारात्मक हरी autofluorscence के प्रतिनिधि confocal micrographs. Actin और mucin लाल रंग में लेबल कर रहे हैं, सेलुलर नाभिक नीले रंग में लेबल कर रहे हैं, और बैक्टीरिया और extracellular मैट्रिक्स के autofluorescent घटकों (उदा., कोलेजन और elastin) हरे हैं. ग्रीन फ्लोरोसेंट दोनों 16S rRNA और हाथापाई जांच एक झूठी सकारात्मक परिणाम का संकेत के साथ मनाया जाता है. छवियाँ 63x आवर्धन पर लिया जाता है. स्केल बार $ 20 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहाँ, हम मानव मूत्राशय बायोप्सी में ऊतक संबद्ध बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन द्वारा 16S rRNA FlSH. इस प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य ऊतकों से ली गई बायोप्सी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे जठरांत्र संबंधी मार्ग या त्वचा, और स्तनधारी मॉडल जीवों की एक किस्म से काटा ऊतकों के लिए बढ़ाया जा सकता है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल भी कई निर्धारण के उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, formalin, इथेनॉल, methacarn) और ऊतक तैयारी तकनीक (उदाहरण के लिए, पैराफिन या राल एम्बेडेड, और cryopreserved ऊतकों). डबल लेबल सार्वभौमिक 16S RRNA जांच ऊतक के भीतर मौजूद सभी जीवाणु प्रजातियों के निष्पक्ष पता लगाने के लिए अनुमति देता है और कैसे रोगजनकों और microbiota स्थानिक रूप से रोग और स्वस्थ में mucosal सतहों के साथ बातचीत में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं राज्यों. इस तरह के probeBase, PhylOPDb या प्रजातियों या वंश-विशिष्ट 16S या 23S RNA जांच के चयन या डिजाइन के लिए ARB सॉफ्टवेयर पैकेज के प्रोब जेड डिजाइन उपकरण के रूप में संसाधनों का उपयोग करना, इस प्रोटोकॉल विशिष्ट जीवाणु प्रजातियों या वंश का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ऊतक15,21,22के भीतर . इस विधि के लिए एक महत्वपूर्ण भविष्य की दिशा प्रजातियों का उपयोग कर multiplexing है- या वंश-विशिष्ट जांच मूत्राशय श्लेष्म के भीतर माइक्रोबियल विविधता के मूल्यांकन के लिए अलग, असतत फ्लोरोफोर के साथ लेबल.

मानव नमूनों पर उपयोग के लिए इस विधि की प्राथमिक सीमा बायोप्सी ऊतक की उपलब्धता है। संस्थागत समीक्षा बोर्ड अनुमोदन और सूचित रोगी सहमति बायोप्सी प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं और प्रक्रिया प्रदर्शन चिकित्सक के साथ प्रत्यक्ष सहयोग इष्टतम नमूना संग्रह और रोगी मेटाडेटा के लिए उपयोग के लिए आवश्यक है. CEFT प्रक्रिया ही मूत्राशय उपकला को नष्ट कर देता है तो हम प्रक्रिया से पहले इन क्षेत्रों की बायोप्सी का औचित्य साबित करने में सक्षम थे. एक धूआं हुड या उचित रूप से फिट जैव सुरक्षा कैबिनेट deparaffinization कदम में विषाक्त xylenes के उपयोग और प्रक्रिया के दौरान एक बाँझ वातावरण बनाए रखने की जरूरत के कारण इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक है. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप, अधिमानतः confocal, एक 63x या एक 100x उद्देश्य और Hoechst, Alexa-555, और Alexa-488 के दृश्य के लिए उपयुक्त फिल्टर सेट के साथ इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक है. चित्र 1 में चित्रित प्रतिनिधि परिणामों को लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया गया था। इसी तरह लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप तुलनीय छवियों का उत्पादन करना चाहिए. इस प्रोटोकॉल केवल ऊतक संबद्ध बैक्टीरिया का पता लगाने की क्षमता द्वारा सीमित है और नहीं, उदाहरण के लिए, कवक. जांच विशिष्ट कवक 18S या 28S rRNA ऊतक18के भीतर कवक रोगजनकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए .

इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण कदम प्रक्रिया के दौरान एक बाँझ वातावरण को बनाए रखने और यह सुनिश्चित करना है कि ऊतक संकरीकरण और धुंधला कदम के बीच बाहर सूखी नहीं है शामिल हैं. यदि प्रक्रिया के दौरान ऊतक सूख जाता है, तो सिग्नल कम हो सकता है या ऊतक धोने के चरण के दौरान स्लाइड से गिर सकता है। यह भी हमेशा इस प्रोटोकॉल के लिए दो सीरियल वर्गों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है - एक 16S rRNA जांच के लिए और एक हाथापाई जांच के लिए. इस नियंत्रण के बिना, यह झूठी सकारात्मक भेद करने के लिए बहुत मुश्किल हो सकता है और प्राप्त डेटा उपयोगी या जानकारीपूर्ण नहीं हो सकता है. यदि इस प्रोटोकॉल सार्वभौमिक 16S rRNA जांच के अलावा अन्य एक जांच के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा रहा है, देखभाल एक उपयुक्त संकरीकरण तापमान का चयन करने के लिए लिया जाना चाहिए, लगभग 5 डिग्री सेल्सियस जांच की भविष्यवाणी पिघलने के तापमान से कम. संकेत तीव्रता बनाए रखने के लिए, जांच के बाद लंबे समय तक प्रकाश के संपर्क में नहीं होना चाहिए और माइक्रोस्कोपी के दौरान ओवरexposed नहीं होना चाहिए। अंत में, माइक्रोस्कोपी के दौरान FLUOROFसे के लिए इसी चैनल के लिए एक ही सेटिंग्स FISH जांच करने के लिए संगत प्रयोगात्मक (16S rRNA जांच) और नियंत्रण (स्क्रैम्बल जांच) स्लाइड के बीच संगत रखा जाना चाहिए. रोगी व्युत्पन्न ऊतकों के mucosal सतहों के भीतर बैक्टीरिया के स्थानिक संबंध कल्पना को समझने और मेजबान-रोगजनक बातचीत अंतर्निहित संक्रामक रोग के बारे में नैदानिक रूप से प्रासंगिक hypotheses के निर्माण के लिए महत्वपूर्ण है।

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम प्रोटोकॉल सलाह और तकनीकी सहायता के लिए अमांडा Arute के लिए किम ओर्थ और Marcela डे सूजा सैंटोस शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. यह काम आंशिक रूप से के.पी. द्वारा आयोजित सिस्टम जीव विज्ञान में सेसिल एच और Ida ग्रीन चेयर द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa-555 Phalloidin Invitrogen A34055 Staining Actin
Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA) Invitrogen W32464 Staining Mucin
Bottle top filters Fisher Scientific 09-741-07 Sterilization
Coplin Jar Simport M900-12W Deparaffinization/washing
Coverslips Fisher Scientific 12-548-5M Microscopy
Ethanol Fisher Scientific 04-355-224 Rehydration
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate Fisher Scientific S311-500 TE
Frosted Slides Thermo Fisher Scientific 12-550-343
Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate Invitrogen H21492 Staining Nucleus
Hydrophobic marker Vector Laboratories H-4000 Hydrophobic barrier
Kimwipes Fisher Scientific 06-666-11
Oil Immersol 518 F Fisher Scientific 12-624-66A Microscopy
Paraformaldehyde (16%) Thermo Scientific TJ274997 Fixation
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen P36934 Mounting medium
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10 Hybridization buffer/PBS
Sodium Dodecyl Sulphate Fisher Scientific BP166-500 Hybridization buffer
Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate Fisher Scientific S373-500 PBS
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate Fisher Scientific S369-500 PBS
Syringe VWR 75486-756 Sterilization
Tris-HCl Fisher Scientific BP152-5 TE/Hybridization buffer
Xylene Fisher Chemical X3P-1GAL Deparaffinization
0.22 μm syringe filter Fisher Scientific 09-754-29 Sterilization

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References

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Neugent, M. L., Gadhvi, J., Palmer, K. L., Zimmern, P. E., De Nisco, N. J. Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (152), e60458, doi:10.3791/60458 (2019).

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