Summary
Wir beschreiben einen Tuberkulose-Molekular-Bakterien-Belastungstest, der nach der Hitzeinaktivierung von Sputum durchgeführt wurde. Die Wärmeinaktivierung macht Sputumproben nicht infektiös und macht die Notwendigkeit von Laboratorien der Eindämmungsstufe 3 für Tuberkulosemolekulartests überflüssig.
Abstract
Tuberkulose wird durch Mycobacterium tuberculosis (Mtb) verursacht, einem Erreger, der von den Vereinten Nationen (UN) als gefährlicher biologischer Stoff der Kategorie B eingestuft wird. Aus Gründen der Sicherheit der Arbeitnehmer muss der Umgang mit allen Proben, von denen angenommen wird, dass sie Mtb tragen, in einem Containment-Labor (CL) 3 durchgeführt werden. Der TB-Test für molekulare bakterielle Last (TB-MBLA) ist ein Reverse-Transkriptase-quantitativer Polymerase-Kettenreaktionstest (RT-qPCR), der die Mtb-Bacillary-Last mit Primern und dual-labelled sonden für 16S rRNA quantifiziert. Wir beschreiben die Verwendung von Wärmeinaktivierung, um TB-Proben nicht infektiös zu machen und gleichzeitig RNA für die TB-MBLA zu erhalten. Ein 1 ml Aliquot der Sputumprobe in dicht geschlossenen 15 ml Zentrifugenrohren wird 20 min bei 80 °C, 85 °C oder 95 °C gekocht, um Mtb-Bazillen zu inaktivieren. Der Anbau der inaktivierten Wärme- und Kontrollproben (Live-Proben) für 42 Tage bestätigte den Tod von TB. Die inaktivierte Probe wird dann mit 100 l der Extraktionskontrolle gespickt und die RNA wird nach dem Standard-RNA-Isolationsverfahren extrahiert. In den Kulturen der wärmebehandelten Proben wurde kein Wachstum beobachtet. Die isolierte RNA wird in Echtzeit RT-qPCR ausgesetzt, das ein bestimmtes Ziel im Mtb 16S rRNA-Gen verstärkt und Ergebnisse in Form von Quantifizierungszyklen (Cq) liefert. Eine Standardkurve wird verwendet, um Cq in bakterielle Belastung oder geschätzte Koloniebildeinheiten pro ml (eCFU/mL) zu übersetzen. Es besteht eine umgekehrte Beziehung zwischen Cq und der bakteriellen Belastung einer Probe. Die Einschränkung besteht darin, dass die Wärmeinaktivierung einige Zellen lysiert und die RNA RNasen aussetzt, die einen Verlust von <1 log10eCFU/mL verursachen (d. h. <10 CFU/mL). Weitere Studien werden den Anteil der Patienten mit sehr geringer Belastung bestimmen, die aufgrund der Wärmeinaktivierung falsche negative Ergebnisse verursachen.
Introduction
Verursacht durch Mycobacterium tuberculosis (Mtb), werden weltweit über 7 x 106 neue Tuberkulosefälle (TB) gemeldet, von denen über 1 x 106 pro Jahr sterben1,2. Um diesen Trend umzukehren, hat die Weltgesundheitsorganisation (WHO) einen Drei-Säulen-Ansatz eingeführt, der die Entwicklung wirksamer Diagnose- und Behandlungsinstrumente 3 einschließensollte. Die Von der UNO als gefährliche biologische Substanz B eingestufte Arbeit mit Proben, die für Mtb als positiv eingestuft wurden, erfordert eine Einschließungsstufe (CL) von 3. CL3-Labore sind teuer zu bauen und zu warten. Folglich verfügen die meisten Länder über zentralisierte TB-Kulturdienste auf regionaler oder nationaler Ebene. Dies bedeutet, dass die Schmiermikroskopie das am meisten verfügbare Diagnoseinstrument in den peripheren Gesundheitseinrichtungen ist.
Es gibt die WHO-Zulassung zur Durchführung von schnellmolekularen Tests wie Xpert MTB/RIF in Gesundheitseinrichtungen der Stufe 4, die sich meist auf Bezirksebene4,5befinden. Einige Bezirke sind ziemlich groß und für einige Leute weniger zugänglich. Xpert MTB/RIF ist zwar vorteilhaft, arbeitet aber, indem es die Mtb-DNA erkennt. DNA ist ein stabiles Molekül, das lange nach dem Absterben der Zellen überlebt und daher kein guter Standard für die Messung lebensfähiger Zellen ist, die für die Überwachung der Behandlungsreaktion kritisch sind5,6. RNA-basierte Assays bieten eine Alternative zur genauen Messung lebensfähiger Zellen7,8,9,10,11,12,13. RNA existiert in verschiedenen Arten unterschiedlicher Stabilität: ribosomale RNA (rRNA), Transfer-RNA (tRNA) und Boten-RNA (mRNA). Messenger RNA ist mit der Genexpression assoziiert und damit am engsten mit der Zellaktivität und Lebensfähigkeit14verbunden. Es ist wichtig zu beachten, dass das Fehlen der Genexpression nicht gleichbedeutend mit Zelltod ist, da Krankheitserreger wie Mtb bekanntermaßen in inaktiv (ruhend) existieren, aber lebensfähige Zustände15,16. Stabile RNA-Arten wie rRNA sind daher bessere Marker sowohl aktiver als auch inaktiver Zustände lebensfähiger Zellen.
Mit Escherichia colizeigte Sheridan, dass 16S rRNA proportional erhöht mit bakteriellem Wachstum gemessen durch Koloniebildnereinheiten (KBE) zählt17. Es gab einen gleichzeitigen Rückgang der KBE-Zahlen und 16S rRNA, wenn E. coli-Bakterien Antibiotika ausgesetzt waren. Der Rückgang der rRNA nach dem Zelltod war ein Indikator dafür, dass er als Marker für die Zelllebensfähigkeit verwendet werden konnte13,17. Ausgehend von diesem Prinzip wurde der TB-Molekular-Bakterien-Last-Assay (TB-MBLA) entwickelt, um M. tuberculosis 16S rRNA als Marker der Behandlungsreaktion für Patienten mit Anti-TB-Therapie zu messen11,18,19. Wir haben die TB-MBLA weiterentwickelt und optimiert, um eine zelluläre Extraktionskontrolle zu integrieren, die die Lyse von M. tuberculosis bacilli widerspiegelt und in verschiedenen Umweltumgebungen robust ist20. Das TB-MBLA-Verfahren erfordert, dass die ersten Schritte der RNA-Isolierung von Mtb in einem CL3-Labor durchgeführt werden, bis Mtb-Zellen vollständig lysiert sind, um die Sicherheit der Arbeiter zu gewährleisten. Es enthält auch die Probenkonservierung für retrospektive Chargenanalysen, die bei -80 °C in Guanidinthiocyanat, einer toxischen Substanz der Stufe 4, aufrechterhalten werden müssen. Zu diesem Zweck haben wir Wärme verwendet, um Mtb zu inaktivieren und Proben sicher zu machen, damit TB-MBLA in Laboren auf Abstrichmikroskopie-Niveau durchgeführt werden kann.
Die Nutzung von Wärme in Labor- und klinischen Anwendungen gibt es seit Jahrhunderten21,22. Jedoch, einige Mikroorganismen wie Mtb sind schwer zu töten, und kürzere Exposition gegenüber Hitze ist nicht ausreichend, um alle Zellen zu töten23,24. Eine Studie ergab, dass 20 min Erhitzung von TB-Kulturen bei 80 °C alle Mtb-Bazillen tötete, ohne die für PCR25benötigte DNA zu zerstören. In der Folge erhitzen sich eine Reihe von Labor-DNA-Extraktionstechniken derzeit auf 95 °C. Wir haben das gleiche Prinzip angewandt, um zu zeigen, dass das Kochen von TB-Proben bei 80 °C, 85 °C oder 95 °C Mtb inaktiviert, während genügend RNA für TB-MBLA erhalten bleibt. Inaktivierte Kultur oder Sputum können in eng verschlossenen Behältern bei Raumtemperatur gehalten oder 7 Tage lang gekühlt werden, ohne die Menge an quantifizierbarer rRNA zu reduzieren.
Die TB-MBLA, die derzeit als Forschungstest (RUO) verwendet wird, ist anpassungsfähig und wurde auf verschiedene Probentypen wie Sputum, Lungengewebe und zerebrale Rückenmarksflüssigkeit angewendet. Es ist noch auf Bronchialalveolar Flüssigkeit angewendet werden, Blut, und andere Probentypen. Anhand von Sputum als Stichprobe zeigen die Ergebnisse der Multisite-Evaluierung in Afrika (unveröffentlichte Daten) und früheren Veröffentlichungen18,26, dass die Empfindlichkeit von MBLA mit der Flüssigkultur des Mycobacterium-Wachstumsindikators (MGIT) übereinstimmt. TB-MBLA ist jedoch schneller, was Ergebnisse in Stunden im Gegensatz zu Tagen oder Wochen kultur, spezifisch, nicht von Nicht-TB-Mikroorganismen in der Probe betroffen, und gibt ein quantitatives Maß für die Schwere der Krankheit. Die WHO hat vor kurzem TB-MBLA als Kandidaten für den Ersatz von Schmiermikroskopie und Kultur zur Überwachung der TB-Behandlung2 anerkannt.
In diesem Artikel beschreiben wir ausführlich die Wärmeinaktivierung und tb-MBLA Protokoll veröffentlicht in Sabiiti et al.27. Dieses detaillierte Protokoll stellt eine visuelle Ressource aus einer Zwischenstation für TB-MBLA-Benutzer auf der ganzen Welt bereit.
Protocol
1. Probenvorbereitung
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Kultur
- Arbeiten auf einer sauberen Bank oder Klasse 1 Kabine, ernten 1 ml Aliquots der exponentiellen Phase Bacillus Calmette-Guérin (BCG) Kultur in 15 ml Kunststoff Zentrifugenrohre. Schließen Sie die Rohre fest.
HINWEIS: Für die Verarbeitung einer ganzen 5 ml Probe sind fünf 15 ml Zentrifugenrohre erforderlich.
VORSICHT: Bei der Arbeit mit jeder TB-Kultur ist ein Biosicherheitsschrank erforderlich.
- Arbeiten auf einer sauberen Bank oder Klasse 1 Kabine, ernten 1 ml Aliquots der exponentiellen Phase Bacillus Calmette-Guérin (BCG) Kultur in 15 ml Kunststoff Zentrifugenrohre. Schließen Sie die Rohre fest.
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Patientensputumprobe
- Arbeiten sie in einem gut belüfteten Raum und tragen eine Nasenmaske, öffnen Sie vorsichtig den Probenbecher, Pipette 1 ml aliquots in 15 ml Kunststoffzentrifugenrohre und dicht die Rohre dicht schließen.
HINWEIS: Eine breite Mundspitze wird zu Pipettensputum empfohlen. Schneiden Sie mit einer Schere den feinen Teil des 1 ml Spitzenmundes ab, um einen breiteren Mund zu erzeugen.
- Arbeiten sie in einem gut belüfteten Raum und tragen eine Nasenmaske, öffnen Sie vorsichtig den Probenbecher, Pipette 1 ml aliquots in 15 ml Kunststoffzentrifugenrohre und dicht die Rohre dicht schließen.
2. Wärmeinaktivierung
- Stellen Sie das Wasserbad vor der Probenvorbereitung auf 95 °C ein.
HINWEIS: Die 95 °C-Temperatur erhöht die Chance, die RNase-Aktivität zu reduzieren und somit mehr RNA für nachgeschaltete TB-MBLA zu erhalten. - Übertragen Sie die Probenrohre in ein im Wasserbad eingetauchtes Halteregal. Stellen Sie sicher, dass drei Viertel jedes Probenrohrs in das Wasser getaucht werden.
- Bei 95 °C 20 min kochen und die Schläuche dann auf die Bank geben, um sie bei Raumtemperatur 5 min abzukühlen, bevor die RNA-Extraktion gestartet wird.
HINWEIS: Die vollständige Wärmeinaktivierung von M. tuberculosis bacilli und BCG wurde durch inkubierte Wärmeproben und Kontrollen bei 37 °C für 42 Tage überprüft, um das Wachstum zu überprüfen. Eine optische Dichtemessung bei 600 nm (OD600) wurde zu Beginn und dann wöchentlich für die 42-tägige Inkubationszeit durchgeführt.
3. RNA-Extraktion
HINWEIS: Der hier beschriebene RNA-Extraktionsprozess ist für das in der Materialtabelleaufgeführte RNA-Kit. Andere geeignete RNA-Extraktionskits verschiedener Hersteller können verwendet werden.
- Extraktionssteuerung (EC) Ergänzung
- 1 ml Aliquots der wärmeinaktivierten Proben in 1,5 ml Rohre übertragen. Spike 100 l der EC in jede Probe, schließen Sie das Rohr, und mischen Sie, indem Sie das Rohr auf den Kopf 3x.
HINWEIS: Die EG wird mit dem TB-MBLA Vitalbakterien-Kit (Tabelle der Materialien) geliefert.
- 1 ml Aliquots der wärmeinaktivierten Proben in 1,5 ml Rohre übertragen. Spike 100 l der EC in jede Probe, schließen Sie das Rohr, und mischen Sie, indem Sie das Rohr auf den Kopf 3x.
- Zellsedimentation
- Zentrifugieren Sie die Rohre mit einer Banktop-Mikrozentrifuge bei 20.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Pipette vom Überstand, so dass 50 L Sediment.
- Setzen Sie das Sediment in 950 l Lysepuffer durch Pipettieren nach oben und unten aus und übertragen Sie die gesamte Suspension in das mit dem RNA-Extraktionskit(Table of Materials)gelieferte Lysing-Matrixrohr. Stellen Sie sicher, dass die Rohre fest geschlossen sind und beschriften Sie sowohl den Deckel als auch die Seite des Rohres.
- Bei der Zelllyse die Rohre von Schritt 3.2.2 auf einen Homogenisator übertragen. Homogenisieren Sie die Proben für 40 s bei 6.000 Rpm.
- Nukleinsäurereinigung
- Zentrifugieren Sie das Lysat ab Schritt 3.3 bei 12.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie frische 1 ml-Rohre vor und fügen Sie 300 l Chloroform in jedes Rohr ein.
- Mit einer 1 ml Spitze vorsichtig Pipette aus dem Überstand, ohne die Lysing-Matrix berühren.
- Übertragen Sie den Überstand auf die chloroformhaltigen Rohre und Wirbel für 5 s. Lassen Sie das Rohr für 5 min oder länger zu begleichen, bis drei Phasen (oben, Mitte und unten) deutlich sichtbar sind.
- Zentrifuge bei 12.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Die obere Phase vorsichtig pipette und in frische 1,5 ml Rohre übertragen.
- Zu den Rohren in Schritt 3.4.5 5 500 l eiskaltes 100% Ethanol hinzufügen, die Rohre schließen und mischen, indem Sie vorsichtig um3x umkehren. Inkubieren Sie die Rohre bei -80 °C für 15 min oder -20 °C für 30 min und setzen Sie die Extraktion fort, oder lassen Sie sie bei -20 °C über Nacht, um die Extraktion am nächsten Tag abzuschließen.
- Stellen Sie die Mikrozentrifuge auf 4 °C und lassen Sie sie vor Beginn der Zentrifugation auf mindestens 12 °C abkühlen. Die Rohre 20 min bei 13.000 x gin die Mikrozentrifuge und Zentrifuge laden. Entsorgen Sie den Überstand, ersetzen Sie ihn durch 70% eiskaltes Ethanol und zentrifugieren Sie weitere 10 min bei 13.000 x g.
HINWEIS: Das 70% Ethanol sollte mit molekularem Nuklease-freiem Wasser hergestellt werden. - Entsorgen Sie den gesamten Überstand ab Schritt 3.4.7 und übertragen Sie die Rohre auf einen Inkubator, der bei 50 °C eingestellt ist. 20 min inkubieren, um das RNA/DNA-Pellet zu trocknen. Halten Sie die Rohre teilweise offen, um die Verdunstung des gesamten Ethanols zu ermöglichen.
- Fügen Sie dem trockenen Pellet 100 l Nuklease-freies Wasser hinzu und brüten Sie 5 min bei Raumtemperatur. Vortex für 3 s, um den Inhalt zu mischen.
HINWEIS: In diesem Stadium kann der Extrakt 2 bis 3 Tage im Kühlschrank oder länger bei -80 °C gelagert werden, bis Abschnitt 3.5 durchgeführt wird.
- DNA-Entfernung
HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, da das Vorhandensein von DNA im Extrakt das MBLA-Ergebnis ungültig macht. Dieser Abschnitt basiert auf einem DNA-Entfernungskit (Tabelle der Materialien).- Bereiten Sie eine Mischung aus dem Enzym DNase I 10x Puffer und DNase I Enzym für die Anzahl der Proben (10 l Puffer und 1 l DNase pro Probe) plus 10% extra, um Verluste aus Pipettieren zu decken. Mischen Sie durch Wirbeln und dann Pipette 11 l in jede Röhre, die den RNA-Extrakt enthält.
- Mischen Sie durch Wirbeln 3 s und drehen Sie dann kurz (10 s bei 13.000 x g), um alle Tröpfchen an den Wänden zu entfernen. Bei 37 °C für 30 min im Heißen Block oder Inkubator inkubieren. Fügen Sie eine zusätzliche 1 l DNase I Enzym direkt in jede Röhre, mischen Sie gut durch Wirbel, und inkubieren für weitere 30 min bei 37 °C.
- Das DNase-Inaktivierungsreagenz 10 min vor dem Ende der DNase-Inkubation auftauen. Vortex 20 s, um eine homogene, milchige Suspension zu gewährleisten und dann 10 L DNase-Inaktivierungsreagenz in jeden RNA-Extrakt aus Schritt 3.5.2 hinzuzufügen.
- Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 5 min. Vortex 3x während der 5 min Inkubationsstufe.
- Zentrifugieren Sie die Mischung bei 13.000 x g für 2 min. Übertragen Sie den Überstand vorsichtig auf 1,5 ml RNase freie Rohre, ohne eine der Inaktivierungsmatrix zu berühren.
- Bewahren Sie den RNA-Extrakt im Kühlschrank auf, wenn der RT-qPCR am selben Tag oder bei -80 °C für eine langfristige Lagerung ausgeführt wird.
4. Reverse Transcriptase qPCR
- Für unbekannte Proben alle RNA-Extrakte verdünnen, die im Verhältnis 1:10 in RNase-freiem Wasser verwendet werden sollen. Mischen Sie gut durch Wirbel für 5 s und kurz nach unten drehen, um alle Tröpfchen oder Luftblasen zu entfernen.
- Für Standardproben für eine Standardkurve nehmen Sie die Mtb- und EC-RNA-Normen aus dem -80 °C-Gefrierschrank und tauen bei Raumtemperatur auf. Stellen Sie sieben- bzw. sechs 10-fache Verdünnungen von Mtb- bzw. EG-Standardproben her. Ändern Sie die Spitzen, bevor Sie die Mischung von einem Rohr in ein anderes übertragen.
HINWEIS: Standardproben werden mit dem TB-MBLA-Kit geliefert. -
Master-Mix-Vorbereitung
HINWEIS: Master Mix (MM) ist eine Lösung von PCR-Reagenzien, die ausreicht, um alle Proben, Standards und Wasser für eine No Template Control (NTC) zu verstärken. Das als NTC verwendete Wasser sollte das gleiche Wasser sein, das bei der Extraktion und zur Vorbereitung des MM verwendet wird. Stellen Sie sicher, dass die Standards, jede RNA-Probe und ihre Dezimalverdünnung 2x für die Reverse-Transkriptase-positive (RT+) Reaktion und 1x für die Reverse-Transkriptase-Negativ (RT-) Reaktion verstärkt werden. Die RT-Reaktion ist eine Kontrolle zur Bestimmung der Effizienz der DNA-Entfernung (Tabelle 1).- Übertragen Sie 16 l MM in jedes PCR-Reaktionsrohr.
- Fügen Sie in jedem RT+- und RT-Reaktionsrohr 4 l RNA-Extrakt und Wasser in die NTC-Reaktionsröhren ein.
- Laden Sie die Reaktionsrohre in eine Echtzeit-PCR-Maschine und stellen Sie die PCR-Bedingungen wie folgt ein: 50 °C für 30 min, 95 °C für 15 min, 40x Zyklen bei 94 °C für 45 s und 60 °C für 1 min mit Erfassung mit Fluorophoren, die in grünen und gelben Kanälen absorbieren.
HINWEIS: Der grüne Kanal ist das Mtb-Detektionsfluorophor und das Gelb ist das Extraktionskontroll-Fluorophor.
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Ergebnisinterpretation
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die doppelten Reaktionen derselben Probe nicht um mehr als 1 Standardabweichung unterscheiden. Mtb- und EC-Cq-Werte über 30 gelten als negativ. Weitere Auslegungsdetails finden Sie in Tabelle 2.- Um das Behandlungsverhalten zu interpretieren, wandeln Sie die Cq-Werte mithilfe der Standardkurve in bakterielle Last (eCFU/mL) um. Lesen Sie die Behandlungsreaktion als Veränderung der bakteriellen Belastung während der Behandlungsnachbeobachtungszeit.
HINWEIS: Der Rückgang der bakteriellen Belastung nach der Behandlung bedeutet eine positive Reaktion (d. h. Anti-TB-Medikamente, die die TB-Bakterien abtöten), während keine Veränderung oder Zunahme der bakteriellen Belastung eine negative Reaktion impliziert, was eine Resistenz von TB-Bakterien gegen Anti-TB-Medikamente oder die Nichtangemessenkeit des Patienten an seiner Behandlungsdosis bedeuten kann. Der durch TB-MBLA gemessene Rückgang der bakteriellen Belastung korreliert mit der Erhöhung der MGIT-Zeit mit der Kulturpositivität (TTP).
- Um das Behandlungsverhalten zu interpretieren, wandeln Sie die Cq-Werte mithilfe der Standardkurve in bakterielle Last (eCFU/mL) um. Lesen Sie die Behandlungsreaktion als Veränderung der bakteriellen Belastung während der Behandlungsnachbeobachtungszeit.
5. Transmissionselektronenmikroskopie
- Übertragen Sie 2 ml Aliquots von wärmeinaktivierten Kulturen und Steuerungen in 2 ml Mikrozentrifugenrohre. Zentrifuge für 10 min bei 20.000 x g.
- Entsorgen Sie den Überstand und hängen Sie das Pellet in 700 l Zellfixierungspuffer aus und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 5 min, um die Zellen zu fixieren.
- Zentrifugieren Sie die Suspension für 30 min bei 16.000 x g, um ein hartes Pellet zu erhalten. Entsorgen Sie den Überstand und ersetzen Sie es durch 1% Saccharose in phosphatgepufferter Saline (PBS). Bewahren Sie die Pellets in Saccharose bei 4 °C auf, bis sie für die Elektronenmikroskopie geschnitten werden.
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Schnitt und TEM
HINWEIS: Das folgende Protokoll ist von Griffiths et al.28angepasst.- Kryoschützen Sie das Zellpellet, indem Sie es über Nacht bei 4 °C in 2,1 M Saccharose in PBS einbetten. 3x mit eiskaltem Wasser waschen.
- Kühlen Sie die kryogeschützten Zellpellets in flüssigem Stickstoff ab und montieren Sie sie kryomikrotomie-Stubs. Mit dem Kryomikrotom ultradünne Abschnitte bei 90 nm schneiden.
- Holen Sie sich die Schnittabschnitte mit den Wolframdrahtschleifen von 1:1 Mischung von 2% Methylcellulose und 2,1 M Saccharose in PBS.
- Übertragen Sie die Abschnitte auf pioloform beschichtete 150 Mesh sechseckige Kupfer TEM Stützen (Gitter) und speichern Sie bei 4 °C oder fahren Sie mit Schritt 5.4.5.
- Die Gitter in Uranylacetat und lufttrocken in einem Film aus Methylacetat kontrastieren. Waschen Sie die Gitter mit eiskaltem Wasser, gefolgt von zwei Tropfen PBS über 5 min und trocken für 15-30 min. Untersuchen Sie die Abschnitte unter TEM nach den Richtlinien des Herstellers.
HINWEIS: Alle Etikettierungsschritte wurden bei Eistemperatur (Flüssigtemperatur) durchgeführt, mit Ausnahme der Waschschritte, die bei Umgebungstemperatur durchgeführt wurden.
Representative Results
Hitze inaktiviert alle M. tuberculosis bacilli
Die optische Dichte (OD) der Kontrollen (lebende Zellen) nahm im Laufe der Zeit zu (0,04OD–0,85OD) und es wurde keine OD-Änderung in den wärmeinaktivierten Proben beobachtet, was wachstum und kein Wachstum bedeutet (Abbildung 1)27. In ähnlicher Weise wuchs der klinische Kontrollsputum am Tag 3 in MGIT positiv, während hitzeinaktivierte klinische Proben bis zum Ende der Inkubation nicht positiv waren. Das Wachstum von Mtb in MGIT wurde durch Ziehl-Neelsen-Abstrichmikroskopie und das Antigen MPT6429bestätigt.
RNA in inaktivierten Proben ist 4 Tage lang stabil bei 37 °C
Wärmeinaktivierte Proben wurden bei 37 °C inkubiert, um festzustellen, ob die RNA nach der Wärmeinaktivierung von Zellen abgebaut wird. Es wurde kein Unterschied zwischen der rna gefunden, die an Tag (D) 0 unmittelbar nach der Wärmeinaktivierung geerntet wurde, und der RNA, die bei D1, 2, 3 und 4 in beiden BCG-Kulturen isoliert wurde (Abbildung 2A-C) und TB-positiver Sputum (Abbildung 2D).
Exogene RNase erhöht die Rate des RNA-Abbaus in den wärmeinaktivierten Fraktionen
Um festzustellen, warum RNA nicht degradierend war, wurde rNase A Enzym exogen bei 1.000 U/ml vor und/oder nach der Wärmeinaktivierung zugegeben. Dies führte zu einem RNA-Verlust, der der bakteriellen Belastung 1,5 x 0,3 -, 1,8 x 0,2 -und 1,3 x 0,1 - Log10 eCFU/ml bei 80 °C, 85 °C bzw. 95 °C über 4 Tage in kubisierenden Tagen entspricht. Es gab einen Unterschied in der RNA, die in Proben abgebaut wurde, in denen RNase vor und/oder nach der Wärmeinaktivierung hinzugefügt wurde (Abbildung 3A-C).
Ausreichende RNA wird für TB-MBLA mit 16S rRNA als Referenzmarker konserviert
Die Wirkung der Wärmeinaktivierung auf rRNA wurde in BCG-Kulturen und Sputum von TB-positiven Patienten gemessen. Die gemessene bakterielle Belastung der Steuer-BCG-Kultur, 5,3 x 0,2 log10 eCFU/ml, war 0,2 x 0,1 log10 eCFU/ml höher als die kombinierte 5,1 x 0,3-Log10 eCFU/ml wärmeinaktivierte Kultur (ANOVA p < 0,0001) bei 80 °C, 85 °C und 95 °C(Abbildung 4A)27. In ähnlicher Weise lag die bakterielle Belastung des Kontrollpatientensputums, 7,1 log10 eCFU/mL, 0,8 x 0,1 log10 eCFU/ml höher als die kombinierte 6,3 x 0,41 log10eCFU/ml bei 80 °C, 85 °C und 95 °C (Abbildung 4B)27. Die bakterielle Lastreduktion betrug <1log in den beiden getesteten Probentypen.
Sidaks Mehrfachvergleichstest ergab einen signifikanten Unterschied zwischen der bakteriellen Belastung bei 95 °C und der von 80 °C und 85 °C (p = 0,001). In TB-Proben bei allen Temperaturen wurde kein Unterschied festgestellt, p = 0,8.
Die Integrität der Zellwand wird in den meisten Mtb-Zellen nicht durch Hitze zerstört
Mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersuchten wir, ob Zellen durch Wärmeinaktivierung lysiert wurden. Dünne Abschnitte von paraformaldehydfixierten Pellets von Zellen wurden vor der Untersuchung durch TEM hergestellt und in ein elektronenreiches Medium eingebettet. Die Inspektion der Zellen bei niedrigerer und höherer Vergrößerung ergab eine intakte Zellwand und sichtbare intrazelluläre Lipidkörper. Zellen erschienen morphologisch länsam, aber nicht lysiert. Abbildung 5 zeigt die Morphologie von Mykobakterienzellen bei verschiedenen Vergrößerungen. Die beiden oberen Paneele zeigen intrazelluläre Lipidkörper und die ungehinderte seilartige Verzitättung, eine morphologische Eigenschaft, die typisch für Mykobakterienarten ist. Die unteren beiden Platten sind eine höhere Vergrößerung, die die Sicht auf Lipidkörper erweitert und einige mikrointrazelluläre Strukturen offenbart.
Die mit TB-MBLA gemessene bakterielle Belastung korreliert umgekehrt mit der MGIT-Kulturzeit mit der Positivität
Bei Patienten, die auf eine Therapie ansprechen, sinkt die bakterielle Belastung im Verlauf der Behandlung auf durchschnittlich 1 Log10 eCFU/ml pro Woche. Schnelle Responder klären schneller und wandeln bis zu 2 Wochen behandlung in negative (Null bakterielle Belastung) um. Der durch TB-MBLA gemessene Rückgang der Bakterienbelastung entsprach dem Anstieg der MGIT-Kulturzeit zur Positivität (TTP). Abbildung 6 zeigt die inverse Korrelation zwischen bakterieller Belastung und MGIT TTP. Der Unterschied besteht jedoch darin, dass die TB-MBLA-Ergebnisse in 4 h verfügbar sind und die Zeit bis zum Ergebnis unabhängig von der bakteriellen Belastung ist. Dies steht im Gegensatz zu 5–25 Tagen für MGIT-Kulturtests. Die Kontamination mit Nicht-TB-Bakterien beeinträchtigt die Ergebnisse von Kulturtests weiter.
Abbildung 1: Überprüfung der BCG-Inaktivierung bei 80 °C (Punktmusterkurve), 85 °C (Punktstrich-Musterkurve) und 95 °C (Strichmusterkurve). Die Kontrolle (schwarze Kurve) war live (unbeheizt) BCG-Kultur in dasselbe Wachstumsmedium geimpft. Das Wachstum der Kontrolle wurde durch die Zunahme der OD der Kultur während der Inkubationszeit bestätigt. Diese Zahl wurde von Sabiiti et al.27geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Stabilität der quantifizierbaren RNA in wärmeinaktivierten Proben, die 4 Tage lang bei 37 °C inkubiert werden (D0–D4). (A), (B) und (C) zeigen BCG-Kulturen, die bei 80 °C, 85 °C bzw. 95 °C inaktiviert sind. (D) zeigt den bei 80 °C inaktivierten TB-Sputum an. Die Kontrolle ist der unbehandelte (Live-)Anteil derselben Probe. Fehlerbalken = Standardabweichung. Drei Wiederholungen, neun Replikationen pro Durchlauf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Höherer RNA-Abbau nach exogener Zugabe des RNase-A-Enzyms. (A) Wärmeinaktivierung (HI) bei 80 °C, (B) HI bei 85 °C und (C) HI 95 °C. Fehlerbalken = Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Die Erhaltung ausreichender RNA für tb-MBLA-Bakterienlastmessungen mit 16S rRNA als Marker. (A) Bakterielle Belastung aus in vitro BCG-Kulturen geschätzt. (B) Bakterielle Belastung, die durch Tuberkulose-positivem Sputum geschätzt wird. Fehlerbalken = Standardfehler des Mittelwerts (n = 18 bzw. 20 replikation für A bzw. B). Diese Zahl wurde von Sabiiti et al.27geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Elektronenmikroskope intakter Mtb-Bacilli nach Inaktivierung bei 95 °C für 20 min. Klare intakte Zellwand und aufzählbare Lipidkörper wurden mit TEM beobachtet. Oben: Bilder mit geringer Vergrößerung einer Gruppe von Zellen, die ungehinderte mykobakterielle seilartige Kordelmorphologie und intrazelluläre Lipidkörper zeigen. Unten: hohe Vergrößerung der oberen Platten, um die Ansicht von Lipidkörpern zu erweitern und einige mikrointrazelluläre Strukturen zu offenbaren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Die 12-wöchige Behandlungsreaktionskurve eines Patienten mit Anti-TB-Therapie, die eine inverse Korrelation von TB-MBLA gemessener bakterieller Belastung und MGIT TTP zeigt. Die bakterielle Belastung (blaue Kurve) sinkt, während TTP steigt (rote Kurve), während der Patient auf die Behandlung reagiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Master-Mix | RT positive Reaktion | RT negative Reaktion |
| Volumen pro Reaktion x Nein. der Reaktionen + 5 | Volumen pro Reaktion x Nein. der Reaktionen + 5 | |
| Quantitect-Mix | 10,0 l | 10,0 l |
| Mtb16S Primermischung (F + R) | 0,4 l | 0,4 l |
| Mtb16S-Sonde | 0,2 l | 0,2 l |
| EC-Primer-Mix (F + R) | 0,4 l | 0,4 l |
| EC-Sonde | 0,2 l | 0,2 l |
| RT-Enzym | 0,2 l | ------- |
| RNase freies Wasser | 4,6 l | 4,8 l |
| Gesamtvolumen | 16 l | 16 l |
Tabelle 1: Master-Mix-Vorbereitungsanleitung für den TB-MBLA qPCR.
| Typ | MTB-Kanal | EC-Kanal | Interpretation |
| Beispiel | Positive | Positive | Gültig |
| Beispiel | Positive | Negative | Unbestimmten |
| Beispiel | Negative | Positive | Gültig |
| Beispiel | Negative | Negative | Ungültig |
| MTB + Steuerung | Positive | Negative | Gültig |
| Extraktionssteuerung (EC) | Negative | Positive | Gültig |
| DNA-Kontrolle | Negative | Negative | Gültig |
| Negativkontrolle (NTC) | Negative | Negative | Gültig |
Tabelle 2: TB-MBLA-Ergebnisanleitung.
Discussion
Dieser Artikel zeigt, dass die Wärmebehandlung für 20 min bei 80 °C, 85 °C und 95 °C Tuberkuloseproben effektiv inaktiviert, wodurch TB-MBLA in einer Nicht-CL3-Anlage ohne Infektionsrisiko für Laborarbeiter durchgeführt werden kann. Die Ergebnisse bestätigen Beobachtungen aus früheren Studien, während sie im Gegensatz zu einigen über die Wirksamkeit der Wärmeinaktivierung von Mtb25,30stehen. Einige Berichte deuten beispielsweise darauf hin, dass das Erhitzen bei 80 °C bei Proben mit hoher Bakteriumlast25,31,32,33nicht wirksam ist. Der inokulumige Effekt mit hoher Dichte wurde in unserer Studie vermieden, indem sichergestellt wurde, dass alle Sputum- und reinen Kulturen mit einem Volumen von 1 ml pro 15 ml Zentrifugenrohr erhitzt wurden, das ausreichend Platz bietet, um jeden Teil der Probe kochend27auszusetzen.
Die RNA-Konservierung nach Wärmeinaktivierung ermöglicht die Durchzuführens von TB-MBLA. Dieser Befund stimmt mit zwei Studien überein, die die RNA-Konservierung nach Wärmeinaktivierung12,34demonstrierten. Wir zeigten, dass die RNA in wärmeinaktivierten Proben 4 Tage lang bei 37 °C stabil ist, was bedeutet, dass Laboratorien Batch-Tests durchführen können, indem sie inaktivierte Proben eine Woche lang bei Raumtemperatur aufbewahren. Durch die Anwendung von RNA-Extraktionskits, die Kühlung oder Gefrieren erfordern, macht die Möglichkeit, wärmeaktivierte Proben bei Raumtemperatur zu halten, die Notwendigkeit, sowohl Fürden als auch für Laboratorien der Kategorie 3 TB-MBLA in ressourcenbegrenzten Umgebungen durchzuführen.
Weniger als 1log bakterielle Last ging mit der 16S rRNA als Marker verloren. Obwohl es einen Unterschied zwischen lebender und wärmeaktivierter Probe gab, ist die Menge, die durch die Wärmeinaktivierung verloren geht, zu klein, um die nachgelagerten Ergebnisse zu gefährden. Die steigende Temperatur erhöhte nicht die Menge an VERLORENer RNA, was bedeutet, dass der beobachtete Verlust unabhängig von der Wärmebehandlung ist. Wärmebehandlung bei hohen Temperaturen verursacht höchstwahrscheinlich eine Zelllyse und setzt RNA dem Abbau durch RNasen aus. Tatsächlich erhöhte die exogene Zugabe von RNase A zur wärmeinaktivierten Fraktion die Rate des RNA-Abbaus. Das Kochen verringerte die Aktivität von RNase nicht, was bedeutet, dass es ein sehr belastbares Protein ist.
Es ist wichtig zu beachten, dass ein durchschnittlicher RNA-Abbau von 1,5 log10 eCFU/mL kein großer Verlust ist. Zu diesem Zweck vermuten wir, dass das Erhitzen einen kleinen Anteil an Mtb-Bazillen limiert und somit eine kleine Menge RNA RNase aussetzt. Mit TEM haben wir gezeigt, dass die Mtb-Zellmorphologie und -integrität der Zellwände durch Erhitzung bei 95 °C kaum beeinträchtigt wird. Dies bedeutet, dass es verschiedene physiologische Faktoren und eine ausreichende Versorgung mit RNasen erfordern kann, wie z. B. im Wirt, um RNA35,36signifikant zu verschlechtern. Darüber hinaus ist 16S rRNA als strukturelles Ribosom potenziell weniger anfällig für RNase37,38. Eine einzelne Mtb-Zelle enthält 700 Ribosomen/0,1 mm3 Zytoplasma37, was bedeutet, dass es höhere Mengen an rRNA pro Zelle gibt. Daher können kleinere Mengen von RNase eine kleinere Auswirkung haben38. Die Existenz einer hohen Anzahl von Ribosomen verschafft TB-MBLA einen Vorteil in Bezug auf Empfindlichkeit und Fähigkeit, TB-Patienten mit geringer Belastung zu erkennen.
Es bestand eine starke Korrelation zwischen der bakteriellen Belastung, gemessen durch TB-MBLA und der MGIT-Kultur TTP. Dies bestätigt die bakterielle Belastung als Treiber der Kulturpositivität bis zu einem gewissen Grad. Der Vorteil von TB-MBLA besteht jedoch darin, dass es die in der Probe vorhandene Bacillary-Belastung direkt quantifiziert und keine Mtb-Zellproliferation vor dem Nachweis erfordert. Dies steht im Gegensatz zu einer Kultur, deren Zeit zur Positivität von der Höhe der bakteriellen Belastung und der Rate der Mtb-Zellproliferation abhängt. Zukünftige Studien werden den TB-MBLA-Workflow, einschließlich der Wärmeinaktivierung, in routinemäßigen klinischen Umgebungen bewerten. Die Studie wird auch Proben mit einer Reihe von bakteriellen Belastungen untersuchen, um die Zahl zu verstehen, die sich von positiv zu negativ ändern könnte (d. h. solche mit weniger Bakterien nach der Hitzeinaktivierung).
Das TB-MBLA-Protokoll zur molekularen Quantifizierung bakterieller Belastung ist das erste seiner Art in der Bakteriologie. Die Methode quantifiziert direkt die Mtb-Bacillary-Belastung aus dem Patientensputum und erfordert dafür keine Kultur. Dies macht es schneller und erhöht sein Potenzial, eine klinische Entscheidung über den Fortschritt der Patienten zu informieren. Der Wärmeinaktivierungsschritt reduziert das Infektionsrisiko und erhöht die Anwendbarkeit von TB-MBLA in Umgebungen, die kein Labor der Kategorie 3 haben. Nach der Wärmeinaktivierung der Probe gibt es drei Protokollschritte, um TB-MBLA-Ergebnisse zu erzielen: RNA-Extraktion, Reverse Transcriptase (RT)-qPCR und qPCR-Ergebnisanalyse.
Je höher die Effizienz der Isolierung von Mtb-RNA aus einer Patientenprobe, desto höher ist die Qualität der Ergebnisse. Es ist wichtig zu beachten, dass die Qualität der Sputumprobe die Menge der isolierten RNA beeinflusst. Zum Beispiel, Speichelsputum gilt als niedrige Qualität und wurde mit niedriger Bacillary Last verbunden. Das bedeutet, dass die Schulung des Patienten für eine qualitativ hochwertige Sputumerwartung wichtig ist. Um die Effizienz des Extraktionsprozesses zu bewerten, wird eine Extraktionskontrolle (d. h. die bekannte Anzahl von Nicht-Mtb-Zellen) vor der RNA-Extraktion in die Probe eingespritzt. Der Abruf der Extraktionskontrolle bestätigt die Effizienz des RNA-Extraktionsprozesses. Der RNA-Isolationsprozess kann nur gültig sein, wenn die Extraktionssteuerung abgerufen wurde. Angesichts der Tatsache, dass Mtb ein widerstandsfähiger Organismus ist, macht die mechanische Lyse zu einem entscheidenden Teil des Prozesses. Die Homogenisierung der Probe bei hoher Geschwindigkeit (600 Rpm) in Gegenwart von Perlen (d.h. Lysing-Matrix) lysiert die Zellen effektiv. Die Reinigung des Lysats ergibt einen Extrakt, der sowohl RNA als auch DNA enthält. Die Entfernung von DNA ist ein entscheidender letzter Schritt der RNA-Extraktion. TB-MBLA zielt darauf ab, lebensfähige Bazillen durch Quantifizierung von RNA zu messen. Daher bedeutet das Versäumnis, genomische DNA zu entfernen, dass die Ergebnisse ein Signal aus der DNA haben, das kein guter Marker für die Zelllebensfähigkeitist 6.
Der RT-qPCR ist ein Duplex-Lauf dual-gekennzeichnete Sonden für Mtb und Extraktionssteuerung. Es umfasst drei Schritte: 30 min Umgekehrte Transkription durch Reverse-Transkriptase bei 50 °C, 15 min Denaturierung bei 95 °C und 40 Zyklen der Verstärkung bei 94 °C und 60 °C. Die Erfassung der Fluoreszenz aus den Sonden erfolgt bei 60 °C (d. h. der Fragmentdehnungsstufe). Es ist wichtig zu beachten, dass die TB-MBLA mit einer bestimmten qPCR-Maschine optimiert wurde, daher sollten Bediener, die andere qPCR-Plattformen verwenden, die Bedingungen für ihre Ausrüstung optimieren. Die Effizienz der DNA-Entfernung wird durch ausführen einer einzigen Reaktion pro Probe in Abwesenheit von RT gesteuert. Ein positives Ergebnis dieser Reaktion bedeutet eine unvollständige Entfernung der DNA. Proben mit hoher Belastung mit hoher DNA-Menge können die doppelte Menge an DNase-Enzym benötigen, um DNA vollständig zu entfernen. Glücklicherweise ist es in Proben mit hoher Bacillary-Last weniger wahrscheinlich, dass sich das Ergebnis aus der RNA auf das Ergebnis auswirkt. Ribosomale RNA, das TB-MBLA-Ziel, kommt natürlicherweise in doppelt so viel DNA37vor. In der PCR, eine No Template Control (NTC), das Wasser verwendet wird, um die PCR-Reagenzien aufzulösen, Kontrollen für Kreuzkontamination mit exogener DNA oder RNA. Ein positives Signal im NTC impliziert Kreuzkontamination und das Ergebnis als ungültig. Das bedeutet, dass alle Lösungen, die mit diesem Wasser konstituiert werden, verworfen und neue mit einer frischen Durchstechflasche mit Wasser hergestellt werden müssen. Es ist ratsam, PCR-Wasser in separaten Aliquots zu halten, um eine Kontamination des gesamten Wassers zu vermeiden. Eine Positivkontrolle (Mtb RNA) wird verwendet, um die Gesamteffizienz der PCR zu steuern.
Die Ergebnisanalyse beinhaltet die Umwandlung von PCR Cqs in bakterielle Last (d. h. die geschätzten Koloniebildungseinheiten pro ml) unter Verwendung der Standardkurve. Die Einstellung und Optimierung der Standardkurve ist für diesen Schritt von entscheidender Bedeutung. Es wird ein Standardkurvenwirkungsgrad von 0,95–1 empfohlen. Standardkurven für MTb und Extraktionssteuerung sollten eingerichtet und optimiert werden, bevor Patienten oder andere Testproben auf der Maschine ausgeführt werden. Standardproben werden mit dem TB-MBLA-Kit geliefert. Für PCR wird eine zehnfache Verdünnung des RNA-Extrakts empfohlen. Dies bedeutet, dass das bakterielle Belastungsergebnis mit dem Faktor 10 multipliziert werden muss, um das endgültige bakterielle Belastungsergebnis pro ml zu erhalten. Es ist wichtig zu beachten, dass Cqs über 30 als negativ für TB-MBLA angesehen werden. Mindestens zwei prospektive bakterielle Belastungsergebnisse, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten gemessen werden, sind erforderlich, um einen Rückschluss auf das Behandlungsverhalten zu ziehen. Es wird dringend empfohlen, dass eines der beiden Ergebnisse vor Beginn der Behandlung als Basiswert bezeichnet werden sollte. Wenn der Patient jedoch eine bakterielle Belastungsbewertung in der Mitte der Behandlung einleitet, muss es eine zweite Zeitpunkt-Bakterienlastmessung geben, um das Behandlungsverhalten zu bewerten. TB-MBLA kann bakterielle Belastung in einem Raum von 3 Tagen auf der Behandlung unterscheiden, aber das Ideal sind zwei bakterielle Belastungsmessungen im Abstand von 7 Tagen.
Während das Protokoll informative quantitative Ergebnisse für die Behandlungsreaktion generiert, ist es immer noch weitgehend manuell und erfordert erhebliche Hände auf Zeit für die RNA-Extraktion. Techniker in stark frequentierten Labors haben diese Zeit möglicherweise nicht. Es laufen Vorkehrungen zur Automatisierung der RNA-Extraktions- und PCR-Prozesse.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Studie wurde durch die Finanzierung durch die European and Developing Countries Clinical Trials Partnership (EDCTP) – Pan African Biomarker Expansion Program (PanBIOME) gewährt. Unterstützung erhielt auch das Forschungsstipendium der University of St Andrews School of Medicine. Die Veröffentlichung dieses Manuskripts und des TB-MBLA-Protokolls als visuelle Ressource wurde durch die Finanzierung durch den Scottish Funding Council und den Global Challenges Research Fund an die University of St Andrews ermöglicht. Dank des Maputo Maternal Hospital und des Mavalane Health Centre, das die klinischen Sputumproben zur Verfügung stellte, und dem Team der Maputo Tuberculosis Treatment Unit, das bei den Wärmeinaktivierungsexperimenten klinischer Sputumproben half.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat inactivation: | |||
| 15 mL Centrifuge tubes | Fisher-Scientific | 10136120 | 50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved |
| 15 mL Wire Tube rack | Fisher-Scientific | 11749128 | Other brands with similar make can be used |
| Water bath | Fisher-Scientific | 15700619 | Other brands with similar make can be used |
| RNA extraction: | |||
| Chloroform | Sigma | 372978-1L | Not necessary in other RNA extraction kit brands |
| Ethanol, absolute 99-100% | Sigma | 51976-500ML-F | Larger volume available |
| Extraction control | SOI group St Andrews | VitalbacteriaEC | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit |
| FASTRNA Pro blue Kit | MP Biomedicals | 116025050 | Supplied with lysing matrix tubes |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Qiagen, Fisherscientific can also supply same product |
| Precellys 24 homogeniser | VWR | 432-3750 | FastPrep MP Biomedicals can be used too |
| Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus | Fisher-Scientific | 15352117 | Other brands with similar capacity can be used |
| Thermomixer | Eppendorf | BLD-455-010C | Works with 1-2 mL tubes |
| TURBO DNA-free | Fisher-Scientific | AM1907M | Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures. |
| RT-qPCR: | |||
| Primers and Taqman probes | SOI group St Andrews | VitalbacteriaPP | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX. |
| QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit | Qiagen | 204845 | PCR mix plus the RT enzyme |
| RotorGene Q 5plex machine | Qiagen | 9001580 | Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc. can be used |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 mL | Qiagen | 981103 | Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed. |
| Non-heat inactivation Sample preservation materials | |||
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | 93313 | Supplied ready to use |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Many competent suppliers |
| Guanidine thiocyanate (GTC) | Promega | V2791 | Promega brand recommended for quality |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Ensures that GTC solution is free of nucleases |
| General materials (used but not specific to TB-MBLA) | |||
| 500 mL plastic containers | 734-5087 | Nalgene brand recommeded | |
| Biological waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Chemical waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Disposable gloves, chemical resistant | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-20 °C) | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-80 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fridge (0-8 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fume hood | For safe handling of toxic reagents | ||
| Laboratory scales | For accurate measurement of reagents | ||
| Measuring cylinders, plastic | To ensure accurate measurement of reagents | ||
| PCR reaction tubes | Should be suitable to the PCR instrument used | ||
| Pipettes and matching sterile filtered pipette tips, | DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended | ||
| Qiagility loading plates | Qiagen | 5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates | |
| QIAgility Pipetting Robot | Qiagen | Important for high throughput pipetting | |
| Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes | Chemical-resistant and autoclavable recommended | ||
| RNase Away (Removes RNases enzymes from working space) | Fisher Scientific | 10666421 | Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme |
| Safety goggles, chemical resistant | Fisher Scientific | Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents. | |
| Sterile Pasteur pipettes, 1.5-3 mL | Many competent suppliers | ||
| Sterile RNAse-free microtubes | 1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended | ||
| TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse | Ensure it is freshly prepared or prepared within a week | ||
| Vortex | Genie 2 brand recommended | ||
| Transmission electron microscopy | |||
| Glutaldehyde (8%) | Sigma | G7526-10ML | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| HEPES (pH 7.4, 100 mM) | Sigma | H4034-25G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Leica FCS ultracryo | Leica | Cryomicrotome for tissue sectioning | |
| Methyl cellulose | Agar Scientific | AGG6425 | Cold mounting resin |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Sigma | P6148-500G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Sucrose | Sigma | 84097-250G | Preservation and mounting medium |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | AGR1260A | Universal Electron microscopy stain |
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