Summary
We beschrijven een tuberculose moleculaire bacteriële load test uitgevoerd na warmte-inactivatie van sputum. Warmteinactivatie maakt sputummonsters niet-besmettelijk en voorkomt de noodzaak van containmentniveau 3-laboratoria voor moleculaire tests op tuberculose.
Abstract
Tuberculose wordt veroorzaakt door Mycobacterium tuberculosis (Mtb), een ziekteverwekker die door de Verenigde Naties (VN) is geclassificeerd als een gevaarlijke biologische stof van categorie B. Omwille van de veiligheid van de werknemers moet de behandeling van alle monsters die vermoedelijk Mtb dragen, worden uitgevoerd in een laboratorium met insluitingsniveau (CL) 3. De TB moleculaire bacteriële load test (TB-MBLA) test is een omgekeerde transcriptase kwantitatieve polymerase kettingreactie (RT-qPCR) test die mtb bacillaire belasting kwantificeert met behulp van primers en dual-labelled sondes voor 16S rRNA. We beschrijven het gebruik van warmte-inactivatie om TB-monsters niet-besmettelijk te maken terwijl het RNA voor de TB-MBLA behouden blijft. Een 1 mL aliquot van het sputummonster in goed gesloten centrifugebuizen van 15 mL wordt gedurende 20 min gekookt bij 80 °C, 85 °C of 95 °C om bacillen in mtbactiveren. Teelt van de warmte geïnactiveerd en controle (levende) monsters voor 42 dagen bevestigde de dood van tbc. Het geïnactiveerde monster wordt vervolgens verrijkt met 100 μL van de extractiecontrole en RNA wordt geëxtraheerd na de standaard RNA-isolatieprocedure. Er werd geen groei waargenomen in de culturen van warmtebehandelde monsters. Het geïsoleerde RNA wordt onderworpen aan real-time RT-qPCR, dat een specifiek doel in het Mtb 16S rRNA-gen versterkt, wat resulteert in de vorm van kwantificeringscycli (Cq). Een standaardcurve wordt gebruikt om Cq te vertalen naar bacteriële belasting, of geschatte kolonievormende eenheden per mL (eCFU/mL). Er is een omgekeerde relatie tussen Cq en de bacteriële belasting van een monster. De beperking is dat warmte inactivatie sommige cellen lyseert, waardoor het RNA wordt blootgesteld aan RNases die een verlies van <1 log10eCFU/mL veroorzaken (d.w.z., <10 CFU/mL). Verdere studies zullen het aandeel van zeer lage lastpatiënten bepalen die vals-negatieve resultaten veroorzaken als gevolg van warmte-inactivatie.
Introduction
Veroorzaakt door Mycobacterium tuberculosis (Mtb), meer dan 7 x 106 nieuwe gevallen van tuberculose (tbc) worden wereldwijd gemeld waarvan meer dan 1 x 106 sterven per jaar1,2. Om de trend te keren, lanceerde de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) een driepijlerbenadering met inbegrip van de ontwikkeling van effectieve diagnostische en behandelingsinstrumenten3. Geclassificeerd als een gevaarlijke biologische stof B door de VN, het werken met monsters verondersteld positief voor Mtb vereist een containment niveau (CL) van 3. CL3-laboratoria zijn duur om te bouwen en te onderhouden. Bijgevolg hebben de meeste landen gecentraliseerde tb-cultuurdiensten op regionaal of nationaal niveau. Dit betekent dat uitstrijkje microscopie het meest beschikbare diagnostische hulpmiddel is in de perifere zorginstellingen.
Er is goedkeuring van de WHO voor het uitvoeren van snelle moleculaire tests zoals Xpert MTB/RIF op niveau 4 zorginstellingen, meestal gelegen op district niveau4,5. Sommige districten zijn vrij groot en minder toegankelijk voor sommige mensen. Hoewel nuttig, Xpert MTB / RIF werkt door het detecteren van de Mtb DNA. DNA is een stabiel molecuul dat lang na de dood van cellen overleeft en dus geen goede standaard is voor het meten van levensvatbare cellen die cruciaal zijn voor het monitoren van de respons van de behandeling5,6. RNA-gebaseerde tests bieden een alternatief voor nauwkeurige meting van levensvatbare cellen7,8,9,10,11,12,13. RNA bestaat in verschillende soorten van verschillende stabiliteit: ribosomal RNA (rRNA), overdrachtRNA (tRNA), en boodschapperRNA (mRNA). Messenger RNA wordt geassocieerd met genexpressie en dus het meest nauw verbonden met celactiviteit en levensvatbaarheid14. Het is belangrijk op te merken dat afwezigheid van genexpressie niet gelijk is aan celdood omdat pathogenen zoals Mtb bekend staan om te bestaan in inactieve (slapende) maar levensvatbare toestanden15,16. Stabiele RNA-soorten zoals rRNA zijn daarom betere markers van zowel actieve als inactieve toestanden van levensvatbare cellen.
Met Escherichia colitoonde Sheridan aan dat 16S rRNA proportioneel steeg met bacteriële groei gemeten door kolonievormende eenheden (CFU)telt 17. Er was een gelijktijdige daling van cfu tellingen en 16S rRNA toen E. coli bacteriën werden blootgesteld aan antibiotica. De daling van rRNA na celdood was een indicator dat het als marker voor cellevensvatbaarheid13,17kon worden gebruikt . Op basis van dit principe is de tbc moleculaire bacteriebelastingstest (TB-MBLA) ontwikkeld voor het richten op M. tuberculose 16S rRNA om levensvatbare tbc-bacillaire belasting te meten als een marker van de behandelingrespons voor patiënten op anti-tbtherapie11,18,19. We hebben de TB-MBLA verder ontwikkeld en geoptimaliseerd om een cellulaire extractiecontrole op te nemen die de lysis van M. tuberculosebacillen weerspiegelt en robuust is in verschillende milieu-instellingen20. De TB-MBLA-procedure vereist dat de eerste stappen van RNA-isolatie van Mtb worden uitgevoerd in een CL3-laboratorium totdat Mtb-cellen volledig zijn gelyseerd om de veiligheid van de werknemers te garanderen. Het omvat ook monsterbewaring voor retrospectieve batched analyse te handhaven op -80 °C in guanidine thiocyanaat, een niveau 4 giftige stof. Hiertoe hebben we warmte gebruikt om Mtb te activeren en monsters veilig te maken voor TB-MBLA die kan worden uitgevoerd in laboratoriumlaboratoria op uitstrijkjes.
Het gebruik van warmte in laboratorium- en klinische toepassingen bestaat al eeuwen21,22. Echter, sommige micro-organismen zoals Mtb zijn moeilijk te doden, en kortere blootstelling aan warmte is onvoldoende om alle cellen te doden23,24. Een studie toonde aan dat 20 min verwarming van TB culturen op 80 ° C gedood alle Mtb bacillen zonder vernietiging van het DNA dat nodig is voor PCR25. Vervolgens verwarmen een aantal laboratorium-DNA-extractietechnieken momenteel tot 95 °C. We hebben hetzelfde principe toegepast om aan te tonen dat kokende TB-monsters bij 80 °C, 85 °C of 95 °C Mtb inactiveert met behoud van voldoende RNA voor tb-MBLA om uit te voeren. Geïnactiveerde cultuur of sputum kan worden gehandhaafd in goed gesloten containers bij kamertemperatuur of gedurende 7 dagen gekoeld zonder de hoeveelheid kwantificeerbare rRNA te verminderen.
De TB-MBLA, momenteel gebruikt als een onderzoek gebruik alleen (RUO) test is aanpasbaar en is toegepast op verschillende soorten monsters, waaronder sputum, longweefsel, en cerebrale spinale vloeistof. Het moet nog worden toegepast op bronchiale alveolar vloeistof, bloed, en andere soorten monsters. Met behulp van sputum als steekproef, resultaten van multisite evaluatie in Afrika (ongepubliceerde gegevens) en eerdere publicaties18,26 blijkt dat de gevoeligheid van MBLA in overeenstemming is met mycobacterium groei indicator indicator buis (MGIT) vloeibare cultuur. Echter, TB-MBLA is sneller, waardoor resultaten in uren in tegenstelling tot dagen of weken van de cultuur, specifiek, niet beïnvloed door niet-tb micro-organismen in het monster, en geeft een kwantitatieve maat van de ernst van de ziekte. De WHO heeft onlangs tb-MBLA erkend als kandidaat ter vervanging van uitstrijkje microscopie en cultuur voor het monitoren van tbc-behandeling2.
In dit artikel beschrijven we in detail de warmte inactivatie en TB-MBLA protocol gepubliceerd in Sabiiti et al.27. Dit gedetailleerde protocol zal een one-stop visuele bron voor de TB-MBLA gebruikers over de hele wereld.
Protocol
1. Bereiding van monsters
-
Cultuur
- Werken op een schone bank of klasse 1 cabine, oogst 1 mL aliquots van exponentiële fase Bacillus Calmette-Guérin (BCG) cultuur in 15 mL plastic centrifuge buizen. Sluit de buizen goed.
LET OP: Voor het verwerken van een heel monster van 5 mL zijn vijf centrifugebuizen van 15 mL nodig.
LET OP:Een bioveiligheidskast is vereist bij het werken met een TB-cultuur.
- Werken op een schone bank of klasse 1 cabine, oogst 1 mL aliquots van exponentiële fase Bacillus Calmette-Guérin (BCG) cultuur in 15 mL plastic centrifuge buizen. Sluit de buizen goed.
-
Het sputumspecimen van de patiënt
- Werken in een goed geventileerde ruimte en het dragen van een neusmasker, zorgvuldig openen van het monster beker, pipet 1 mL aliquots in 15 mL plastic centrifuge buizen en strak sluiten van de buizen.
LET OP: Een brede mondpunt wordt aanbevolen om sputum te pipetteren. Met behulp van een schaar, clip uit het fijne deel van de 1 mL tip mond om een bredere mond te creëren.
- Werken in een goed geventileerde ruimte en het dragen van een neusmasker, zorgvuldig openen van het monster beker, pipet 1 mL aliquots in 15 mL plastic centrifuge buizen en strak sluiten van de buizen.
2. Warmte inactivatie
- Zet het waterbad vóór de monsterbereiding op 95 °C.
LET OP: De temperatuur van 95 °C verhoogt de kans op vermindering van de RNase-activiteit en behoudt zo meer RNA voor downstream TB-MBLA. - Breng de monsterbuizen naar een rek dat in het waterbad is ondergedompeld. Zorg ervoor dat driekwart van elke monsterbuis in het water wordt ondergedompeld.
- Kook op 95 °C gedurende 20 min en breng de buizen vervolgens naar de bank om 5 minuten op kamertemperatuur te koelen voordat u met de RNA-extractie begint.
LET OP: Volledige warmte-inactivering van M. tuberculose bacilli en BCG werd gecontroleerd door het uitbroeden van warmte geïnactiveerde monsters en controles bij 37 °C gedurende 42 dagen om de groei te verifiëren. Een optische dichtheidsmeting bij 600 nm (OD600)werd genomen bij basislijn en vervolgens wekelijks voor de 42 dagen incubatieperiode.
3. RNA-extractie
LET OP: Het RNA extractieproces dat hier wordt beschreven is voor de RNA-kit die in de Materiaaltafelwordt vermeld. Andere geschikte RNA extractie kits door verschillende fabrikanten kunnen worden gebruikt.
- Toevoeging extractiecontrole (EG)
- Breng 1 mL aliquots van de warmte geïnactiveerde monsters over op 1,5 mL buizen. Spike 100 μL van de EC in elk monster, sluit de buis en meng door de buis 3x ondersteboven te keren.
LET OP: De EC wordt geleverd met de TB-MBLA vitale bacteriën kit (Table of Materials).
- Breng 1 mL aliquots van de warmte geïnactiveerde monsters over op 1,5 mL buizen. Spike 100 μL van de EC in elk monster, sluit de buis en meng door de buis 3x ondersteboven te keren.
- Celsedimentatie
- Centrifugeer de buizen met behulp van een microcentrifuge op de bank met behulp van een microcentrifuge van 20.000 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Pipetteer van de supernatant, waardoor 50 μL sediment achterblijft.
- Hang het sediment op in 950 μL lysisbuffer door op en neer te paien en breng de hele suspensie over in de lysing matrix die wordt geleverd met de RNA-extractiekit (Tabel van materialen). Zorg ervoor dat de buizen goed gesloten zijn en bewaar zowel het deksel als de zijkant van de buis.
- Breng voor cellyse de buizen van stap 3.2.2 naar een homogenisator. Homogeniseer de monsters voor 40 s bij 6.000 tpm.
- Nucleïnezuurzuivering
- Centrifugeer het lysaat vanaf stap 3.3 bij 12.000 x g gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
- Bereid verse 1 mL buizen en voeg 300 μL chloroform in elke buis.
- Met behulp van een 1 mL tip zorgvuldig pipet te uit de supernatant zonder het aanraken van de lysing matrix.
- Breng de supernatant over op de chloroform met buizen en vortex gedurende 5 s. Laat de buis 5 minuten of langer bezinken totdat drie fasen (bovenste, midden en onder) duidelijk zichtbaar zijn.
- Centrifugeer op 12.000 x g voor 5 min bij kamertemperatuur. Pipetteer de bovenste fase zorgvuldig en breng over in verse buizen van 1,5 mL.
- Voeg in stap 3.4.5 5 500 μL ijskoude 100% ethanol toe, sluit de buizen en meng door 3x zachtjes ondersteboven te keren. Incubeer de buizen bij -80 °C gedurende 15 min of -20 °C gedurende 30 min en zet de extractie voort, of laat 's nachts bij -20 °C om de extractie de volgende dag te voltooien.
- Stel de microcentrifuge in op 4 °C en laat afkoelen tot ten minste 12 °C voordat de centrifugatie begint. Laad de buizen in de microcentrifuge en centrifugeer gedurende 20 min op 13.000 x g. Gooi de supernatant weg, vervang deze door 70% ijskoude ethanol en centrifugeer nog eens 10 min bij 13.000 x g.
LET OP: De 70% ethanol moet worden gemaakt met moleculaire kwaliteit nuclease vrij water. - Gooi alle supernatantuit stap 3.4.7 weg en breng de buizen over naar een couveuse van 50 °C. Incubeer gedurende 20 min om de RNA/DNA pellet te drogen. Houd de buizen gedeeltelijk open om verdamping van alle ethanol mogelijk te maken.
- Voeg 100 μL nucleasevrij water toe aan de droge pellet en incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur. Vortex voor 3 s om de inhoud te mengen.
LET OP: In dit stadium mag het extract 2−3 dagen in de koelkast of langer bij -80 °C worden bewaard totdat punt 3.5 wordt uitgevoerd.
- DNA-verwijdering
OPMERKING: Deze stap is cruciaal omdat de aanwezigheid van DNA in het extract het MBLA-resultaat ongeldig maakt. Deze sectie is gebaseerd op een DNA-verwijderingskit(Tabel van materialen).- Bereid een mix van het enzym DNase I 10x buffer en DNase I enzym voor het aantal monsters (10 μL buffer en 1 μL DNase per monster) plus 10% extra om eventuele verliezen van pipetteren te dekken. Meng door vortexing en vervolgens pipet1 μL in elke buis met het RNA-extract.
- Meng door vortexing 3 s en draai dan kort (10 s op 13.000 x g) om eventuele druppels op de muren te verwijderen. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min in het hete blok of de broedmachine. Voeg nog eens 1 μL DNase I enzym direct in elke buis, meng goed door vortexing, en incubeer voor nog eens 30 min bij 37 °C.
- Ontdooi de DNase inactivatie reagens 10 min voor het einde van de DNase incubatie. Vortex 20 s om een homogene, melkachtige suspensie te garanderen en voeg vervolgens 10 μL DNase inactivatierea toe aan elk RNA-extract uit stap 3.5.2.
- Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Vortex 3x tijdens de 5 min incubatiestap.
- Centrifugeer het mengsel op 13.000 x g gedurende 2 min. Breng de supernatant voorzichtig over op 1,5 mL RNase vrije buizen zonder een van de inactivatiematrix aan te raken.
- Bewaar het RNA-extract in de koelkast als u de RT-qPCR op dezelfde dag of op -80 °C gebruikt voor langdurige opslag.
4. Reverse Transcriptase qPCR
- Voor onbekende monsters verdun t u alle RNA-extracten die in een verhouding van 1:10 in RNase-vrij water moeten worden gebruikt. Meng goed door vortexing voor 5 s en kort spin naar beneden om eventuele druppels of luchtbellen te verwijderen.
- Voor standaard monsters voor een standaard curve, neem de Mtb en EC RNA normen uit de -80 °C vriezer en ontdooien bij kamertemperatuur. Maak respectievelijk zeven en zes 10-voudige verdunningen van Mtb- en EG-standaardsamples. Verander de tips voordat u het mengsel van de ene buis naar de andere overbrengt.
LET OP: Standaard monsters worden geleverd met de TB-MBLA kit. -
Master mix voorbereiding
OPMERKING: Master mix (MM) is een oplossing van PCR reagentia die voldoende zijn om alle monsters, standaarden en water te versterken voor een no template control (NTC). Het water dat als NTC wordt gebruikt, moet hetzelfde water zijn dat wordt gebruikt bij de extractie en voor de voorbereiding van de MM. Zorg ervoor dat de normen, elk RNA-monster en de decimale verdunning 2x worden versterkt voor de omgekeerde transcriptase positieve (RT+) reactie en 1x voor de omgekeerde transcriptase negatieve (RT-) reactie. De RT-reactie is een controle om de efficiëntie van DNA-verwijdering te bepalen (Tabel 1).- Breng 16 μL MM over in elke PCR-reactiebuis.
- Voeg 4 μL RNA-extract toe aan elke RT+ en RT-reactiebuis en water in de NTC-reactiebuizen.
- Laad de reactiebuizen in een real-time PCR-machine en stel de PCR-omstandigheden als volgt in: 50 °C voor 30 min, 95 °C gedurende 15 min, 40x cycli bij 94 °C voor 45 s, en 60 °C voor 1 min met acquisitie met fluorophores die absorberen in groene en gele kanalen.
LET OP: Het groene kanaal is de Mtb detectie fluorophore en het geel is de extractie controle detectie fluorophore.
-
Resultaatinterpretatie
OPMERKING: Zorg ervoor dat de dubbele reacties van hetzelfde monster niet meer dan 1 standaarddeviatie verschillen. Mtb en EC Cq waarden hoger dan 30 worden beschouwd als negatief. Zie meer interpretatiedetails in tabel 2.- Om de respons van de behandeling te interpreteren, zet u de Cq-waarden om in bacteriële belasting (eCFU/mL) met behulp van de standaardcurve. Lees de respons van de behandeling als de verandering in bacteriële belasting tijdens de follow-upperiode van de behandeling.
LET OP: De daling van de bacteriële belasting na de behandeling betekent een positieve respons (d.w.z. anti-TB-geneesmiddelen die de tbc-bacteriën doden), terwijl geen verandering of stijging van de bacteriële belasting een negatieve reactie impliceert, wat kan betekenen dat tbc-bacteriën tegen anti-TB-geneesmiddelen of de patiënt zich niet op de juiste manier aan hun behandelingsdosis houden. De daling van de bacteriële belasting gemeten door TB-MBLA correleert met de toename van MGIT tijd naar cultuur positiviteit (TTP).
- Om de respons van de behandeling te interpreteren, zet u de Cq-waarden om in bacteriële belasting (eCFU/mL) met behulp van de standaardcurve. Lees de respons van de behandeling als de verandering in bacteriële belasting tijdens de follow-upperiode van de behandeling.
5. Transmissie Elektronenmicroscopie
- Breng 2 mL aliquots van warmte geïnactiveerde culturen en controles in 2 mL microcentrifuge buizen. Centrifugeer gedurende 10 min bij 20.000 x g.
- Gooi de supernatant weg en hang de pellet op in 700 μL celfixatiebuffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min om de cellen te fixeren.
- Centrifugeer de vering gedurende 30 min bij 16.000 x g om een harde pellet te verkrijgen. Gooi de supernatant weg en vervang de sucrose van 1% in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Bewaar de pellets in sacharose bij 4 °C tot het doorsnede voor elektronenmicroscopie.
-
Sectioning en TEM
OPMERKING: Het onderstaande protocol is aangepast van Griffiths et al.28.- Cryoprotect de celpellet door deze 's nachts in 2,1 m sucrose in PBS in te bedden bij 4 °C. Was 3x met ijskoud water.
- Koel de cryobeschermde celpellets af in vloeibare stikstof en monteer ze cryomicrotomiestompen. Snijd met de cryomicrotoom ultradunne secties op 90 nm.
- Haal de snijsecties op met behulp van de wolfraamdraadlussen van 1:1 mengsel van 2% methylcellulose en 2,1 M sacharose in PBS.
- Breng de secties over naar met pioloforforcoate 150 mesh zeshoekige koperen TEM-steunen (roosters) en bewaar bij 4 °C of ga naar stap 5.4.5.
- Contrast de roosters in uranyl acetaat en luchtdroog in een film van methylacetaat. Was de roosters met ijskoud water, gevolgd door twee druppels PBS over 5 min en droog gedurende 15−30 min. Bekijk de secties onder TEM volgens de richtlijnen van de fabrikant.
LET OP: Alle etiketteringsstappen werden uitgevoerd bij ijstemperatuur (vloeibare temperatuur), met uitzondering van de wasstappen, die bij omgevingstemperatuur werden uitgevoerd.
Representative Results
Hitte activeert alle M. tuberculose bacillen
De optische dichtheid (OD) van de controles (levende cellen) steeg in de tijd (0,04OD-0,85OD) en er werd geen OD-verandering waargenomen in de warmte-geïnactiveerde monsters, wat respectievelijk groei en geen groei betekent (Figuur 1)27. Op dezelfde manier werd de controle klinische sputum positief tegen dag 3 in MGIT, terwijl warmte geïnactiveerde klinische monsters niet positief vlag tot het einde van de incubatie. De groei van Mtb in MGIT werd bevestigd door Ziehl-Neelsen smeermicroscopie en het antigeen MPT6429.
RNA in geïnactiveerde monsters is 4 dagen stabiel bij 37 °C
Warmte geïnactiveerde monsters werden geïncubeerd bij 37 °C om te bepalen of RNA degradeert na warmte-inactivatie van cellen. Er werd geen verschil gevonden tussen het RNA dat op dag (D) 0 werd geoogst onmiddellijk na warmteinactivatie en het RNA geïsoleerd bij D1, 2, 3 en 4 in beide BCG-culturen (Figuur 2A-C) en TB-positief sputum (figuur 2D).
Exogene RNase verhoogt de snelheid van RNA afbraak in de warmte geïnactiveerde fracties
Om te bepalen waarom RNA niet vernederend was, werd RNase A enzym exogenously toegevoegd bij 1.000 U/mL voor en/of na hitteinactivatie. Dit veroorzaakte RNA-verlies gelijk aan bacteriële belasting 1,5 ± 0,3 -, 1,8 ± 0,2 -, en 1,3 ± 0,1 – log10 eCFU/mL bij 80 °C, 85 °C en 95 °C over respectievelijk 4 dagen incubatie. Er was een verschil in het RNA gedegradeerd in monsters waar RNase werd toegevoegd voor en/ of na warmte inactivatie (Figuur 3A-C).
Voldoende RNA blijft behouden voor TB-MBLA met 16S rRNA als referentiemarker
Het effect van warmteinactivatie op rRNA werd gemeten in BCG-culturen en sputum van tb-positieve patiënten. De gemeten bacteriële belasting van de BCG-cultuur, 5,3 ± 0,2 log10 eCFU/mL, was 0,2 ± 0,1 log10 eCFU/mL hoger dan de gecombineerde 5,1 ± 0,3 log10 eCFU/mL van warmte inactivated cultuur (ANOVA p < 0,0001) bij 80 °C, 85 °C en 95 °C (figuur 4A)27. Evenzo was de bacteriële belasting van de controlepatiënt sputum, 7.1 log10 eCFU/mL, 0,8 ± 0,1 log10 eCFU/mL hoger dan het gecombineerde 6,3 ± 0,41 log10eCFU/mL bij 80 °C, 85 °C en 95 °C (figuur 4B)27. De bacteriële belastingvermindering was <1log in de twee geteste soorten monsters.
Uit de meervoudige vergelijkingstest van Sidak bleek een significant verschil tussen de bacteriële belasting bij 95 °C en die van 80 °C en 85 °C (p = 0,001). Er werd geen verschil gevonden in TB-monsters bij alle temperaturen, p = 0,8.
Celwand integriteit wordt niet vernietigd door warmte in de meerderheid van mtb cellen
Met behulp van transmissie elektronenmicroscopie (TEM) onderzochten we of cellen werden gelyseerd door warmte-inactivatie. Dunne delen van paraformaldehyde vaste pellets van cellen werden gemaakt en ingebed in een elektron rijk medium voorafgaand aan onderzoek door TEM. Inspectie van de cellen bij lagere en hogere vergroting bleek intacte celwand en zichtbare intracellulaire lipide lichamen. Cellen morfologisch leek langwerpig, maar niet lysed. Figuur 5 illustreert de morfologie van mycobacterium cellen bij verschillende vergrotingen. De bovenste twee panelen onthullen intracellulaire lipide lichamen en de ongehinderde touw-achtige cording, een morfologische kenmerk typisch voor mycobacterium soorten. De onderste twee panelen zijn hogere vergroting uitbreiding van de weergave van lipide lichamen en onthullen sommige micro-intracellulaire structuren.
Bacteriële belasting gemeten door TB-MBLA is omgekeerd gecorreleerd aan MGIT cultuur tijd om positiviteit
Voor patiënten die reageren op de therapie, de bacteriële belasting daalt met een gemiddelde 1 log10 eCFU/mL per week in de loop van de behandeling. Snelle responders wissen sneller, omzetten in negatief (nul bacteriële belasting) door 2 weken van de behandeling. De daling van de bacteriële belasting gemeten door TB-MBLA kwam overeen met de stijging van mgit cultuur tijd aan positiviteit (TTP). Figuur 6 toont de omgekeerde correlatie gevonden tussen bacteriële belasting en MGIT TTP. Het verschil is echter dat de TB-MBLA resultaten beschikbaar zijn in 4 uur en time-to-result is onafhankelijk van het niveau van bacteriële belasting. Dit in tegenstelling tot 5-25 dagen voor MGIT cultuurtests. Besmetting met niet-tbc-bacteriën brengt de resultaten van cultuurtests verder in gevaar.
Figuur 1: Verificatie van bcg-inactivatie bij 80 °C (stippatrooncurve), 85 °C (stip-dash-patrooncurve) en 95 °C (dashpatrooncurve). De controle (zwarte kromme) werd levend (onverwarmd) bcg cultuur ingeënt in zelfde groeimiddel. De groei in de controle werd bevestigd door de verhoging van OD van de cultuur tijdens de incubatieperiode. Dit cijfer werd gewijzigd van Sabiiti et al.27. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Stabiliteit van kwantificeerbaar RNA in warmte geïnactiveerd monster dat gedurende 4 dagen bij 37 °C wordt geïncubeerd (D0–D4). aA),b) enC) tonen BCG-culturen die bij respectievelijk 80 °C, 85 °C en 95 °C zijn geactiveerd. dD) toont de tbc sputum geïnactiveerd bij 80 °C. De controle is de onbehandelde (levende) fractie van hetzelfde monster. Foutbalken = standaarddeviatie. Drie herhalingen, negen replica's per run. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Hogere RNA afbraak na exogene toevoeging van RNase A enzym. aA) Warmteinactivatie (HI) bij 80 °C,b) HI bij 85 °C, enc) HI 95 °C. Foutbalken = standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Het behoud van voldoende RNA voor tb-MBLA bacteriële belasting metbehulp van 16S rRNA als marker. (A) Bacteriële belasting geschat uit in vitro BCG culturen. bB) Bacteriële belasting geschat op tuberculose positief sputum. Foutbalken = standaardfout van het gemiddelde (n = 18 en 20 repliceren voor respectievelijk A en B). Dit cijfer werd gewijzigd van Sabiiti et al.27. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Elektronenmicrografen van intacte Mtb bacilli na inactivatie bij 95 °C gedurende 20 min. Duidelijke intacte celwand en enumerable lipidelichamen werden waargenomen met TEM. Top: lage vergroting beelden van een groep cellen onthullen ongehinderd mycobacteriële touw-achtige cording morfologie en intracellulaire lipide lichamen. Bodem: hoge vergroting van de bovenste panelen om het zicht van lipide lichamen uit te breiden en het onthullen van een aantal micro-intracellulaire structuren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: De 12 weken durende behandelingsresponscurve van een patiënt met anti-tb-therapie met een omgekeerde correlatie van TB-MBLA gemeten bacteriële belasting en MGIT TTP. De bacteriële belasting (blauwe curve) daalt terwijl TTP stijgt (rode curve) als de patiënt reageert op de behandeling. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Master mix | RT positieve reactie | RT negatieve reactie |
| Volume per reactie x nee. reacties + 5 | Volume per reactie x nee. reacties + 5 | |
| Quantitect mix | 10,0 μL | 10,0 μL |
| Mtb16S primer mix (F + R) | 0,4 μL | 0,4 μL |
| Mtb16S-sonde | 0,2 μL | 0,2 μL |
| EC primer mix (F + R) | 0,4 μL | 0,4 μL |
| EG-sonde | 0,2 μL | 0,2 μL |
| RT-enzym | 0,2 μL | ------- |
| RNase gratis water | 4,6 μL | 4,8 μL |
| Totaal volume | 16 μL | 16 μL |
Tabel 1: Master mix voorbereiding snuistem voor de TB-MBLA qPCR.
| Type | MTB-kanaal | EG-kanaal | Interpretatie |
| Monster | Positieve | Positieve | Geldig |
| Monster | Positieve | Negatieve | Onbepaalde |
| Monster | Negatieve | Positieve | Geldig |
| Monster | Negatieve | Negatieve | Ongeldig |
| MTB + Besturing | Positieve | Negatieve | Geldig |
| Extractiecontrole (EG) | Negatieve | Positieve | Geldig |
| DNA-controle | Negatieve | Negatieve | Geldig |
| Negatieve controle (NTC) | Negatieve | Negatieve | Geldig |
Tabel 2: TB-MBLA resultaten interpretatie gids.
Discussion
Dit artikel toont aan dat warmtebehandeling voor 20 min bij 80 °C, 85 °C en 95 °C tuberculosemonsters effectief activeert, waardoor tb-MBLA in een niet-CL3-faciliteit kan worden uitgevoerd zonder infectiegevaar voor laboratoriummedewerkers. De bevindingen bevestigen waarnemingen in eerdere studies, terwijl ze in contrast staan met sommige over de effectiviteit van warmteinactivatie van Mtb25,30. Sommige rapporten geven bijvoorbeeld aan dat verwarming bij 80 °C niet effectief is op monsters25,31,,32,33. Het inoculumeffect met hoge dichtheid werd in onze studie vermeden door ervoor te zorgen dat alle sputum- en zuivere culturen werden verwarmd met een volume van 1 mL per centrifugebuis van 15 mL, waardoor voldoende ruimte werd geboden om elk deel van het monster bloot te stellen aankoken27.
RNA-conservering na warmteinactivatie maakt het mogelijk om TB-MBLA uit te voeren. Deze bevinding sluit aan bij twee studies die rna-conservering na warmteinactivatie aantoonden12,34. We toonden aan dat het RNA in warmte geïnactiveerde monsters stabiel is op 37 °C gedurende 4 dagen, wat impliceert dat laboratoria tests konden batchdoor het handhaven van geïnactiveerde monsters op kamertemperatuur voor een week. Door rna-extractiekits toe te passen die koeling of bevriezing vereisen, zorgt de mogelijkheid om warmte-geïnactiveerde monsters bij kamertemperatuur te handhaven de noodzaak voor zowel koudeketen- als categorie 3-laboratoria om TB-MBLA uit te voeren in beperkte omgevingen.
Minder dan 1log bacteriële belasting ging verloren met behulp van de 16S rRNA als een marker. Hoewel er een verschil was tussen levend en warmte geïnactiveerd monster, is de hoeveelheid verloren aan warmteinactivatie te klein om downstreamresultaten in gevaar te brengen. De stijgende temperatuur verhoogde niet de hoeveelheid verloren RNA, implicerend dat het waargenomen verlies onafhankelijk van de hittebehandeling is. Warmtebehandeling bij hoge temperaturen veroorzaakt hoogstwaarschijnlijk cellyse, waardoor RNA wordt blootgesteld aan degradatie door RNases. Inderdaad, exogene toevoeging van RNase A aan de warmte geïnactiveerde fractie verhoogde de snelheid van RNA afbraak. Koken heeft de activiteit van RNase niet verminderd, wat impliceert dat het een zeer veerkrachtig eiwit is.
Het is belangrijk op te merken dat een gemiddelde RNA afbraak van 1,5 log10 eCFU/mL is niet een groot verlies. Hiervoor veronderstellen we dat het verwarmen van een klein deel van mtb bacillen lyses, waardoor een kleine hoeveelheid RNA bloot aan RNase. Met behulp van TEM toonden we aan dat mtb-celmorfologie en integriteit van de celwanden nauwelijks worden beïnvloed door verwarming bij 95 °C. Dit betekent dat het verschillende fysiologische factoren en voldoende toevoer van RNases kan vereisen, zoals in de gastheer om RNA35,36aanzienlijk te degraderen . Bovendien is 16S rRNA als structureel ribosoom potentieel minder gevoelig voor RNase37,38. Een enkele Mtb-cel bevat ~ 700 ribosomen/ 0,1 mm3 van cytoplasma37,wat impliceert dat er grotere hoeveelheden rRNA per cel zijn. Kleinere hoeveelheden RNase kunnen dus een kleinere impact hebben38. Het bestaan van grote aantallen ribosomen geeft een voordeel aan TB-MBLA in termen van gevoeligheid en het vermogen om patiënten met een lage belasting te detecteren.
Er was een sterke correlatie tussen bacteriële belasting gemeten door TB-MBLA en MGIT cultuur TTP. Dit bevestigt bacteriële belasting als de bestuurder van cultuur positiviteit tot op zekere hoogte. Het voordeel van TB-MBLA is echter dat het direct de bacillaire belasting in het monster kwantificeert en geen Mtb-celproliferatie vereist vóór detectie. Dit in tegenstelling tot cultuur waarvan de tijd tot positiviteit afhangt van het niveau van bacteriële belasting en de snelheid van Mtb cel proliferatie. Toekomstige studies zullen de TB-MBLA workflow, inclusief warmte-inactivatie, evalueren in routinematige klinische instellingen. De studie zal ook monsters verkennen met een reeks bacteriële belastingen om het aantal te begrijpen dat van positief naar negatief kan veranderen (d.w.z. die met minder bacteriën na hitte-inactivatie).
Het TB-MBLA protocol voor moleculaire kwantificering van bacteriële belasting is de eerste in zijn soort in bacteriologie. De methode kwantificeert direct Mtb bacillaire belasting van patiënt sputum en vereist geen cultuur om dit te doen. Dit maakt het sneller en verhoogt zijn potentieel om een klinische beslissing over de voortgang van de patiënt te informeren. De warmteinactivatiestap vermindert het risico op infectie en verhoogt de toepasbaarheid van TB-MBLA in instellingen die geen categorie 3-laboratorium hebben. Na warmte-inactivatie van het monster zijn er drie protocolstappen om TB-MBLA-resultaten te bereiken: RNA-extractie, reverse transcriptase (RT)-qPCR en qPCR-resultatenanalyse.
Hoe hoger de efficiëntie van het isoleren van Mtb RNA uit een patiëntmonster, hoe hoger de kwaliteit van de resultaten. Het is belangrijk op te merken dat de kwaliteit van het sputummonster de hoeveelheid geïsoleerd RNA beïnvloedt. Bijvoorbeeld, speekselsputum wordt beschouwd als lage kwaliteit en is geassocieerd met lage bacillaire belasting. Dit betekent dat het trainen van de patiënt op kwaliteit sputum expectoration belangrijk is. Om de efficiëntie van het extractieproces te beoordelen, wordt een extractiecontrole (d.w.z. het bekende aantal niet-mtb-cellen) in het monster geprikt voorafgaand aan de RNA-extractie. Het ophalen van de extractiecontrole bevestigt de efficiëntie van het RNA-extractieproces. Het RNA-isolatieproces kan alleen geldig zijn als het extractiebesturingselement is opgehaald. Gezien het feit dat Mtb een veerkrachtig organisme is, maakt mechanische lysis een cruciaal onderdeel van het proces. Homogenisatie van het monster bij hoge snelheid (600 rpm) in aanwezigheid van kralen (d.w.z. lysing matrix) verlyseert de cellen effectief. Zuivering van het lysaat levert een extract op dat zowel RNA als DNA bevat. Verwijdering van DNA is een cruciale laatste stap van de RNA-extractie. TB-MBLA wil levensvatbare bacillen meten door RNA te kwantificeren. Het niet verwijderen van genomic DNA betekent dus dat de resultaten een signaal uit het DNA hebben, wat geen goede marker is voor cellevensvatbaarheid6.
De RT-qPCR is een duplex met dubbele gelabelde sondes voor Mtb en extractiecontrole. Het gaat om drie stappen: 30 min omgekeerde transcriptie door omgekeerde transcriptie bij 50 °C, 15 min denaturatie bij 95 °C en 40 cycli van versterking bij 94 °C en 60 °C. De verwerving van fluorescentie van de sondes vindt plaats bij 60 °C (d.w.z. de lengtefase van het fragment). Het is belangrijk op te merken dat de TB-MBLA is geoptimaliseerd met behulp van een bepaalde qPCR-machine, dus operators die andere qPCR-platforms gebruiken, moeten de omstandigheden voor hun apparatuur optimaliseren. De efficiëntie van DNA-verwijdering wordt gecontroleerd door het uitvoeren van een enkele reactie per monster in de afwezigheid van RT. Een positief resultaat van deze reactie betekent onvolledige verwijdering van DNA. Hoge last monsters die hoge hoeveelheden DNA kan vereisen het dubbele van de hoeveelheid DNase enzym om volledig dna te verwijderen. Gelukkig, in hoge bacillaire belasting monsters, de aanwezigheid van kleine hoeveelheden DNA is minder waarschijnlijk van invloed op het resultaat van het RNA. Ribosomal RNA, het TB-MBLA doel, komt van nature voor in twee maal de hoeveelheid DNA37. In de PCR, een no template control (NTC), dat is het water dat wordt gebruikt om de PCR reagentia op te lossen, controles voor kruisbesmetting met exogene DNA of RNA. Een positief signaal in de NTC impliceert kruisbesmetting en het resultaat wordt als ongeldig beschouwd. Dit betekent dat alle oplossingen die met behulp van dit water moeten worden weggegooid en nieuwe worden gemaakt met behulp van een vers flesje water. Het is raadzaam om PCR-water in afzonderlijke aliquots te houden om verontreiniging van al het water te voorkomen. Een positieve controle (Mtb RNA) wordt gebruikt om te controleren op de algehele efficiëntie van PCR.
Resultaatanalyse omvat de omzetting van PCR Cqs in bacteriële belasting (d.w.z. de geschatte kolonievormende eenheden per mL) met behulp van de standaardcurve. Het instellen en optimaliseren van de standaardcurve is cruciaal voor deze stap. Een standaard curve-efficiëntie van 0,95–1 wordt aanbevolen. Standaardcurven voor MTb's en extractiecontrole moeten worden ingesteld en geoptimaliseerd voordat patiënten of andere testmonsters op de machine worden uitgevoerd. Standaard monsters zijn voorzien van de TB-MBLA kit. Een tienvoudige verdunning van het RNA-extract wordt aanbevolen voor PCR. Dit houdt in dat het bacteriële belastingsresultaat met een factor 10 moet worden vermenigvuldigd om het uiteindelijke bacteriële belastingsresultaat per mL te verkrijgen. Het is belangrijk op te merken dat Cqs boven de 30 worden beschouwd als negatief voor TB-MBLA. Een minimum van twee prospectieve bacteriële belasting resultaten gemeten op verschillende tijdpunten is vereist om een conclusie te trekken over de behandeling respons. Het wordt sterk aanbevolen dat een van de twee resultaten basislijn moet zijn, vóór het begin van de behandeling. Als de patiënt echter halverwege de behandeling bacteriële belastingsbeoordeling heeft geïnitieerd, moet er een tweede tijdpuntbacteriële belastingsmeting zijn om de respons op de behandeling te evalueren. TB-MBLA kan bacteriële belasting onderscheiden in een ruimte van 3 dagen na behandeling, maar het ideaal is twee bacteriële belastingmetingen genomen 7 dagen uit elkaar.
Hoewel het protocol informatieve kwantitatieve resultaten genereert voor de respons op de behandeling, is het nog steeds grotendeels handmatig en vereist het aanzienlijke hands-on tijd voor RNA-extractie. Technici in drukke laboratoria hebben deze tijd mogelijk niet. Er worden regelingen getroffen om de RNA-extractie- en PCR-processen te automatiseren.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De studie werd mogelijk gemaakt door financiering van de Europese en ontwikkelingslanden Clinical Trials Partnership (EDCTP) - Pan African Biomarker Expansion program (PanBIOME) subsidie SP.2011.41304.008. Ondersteuning werd ook verkregen de Universiteit van St Andrews School of Medicine onderzoeksbeurs. De publicatie van dit manuscript en TB-MBLA protocol als een visuele bron is mogelijk gemaakt door de financiering van scottish funding council en Global Challenges Research Fund aan de Universiteit van St Andrews. Dankzij het Maputo Maternal hospital en Mavalane Health Centre dat de klinische sputummonsters leverde, en het Maputo Tuberculosis Treatment Unit team dat hielp met de hitte-inactivatieexperimenten van klinische sputumspecimens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat inactivation: | |||
| 15 mL Centrifuge tubes | Fisher-Scientific | 10136120 | 50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved |
| 15 mL Wire Tube rack | Fisher-Scientific | 11749128 | Other brands with similar make can be used |
| Water bath | Fisher-Scientific | 15700619 | Other brands with similar make can be used |
| RNA extraction: | |||
| Chloroform | Sigma | 372978-1L | Not necessary in other RNA extraction kit brands |
| Ethanol, absolute 99-100% | Sigma | 51976-500ML-F | Larger volume available |
| Extraction control | SOI group St Andrews | VitalbacteriaEC | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit |
| FASTRNA Pro blue Kit | MP Biomedicals | 116025050 | Supplied with lysing matrix tubes |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Qiagen, Fisherscientific can also supply same product |
| Precellys 24 homogeniser | VWR | 432-3750 | FastPrep MP Biomedicals can be used too |
| Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus | Fisher-Scientific | 15352117 | Other brands with similar capacity can be used |
| Thermomixer | Eppendorf | BLD-455-010C | Works with 1-2 mL tubes |
| TURBO DNA-free | Fisher-Scientific | AM1907M | Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures. |
| RT-qPCR: | |||
| Primers and Taqman probes | SOI group St Andrews | VitalbacteriaPP | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX. |
| QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit | Qiagen | 204845 | PCR mix plus the RT enzyme |
| RotorGene Q 5plex machine | Qiagen | 9001580 | Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc. can be used |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 mL | Qiagen | 981103 | Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed. |
| Non-heat inactivation Sample preservation materials | |||
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | 93313 | Supplied ready to use |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Many competent suppliers |
| Guanidine thiocyanate (GTC) | Promega | V2791 | Promega brand recommended for quality |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Ensures that GTC solution is free of nucleases |
| General materials (used but not specific to TB-MBLA) | |||
| 500 mL plastic containers | 734-5087 | Nalgene brand recommeded | |
| Biological waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Chemical waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Disposable gloves, chemical resistant | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-20 °C) | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-80 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fridge (0-8 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fume hood | For safe handling of toxic reagents | ||
| Laboratory scales | For accurate measurement of reagents | ||
| Measuring cylinders, plastic | To ensure accurate measurement of reagents | ||
| PCR reaction tubes | Should be suitable to the PCR instrument used | ||
| Pipettes and matching sterile filtered pipette tips, | DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended | ||
| Qiagility loading plates | Qiagen | 5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates | |
| QIAgility Pipetting Robot | Qiagen | Important for high throughput pipetting | |
| Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes | Chemical-resistant and autoclavable recommended | ||
| RNase Away (Removes RNases enzymes from working space) | Fisher Scientific | 10666421 | Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme |
| Safety goggles, chemical resistant | Fisher Scientific | Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents. | |
| Sterile Pasteur pipettes, 1.5-3 mL | Many competent suppliers | ||
| Sterile RNAse-free microtubes | 1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended | ||
| TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse | Ensure it is freshly prepared or prepared within a week | ||
| Vortex | Genie 2 brand recommended | ||
| Transmission electron microscopy | |||
| Glutaldehyde (8%) | Sigma | G7526-10ML | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| HEPES (pH 7.4, 100 mM) | Sigma | H4034-25G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Leica FCS ultracryo | Leica | Cryomicrotome for tissue sectioning | |
| Methyl cellulose | Agar Scientific | AGG6425 | Cold mounting resin |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Sigma | P6148-500G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Sucrose | Sigma | 84097-250G | Preservation and mounting medium |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | AGR1260A | Universal Electron microscopy stain |
References
- World Health Organization. END TB Global Tuberculosis Report 2017. World Health Organization. , (2017).
- World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. World Health Organization. , (2018).
- World Health Organization. TB Elimination in Low-Incidence Countries. World Health Organization. , (2014).
- Boehme, C. C., et al. diagnostic accuracy, and effectiveness of decentralised use of the Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistance: a multicentre implementation study. The Lancet. 377, 1495-1505 (2011).
- World Health Organization. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children. World Health Organization. , (2010).
- Friedrich, S. O., et al. Assessment of the sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF assay as an early sputum biomarker of response to tuberculosis treatment. The Lancet Respiratory Medicine. 1, 462-470 (2013).
- Desjardin, L. E., et al. Measurement of Sputum Mycobacterium tuberculosis Messenger RNA as a Surrogate for Response to Chemotherapy. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 160, 203-210 (1999).
- Hellyer, T. J., et al. Detection of Viable Mycobacterium tuberculosis by Reverse Transcriptase-Strand Displacement Amplification of mRNA. Journal of Clinical Microbiology. 37, 518-523 (1999).
- Honeyborne, I., et al. Molecular Bacterial Load Assay , a Culture-Free Biomarker for Rapid and Accurate Quantification of Sputum Mycobacterium tuberculosis Bacillary Load during Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).
- Li, L., et al. Sputum Mycobacterium tuberculosis mRNA as a Marker of Bacteriologic Clearance in Response to Antituberculosis Therapy. Journal of Clinical Microbiology. 48, 46-51 (2010).
- Honeyborne, I., et al. The Molecular Bacterial Load Assay Replaces Solid Culture for Measuring Early Bactericidal Response to Antituberculosis Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).
- Hellyer, T. J., Jardin, L. E. D. E. S., Hehman, G. L., Cave, M. D. Quantitative Analysis of mRNA as a Marker for Viability of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology. 37, 290-295 (1999).
- Aellen, S., Que, Y., Guignard, B., Haenni, M., Moreillon, P. Detection of Live and Antibiotic-Killed Bacteria by Quantitative Real-Time PCR of Specific Fragments of rRNA. Antimicrobial agents chemotherapy. 50, 1913-1920 (2006).
- Deutscher, M. P. Degradation of RNA in bacteria: Comparison of mRNA and stable RNA. Nucleic Acids Research. 34, 659-666 (2006).
- Gupta, R. K., Srivastava, R. Resuscitation Promoting Factors: A Family of Microbial Proteins in Survival and Resuscitation of Dormant Mycobacteria. Indian Journal of Microbiology. 52, 114-121 (2012).
- Mukamolova, G. V., Turapov, O., Malkin, J., Woltmann, G., Barer, M. R. Resuscitation-promoting factors reveal an occult population of tubercle bacilli in sputum. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 181, 174-180 (2010).
- Sheridan, G. E. C., Masters, C. I., Shallcross, J. A., Mackey, B. M. Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coliCells Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coli Cells. Applied Environment Microbiology. 64, 1313-1318 (1998).
- Honeyborne, I., et al. Molecular bacterial load assay, a culture-free biomarker for rapid and accurate quantification of sputum Mycobacterium tuberculosis bacillary load during treatment. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).
- Sabiiti, W., et al. Molecular Bacterial Load Assay: a Fast and Accurate Means for Monitoring Tuberculosis Treatment Response. BMJ Global Health. 2, 1-8 (2017).
- Gillespie, H., Stephen, S. W., Oravcova, K. Mybacterial Load Assay. Diagnostic Bacteriology. Methods and Protocols. Bishop, A. K. , Humana Press. Totowa, NJ. 89-105 (2017).
- Juffs, H., Deeth, H. Scientific Evaluation of Pasteurisation for Pathogen Reduction in Milk and Milk Products. Food Standards Australia New Zealand. , Wellington, New Zealand. (2007).
- Holmes, C. J., Degremont, A., Kubey, W. Effectiveness of Various Chemical Disinfectants versus Cleaning Combined with Heat Disinfection on Pseudomonas Biofi lm. Blood Purification. 22, 461-468 (2004).
- Chedore, P., et al. Method for inactivating and fixing unstained smear preparations of Mycobacterium tuberculosis for improved laboratory safety. Journal of Clinical Microbiology. 40, 4077-4080 (2002).
- Cardoso, C. L., et al. Survival of Tubercle Bacilli in Heat-fixed and Stained Sputum Smears. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 96, 277-280 (2001).
- Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Pathology. 55, 778-779 (2002).
- Honeyborne, I., et al. The molecular bacterial load assay replaces solid culture for measuring early bactericidal response to antituberculosis treatment. Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).
- Sabiiti, W., et al. Heat Inactivation Renders Sputum Safe and Preserves Mycobacterium tuberculosis RNA for Downstream Molecular tests. Journal of Clinical Microbiology. , 1-8 (2019).
- Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrasructure Research. 89, 65-78 (1984).
- Kumar, V. G., Urs, T. A., Ranganath, R. R. MPT 64 Antigen detection for Rapid confirmation of M. tuberculosis isolates. BMC Research Notes. 4, 79 (2011).
- Zwadyk, P., Down, J. A., Myers, N., Dey, M. S. Rendering of mycobacteria safe for molecular diagnostic studies and development of a lysis method for strand displacement amplification and PCR. Journal of Clinical Microbiology. 32, 2140-2146 (1994).
- Blackwood, K. S., et al. Viability testing of material derived from Mycobacterium tuberculosis prior to removal from a Containment Level-III Laboratory as part of a Laboratory Risk Assessment Program. BMC Infectious Diseases. 5, 3-9 (2005).
- Somerville, W., Thibert, L., Schwartzman, K., Behr, M. A. Extraction of Mycobacterium tuberculosis DNA: a Question of Contaiment. Journal of Clinical Microbiology. 43, 2996-2997 (2005).
- Bemer-Melchior, P., Drugeon, H. B. Inactivation of Mycobacterium tuberculosis for DNA typing analysis. Journal of Clinical Microbiology. 37, 2350-2351 (1999).
- McKillip, J. L., Jaykus, L. A., Drake, M. rRNA stability in heat killed and UV-irradiated enterotoxigenic Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157:H7. Journal of Appied Environmental Microbiology. 64, 4264-4268 (1998).
- Blank, A., Dekker, C. A. Ribonucleases of Human Serum, Urine, Cerebrospinal Fluid, and Leukocytes. Activity Staining following Electrophoresis in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels. Biochemistry. 20, 2261-2267 (1981).
- O'Leary, T. J. Reducing the impact of endogenous ribonucleases on reverse transcription-PCR assay systems. Clinical Chemistry. 45, 449-450 (1999).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes per 0.1 fl of cytoplasm. PLoS One. 10, 1-14 (2015).
- Yang, K., et al. Structural insights into species-specific features of the ribosome from the human pathogen Mycobacterium tuberculosis. Nucleic Acids Research. 45, 10884-10894 (2017).
