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Immunology and Infection

एक तपेदिक आणविक जीवाणु भार परख (टीबी-MBLA)

Published: April 30, 2020 doi: 10.3791/60460
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 4, 1, 1
1Division of Infection and Global Health, School of Medicine, University of St Andrews, 2National Institute for Medical Research (NIMR)-Mbeya Medical Research Centre, 3Instituto Nacional de Saúde (INS), Ministério da Saúde, 4Institute of Biodiversity, Animal Health & Comparative Medicine, College of Medical, Veterinary & Life Sciences, University of Glasgow

Summary

हम थूक की गर्मी निष्क्रियता के बाद किए गए तपेदिक आणविक जीवाणु भार परख परीक्षण का वर्णन करते हैं। हीट इनएक्टिवेशन थूक के नमूने को गैर संक्रामक बनाता है और तपेदिक आणविक परीक्षणों के लिए रोकथाम स्तर 3 प्रयोगशालाओं की आवश्यकता को मिटादेता है।

Abstract

तपेदिक माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी) के कारण होता है, जो संयुक्त राष्ट्र (यूएन) द्वारा एक खतरनाक श्रेणी बी जैविक पदार्थ के रूप में वर्गीकृत एक रोगजनक है । कामगारों की सुरक्षा के लिए, एमटीबी को ले जाने के लिए प्रकल्पित सभी नमूनों की हैंडलिंग रोकथाम स्तर (सीएल) 3 प्रयोगशाला में आयोजित की जानी चाहिए । टीबी आणविक जीवाणु भार परख (टीबी-MBLA) परीक्षण एक रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ मात्रात्मक बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-क्यूपीसीआर) परीक्षण है जो प्राइमर और 16S rRNA के लिए दोहरी लेबल जांच का उपयोग करएमटीबी बेसिलरी लोड की मात्रा निर्धारित करता है । हम टीबी-MBLA के लिए आरएनए को संरक्षित करते समय टीबी के नमूनों को गैर संक्रामक प्रदान करने के लिए गर्मी निष्क्रियता के उपयोग का वर्णन करते हैं। टीबी बेसिली को निष्क्रिय करने के लिए कसकर बंद 15 मिलीस सेंट्रलाइज ट्यूबमें थूक के नमूने का 1 मिलीएल एलिकोट 20 मिन के लिए उबला हुआ है। 42 दिनों तक गर्मी निष्क्रिय और नियंत्रण (लाइव) नमूनों की खेती से टीबी की मौत की पुष्टि हुई। निष्क्रिय नमूना तो निष्कर्षण नियंत्रण के १०० μL के साथ नुकीला है और आरएनए मानक आरएनए अलगाव प्रक्रिया के बाद निकाला जाता है । गर्मी के इलाज के नमूनों की संस्कृतियों में कोई वृद्धि नहीं देखी गई । अलग आरएनए वास्तविक समय आरटी-qPCR के अधीन है, जो एमटीबी 16S rRNA जीन में एक विशिष्ट लक्ष्य को बढ़ाता है, जो क्वांटिफिकेशन चक्र (सीक्यू) के रूप में परिणाम देता है। एक मानक वक्र का उपयोग सीक्यू को बैक्टीरियल लोड में अनुवाद करने के लिए किया जाता है, या अनुमानित कॉलोनी प्रति एमसीएल (ईसीएफयू/एमएल) इकाइयां बनारही है। सीक्यू और एक नमूने के बैक्टीरियल लोड के बीच एक व्युत्क्रम संबंध है। सीमा यह है कि गर्मी निष्क्रियता कुछ कोशिकाओं को उजागर करती है, आरएनए को RNases को उजागर करती है जो और एलटी; 1 लॉग10ईसीएफयू/एमएल (यानी, & 10 CFU/mL) का नुकसान का कारण बनती है । आगे के अध्ययन बहुत कम बोझ वाले रोगियों के अनुपात को निर्धारित करेंगे जो गर्मी निष्क्रियता के कारण झूठे नकारात्मक परिणाम पैदा करते हैं।

Introduction

माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी) के कारण, विश्व स्तर पर तपेदिक (टीबी) के 7 x 106 से अधिक नए मामले सामने आते हैं जिनमें से प्रति वर्ष1,,2से अधिक 1 x 106 मर जाते हैं। इस प्रवृत्ति को पलटने के लिए विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) ने प्रभावी नैदानिक और उपचार उपकरण3विकसित करने सहित तीन स्तंभ दृष्टिकोण शुरू किया । संयुक्त राष्ट्र द्वारा एक खतरनाक जैविक पदार्थ बी के रूप में वर्गीकृत, एमटीबी के लिए सकारात्मक माना नमूनों के साथ काम करने के लिए 3 के रोकथाम स्तर (सीएल) की आवश्यकता होती है । CL3 प्रयोगशालाओं का निर्माण और रखरखाव के लिए महंगा कर रहे हैं । नतीजतन, अधिकांश देशों में क्षेत्रीय या राष्ट्रीय स्तर पर केंद्रीकृत टीबी संस्कृति सेवाएं हैं । इसका मतलब यह है कि धब्बा माइक्रोस्कोपी परिधीय स्वास्थ्य सुविधाओं में सबसे उपलब्ध नैदानिक उपकरण है।

स्तर 4 स्वास्थ्य सुविधाओं पर एक्सपीर्ट एमटीबी/आरआईएफ जैसे तेजी से आणविक परीक्षणों को लागू करने के लिए डब्ल्यूएचओ की मंजूरी है, जो ज्यादातर जिला स्तर4,,5पर स्थित है । कुछ जिले काफी बड़े और कुछ लोगों के लिए कम सुलभ हैं । जबकि फायदेमंद एक्सपीर्ट एमटीबी/आरआईएफ एमटीबी डीएनए का पता लगाकर काम करता है। डीएनए एक स्थिर अणु है जो कोशिकाओं की मृत्यु के बाद लंबे समय तक जीवित रहता है और इस प्रकार उपचार प्रतिक्रिया5,6की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण व्यवहार्य कोशिकाओं को मापने के लिए एक अच्छा मानक नहीं है । आरएनए आधारित परखव्यवहार्य कोशिकाओं7,8,,9,10,11,,1212,13के सटीक माप नहोने का विकल्प प्रदान करते हैं । आरएनए अलग-अलग स्थिरता की विभिन्न प्रजातियों में मौजूद है: राइबोसोमल आरएनए (आरएनए), स्थानांतरण आरएनए (टीआरएनए), और मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए)। मैसेंजर आरएनए जीन अभिव्यक्ति से जुड़ा हुआ है और इस प्रकार सेल गतिविधि और व्यवहार्यता14से सबसे निकटता से जुड़ा हुआ है । यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि जीन अभिव्यक्ति का अभाव कोशिका मृत्यु के बराबर नहीं है क्योंकि एमटीबी जैसे रोगजनक निष्क्रिय (निष्क्रिय) लेकिन व्यवहार्य राज्यों15,16में मौजूद हैं। इसलिए आरएनए जैसी स्थिर आरएनए प्रजातियां व्यवहार्य कोशिकाओं के सक्रिय और निष्क्रिय दोनों राज्यों के बेहतर मार्कर हैं।

एस्चेरिचिया कोलाईका उपयोग करते हुए, शेरीडान ने दिखाया कि 16S rRNA आनुपातिक रूप से कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) द्वारा मापा बैक्टीरियल विकास के साथ वृद्धि हुई17गिना जाता है । वहां CFU मायने रखता है और 16S rRNA में एक समवर्ती गिरावट थी जब ई. कोलाई बैक्टीरिया एंटीबायोटिक दवाओं के संपर्क में थे । सेल डेथ के बाद आरएनए में गिरावट एक संकेतक थी कि इसे सेल व्यवहार्यता13,17के लिए मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता था । इस सिद्धांत से ड्राइंग, टीबी आणविक जीवाणु भार परख (टीबी-MBLA) को एंटी टीबी थेरेपी11,,18,19पर रोगियों के लिए उपचार प्रतिक्रिया के मार्कर के रूप में व्यवहार्य टीबी बेसिलरी लोड को मापने के लिए एम तपेदिक 16S rRNA को लक्षित करने के लिए विकसित किया गया था ।, हमने टीबी-MBLA को एक सेलुलर निष्कर्षण नियंत्रण को शामिल करने के लिए आगे विकसित और अनुकूलित किया है जो एम तपेदिक बेसिली के लिसिस को दर्शाता है और20विभिन्न पर्यावरणीय सेटिंग्स में मजबूत है । टीबी-MBLA प्रक्रिया एमटीबी से आरएनए अलगाव के पहले कदम के लिए एक CL3 प्रयोगशाला में आयोजित किया जाना है जब तक एमटीबी कोशिकाओं को पूरी तरह से श्रमिकों की सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए lysed हैं की आवश्यकता है । इसमें भूतलक्षी बैचेड विश्लेषण के लिए नमूना संरक्षण भी शामिल है जिसे ग्वानिडीन थिओसाइनेट में -80 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाएगा, जो एक स्तर 4 विषाक्त पदार्थ है। इस उद्देश्य के लिए, हमने टीबी को निष्क्रिय करने और टीबी-MBLA के लिए सुरक्षित नमूनों को धब्बा माइक्रोस्कोपी स्तर की प्रयोगशालाओं में किए जाने के लिए गर्मी का उपयोग किया है ।

प्रयोगशाला और नैदानिक अनुप्रयोगों में गर्मी का उपयोग सदियों से21,22के आसपास किया गया है । हालांकि, एमटीबी जैसे कुछ सूक्ष्मजीवों को मारना कठिन है, और गर्मी के लिए कम जोखिम23,,24सभी कोशिकाओं को मारने के लिए अपर्याप्त है। एक अध्ययन से पता चला है कि 80 डिग्री सेल्सियस पर टीबी संस्कृतियों के 20 मिनट हीटिंग ने पीसीआर25के लिए आवश्यक डीएनए को नष्ट किए बिना सभी एमटीबी बेसिली को मार डाला । इसके बाद, प्रयोगशाला डीएनए निष्कर्षण तकनीकों की एक संख्या वर्तमान में 95 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी। हमने यह दिखाने के लिए एक ही सिद्धांत लागू किया है कि टीबी-MBLA के लिए पर्याप्त आरएनए को संरक्षित करते हुए 80 डिग्री सेल्सियस, 85 डिग्री सेल्सियस या 95 डिग्री सेल्सियस निष्क्रिय एमटीबी पर उबलते टीबी के नमूने लगाए हैं। निष्क्रिय संस्कृति या थूक कमरे के तापमान पर कसकर बंद कंटेनरों में बनाए रखा जा सकता है या मात्रात्मक rRNA की मात्रा को कम किए बिना 7 दिनों के लिए प्रशीतित ।

टीबी-MBLA, वर्तमान में केवल (RUO) परीक्षण के रूप में इस्तेमाल किया अनुकूलनीय है और थूक, फेफड़ों के ऊतकों, और मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी तरल पदार्थ सहित विभिन्न नमूना प्रकार के लिए लागू किया गया है । यह अभी तक ब्रोंकियल एल्वेलर तरल पदार्थ, रक्त और अन्य नमूना प्रकारों पर लागू किया जाना है। नमूने के रूप में थूक का उपयोग करना, अफ्रीका में मल्टीसाइट मूल्यांकन (अप्रकाशित डेटा) और पिछलेप्रकाशनों 18,,26 से परिणाम बताते हैं कि MBLA की संवेदनशीलता माइकोबैक्टीरियम विकास संकेतक ट्यूब (MGIT) तरल संस्कृति के अनुरूप है। हालांकि, टीबी-MBLA तेजी से है, घंटे में परिणाम देने के रूप में दिनों या संस्कृति के हफ्तों के खिलाफ, विशिष्ट, नमूने में गैर टीबी सूक्ष्मजीवों से प्रभावित नहीं है, और रोग की गंभीरता का एक मात्रात्मक उपाय देता है । डब्ल्यूएचओ ने हाल ही में टीबी-MBLA को टीबी उपचार2की निगरानी के लिए धब्बा माइक्रोस्कोपी और संस्कृति की जगह एक उंमीदवार के रूप में मान्यता दी है ।

इस लेख में हम साबिती एट अल27में प्रकाशित गर्मी निष्क्रियता और टीबी-MBLA प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करते हैं। यह विस्तृत प्रोटोकॉल दुनिया भर में टीबी-MBLA उपयोगकर्ताओं के लिए एक बंद दृश्य संसाधन प्रदान करेगा ।

Protocol

1. नमूना तैयारी

  1. संस्कृति
    1. एक स्वच्छ बेंच या कक्षा 1 केबिन पर काम करना, 15 मीटर प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूबों में घातीय चरण बेसिलस कैस्टेलेट-गुएरिन (बीसीजी) संस्कृति की फसल 1 मिलीएल एलिकोट्स। ट्यूबों को कसकर बंद करें।
      नोट: एक पूरे 5 mL नमूने को संसाधित करने के लिए, पांच 15 mL अपकेंद्री ट्यूबों की आवश्यकता होती है।
      सावधानी:किसी भी टीबी संस्कृति के साथ काम करते समय एक जैव सुरक्षा कैबिनेट की आवश्यकता होती है।
  2. रोगी थूक नमूना
    1. एक अच्छी तरह से हवादार अंतरिक्ष में काम करना और नाक का मुखौटा पहनना, ध्यान से नमूना कप खोलें, 1 एमएल एलिकोट को 15 मीटर प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूबों में डालें और ट्यूबों को कसकर बंद करें।
      नोट: थूक को पिपेट करने के लिए एक विस्तृत मुंह टिप की सिफारिश की जाती है। कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करना, एक व्यापक मुंह बनाने के लिए 1 mL टिप मुंह के ठीक हिस्से से क्लिप ।

2. हीट इनएक्टिवेशन

  1. सैंपल तैयार करने से पहले पानी के नहाने को 95 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
    नोट: 95 डिग्री सेल्सियस तापमान RNase गतिविधि को कम करने की संभावना बढ़ जाती है और इस तरह डाउनस्ट्रीम टीबी-MBLA के लिए अधिक आरएनए की रक्षा करता है।
  2. पानी के स्नान में डूबे एक होल्डिंग रैक के लिए नमूना ट्यूबों स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक नमूना ट्यूब का तीन चौथाई पानी में डूब गया है।
  3. 20 न्यूनतम के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबालें, फिर आरएनए निष्कर्षण शुरू करने से पहले कमरे के तापमान पर ठंडा करने के लिए ट्यूबों को बेंच पर स्थानांतरित करें।
    नोट: एम तपेदिक बेसिली और बीसीजी की पूरी गर्मी निष्क्रियता को विकास को सत्यापित करने के लिए ४२ दिनों के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी निष्क्रिय नमूनों और नियंत्रणों को इनक्यूबेटिंग करके सत्यापित किया गया था । 600 एनएम (ओडी600)पर एक ऑप्टिकल घनत्व माप बेसलाइन पर लिया गया था और फिर 42 दिन इनक्यूबेशन अवधि के लिए साप्ताहिक।

3. आरएनए निष्कर्षण

नोट: यहां वर्णित आरएनए निष्कर्षण प्रक्रिया सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध आरएनए किट के लिए है। विभिन्न निर्माताओं द्वारा अन्य उपयुक्त आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग किया जा सकता है।

  1. निष्कर्षण नियंत्रण (ईसी) इसके अलावा
    1. गर्मी निष्क्रिय नमूनों के 1 mL aliquots 1.5 मिलीएल ट्यूबों के लिए स्थानांतरण। प्रत्येक नमूने में ईसी के स्पाइक 100 माइक्रोन, ट्यूब को बंद करें, और ट्यूब को उल्टा 3x द्वारा मिलाएं।
      नोट: ईसी को टीबी-MBLA महत्वपूर्ण बैक्टीरिया किट(सामग्री की तालिका) केसाथ आपूर्ति की जाती है।
  2. सेल तलछट
    1. एक बेंचटॉप माइक्रोसेंट्रिकफ्यूज का उपयोग करना, कमरे के तापमान पर 10 मीटर के लिए 20,000 x ग्राम पर ट्यूबों को अपकेंद्रित करें। सुपरनेट ेंट से पिपेट, तलछट के 50 μL छोड़ ।
    2. ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा lysis बफर के 950 μL में तलछट को निलंबित करें, और आरएनए निष्कर्षण किट(सामग्री की तालिका)के साथ आपूर्ति की lysing मैट्रिक्स ट्यूब में पूरे निलंबन हस्तांतरण। सुनिश्चित करें कि ट्यूब कसकर बंद हो जाएं और ढक्कन और ट्यूब के किनारे दोनों को लेबल करें।
  3. सेल लाइसिस के लिए, ट्यूबों को चरण 3.2.2 से एक समरूपमें स्थानांतरित करें। 6,000 आरपीएम पर 40 एस के लिए नमूनों को समरूप करें।
  4. न्यूक्लिक एसिड शुद्धि
    1. कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए 12,000 x ग्राम पर चरण 3.3 से लाइसेट को सेंट्रलाइज करें।
    2. ताजा 1 mL ट्यूब तैयार करें और प्रत्येक ट्यूब में क्लोरोफॉर्म के 300 माइक्रोन जोड़ें।
    3. 1 एमएल टिप का उपयोग ध्यान से lysing मैट्रिक्स को छूने के बिना supernatant बंद पाइप ।
    4. 5 एस के लिए ट्यूब और भंवर युक्त क्लोरोफॉर्म के लिए अधिनेत स्थानांतरित करें। ट्यूब को 5 मिन या उससे अधिक समय तक व्यवस्थित करने के लिए छोड़ दें जब तक कि तीन चरण (ऊपरी, मध्य और नीचे) स्पष्ट रूप से दिखाई न दें।
    5. कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए 12,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। ध्यान से ऊपरी चरण पिपेट और ताजा 1.5 mL ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    6. चरण 3.4.5 में ट्यूबों के लिए, बर्फ के 500 μL-ठंडा 100% इथेनॉल जोड़ें, ट्यूबों को बंद करें, और धीरे-धीरे 3x को उलटते हुए मिलाएं। ट्यूबों को 15 मिन के लिए -80 डिग्री सेल्सियस या 30 0 0 0 के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और निष्कर्षण जारी रखें, या अगले दिन निष्कर्षण को पूरा करने के लिए रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
    7. माइक्रोसेंटिफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें और सेंट्रलाइज्ड शुरू करने से पहले कम से कम 12 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने के लिए छोड़ दें। ट्यूबों को माइक्रोसेंटरिफ्यूज में लोड करें और 20 मिन के लिए 13,000 x ग्रामपर अपकेंद्रित्र करें। अधिनेता को त्यागें, 70% बर्फ-ठंडे इथेनॉल के साथ बदलें, और 13,000 x ग्रामपर एक और 10 कमर के लिए अपकेंद्री।
      नोट: 70 प्रतिशत इथेनॉल को आणविक ग्रेड न्यूकलीज मुक्त पानी के साथ बनाया जाना चाहिए।
    8. चरण 3.4.7 से सभी अधिनेत को त्यागें और ट्यूबों को 50 डिग्री सेल्सियस पर सेट इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। आरएनए/डीएनए पैलेट को सुखाने के लिए 20 मिन के लिए इनक्यूबेट । सभी इथेनॉल के वाष्पीकरण को सक्षम करने के लिए ट्यूबों को आंशिक रूप से खुला रखें।
    9. सूखे पैलेट में 100 माइक्रोन मुफ्त पानी डालें और कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट करें। सामग्री को मिलाने के लिए 3 एस के लिए भंवर।
      नोट: इस स्तर पर निकालने फ्रिज में 2−3 दिन या अब -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि धारा 3.5 नहीं हो जाती है।
  5. डीएनए हटाने
    नोट:     यह कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि निकालने में डीएनए की उपस्थिति MBLA परिणाम अमान्य है । यह धारा डीएनए रिमूवल किट(टेबल ऑफ मैटेरियल)पर आधारित है ।
    1. नमूनों की संख्या के लिए एंजाइम DNase I 10x बफर और DNase I एंजाइम का मिश्रण तैयार करें (बफर के 10 μL और प्रति नमूना DNase के 1 μL) प्लस 10% अतिरिक्त पाइपटिंग से किसी भी नुकसान को कवर करने के लिए । भंवर से मिलाएं और फिर आरएनए निकालने वाली प्रत्येक ट्यूब में 11 μL को पिपेट करें।
    2. भंवर 3 एस द्वारा मिश्रण और फिर संक्षेप में स्पिन (13,000 x ग्रामपर 10 एस) दीवारों पर किसी भी बूंदों को दूर करने के लिए । हॉट ब्लॉक या इनक्यूबेटर में 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। प्रत्येक ट्यूब में सीधे DNase I एंजाइम का एक अतिरिक्त 1 μL जोड़ें, भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं, और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 30 मीटर के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. DNase निष्क्रियता अभिकर्मक 10 min DNase इनक्यूबेशन के अंत से पहले गल । भंवर 20 एस एक समरूप, दूधिया निलंबन सुनिश्चित करने के लिए और फिर चरण 3.5.2 से प्रत्येक आरएनए निकालने में DNase निष्क्रिय अभिकर्मक के 10 μL जोड़ें।
    4. 5 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण इनक्यूबेट करें भंवर 3x 5 न्यूनतम इनक्यूबेशन चरण के दौरान।
    5. 2 मिनट के लिए 13,000 x ग्राम पर मिश्रण को सेंट्रलाइज करें। किसी भी निष्क्रियता मैट्रिक्स को छुए बिना सुपरनेटेंट को 1.5 मीटर आरएनसे फ्री ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
    6. आरएनए निकालने को फ्रिज में स्टोर करें यदि उसी दिन आरटी-क्यूपीसीआर चलाएं या दीर्घकालिक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर।

4. रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ क्यूपीसीआर

  1. अज्ञात नमूनों के लिए, सभी आरएनए अर्क को कमजोर करें, जिनका उपयोग रनास मुक्त पानी में 1:10 अनुपात में किया जाएगा। 5 एस के लिए भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं और किसी भी बूंदों या हवा के बुलबुले को हटाने के लिए संक्षेप में नीचे स्पिन करें।
  2. एक मानक वक्र के लिए मानक नमूनों के लिए, -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से एमटीबी और ईसी आरएनए मानकों को लें और कमरे के तापमान पर गल जाएं। एमटीबी और ईसी मानक के नमूने क्रमशः सात और छह 10 गुना कमजोर पड़ें। मिश्रण को एक ट्यूब से दूसरे ट्यूब में स्थानांतरित करने से पहले सुझाव बदलें।
    नोट: टीबी-एमएमएएलए किट से मानक नमूनों की आपूर्ति की जाती है।
  3. मास्टर मिक्स तैयारी
    नोट:     मास्टर मिक्स (एमएम) पीसीआर एजेंटों का एक समाधान है जो सभी नमूनों, मानकों और पानी को नो टेम्पलेट कंट्रोल (एनटीसी) के लिए बढ़ाना है। एनटीसी के रूप में उपयोग किया जाने वाला पानी निकासी में और एमएम तैयार करने के लिए एक ही पानी होना चाहिए। यह सुनिश्चित करें कि मानक, प्रत्येक आरएनए नमूना, और इसके दशमलव कमजोर पड़ने रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ सकारात्मक (आरटी +) प्रतिक्रिया के लिए 2x और रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस नकारात्मक (आरटी-) प्रतिक्रिया के लिए 1x परिलक्षित होते हैं। डीएनए हटाने की दक्षता निर्धारित करने के लिए आरटी-प्रतिक्रिया एक नियंत्रण है(तालिका 1)।
    1. प्रत्येक पीसीआर रिएक्शन ट्यूब में एमएम के 16 माइक्रोन ट्रांसफर करें।
    2. प्रत्येक आरटी + और आरटी-रिएक्शन ट्यूब और पानी में आरएनए निकालने के 4 μL को एनटीसी प्रतिक्रिया ट्यूबों में जोड़ें।
    3. प्रतिक्रिया ट्यूबों को वास्तविक समय पीसीआर मशीन में लोड करें और पीसीआर की स्थिति को इस प्रकार सेट करें: 30 मिन के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, 15 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 45 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर 40x चक्र, और हरे और पीले चैनलों में अवशोषित फ्लोरोफोर के साथ अधिग्रहण के साथ 1 मिन के लिए 60 डिग्री सेल्सियस।
      नोट: ग्रीन चैनल एमटीबी डिटेक्शन फ्लोरोफोर है और पीला निष्कर्षण नियंत्रण डिटेक्शन फ्लोरोफोर है।
  4. परिणाम व्याख्या
    नोट:     सुनिश्चित करें कि एक ही नमूने की डुप्लिकेट प्रतिक्रियाएं 1 मानक विचलन से भिन्न नहीं हैं। एमटीबी और ईसी सीक्यू मान 30 से अधिक नकारात्मक माने जाते हैं। तालिका 2में आगे व्याख्या विवरण देखें ।
    1. उपचार प्रतिक्रिया की व्याख्या करने के लिए, मानक वक्र का उपयोग करके सीक्यू मूल्यों को बैक्टीरियल लोड (ईसीएफयू/एमएल) में परिवर्तित करें। उपचार अनुवर्ती अवधि में बैक्टीरियल लोड में परिवर्तन के रूप में उपचार प्रतिक्रिया पढ़ें।
      नोट: उपचार के बाद बैक्टीरियल लोड में गिरावट एक सकारात्मक प्रतिक्रिया (यानी, टीबी बैक्टीरिया को मारने वाली टीबी रोधी दवाओं) का प्रतीक है, जबकि बैक्टीरियल लोड में कोई परिवर्तन या वृद्धि एक नकारात्मक प्रतिक्रिया का तात्पर्य है, जिसका मतलब टीबी रोधी दवाओं के लिए टीबी बैक्टीरिया का प्रतिरोध हो सकता है या रोगी उचित रूप से अपने उपचार की खुराक का पालन नहीं कर सकता है । टीबी-MBLA द्वारा मापा बैक्टीरियल लोड में गिरावट संस्कृति सकारात्मकता (टीटीपी) के लिए MGIT समय में वृद्धि के साथ संबंधित है ।

5. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

  1. हीट इनएक्टिवेटेड संस्कृतियों के 2 एमएल एलिकोट स्थानांतरित करें और 2 मिलीएम माइक्रोसेंट्रोफ्यूज ट्यूबों में नियंत्रण करें। 20,000 x ग्रामपर 10 मिन के लिए सेंट्रलाइज।
  2. अधिनायक को त्यागें और कोशिकाओं को ठीक करने के लिए 5 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर सेल फिक्सेशन बफर के 700 माइक्रोन में पैलेट को निलंबित करें।
  3. एक कठिन गोली प्राप्त करने के लिए 16,000 x ग्राम पर 30 मिन के लिए निलंबन को केंद्राधीक्षक करें। सुपरनेट को त्यागें और फॉस्फेट-बफर्ड लवइन (पीबीएस) में 1% सुक्रोज के साथ बदलें। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए सेक्शनिंग तक छर्रों को 4 डिग्री सेल्सियस पर सुक्रोज में स्टोर करें।
  4. सेक्शनिंग और टेम
    नोट:     नीचे प्रोटोकॉल ग्रिफ़िथ एट अल28से अनुकूलित है ।
    1. क्रायोप्रोटेक्ट सेल पैलेट को पीबीएस में 2.1 मीटर सुक्रोज में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एम्बेड करके सुरक्षित रखें। बर्फ-ठंडे पानी से 3x धोएं।
    2. तरल नाइट्रोजन में क्रायोप्रोटेक्की सेल छर्रों को ठंडा करें और उन्हें क्रायोमाइक्रोटॉमी स्टब्स माउंट करें। क्रायोमाइक्रोटोम का उपयोग करके, 90 एनएम पर अल्ट्राथिन सेक्शन काटें।
    3. पीबीएस में 2% मिथाइल सेल्यूलोज और 2.1 मीटर सुक्रोज के 1:1 मिश्रण के टंगस्टन वायर लूप का उपयोग करके कट अनुभागों को पुनः प्राप्त करें।
    4. धाराओं को पिओलोफॉर्म लेपित 150 मेश हेक्सागोनल कॉपर टेम में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या 5.4.5 कदम पर आगे बढ़ें।
    5. मिथाइल एसीटेट की एक फिल्म में यूरेनल एसीटेट और एयर-ड्राई में ग्रिड के विपरीत। ग्रिडों को बर्फ-ठंडे पानी से धोएं और इसके बाद 5 मिन से अधिक पीबीएस की दो बूंदें और 15−30 0 0 0 00 के लिए सूखी। निर्माता के दिशानिर्देशों का पालन करते हुए टेम के तहत वर्गों की जांच करें।
      नोट: सभी लेबलिंग कदम बर्फ के तापमान (तरल तापमान) पर धुलाई कदम है, जो परिवेश के तापमान पर प्रदर्शन किया गया के अलावा प्रदर्शन किया गया ।

Representative Results

गर्मी सभी एम तपेदिक बेसिली को निष्क्रिय करती है
नियंत्रण के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) समय के साथ वृद्धि हुई, (०.०४ ओडी-०.८५ओडी)और गर्मी निष्क्रिय नमूनों में कोई ओडी परिवर्तन नहीं देखा गया, विकास और क्रमशः कोई वृद्धिOD(चित्रा 1)27को वाचक नहीं दिया गया । इसी तरह, नियंत्रण नैदानिक थूक MGIT में 3 दिन से सकारात्मक वृद्धि हुई, जबकि गर्मी निष्क्रिय नैदानिक नमूनों इनक्यूबेशन के अंत तक सकारात्मक झंडा नहीं था । एमजीआईटी में एमटीबी के विकास की पुष्टि ज़िहल-नीलसन स्मीयर माइक्रोस्कोपी और एंटीजन एमपीटी6429द्वारा की गई थी ।

निष्क्रिय नमूनों में आरएनए 4 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है
गर्मी निष्क्रिय नमूनों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया गया ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि कोशिकाओं की गर्मी निष्क्रियता के बाद आरएनए कम हो जाता है या नहीं। दिन में काटा आरएनए (डी) 0 के बीच कोई अंतर नहीं पाया गया था, जो गर्मी निष्क्रियता के तुरंत बाद और डी 1, 2, 3 और दोनों बीसीजी संस्कृतियों में अलग आरएनए(चित्रा 2ए-सी)और टीबी पॉजिटिव थूक(चित्रा 2डी)में अलग हो गया था।

एक्सोजेनस रनासे गर्मी निष्क्रिय अंशों में आरएनए क्षरण की दर को बढ़ाता है
यह निर्धारित करने के लिए कि आरएनए क्यों अपमानजनक नहीं था, RNase एक एंजाइम को गर्मी निष्क्रियता से पहले और/या बाद में १,००० यू/एमएल पर जोड़ा गया था । इससे बैक्टीरियल लोड के बराबर आरएनए हानि हुई 1.5 ± 0.3 -, 1.8 ± 0.2 -, और 1.3 ± 0.1 - लॉग 10 ईसीएफयू/एमएल क्रमशः 80 डिग्री सेल्सियस, 85 डिग्री सेल्सियस और 95 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों के इनक्यूबेशन में लॉग10 ईसीएफयू/एमएल। आरएनए में एक अंतर था नमूनों में जहां RNase पहले और/Figure 3A-C

पर्याप्त आरएनए संदर्भ मार्कर के रूप में 16S rRNA का उपयोग कर टीबी-MBLA के लिए संरक्षित है
आरएनए पर गर्मी निष्क्रियता के प्रभाव को टीबी पॉजिटिव मरीजों से बीसीजी संस्कृतियों और थूक में मापा गया । नियंत्रण बीसीजी संस्कृति का मापा जीवाणु भार, 5.3 ± 0.2 लॉग10 ईसीएफयू/एमएल, 0.2 ± 0.1 लॉग10 ईसीएफयू/एमएल संयुक्त 5.1 ± 0.3 लॉग10 ईसीएफयू/एमएल से अधिक था जो गर्मी निष्क्रिय संस्कृति (एनोवा पी एंड एलटी; 0.0001) 80 डिग्री सेल्सियस, 85 डिग्री सेल्सियस और 95 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 4ए)27. इसी तरह, नियंत्रण रोगी थूक का जीवाणु भार, 7.1 लॉग10 ईसीएफयू/एमएल, 0.8 ± 0.1 लॉग10 ईसीएफयू/एमएल संयुक्त 6.3 ± 0.41 लॉग10ईसीएफयू/एमएल 80 डिग्री सेल्सियस, 85 डिग्री सेल्सियस और 95 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 4 बी)27पर अधिक था। बैक्टीरियल लोड में कमी दो प्रकार के नमूनों में और 1लॉग थी।

सिदक के मल्टीपल तुलना परीक्षण से बैक्टीरियल लोड के बीच 80 डिग्री सेल्सियस और 85 डिग्री सेल्सियस (पी = 0.001) बनाम 95 डिग्री सेल्सियस के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर का पता चला। टीबी के नमूनों में कोई अंतर नहीं पाया गया सभी तापमान पर, पी = ०.८ ।

सेल दीवार अखंडता एमटीबी कोशिकाओं के बहुमत में गर्मी से नष्ट नहीं है
ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) का उपयोग करके हमने जांच की कि क्या कोशिकाओं को गर्मी निष्क्रियता से बढ़ाया गया था। कोशिकाओं के पैराफॉर्मलडिहाइड फिक्स्ड छर्रों के पतले खंडों को टेम द्वारा परीक्षा से पहले इलेक्ट्रॉन समृद्ध माध्यम में बनाया गया और एम्बेडेड किया गया था। कम और उच्च आवर्धन पर कोशिकाओं के निरीक्षण से बरकरार कोशिका दीवार और दृश्यमान इंट्रासेलुलर लिपिड निकायों का पता चला । कोशिकाएं रूपात्मक रूप से लम्बी दिखाई दीं लेकिन लायसे नहीं । चित्रा 5 विभिन्न आवर्धन पर माइकोबैक्टीरियम कोशिकाओं की आकृति विज्ञान दिखाता है। शीर्ष दो पैनलइंट्रासेलर लिपिड शरीर और अबाधित रस्सी की तरह कॉर्डिंग, माइकोबैक्टीरियम प्रजातियों की विशिष्ट एक रूपात्मक विशेषता प्रकट करते हैं। निचले दो पैनल लिपिड निकायों के दृश्य का विस्तार करने और कुछ सूक्ष्म-अंतरकोशिकीय संरचनाओं का खुलासा करते हुए उच्च आवर्धन कर रहे हैं।

टीबी-MBLA द्वारा मापा बैक्टीरियल लोड उलटा सकारात्मकता के लिए MGIT संस्कृति समय से सहसंबद्ध है
चिकित्सा का जवाब देने वाले रोगियों के लिए, बैक्टीरियल लोड उपचार के दौरान प्रति सप्ताह औसतन 1 लॉग10 ईसीएफयू/एमएल पर पड़ता है । तेजी से उत्तरदाताओं तेजी से स्पष्ट, उपचार के 2 सप्ताह के द्वारा नकारात्मक (शून्य जीवाणु लोड) में परिवर्तित। टीबी-MBLA द्वारा मापा बैक्टीरियल लोड में गिरावट MGIT संस्कृति समय सकारात्मकता (टीटीपी) में वृद्धि के अनुरूप है । चित्रा 6 बैक्टीरियल लोड और एमजीआईटी टीटीपी के बीच पाए जाने वाले विलोम सहसंबंध को दर्शाता है। हालांकि अंतर यह है कि टीबी-एमएमएलए के परिणाम 4 घंटे में उपलब्ध हैं और समय-दर-परिणाम बैक्टीरियल लोड के स्तर से स्वतंत्र है । यह एमजीआईटी कल्चर टेस्ट के लिए 5-25 दिनों के विपरीत है। गैर टीबी बैक्टीरिया के साथ संदूषण आगे संस्कृति परीक्षणों से परिणाम समझौता ।

Figure 1
चित्रा 1: 80 डिग्री सेल्सियस (डॉट पैटर्न वक्र), 85 डिग्री सेल्सियस (डॉट-डैश पैटर्न वक्र), और 95 डिग्री सेल्सियस (डैश पैटर्न वक्र) पर बीसीजी निष्क्रियता का सत्यापन। नियंत्रण (काला वक्र) लाइव (गरम) बीसीजी संस्कृति एक ही विकास माध्यम में टीका लगाया गया था । नियंत्रण में वृद्धि की पुष्टि इनक्यूबेशन अवधि में संस्कृति की ओडी में वृद्धि से हुई । यह आंकड़ा सबीती एट अल27से संशोधित किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: गर्मी में मात्रात्मक आरएनए की स्थिरता निष्क्रिय नमूना 4 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (D0-D4) पर इनक्यूबेटेड हो गया। (ए),(बी),और(सी)दिखाते हैं कि बीसीजी संस्कृतियां क्रमशः 80 डिग्री सेल्सियस, 85 डिग्री सेल्सियस और 95 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय हो गई हैं। (D)80 डिग्री सेल्सियस पर टीबी थूक निष्क्रिय दिखाता है। नियंत्रण एक ही नमूने का अनुपचारित (लाइव) अंश है। त्रुटि सलाखों = मानक विचलन। तीन दोहराता है, नौ प्रति रन प्रतिकृति । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: RNase ए एंजाइम के बहिर्जात इसके अलावा के बाद उच्च आरएनए क्षरण। }A80 डिग्री सेल्सियस पर हीट इनएक्टिवेशन (एचआई),85डिग्री सेल्सियस पर बी एचआई, और(C)HI 95 डिग्री सेल्सियस। त्रुटि सलाखों = मतलब की मानक त्रुटि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एक मार्कर के रूप में 16S rRNA का उपयोग कर टीबी-MBLA जीवाणु लोड माप के लिए पर्याप्त आरएनए का संरक्षण । (A)इन विट्रो बीसीजी संस्कृतियों से अनुमानित बैक्टीरियल लोड। (ख)तपेदिक पॉजिटिव थूक से अनुमानित बैक्टीरियल लोड। त्रुटि सलाखों = मतलब की मानक त्रुटि (एन = 18 और 20 क्रमशः ए और बी के लिए प्रतिकृति) । यह आंकड़ा सबीती एट अल27से संशोधित किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: 20 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रियता के बाद अक्षुण्ण एमटीबी बेसिली के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ। टेम के साथ स्पष्ट अक्षुण्ण कोशिका दीवार और असंख्य लिपिड निकायों को देखा गया। शीर्ष: कोशिकाओं के एक समूह की कम आवर्धन छवियां अबाधित माइकोबैक्टीरियल रस्सी-जैसे कॉर्डिंग आकृति विज्ञान और इंट्रासेलर लिपिड शरीर का खुलासा करती हैं। नीचे: लिपिड निकायों के दृश्य का विस्तार करने और कुछ सूक्ष्म-अंतरकोशिकीय संरचनाओं का खुलासा करने के लिए शीर्ष पैनलों का उच्च आवर्धन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: एंटी टीबी थेरेपी पर एक मरीज के 12 सप्ताह के उपचार प्रतिक्रिया वक्र टीबी के एक व्युत्क्रम सहसंबंध दिखा-MBLA मापा जीवाणु लोड और MGIT TTP । बैक्टीरियल लोड (ब्लू वक्र) गिर जाता है, जबकि टीटीपी उगता है (लाल वक्र) के रूप में रोगी उपचार का जवाब । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

मास्टर मिक्स आर टी सकारात्मक प्रतिक्रिया आर टी नकारात्मक प्रतिक्रिया
प्रति प्रतिक्रिया एक्स नं. प्रतिक्रियाओं की + 5 प्रति प्रतिक्रिया एक्स नं. प्रतिक्रियाओं की + 5
क्वांटिटेक्ट मिक्स 10.0 माइक्रोन 10.0 माइक्रोन
Mtb16S प्राइमर मिश्रण (एफ + आर) 0.4 माइक्रोन 0.4 माइक्रोन
Mtb16S जांच 0.2 माइक्रोन 0.2 माइक्रोन
चुनाव आयोग प्राइमर मिश्रण (एफ + आर) 0.4 माइक्रोन 0.4 माइक्रोन
चुनाव आयोग की जांच 0.2 माइक्रोन 0.2 माइक्रोन
आरटी एंजाइम 0.2 माइक्रोन -------
RNase मुक्त पानी 4.6 माइक्रोन 4.8 माइक्रोन
कुल मात्रा 16 माइक्रोन 16 माइक्रोन

तालिका 1: टीबी-MBLA qPCR के लिए मास्टर मिक्स तैयारी गाइड।

प्रकार एमटीबी चैनल ईसी चैनल व्याख्या
नमूना सकारात्मक सकारात्मक मान्य
नमूना सकारात्मक नकारात्मक अस्पष्ट
नमूना नकारात्मक सकारात्मक मान्य
नमूना नकारात्मक नकारात्मक अमान्य
एमटीबी + नियंत्रण सकारात्मक नकारात्मक मान्य
निष्कर्षण नियंत्रण (ईसी) नकारात्मक सकारात्मक मान्य
डीएनए नियंत्रण नकारात्मक नकारात्मक मान्य
नकारात्मक नियंत्रण (एनटीसी) नकारात्मक नकारात्मक मान्य

तालिका 2: टीबी-MBLA परिणाम व्याख्या गाइड।

Discussion

इस लेख से पता चलता है कि 80 डिग्री सेल्सियस, 85 डिग्री सेल्सियस और 95 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए गर्मी उपचार तपेदिक के नमूनों को प्रभावी ढंग से निष्क्रिय कर देता है, जिससे टीबी-MBLA के लिए प्रयोगशाला कर्मियों को संक्रमण के जोखिम के बिना गैर-CL3 सुविधा में किया जाना संभव हो जाता है। यह निष्कर्ष पिछले अध्ययनों में की गई टिप्पणियों की पुष्टि करता है जबकि एमटीबी25,30की गर्मी निष्क्रियता की प्रभावशीलता पर कुछ के विपरीत है । उदाहरण के लिए, कुछ रिपोर्टों से पता चलता है कि 80 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग उच्च बेसिलरी लोड नमूनों25,31,32,,33पर प्रभावी नहीं है। उच्च घनत्व इनोकुलम प्रभाव को हमारे अध्ययन में यह सुनिश्चित करके टाला गया था कि सभी थूक और शुद्ध संस्कृतियों को 15 मीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब प्रति 1 मिलीएल मात्रा में गर्म किया गया था ताकि नमूने के हर हिस्से को27उबलते के लिए पर्याप्त स्थान मिल सके ।

आरएनए संरक्षण गर्मी निष्क्रियता के बाद टीबी-MBLA के लिए यह संभव बनाता है प्रदर्शन किया जाएगा । यह निष्कर्ष दो अध्ययनों से सहमत है जिसने गर्मी के बाद आरएनए संरक्षण का प्रदर्शन किया12,34. हमने दिखाया कि गर्मी निष्क्रिय नमूनों में आरएनए 4 दिनों के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है, जिसका अर्थ है कि प्रयोगशालाओं एक सप्ताह के लिए कमरे के तापमान पर निष्क्रिय नमूनों को बनाए रखने के द्वारा परीक्षण बैच सकता है । आरएनए निष्कर्षण किट है कि प्रशीतन या ठंड की आवश्यकता को लागू करने से, कमरे के तापमान पर गर्मी निष्क्रिय नमूनों को बनाए रखने की क्षमता दोनों कोल्ड चेन और श्रेणी 3 प्रयोगशालाओं के लिए संसाधन सीमित सेटिंग्स में टीबी-MBLA प्रदर्शन करने के लिए की जरूरत है ।

एक मार्कर के रूप में 16S rRNA का उपयोग कर के 1लॉग बैक्टीरियल लोड से कम खो गया था । हालांकि लाइव और हीट इनएक्टिवेटेड सैंपल के बीच अंतर था, लेकिन हीट इनएक्टिवेशन के लिए खो ईस राशि डाउनस्ट्रीम परिणामों से समझौता करने के लिए बहुत छोटी है । तापमान बढ़ने से आरएनए की मात्रा में वृद्धि नहीं हुई, जिसका अर्थ है कि मनाया गया नुकसान गर्मी उपचार से स्वतंत्र है। उच्च तापमान पर गर्मी उपचार सबसे अधिक संभावना सेल lysis का कारण बनता है, RNases द्वारा गिरावट के लिए आरएनए को उजागर । दरअसल, गर्मी निष्क्रिय अंश के लिए RNase ए के बहिर्जात जोड़ आरएनए गिरावट की दर में वृद्धि हुई है । उबलते ने रनास की गतिविधि को कम नहीं किया, जिसका अर्थ है कि यह एक बहुत ही लचीला प्रोटीन है।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि १.५ लॉग10 ईसीएफयू/एमएल का औसत आरएनए क्षरण एक बड़ा नुकसान नहीं है । इस उद्देश्य के लिए हम परिकल्पना करते हैं कि हीटिंग एमटीबी बेसिली के एक छोटे से अनुपात को उजागर करता है, इस प्रकार आरएनए की एक छोटी राशि को RNase को उजागर करता है। TEM का उपयोग कर हमने दिखाया कि एमटीबी सेल आकृति विज्ञान और सेल दीवारों की अखंडता शायद ही 95 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग से प्रभावित होती है। इसका मतलब यह है कि इसके लिए विभिन्न शारीरिक कारकों और आरनएसेस की पर्याप्त आपूर्ति की आवश्यकता हो सकती है जैसे कि मेजबान में आरएनए35,36को काफी नीचा दिखाया जा सकता है । इसके अलावा, एक संरचनात्मक राइबोसोम होने के नाते, 16S rRNA संभावित रूप से RNase37,,38के लिए कम संवेदनशील है। एक एकल एमटीबी सेल में साइटोप्लाज्म37के ~ 700 राइबोसोम/0.1 मिमी3 होते हैं, जिसका अर्थ है कि प्रति सेल आरएनए की मात्रा अधिक होती है। इस प्रकार, रनास की छोटी मात्रा में38का प्रभाव कम हो सकता है। राइबोसोम्स की उच्च संख्या का अस्तित्व टीबी-MBLA को संवेदनशीलता और कम बोझ वाले टीबी रोगियों का पता लगाने की क्षमता के मामले में लाभ देता है ।

टीबी-एमएमएलए और एमजीआईटी कल्चर टीटीपी द्वारा मापा गया बैक्टीरियल लोड के बीच एक मजबूत संबंध था । यह कुछ हद तक संस्कृति सकारात्मकता के चालक के रूप में बैक्टीरियल लोड की पुष्टि करता है। हालांकि, टीबी-MBLA का लाभ यह है कि यह सीधे नमूने में मौजूद बेसिलरी लोड की मात्रा निर्धारित करता है और पता लगाने से पहले एमटीबी सेल प्रसार की आवश्यकता नहीं होती है। यह संस्कृति के साथ विरोधाभासों जिसका सकारात्मकता के लिए समय बैक्टीरियल लोड और एमटीबी सेल प्रसार की दर के स्तर पर निर्भर करता है । भविष्य के अध्ययन नियमित नैदानिक सेटिंग्स में गर्मी निष्क्रियता सहित टीबी-MBLA कार्यप्रवाह का मूल्यांकन करेंगे । अध्ययन भी बैक्टीरियल भार की एक श्रृंखला के साथ नमूनों का पता लगाने के लिए संख्या है कि सकारात्मक से नकारात्मक करने के लिए बदल सकता है समझने के लिए (यानी, कम बैक्टीरिया के साथ उन गर्मी निष्क्रियता के बाद) ।

बैक्टीरियल लोड के आणविक मात्राीकरण के लिए टीबी-MBLA प्रोटोकॉल जीवाणु विज्ञान में अपनी तरह का पहला है । विधि सीधे रोगी थूक से एमटीबी बेसिलरी लोड की मात्रा निर्धारित करती है और ऐसा करने के लिए कोई संस्कृति की आवश्यकता नहीं है। यह इसे तेजी से बनाता है और रोगी प्रगति के बारे में एक नैदानिक निर्णय को सूचित करने की क्षमता बढ़ जाती है। हीट इनएक्टिवेशन स्टेप संक्रमण के खतरे को कम करता है और उन सेटिंग्स में टीबी-MBLA की प्रयोज्यता को बढ़ाता है जिनमें श्रेणी 3 प्रयोगशाला नहीं है। नमूने की गर्मी निष्क्रियता के बाद, टीबी-MBLA परिणाम प्राप्त करने के लिए तीन प्रोटोकॉल कदम हैं: आरएनए निष्कर्षण, रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ (आरटी)-क्यूपीसीआर, और क्यूपीसीआर परिणाम विश्लेषण।

रोगी के नमूने से एमटीबी आरएनए को अलग करने की दक्षता जितनी अधिक होगी, परिणामों की गुणवत्ता उतनी ही अधिक होगी। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि थूक नमूने की गुणवत्ता अलग आरएनए की मात्रा को प्रभावित करती है। उदाहरण के लिए, लार थूक को कम गुणवत्ता माना जाता है और कम बेसिलरी लोड से जुड़ा हुआ है। इसका मतलब यह है कि गुणवत्ता थूक गर्भवती के लिए रोगी प्रशिक्षण महत्वपूर्ण है। निष्कर्षण प्रक्रिया की दक्षता का आकलन करने के लिए, एक निष्कर्षण नियंत्रण (यानी, गैर-एमटीबी कोशिकाओं की ज्ञात संख्या) आरएनए निष्कर्षण से पहले नमूने में नुकीला है। निष्कर्षण नियंत्रण की पुनर्प्राप्ति आरएनए निष्कर्षण प्रक्रिया की दक्षता की पुष्टि करती है। आरएनए अलगाव प्रक्रिया तब तक मान्य नहीं हो सकती जब तक कि निष्कर्षण नियंत्रण प्राप्त नहीं किया जाता है। इस तथ्य को देखते हुए कि एमटीबी एक लचीला जीव है यांत्रिक lysis प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण हिस्सा बनाता है । मोतियों (यानी, लाइसिंग मैट्रिक्स) की उपस्थिति में उच्च गति (600 आरपीएम) पर नमूने का समरूपीकरण कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से प्राप्त करता है। lysate की शुद्धि आरएनए और डीएनए दोनों युक्त एक उद्धरण पैदावार । डीएनए को हटाना आरएनए निष्कर्षण का एक महत्वपूर्ण अंतिम कदम है। टीबी-MBLA का उद्देश्य आरएनए की मात्रा निर्धारित करके व्यवहार्य बैसिली को मापना है । इस प्रकार, जीनोमिक डीएनए को हटाने में विफलता का मतलब है कि परिणामों में डीएनए से एक संकेत होगा, जो सेल व्यवहार्यता6के लिए एक अच्छा मार्कर नहीं है ।

आरटी-क्यूपीसीआर एमटीबी और निष्कर्षण नियंत्रण के लिए दोहरी लेबल वाली जांच चलाने वाला डुप्लेक्स है। इसमें तीन चरण शामिल हैं: रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन द्वारा 50 डिग्री सेल्सियस, 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन डेनेचर और 94 डिग्री सेल्सियस और 60 डिग्री सेल्सियस पर प्रवर्धन के 40 चक्र शामिल हैं। जांच से फ्लोरेसेंस का अधिग्रहण 60 डिग्री सेल्सियस (यानी, टुकड़ा विस्तार चरण) पर होता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि टीबी-MBLA को एक विशेष क्यूपीसीआर मशीन का उपयोग करके अनुकूलित किया गया है, इसलिए अन्य क्यूपीसीआर प्लेटफार्मों का उपयोग करने वाले ऑपरेटरों को अपने उपकरणों के लिए शर्तों का अनुकूलन करना चाहिए। डीएनए हटाने की दक्षता आरटी की अनुपस्थिति में प्रति नमूना एक प्रतिक्रिया चलाकर नियंत्रित की जाती है। इस प्रतिक्रिया से एक सकारात्मक परिणाम डीएनए को अधूरा हटाने का प्रतीक है । उच्च बोझ वाले नमूनों में डीएनए की उच्च मात्रा होती है, डीएनए को पूरी तरह से हटाने के लिए DNase एंजाइम की मात्रा दोगुनी हो सकती है। सौभाग्य से, उच्च बेसिलरी लोड नमूनों में, डीएनए की छोटी मात्रा की उपस्थिति आरएनए से परिणाम को प्रभावित करने की संभावना कम होती है। रिबसोमल आरएनए, टीबी-MBLA लक्ष्य, स्वाभाविक रूप से डीएनए३७की मात्रा से दोगुनी में होता है । पीसीआर में, एक नो टेम्पलेट कंट्रोल (एनटीसी), जो पीसीआर एजेंटों को भंग करने के लिए उपयोग किया जाने वाला पानी है, एक्सोजेनस डीएनए या आरएनए के साथ क्रॉस संदूषण के लिए नियंत्रण करता है। एनटीसी में एक सकारात्मक संकेत पार संदूषण और परिणाम अमान्य माना जाता है का तात्पर्य है । इसका मतलब यह है कि इस पानी का उपयोग कर गठित सभी समाधानों को त्याग दिया जाना चाहिए और पानी की एक ताजा शीशी का उपयोग करके नए लोगों को बनाया जाना चाहिए । सभी पानी के दूषित होने से बचने के लिए पीसीआर पानी को अलग-अलग एलिकोट्स में रखने की सलाह दी जाती है। पीसीआर की समग्र दक्षता के लिए नियंत्रण के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण (एमटीबी आरएनए) का उपयोग किया जाता है।

परिणाम विश्लेषण मानक वक्र का उपयोग करके पीसीआर सीक्यू एस को बैक्टीरियल लोड (यानी, अनुमानित कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों प्रति एमएमएल) में परिवर्तित करना शामिल है। मानक वक्र की स्थापना और अनुकूलन इस चरण के लिए महत्वपूर्ण है। 0.95-1 की एक मानक वक्र दक्षता की सिफारिश की जाती है। एमटीबी और निष्कर्षण नियंत्रण के लिए मानक घटता स्थापित किया जाना चाहिए और रोगियों या अन्य परीक्षण नमूनों को मशीन पर चलाने से पहले अनुकूलित किया जाना चाहिए। टीबी-एमएमएएलए किट के साथ मानक नमूने दिए जाते हैं। पीसीआर के लिए आरएनए निकालने की दस गुना कमजोर पड़ने की सिफारिश की जाती है। इसका तात्पर्य यह है कि बैक्टीरियल लोड परिणाम को प्रति एमएम एल अंतिम बैक्टीरियल लोड परिणाम प्राप्त करने के लिए 10 के कारक से गुणा करना होगा। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि टीबी-MBLA के लिए 30 से ऊपर के सीक्यूको को नकारात्मक माना जाता है । उपचार प्रतिक्रिया पर अनुमान लगाने के लिए विभिन्न समय बिंदुओं पर मापा गया न्यूनतम दो संभावित बैक्टीरियल लोड परिणाम आवश्यक हैं। यह दृढ़ता से सिफारिश की जाती है कि उपचार शुरू होने से पहले दो परिणामों में से एक बेसलाइन होना चाहिए। हालांकि, यदि रोगी ने उपचार के माध्यम से बैक्टीरियल लोड मूल्यांकन शुरू किया है, तो उपचार प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए दूसरी बार बिंदु बैक्टीरियल लोड माप होना चाहिए। टीबी-MBLA उपचार पर 3 दिनों की जगह में बैक्टीरियल लोड को अलग कर सकता है लेकिन आदर्श दो बैक्टीरियल लोड माप 7 दिनों के अलावा लिया जाता है।

जबकि प्रोटोकॉल उपचार प्रतिक्रिया के लिए जानकारीपूर्ण मात्रात्मक परिणाम उत्पन्न करता है, यह अभी भी काफी हद तक मैनुअल है और आरएनए निष्कर्षण के लिए समय पर पर्याप्त हाथों की मांग करता है। व्यस्त लैब में टेक्नीशियन इस बार नहीं हो सकते। आरएनए निकालने और पीसीआर प्रक्रियाओं को स्वचालित करने की व्यवस्था चल रही है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह अध्ययन यूरोपीय और विकासशील देशों के नैदानिक परीक्षण साझेदारी (EDCTP) से वित्तपोषण द्वारा संभव बनाया गया था - पैन अफ्रीकी बायोमार्कर विस्तार कार्यक्रम (PanBIOME) अनुदान एसपी. 2011.41304.008। यूनिवर्सिटी ऑफ सेंट एंड्रयूज स्कूल ऑफ मेडिसिन रिसर्च ग्रांट भी सहायता प्राप्त की गई । एक दृश्य संसाधन के रूप में इस पांडुलिपि और टीबी-MBLA प्रोटोकॉल के प्रकाशन स्कॉटिश फंडिंग काउंसिल और ग्लोबल चैलेंजरिसर्च फंड से सेंट एंड्रयूज विश्वविद्यालय के लिए धन से संभव बनाया गया है । मापुटो मातृ अस्पताल और मावालेन स्वास्थ्य केंद्र के लिए धन्यवाद जिसने नैदानिक थूक नमूने प्रदान किए, और मापुटो तपेदिक उपचार इकाई टीम जिसने नैदानिक थूक नमूनों के गर्मी निष्क्रियता प्रयोगों में मदद की।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heat inactivation:
15 mL Centrifuge tubes Fisher-Scientific 10136120 50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved
15 mL Wire Tube rack Fisher-Scientific 11749128 Other brands with similar make can be used
Water bath Fisher-Scientific 15700619 Other brands with similar make can be used
RNA extraction:
Chloroform Sigma 372978-1L Not necessary in other RNA extraction kit brands
Ethanol, absolute 99-100% Sigma 51976-500ML-F Larger volume available
Extraction control SOI group St Andrews VitalbacteriaEC Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit
FASTRNA Pro blue Kit MP Biomedicals 116025050 Supplied with lysing matrix tubes
Molecular grade water (RNase free) Sigma W4502-1L Qiagen, Fisherscientific can also supply same product
Precellys 24 homogeniser VWR 432-3750 FastPrep MP Biomedicals can be used too
Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus Fisher-Scientific 15352117 Other brands with similar capacity can be used
Thermomixer Eppendorf BLD-455-010C Works with 1-2 mL tubes
TURBO DNA-free Fisher-Scientific AM1907M Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures.
RT-qPCR:
Primers and Taqman probes SOI group St Andrews VitalbacteriaPP Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX.
QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit Qiagen 204845 PCR mix plus the RT enzyme
RotorGene Q 5plex machine Qiagen 9001580 Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc. can be used
Strip Tubes and Caps, 0.1 mL Qiagen 981103 Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed.
Non-heat inactivation Sample preservation materials
1 M Tris-HCl pH 7.5 Sigma 93313 Supplied ready to use
2-Mercaptoethanol Sigma 63689 Many competent suppliers
Guanidine thiocyanate (GTC) Promega V2791 Promega brand recommended for quality
Molecular grade water (RNase free) Sigma W4502-1L Ensures that GTC solution is free of nucleases
General materials (used but not specific to TB-MBLA)
500 mL plastic containers 734-5087 Nalgene brand recommeded
Biological waste discard jars Many competent suppliers
Chemical waste discard jars Many competent suppliers
Disposable gloves, chemical resistant Many competent suppliers
Freezer (-20 °C) Many competent suppliers
Freezer (-80 °C) Many competent suppliers
Fridge (0-8 °C) Many competent suppliers
Fume hood For safe handling of toxic reagents
Laboratory scales For accurate measurement of reagents
Measuring cylinders, plastic To ensure accurate measurement of reagents
PCR reaction tubes Should be suitable to the PCR instrument used
Pipettes and matching sterile filtered pipette tips, DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended
Qiagility loading plates Qiagen 5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates
QIAgility Pipetting Robot Qiagen Important for high throughput pipetting
Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes Chemical-resistant and autoclavable recommended
RNase Away (Removes RNases enzymes from working space) Fisher Scientific 10666421 Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme
Safety goggles, chemical resistant Fisher Scientific Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents.
Sterile Pasteur pipettes, 1.5-3 mL Many competent suppliers
Sterile RNAse-free microtubes 1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended
TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse Ensure it is freshly prepared or prepared within a week
Vortex Genie 2 brand recommended
Transmission electron microscopy
Glutaldehyde (8%) Sigma G7526-10ML Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer)
HEPES (pH 7.4, 100 mM) Sigma H4034-25G Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer)
Leica FCS ultracryo Leica Cryomicrotome for tissue sectioning
Methyl cellulose Agar Scientific AGG6425 Cold mounting resin
Paraformaldehyde (4% in PBS) Sigma P6148-500G Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer)
Sucrose Sigma 84097-250G Preservation and mounting medium
Uranyl acetate Agar Scientific AGR1260A Universal Electron microscopy stain

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References

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इम्यूनोलॉजी एंड इंफेक्शन इश्यू 158 तपेदिक माइकोबैक्टीरियम तपेदिक,व्यवहार्यता हीट इनएक्टिवेशन आरएनए आणविक बैक्टीरियल लोड परख रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस मात्रात्मक पीसीआर
एक तपेदिक आणविक जीवाणु भार परख (टीबी-MBLA)
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