Summary
우리는 가래의 열 불활성화 후에 수행된 결핵 분자 세균성 하중 분석 시험을 기술합니다. 열 불활성화는 가래 샘플을 비감염성으로 만들고 결핵 분자 검사를 위한 봉쇄 수준 3 실험실에 대한 필요성을 없애주게 합니다.
Abstract
결핵은 유엔(UN)이 위험한 범주 B 생물학적 물질로 분류한 병원균인 결핵균(Mtb)에 의해 발생합니다. 작업자의 안전을 위해 Mtb를 운반하는 것으로 추정되는 모든 시료의 취급은 봉쇄 수준(CL) 3 실험실에서 수행되어야 합니다. 결핵 분자 세균 부하 분석 (TB-MBLA) 시험은 16S rRNA를 위한 프라이머 및 이중 표지된 탐사기를 사용하여 Mtb 간부 부하를 정량화하는 역전사 정량적 중합효소 연쇄 반응 (RT-qPCR) 시험입니다. 우리는 TB-MBLA를 위한 RNA를 보존하는 동안 비감염성 결핵 견본을 렌더링하기 위하여 열 불활성화의 사용을 기술합니다. 단단히 닫힌 15 mL 원심 분리기 튜브에서 가래 샘플의 1 mL aliquot는 Mtb 간균을 비활성화하기 위해 80 °C, 85 °C 또는 95 °C에서 20 분 동안 끓입니다. 42일 동안 열불활성화 및 제어(live) 샘플을 재배하여 결핵의 사망을 확인하였다. 불활성화된 샘플은 추출 대조군 100 μL로 스파이크되고 RNA는 표준 RNA 격리 절차에 따라 추출됩니다. 열처리된 시료의 배양에서 성장이 관찰되지 않았다. 단리된 RNA는 실시간 RT-qPCR을 실시하여 Mtb 16S rRNA 유전자에서 특정 표적을 증폭시키고, 정량화 사이클(Cq)의 형태로 결과를 산출한다. 표준 곡선은 Cq를 박테리아 하중또는 mL당 추정 콜로니 형성 단위(eCFU/mL)로 변환하는 데 사용됩니다. Cq와 샘플의 세균 부하 사이에는 역관계가 있습니다. 한계는 열 불활성화가 일부 세포를 침출하여 RNA를 RNases에 노출하여 1 log10eCFU/mL(즉, <10 CFU/mL)의 손실을 유발한다는 것입니다. 추가 연구는 열 불활성화로 인한 거짓 부정적인 결과를 일으키는 매우 낮은 부담 환자의 비율을 결정할 것입니다.
Introduction
결핵균(Mtb)에 의한 결핵은 7 x 106의 새로운 결핵(TB)에 의해 전 세계적으로 보고되며, 그 중 1 x 106 이상이 매년 Mycobacterium tuberculosis 1,,2씩사망합니다. 이러한 추세를 반전시키기 위해 세계보건기구(WHO)는 효과적인 진단 및 치료 도구 개발을 포함한 3가지 기둥 접근법을시작했습니다 3. UN에 의해 위험한 생물학적 물질 B로 분류되고, Mtb에 대해 양성으로 추정되는 샘플로 작업하려면 3의 봉쇄 수준(CL)이 필요합니다. CL3 실험실은 구축 및 유지 보수비용이 많이 듭니다. 따라서 대부분의 국가는 지역 또는 국가 수준에서 중앙 집중식 결핵 문화 서비스를 보유하고 있습니다. 이것은 얼룩 현미경 검사가 말초 헬스케어 시설에서 이용 가능한 진단 공구이다는 것을 의미합니다.
레벨 4 의료 시설에서 Xpert MTB / RIF와 같은 빠른 분자 검사를 구현하기 위한 WHO 승인이 있으며, 주로 지구4,,5에위치하고 있습니다. 일부 지구는 매우 크고 어떤 사람들에 게 덜 접근. 유익한 동안, Xpert MTB/RIF는 Mtb DNA를 검출하여 작동합니다. DNA는 세포가 죽은 후 오래 생존하는 안정된 분자이며, 따라서 치료 반응5,,6을모니터링하는 데 중요한 생존 세포를 측정하는 좋은 표준이 아니다. RNA 계 세포는 생존 세포의 정확한 측정을 위한 대안을 제공합니다77,8,,9,10,,11,,912,,13. RNA는 다양한 안정성의 다른 종에 존재: 리보소말 RNA (rRNA), 전송 RNA (tRNA), 그리고 메신저 RNA (mRNA). 메신저 RNA는 유전자 발현과 연관되어 세포 활성 및생존가능성(14)과가장 밀접하게 연관되어 있다. 유전자 발현의 부재는 Mtb와 같은 병원체가 비활성(휴면 상태)에 존재하지만 실행 가능한 상태15,,16에존재하기 때문에 세포 사멸과 동등하지 않다는 점에 유의하는 것이 중요하다. rRNA와 같은 안정한 RNA 종은 그러므로 실행 가능한 세포의 활성 및 비활성 상태 둘 다의 더 나은 마커입니다.
대장균을사용하여, 셰리던은 16S rRNA가 콜로니 형성 단위(CFU)에 의해 측정된 세균 성장과 비례적으로 증가한다는 것을 보여주었다17. 대장균 박테리아가 항생제에 노출되었을 때 CFU 수와 16S rRNA에서 동시 감소가 있었습니다. 세포 사멸 후 rRNA의 추락은 세포 생존을 위한 마커로서 사용될 수 있다는 지표였다13,,17. 이러한 원리로부터, TB 분자 세균 부하 분석법(TB-MBLA)은,항결핵 치료11,,18,19에대한 환자에 대한 치료 반응의 마커로서 생존 가능한 결핵 균주 부하를 측정하기 위해 M. 결핵 16S rRNA를 표적으로 하기 위해 개발되었다. 우리는 M. 결핵 간균의 용해를 반영하는 세포 추출 제어를 통합하고 다른 환경 설정20에서견고하다는 것을 통합하기 위해 TB-MBLA를 더욱 개발하고 최적화했습니다. TB-MBLA 절차는 Mtb 세포가 작업자의 안전을 보장하기 위해 완전히 용해 될 때까지 CL3 실험실에서 수행될 Mtb에서 RNA 격리의 첫 번째 단계를 필요로한다. 또한 구니딘 티오차네이트에서 -80°C에서 유지되는 회고적 배치 분석을 위한 샘플 보존, 레벨 4 독성 물질을 포함한다. 이를 위해, 우리는 Mtb를 비활성화하고 TB-MBLA가 얼룩 현미경 수준 실험실에서 수행 될 안전한 샘플을 렌더링하기 위해 열을 사용했다.
실험실 및 임상 응용 프로그램에서 열의 사용은 수세기 동안 주변되었습니다21,,22. 그러나, Mtb 와 같은 일부 미생물은 죽이기 어렵고, 열에 대한 노출이 짧아 모든세포(23,,24)를죽이기에는 충분하지 않다. 연구 는 80 °C에서 결핵 배양의 20 분 가열PCR25에필요한 DNA를 파괴하지 않고 모든 Mtb 간균을 죽였다는 것을 밝혔다. 이어서, 다수의 실험실 DNA 추출 기술은 현재 95°C로 가열된다. 우리는 80 °C, 85 °C 또는 95 °C에서 끓는 결핵 샘플이 TB-MBLA가 수행될 충분한 RNA를 보존하면서 Mtb를 비활성화한다는 것을 보여주기 위해 동일한 원리를 적용했습니다. 불활성화 배양 또는 가래는 정량화 가능한 rRNA의 양을 감소없이 실온에서 단단히 닫힌 용기에 유지되거나 7 일 동안 냉장 될 수 있습니다.
현재 연구용(RUO) 테스트로만 사용되고 있는 TB-MBLA는 적응이 가능하며 가래, 폐 조직 및 뇌척수액을 포함한 다양한 시료 유형에 적용되었습니다. 그것은 기관지 폐포 액체, 혈액 및 그밖 견본 모형에 아직 적용될 수 있습니다. 가래를 시료로 사용하여, 아프리카의 다중 사이트 평가(미공개 데이터) 및 이전 간행물18,,26은 MBLA의 민감도가 진균 성장 지표 튜브(MGIT) 액체 배양과 일치한다는 것을 보여준다. 그러나, TB-MBLA는 더 빠르며, 시료내의 비결핵 미생물에 의해 영향을 받지 않는, 특이적이고, 질병 중증도의 정량적 척도를 제공한다. WHO는 최근 결핵 치료를 모니터링하기 위한 얼룩 현미경 및 배양을 대체할 후보로 TB-MBLA를 인정했다2.
이 문서에서 우리는 사비티 외27에게시 된 열 불활성화 및 TB-MBLA 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 상세한 프로토콜은 전 세계 TB-MBLA 사용자를 위한 원스톱 시각적 리소스를 제공합니다.
Protocol
1. 견본 준비
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문화
- 깨끗한 벤치 또는 클래스 1 캐빈에서 작업, 15 mL 플라스틱 원심 분리 튜브로 지수 단계 Bacillus Calmette-Guérin (BCG) 배양의 1 mL aliquots를 수확. 튜브를 단단히 닫습니다.
참고: 전체 5 mL 샘플을 처리하려면 5 개의 15 mL 원심 분리튜브가 필요합니다.
주의: 결핵 배양시 생체 안전 캐비닛이 필요합니다.
- 깨끗한 벤치 또는 클래스 1 캐빈에서 작업, 15 mL 플라스틱 원심 분리 튜브로 지수 단계 Bacillus Calmette-Guérin (BCG) 배양의 1 mL aliquots를 수확. 튜브를 단단히 닫습니다.
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환자 가래 시편
- 통풍이 잘되는 공간에서 작업하고 비강 마스크를 착용하고 시편 컵을 조심스럽게 열고 15 mL 플라스틱 원심 분리튜브에 파이펫 1 mL aliquots를 넣고 튜브를 단단히 닫습니다.
참고: 파이펫 가래에 넓은 입 끝을 추천합니다. 한 쌍의 가위를 사용하여 1 mL 팁 입의 미세한 부분을 잘라서 입을 넓게 만듭니다.
- 통풍이 잘되는 공간에서 작업하고 비강 마스크를 착용하고 시편 컵을 조심스럽게 열고 15 mL 플라스틱 원심 분리튜브에 파이펫 1 mL aliquots를 넣고 튜브를 단단히 닫습니다.
2. 열 불활성화
- 시료 를 준비하기 전에 수조를 95 °C로 설정하십시오.
참고: 95 °C 온도RNase 활동을 감소의 기회를 증가 하 고 따라서 다운 스트림 TB-MBLA에 대 한 더 많은 RNA를 보존. - 샘플 튜브를 수조에 담근 홀딩 랙으로 옮김을 옮김으로 옮김. 각 샘플 튜브의 3/4가 물에 담그도록 하십시오.
- 95 °C에서 20 분 동안 끓인 다음 RNA 추출을 시작하기 전에 실온에서 5 분 동안 식히기 위해 튜브를 벤치로 옮김하십시오.
참고: M. 결핵 간균 및 BCG의 완전한 열 불활성화는 성장을 확인하기 위해 42일 동안 37°C에서 열 불활성화 샘플 및 대조군을 배양하여 검증하였다. 600 nm (OD600)에서광학 밀도 측정은 기준선에서 찍은 다음 42 일 잠복기 동안 매주 취했습니다.
3. RNA 추출
참고: 여기에 설명된 RNA 추출 과정은 재료 표에나열된 RNA 키트를 위한 것입니다. 다른 제조 업체에 의해 다른 적합한 RNA 추출 키트를 사용할 수 있습니다.
- 추출 제어(EC) 추가
- 열 불활성화 샘플의 1 mL aliquots를 1.5 mL 튜브로 옮김. EC의 100 μL을 각 샘플내로 스파이크하고, 튜브를 닫고, 튜브를 거꾸로 3배 뒤집어 혼합한다.
참고: EC는 TB-MBLA 생명 균 키트(재료의 표)와함께 제공 됩니다.
- 열 불활성화 샘플의 1 mL aliquots를 1.5 mL 튜브로 옮김. EC의 100 μL을 각 샘플내로 스파이크하고, 튜브를 닫고, 튜브를 거꾸로 3배 뒤집어 혼합한다.
- 세포 침전
- 벤치탑 미세원심분리기를 사용하여 실온에서 10분 동안 20,000 x g의 튜브를 원심분리합니다. 50 μL의 퇴적물을 남기고 상급제에서 피펫을 벗겨내다.
- 950 μL의 용해 완충액으로 침전물을 상하로 파이펫팅하여 침전물을 중단하고, RNA 추출 키트(Tableof Materials)와함께 제공된 용해 매트릭스 튜브로 전체 현탁액을 전달한다. 튜브가 단단히 닫혀 있는지 확인하고 뚜껑과 튜브 측면에 라벨을 붙입니다.
- 세포 용해의 경우, 튜브를 3.2.2 단계에서 균질화로 옮김으로 옮김을 옮김. 6,000 rpm에서 40 s에 대한 샘플을 균질화합니다.
- 핵산 정제
- 실온에서 5분 동안 12,000 x g에서 3.3단계에서 용해액을 원심분리합니다.
- 신선한 1 mL 튜브를 준비하고 각 튜브에 300 μL의 클로로포름을 추가합니다.
- 1 mL 팁을 사용하여 용해 매트릭스를 건드리지 않고 상급자에서 조심스럽게 피펫을 피펫합니다.
- 상층을 5초 동안 튜브와 소용돌이를 함유한 클로로폼으로 옮기고, 3단계(상부, 중, 하부)가 명확하게 보일 때까지 튜브를 5분 이상 정착시키도록 방치한다.
- 실온에서 5 분 동안 12,000 x g의 원심 분리기. 조심스럽게 상부를 파이펫하고 신선한 1.5 mL 튜브로 옮김.
- 3.4.5단계의 튜브에 500 μL의 얼음-차가운 100% 에탄올을 넣고 튜브를 닫고 3배 아래로 부드럽게 뒤집어 섞습니다. 튜브를 -80°C에서 15분 동안 또는 -20°C에서 30분 동안 배양하고 추출을 계속하거나, 다음날 추출을 완료하기 위해 -20°C에서 하룻밤 방치한다.
- 미세원심분리기를 4°C로 설정하고 원심분리를 시작하기 전에 적어도 12°C로 식힌다. 13,000 x g에서20 분 동안 미세 원심 분리기및 원심 분리기에 튜브를적재하십시오. 상급제는 버리고, 70% 얼음차가운 에탄올로 교체하고, 원심분리기를 13,000 x g에서10분 더 돌립니다.
참고: 70% 에탄올은 분자 등급의 뉴클레아제 프리 워터로 만들어야 합니다. - 3.4.7 단계에서 모든 상급자를 버리고 튜브를 50 °C로 설정된 인큐베이터로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김. RNA/DNA 펠릿을 건조시키기 위해 20분 동안 배양합니다. 모든 에탄올의 증발을 가능하게 하기 위해 튜브를 부분적으로 열어 두십시오.
- 100 μL의 뉴클레아제 프리 워터를 마른 펠릿에 넣고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 3 s에 대 한 소용돌이 내용물 혼합.
참고: 이 단계에서 추출물은 섹션 3.5가 수행될 때까지 -80°C에서 냉장고에 2-3일 이상 보관될 수 있다.
- DNA 제거
참고: 이 단계는 추출물에 DNA가 존재하면 MBLA 결과를 무효화하기 때문에 매우 중요합니다. 이 섹션은 DNA 제거키트(재료 표)를기반으로 합니다.- 샘플 수(완충액 10 μL 및 샘플당 DNase 1 μL)와 파이펫팅으로 인한 손실을 커버하기 위해 10% 추가로 DNase I 효소를 혼합하여 준비합니다. RNA 추출물을 함유하는 각 튜브에 11 μL의 피펫을 소용돌이치게 하여 혼합한다.
- 3s를 휘두를 때 섞은 다음 잠시 회전 (10 s 에서 13,000 x g)을사용하여 벽에 있는 물방울을 제거합니다. 37°C에서 30분 동안 뜨거운 블록 또는 인큐베이터에서 배양한다. DNase I 효소 1 μL을 각 튜브에 직접 넣고, 소용돌이에 의해 잘 섞고, 37°C에서 30분 동안 추가로 배양합니다.
- DNase 인큐베이션이 끝나기 10분 전에 DNase 불활성화 시약을 해동합니다. 소용돌이 20 s는 균질한, 유백색 현탁액을 보장한 다음 3.5.2 단계에서 각 RNA 추출물에 DNase 불활성화 시약 10 μL을 첨가한다.
- 5 분 배양 단계에서 5 분 동안 소용돌이 3x동안 실온에서 혼합물을 배양합니다.
- 혼합물을 13,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리합니다.
- RT-qPCR을 같은 날 또는 장기 보관을 위해 -80°C에서 실행하는 경우 RNA 추출물을 냉장고에 보관하십시오.
4. 역전사 qPCR
- 알 수 없는 샘플의 경우, RNase 자유 물에서 1:10 비율로 사용되는 모든 RNA 추출물을 희석합니다. 5s에 대한 소용돌이에 의해 잘 혼합하고 잠시 물방울이나 기포를 제거하기 위해 아래로 회전.
- 표준 곡선에 대한 표준 시료의 경우 -80°C 냉동고에서 Mtb 및 EC RNA 표준을 취하고 실온에서 해동합니다. Mtb 및 EC 표준 샘플의 7개 및 6개의 10배 희석을 각각 확인합니다. 혼합물을 한 튜브에서 다른 튜브로 옮기기 전에 팁을 변경합니다.
참고: 표준 샘플은 TB-MBLA 키트와 함께 제공됩니다. -
마스터 믹스 준비
참고: 마스터 믹스(MM)는 모든 시료, 표준 및 물을 증폭하여 템플릿 제어(NTC)를 충분히 증폭할 수 있는 PCR 시약의 용액입니다. NTC로서 사용되는 물은 MM을 추출 및 준비시키기 위해 사용되는 물과 동일한 물이어야 한다. RT-반응은 DNA 제거의 효율을 결정하는 대조군이다(표1).- 각 PCR 반응 튜브에 MM의 16 μL을 전달합니다.
- 각 RT+ 및 RT-반응 튜브와 물을 NTC 반응 튜브에 4 μL의 RNA 추출물을 첨가합니다.
- 반응 튜브를 실시간 PCR 기계에 로드하고 다음과 같이 PCR 조건을 설정합니다: 30분 동안 50°C, 15분 동안 95°C, 94°C에서 40x 사이클, 45초동안 94°C, 녹색 및 노란색 채널에서 흡수되는 형광소로 1분 동안 60°C.
참고: 녹색 채널은 Mtb 검출 형광포및 황색은 추출 제어 형광포골이다.
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결과 해석
참고: 동일한 샘플의 중복 반응이 1개 이상의 표준 편차로 다르지 않은지 확인합니다. Mtb 및 EC Cq 값이 30보다 높은 값은 음수로 간주됩니다. 자세한 해석 세부 정보는 표 2에서참조하십시오.- 치료 반응을 해석하려면 표준 곡선을 사용하여 Cq 값을 박테리아 하중(eCFU/mL)으로 변환합니다. 치료 후속 기간에 걸쳐 세균 부하의 변화로 치료 반응을 읽는다.
참고: 처리 다음 세균 성 부하에 있는 가을은 양성 반응을 의미합니다 (즉, 결핵 박테리아를 죽이는 항 결핵 약) 세균부 짐에 있는 아무 변경 또는 상승도, 반대로 결핵 약에 결핵 박테리아의 저항을 의미할 수 있는 또는 환자는 그들의 처리 복용량에 적당하게 고수하지 않는 부정적인 반응을 의미합니다. TB-MBLA에 의해 측정된 세균 부하의 하락은 배양 양성(TTP)에 대한 MGIT 시간의 증가와 상관관계가 있다.
- 치료 반응을 해석하려면 표준 곡선을 사용하여 Cq 값을 박테리아 하중(eCFU/mL)으로 변환합니다. 치료 후속 기간에 걸쳐 세균 부하의 변화로 치료 반응을 읽는다.
5. 전송 전자 현미경 검사법
- 2 mL aliquots의 열 불활성화 배양 및 대조군을 2 mL 마이크로 원심 분리튜브로 옮김. 원심분리기 는 20,000 x g에서10 분 동안 .
- 상온액을 버리고 펠릿을 700 μL의 세포 고정 버퍼로 중단하고 실온에서 5분 동안 배양하여 세포를 고정시한다.
- 16,000 x g에서 30 분 동안 현탁액을 원심 분리하여 단단한 펠릿을 얻었다. 상급체를 버리고 인산완식염수린(PBS)에 1% 자당으로 교체합니다. 전자 현미경 검사법을 위해 단면화 될 때까지 4 °C에서 자당에 펠릿을 저장합니다.
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단면 및 TEM
참고 : 아래의 프로토콜은 그리피스 외28에서적응된다.- 4°C에서 하룻밤 동안 PBS에 2.1 M 자당에 포함시킴으로써 세포 펠릿을 냉동 보호. 얼음으로 차가운 물로 3x 씻으소서.
- 액체 질소에 냉동 보호 세포 펠릿을 냉각하고 저온 미세 절제 스텁을 장착. 저온 마이크로토메를 사용하여 초박형 부분을 90 nm로 자른다.
- PBS에서 2% 메틸 셀룰로오스와 2.1 M 수크로오스의 1:1 혼합물의 텅스텐 와이어 루프를 사용하여 절단 섹션을 검색합니다.
- 피올로폼 코팅 된 150 메쉬 육각 구리 TEM 지지체 (그리드)로 섹션을 전송하고 4 °C에서 저장하거나 5.4.5 단계로 진행합니다.
- 우라닐 아세테이트의 그리드와 대조를 이루고 메틸 아세테이트 필름에서 공기 건조를 합니다. 얼음-차가운 물로 그리드를 세척한 다음 5분 동안 PBS 2방울을 떨어뜨리고 15-30분 동안 건조시십시오.
참고: 모든 라벨링 단계는 주위 온도에서 수행된 세척 단계를 제외한 얼음 온도(액체 온도)에서 수행되었다.
Representative Results
열은 모든 M. 결핵 균을 비활성화
제어(live cells)의 광학 밀도(OD)는 시간이 지남에OD따라 증가하였고(0.04 OD-0.85OD)열 불활성화 샘플에서 OD 변화가 관찰되지 않았으며, 각각 성장 및 성장이 없음을 의미하였다(도1)27. 유사하게, 제어 임상 가래는 MGIT에서 3일째까지 양성으로 성장했으며 열 불활성화 임상 샘플은 인큐베이션이 끝날 때까지 양성 플래그를 표시하지 않았습니다. MGIT에서 Mtb의 성장은 지엘-넬센 얼룩 현미경 검사법 및 항원 MPT6429에의해 확인되었다.
불활성화 된 샘플의 RNA는 4 일 동안 37 °C에서 안정적입니다.
열 불활성화 샘플은 세포의 열 불활성화 에 따라 RNA가 저하되는지 여부를 결정하기 위해 37 °C에서 배양하였다. BCG 배양물 모두에서 D1, 2, 3 및 4에서 단리된 열 불활성화 직후의 데이(D) 0에서 수확된 RNA와 4의 RNA 사이에는 차이가 발견되지않았다(도 2A-C)및 결핵 양성 가래(도2D).
외인성 RNase는 열 불활성화 분획에서 RNA 분해속도를 증가시킵니다.
RNA가 분해되지 않는 이유를 확인하기 위해 RNase A 효소는 열 불활성화 전 및/또는 열 불활성화 전후에 1,000 U/mL에서 외인성으로 첨가되었습니다. 이것은 세균 부하 에 상응하는 RNA 손실을 일으켰습니다 1.5± 0.3 -, 1.8±0.2 -, 및 1.3±0.1 –80°C, 85°C 및 95°C에서 각각 4일간의 배양에 걸쳐 10eCFU/mL. RNase가 열 불활성화 전 및/또는 후에 첨가된 샘플에서 분해된 RNA에 차이가있었습니다(그림 3A-C).
16S rRNA를 기준 마커로 사용하여 TB-MBLA에 충분한 RNA가 보존됩니다.
rRNA에 대한 열 불활성화의 효과는 결핵 양성 환자로부터 BCG 배양 및 가래에서 측정되었다. 대조군 BCG 배양의 측정된 세균 부하, 5.3±0.2 로그10 eCFU/mL, 결합된 5.1±0.3 로그10 eCFU/mL보다 높은 열 불활성화 배양(ANOVA p < 0.0001)에서 80°C, 85°C, 25°C, 45°C에서 45°C, 25°C, 25°C, 2725°C에서 유사하게, 대조군 환자 가래의 세균 부하, 7.1 로그10 eCFU/mL, 결합된 6.3±0.41 로그10eCFU/mL 80°C, 85°C 및 95°C(도4B)27보다0.8±0.1 로그10 eCFU/mL 높았다. 세균 부하 감소는 시험된 두 가지 유형의 샘플에서 <1log였다.
Sidak의 다중 비교 시험은 80°C 및 85°C(p = 0.001)의 95°C에서의 세균 부하 간의 유의한 차이를 밝혀냈습니다. 모든 온도에서 TB 샘플에서 차이가 발견되지 않았습니다, p = 0.8.
세포벽 무결성은 대부분의 Mtb 셀에서 열에 의해 파괴되지 않습니다.
투과 전자 현미경 검사법 (TEM)를 사용하여 우리는 세포가 열 불활성화에 의해 용해되었는지 여부를 조사했습니다. 세포의 파라 포름 알데히드 고정 펠릿의 얇은 섹션은 TEM에 의해 검사하기 전에 전자 풍부한 배지에 만들어지고 포함되었다. 더 낮고 더 높은 배율에서 세포의 검사는 그대로 세포벽과 눈에 보이는 세포 내 지질 바디를 드러냈습니다. 세포는 형태학적으로 길쭉하지만 lysed 나타났다. 도 5는 상이한 배율에서 진균 세포의 형태를 나타낸 다. 상단 두 패널은 세포 내 지질 몸과 방해받지 않는 로프 와 같은 코드, 진균 종의 전형적인 형태학적 특성을 보여줍니다. 더 낮은 2개의 패널은 지질 바디의 보기를 확장하고 몇몇 micro 세포 내 구조물을 드러내는 더 높은 배율입니다.
TB-MBLA에 의해 측정된 세균 하중은 양성에 MGIT 배양 시간과 반비례합니다.
치료에 응답 하는 환자에 대 한, 세균 성 부하 평균에 폭포 1 로그10 eCFU/mL 치료 과정 동안 주당. 빠른 응답자는 2주 간의 치료로 음수(세균 부하 제로)로 전환하여 더 빨리 클리어합니다. TB-MBLA에 의해 측정된 세균 부하의 하락은 MGIT 배양 시간의 상승에 대응하여 양성(TTP)을 하였다. 도 6은 세균 부하와 MGIT TTP 사이에 발견되는 역상관관계를 나타낸다. 그러나 차이점은 TB-MBLA 결과를 4시간 으로 사용할 수 있으며 세균 부하 수준과 는 무관하다는 것입니다. 이것은 대조적으로 5-25 MGIT 문화 테스트에 대 한 일. 비 결핵 박테리아와의 오염은 배양 검사결과를 더욱 손상시다.
도 1: 80°C(도트 패턴 곡선), 85°C(도트-대시 패턴 곡선) 및 95°C(대시 패턴 곡선)에서 BCG 불활성화 검증. 대조군(검정곡선)은 동일한 성장 배지로 접종된 BCG 배양물(unheated)을 살아 있었다. 대조군에서의 성장은 배양 기간 동안 배양의 OD의 증가에 의해 확인되었다. 이 그림은 사비티 외27에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 4일 동안 37°C에서 배양된 열 불활성화 샘플에서 정량화 가능한 RNA의 안정성(D0-D4). (A),(B),및(C)는각각 80°C, 85°C 및 95°C에서 불활성화된 BCG 배양체를 보여준다. (D)는80°C에서 불활성화된 결핵 가래를 나타낸다. 대조군은 동일한 샘플의 처리되지 않은(live) 분율이다. 오류 막대 = 표준 편차. 3회 반복, 실행당 9개의 복제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: RNase A 효소의 외인성 첨가 후 RNA 분해가 더 높다. (a)80 °C에서 열 불활성화 (HI),(B)85 °C에서 HI,(C)HI 95 °C. 오류 막대 = 평균의 표준 오차입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 마커로서 16S rRNA를 사용하여 TB-MBLA 세균 부하 측정을 위한 충분한 RNA의 보존. (A)시험관 내 BCG 배양물로부터 추정된 세균 부하. (B)결핵 양성 가래로부터 추정된 세균 부하. 오류 막대 = 평균의 표준 오차(n = 18 및 20는 각각 A와 B에 대해 복제됩니다). 이 그림은 사비티 외27에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 20분 동안 95°C에서 불활성화 후 온전한 Mtb 바실리의 전자 현미경. 명확한 손상되지 않은 세포벽 및 열거성 지질 체는 TEM으로 관찰되었다. 상단: 방해받지 않는 진균 로프와 같은 코드 형태및 세포 내 지질 체를 드러내는 세포 군의 저배율 이미지. 바닥: 상단 패널의 높은 배율은 지질 몸의 시야를 확장하고 일부 미세 세포 내 구조를 드러냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: TB-MBLA 측정 세균 부하 및 MGIT TTP의 역상관을 나타내는 항결핵 치료에 대한 환자의 12주 치료 반응 곡선. 환자가 치료에 반응함에 따라 TTP가 상승 (빨간색 곡선)하는 동안 세균 부하 (파란색 곡선)가 떨어집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 마스터 믹스 | RT 양성 반응 | RT 음성 반응 |
| 반응 당 볼륨 x 아니오. 반응 + 5 | 반응 당 볼륨 x 아니오. 반응 + 5 | |
| 수량 혼합 | 10.0 μL | 10.0 μL |
| Mtb16S 프라이머 믹스 (F + R) | 0.4 μL | 0.4 μL |
| Mtb16S 프로브 | 0.2 μL | 0.2 μL |
| EC 프라이머 믹스 (F + R) | 0.4 μL | 0.4 μL |
| EC 프로브 | 0.2 μL | 0.2 μL |
| RT 효소 | 0.2 μL | ------- |
| RNase 무료 물 | 4.6 μL | 4.8 μL |
| 총 볼륨 | 16 μL | 16 μL |
표 1: TB-MBLA qPCR에 대한 마스터 믹스 준비 가이드.
| 형식 | MTB 채널 | EC 채널 | 해석 |
| 샘플 | 긍정적인 | 긍정적인 | 유효한 |
| 샘플 | 긍정적인 | 부정적인 | 확정 되지 않은 |
| 샘플 | 부정적인 | 긍정적인 | 유효한 |
| 샘플 | 부정적인 | 부정적인 | 올바르지 않음 |
| MTB + 제어 | 긍정적인 | 부정적인 | 유효한 |
| 추출 제어(EC) | 부정적인 | 긍정적인 | 유효한 |
| DNA 제어 | 부정적인 | 부정적인 | 유효한 |
| 네거티브 컨트롤(NTC) | 부정적인 | 부정적인 | 유효한 |
표 2: TB-MBLA 결과 해석 가이드.
Discussion
이 기사는 80 °C, 85 °C 및 95 °C에서 20 분 동안 열처리가 결핵 시편을 효과적으로 비활성화하여 TB-MBLA가 실험실 근로자에게 감염될 위험없이 비 CL3 시설에서 수행 될 수 있음을 보여줍니다. 연구 결과는 Mtb25,,30의열 불활성화의 효과에 몇몇과 대조하는 동안 이전 연구 결과에서 만든 관측을 확인합니다. 예를 들어, 일부 보고서는 80 °C에서 가열이 높은 간균 부하 샘플25,,31,,32,,33에효과적이지 않다는 것을 나타냅니다. 고밀도 접종 효과는 모든 가래 와 순수 한 배양이 15 mL 원심 분리기 튜브 당 1 mL 부피에서 가열되어 시료의 모든 부분을 끓는27에노출시킬 수있는 적절한 공간을 제공함으로써 연구에서 피했습니다.
열 불활성화 에 따른 RNA 보존은 TB-MBLA가 수행될 수 있게 합니다. 이 발견은 열 불활성화 후 RNA 보존을 입증 한 두 가지 연구와일치12,34. 우리는 열 불활성화 샘플의 RNA가 4 일 동안 37 °C에서 안정적이라는 것을 보여주었으며, 이는 실험실이 일주일 동안 실온에서 불활성화 된 샘플을 유지함으로써 일괄 테스트를 할 수 있음을 암시합니다. 냉장 또는 동결이 필요한 RNA 추출 키트를 적용함으로써 실온에서 열 불활성화 샘플을 유지하는 능력은 자원 제한 설정에서 TB-MBLA를 수행하기 위해 콜드 체인 및 카테고리 3 실험실 모두에 대한 필요성을 없애주게 됩니다.
1log 미만의 세균 하중은 마커로서 16S rRNA를 사용하여 손실되었다. 라이브 및 열 불활성화 샘플 간에 차이가 있었지만 열 불활성화로 손실된 양이 너무 작아 다운스트림 결과를 손상시킬 수 없습니다. 온도가 증가하면 RNA 손실량이 증가하지 않았으며, 이는 관찰된 손실이 열처리와 무관하다는 것을 암시한다. 고온에서열처리는 세포 분해를 일으켜 RNA가 RNases에 의해 분해될 가능성이 높습니다. 실제로, RNase A를 열 불활성화 분획에 외인성 첨가하면 RNA 분해의 속도가 증가한다. 끓는 것은 RNase의 활성을 감소시키지 않았으며, 이는 매우 탄력있는 단백질임을 암시합니다.
1.5 로그10 eCFU/mL의 평균 RNA 분해는 큰 손실이 아니라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이를 위해 우리는 가열이 Mtb 간균의 작은 비율을 용해한다는 가설을 세우고, 따라서 RNase에 소량의 RNA를 노출시다. TEM을 사용하여 우리는 세포벽의 Mtb 세포 형태 및 무결성이 95 °C에서 가열에 의해 거의 영향을받지 않는다는 것을 보여주었습니다. 이는 RNA35,,36을현저히 저하시키기 위해 숙주에서와 같은 다양한 생리적 인자 및 RNases의 충분한 공급을 요구할 수 있음을 의미한다. 더욱이, 구조적 리보솜인, 16S rRNA는 RNase37,,38에잠재적으로 덜 민감하다. 단일 Mtb 세포는 세포질37의~ 700 리보솜 / 0.1 mm3을 포함하며, 이는 세포 당 rRNA의 양이 더 많다는 것을 암시합니다. 따라서, RNase의 작은 수량은 작은 충격을 가질 수있다38. 리보솜의 높은 수의 존재는 낮은 부담 결핵 환자를 검출하는 감도 그리고 기능면에서 TB-MBLA에 이점을 제공합니다.
TB-MBLA및 MGIT 배양 TTP에 의해 측정된 세균 부하 사이에 강한 상관관계가 있었다. 이것은 어느 정도 배양 양성의 동인으로 세균 부하를 확인합니다. 그러나, TB-MBLA의 장점은 시료에 존재하는 간균 부하를 직접 정량화하고 검출 전에 Mtb 세포 증식을 필요로 하지 않는다는 것입니다. 이것은 양성에 시간이 세균성 짐의 수준 및 Mtb 세포 증식의 비율에 달려 있는 문화와 대조됩니다. 향후 연구는 일상적인 임상 환경에서 열 불활성화를 포함한 TB-MBLA 워크플로우를 평가할 것입니다. 연구 결과는 또한 양성에서 부정으로 변경될 수 있는 수를 이해하기 위하여 세균성 하중의 범위를 가진 견본을 탐구할 것입니다 (즉, 열 불활성화다음 더 적은 박테리아를 가진 사람들).
세균 부하의 분자 정량화를 위한 TB-MBLA 프로토콜은 세균학에서 그것의 종류의 첫번째입니다. 이 방법은 환자 가래에서 Mtb 균류 부하를 직접 정량화하고 그렇게 할 문화가 필요하지 않습니다. 이것은 더 빨리 하고 참을성 있는 진행에 관하여 임상 결정을 알리기 위하여 그것의 잠재력을 증가합니다. 열 불활성화 단계는 감염의 위험을 감소시키고 카테고리 3 실험실이없는 설정에서 TB-MBLA의 적용 가능성을 증가시킵니다. 샘플의 열 불활성화에 이어, TB-MBLA 결과를 달성하기 위한 세 가지 프로토콜 단계가 있습니다: RNA 추출, 역사효소(RT)-qPCR 및 qPCR 결과 분석.
환자 샘플로부터 Mtb RNA를 분리하는 효율이 높을수록 결과의 품질이 높아지다. 가래 샘플의 품질이 RNA 분리의 양에 영향을 미친다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 타액 가래는 낮은 품질로 간주되며 낮은 간장 부하와 관련이 있습니다. 이것은 질 가래 기수에 대한 환자를 훈련하는 것이 중요하다는 것을 의미합니다. 추출 공정의 효율성을 평가하기 위해, 추출 대조군(즉, 공지된 수의 비-Mtb 세포)이 RNA 추출 전에 샘플 내로 스파이크된다. 추출 제어의 검색은 RNA 추출 공정의 효율을 확인한다. 추출 컨트롤이 검색되지 않는 한 RNA 격리 프로세스는 유효할 수 없습니다. Mtb가 탄력있는 유기체라는 사실을 감안할 때 기계적 인해는 공정의 중요한 부분입니다. 비드 (즉, 라이징 매트릭스)의 존재 에서 고속도 (600 rpm)에서 샘플의 균질화는 효과적으로 세포를 lysing. 용해물의 정제는 RNA와 DNA를 모두 포함하는 추출물을 산출한다. DNA의 제거는 RNA 추출의 중요한 마지막 단계입니다. TB-MBLA는 RNA를 정량화하여 실행 가능한 간균을 측정하는 것을 목표로 합니다. 따라서, 게놈 DNA를 제거하지 못하면 DNA로부터 신호가 생성될 것이고, 이는 세포 생존에 대한 좋은 마커가 아님을 의미한다6.
RT-qPCR은 Mtb 및 추출 제어를 위한 이중 라벨 프로브를 실행하는 이중 장치입니다. 3단계를 수반한다: 50°C에서 역전사에 의한 30분 역전사, 95°C에서 15분 변성, 94°C 및 60°C에서 의 증폭의 40사이클. 프로브로부터형광의 취득은 60°C(즉, 단편 신장 단계)에서 발생한다. TB-MBLA는 특정 qPCR 기계를 사용하여 최적화되었기 때문에 다른 qPCR 플랫폼을 사용하는 작업자는 장비의 조건을 최적화해야 합니다. DNA 제거의 효율은 RT가 없는 시료당 단일 반응을 실행함으로써 조절된다. 이 반응에서 긍정적인 결과 DNA의 불완전 한 제거를 의미 합니다. DNA의 높은 양을 가진 높은 부담 견본은 DNA를 완전히 제거하기 위하여 DNase 효소의 양을 두 배로 요구할 수 있습니다. 다행히도, 높은 간 장 하중 견본에서, DNA의 소량의 존재는 RNA에서 결과에 영향을 미치기 위하여 확률이 낮습니다. 리보소말 RNA, TB-MBLA 표적은 DNA37의두 배 양에서 자연적으로 발생한다. PCR에서, PCR 시약을 용해하는 데 사용되는 물인 무템플릿 제어(NTC)는 외인성 DNA 또는 RNA와의 교차 오염을 제어한다. NTC의 양수 신호는 교차 오염을 의미하며 그 결과는 무효로 간주됩니다. 즉, 이 물을 사용하여 구성되는 모든 용액은 폐기되어야 하며 신선한 물 병으로 만든 새로운 용액을 폐기해야 합니다. 모든 물의 오염을 피하기 위해 PCR 물을 별도의 알리쿼트에 보관하는 것이 좋습니다. 양성 대조군(Mtb RNA)은 PCR의 전반적인 효율을 조절하는 데 사용된다.
결과 분석은 표준 곡선을 사용하여 PCR Cqs를 박테리아 하중(즉, mL당 추정 된 콜로니 형성 단위)으로 변환하는 것을 포함합니다. 이 단계에서는 표준 곡선을 설정하고 최적화하는 것이 매우 중요합니다. 0.95-1의 표준 곡선 효율을 권장합니다. MTb 및 추출 제어를 위한 표준 곡선은 환자 또는 다른 테스트 샘플이 기계에서 실행되기 전에 설정되고 최적화되어야 합니다. 표준 샘플은 TB-MBLA 키트와 함께 제공됩니다. PCR에는 RNA 추출물의 10배 희석이 권장됩니다. 이는 mL당 최종 세균 하중 결과를 얻기 위해 세균 하중 결과를 10의 곱하여 곱해야 한다는 것을 의미합니다. 30 을 초과하는 Cqs는 TB-MBLA에 대해 부정적인 것으로 간주됩니다. 치료 반응에 대한 추론을 하기 위해서는 서로 다른 시점에서 측정된 최소 2개의 장래 세균 부하 결과가 필요합니다. 두 가지 결과 중 하나가 치료를 시작하기 전에 기준선이어야한다는 것이 좋습니다. 그러나, 환자가 세균 부하 평가를 개시한 경우 치료 과정을 통해 중간에 발생하며, 치료 반응을 평가하기 위해 제2 시점의 세균 부하 측정이 있어야 한다. TB-MBLA는 치료에 3 일의 공간에서 세균 부하를 구별 할 수 있지만 이상적 7 일 떨어져 찍은 두 개의 세균 부하 측정이다.
프로토콜은 치료 반응에 대한 유익한 정량적 결과를 생성하는 반면, 여전히 크게 수동이며 RNA 추출을 위한 상당한 손이 요구됩니다. 바쁜 실험실의 기술자는 이 시간이 없을 수 있습니다. RNA 추출 및 PCR 프로세스를 자동화하기 위한 준비가 진행 중입니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 연구는 유럽 및 개발도상국 임상 시험 파트너십(EDCTP)-범아프리카 바이오마커 확장 프로그램(PanBIOME) 보조금 SP.2011.41304.008의 자금 지원을 통해 가능해졌습니다. 지원은 또한 의학 연구 교부금의 세인트 앤드류스 대학의 대학을 얻었다. 시각적 자원으로이 원고와 TB-MBLA 프로토콜의 출판은 세인트 앤드류스 대학에 스코틀랜드 자금 조달 위원회와 글로벌 도전 연구 기금에서 자금에 의해 가능하게되었다. 임상 가래 표본을 제공한 마푸토 모성 병원과 마발란 보건 센터, 임상 가래 표본의 열 불활성화 실험을 도운 마푸토 결핵 치료유닛 팀 덕분입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat inactivation: | |||
| 15 mL Centrifuge tubes | Fisher-Scientific | 10136120 | 50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved |
| 15 mL Wire Tube rack | Fisher-Scientific | 11749128 | Other brands with similar make can be used |
| Water bath | Fisher-Scientific | 15700619 | Other brands with similar make can be used |
| RNA extraction: | |||
| Chloroform | Sigma | 372978-1L | Not necessary in other RNA extraction kit brands |
| Ethanol, absolute 99-100% | Sigma | 51976-500ML-F | Larger volume available |
| Extraction control | SOI group St Andrews | VitalbacteriaEC | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit |
| FASTRNA Pro blue Kit | MP Biomedicals | 116025050 | Supplied with lysing matrix tubes |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Qiagen, Fisherscientific can also supply same product |
| Precellys 24 homogeniser | VWR | 432-3750 | FastPrep MP Biomedicals can be used too |
| Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus | Fisher-Scientific | 15352117 | Other brands with similar capacity can be used |
| Thermomixer | Eppendorf | BLD-455-010C | Works with 1-2 mL tubes |
| TURBO DNA-free | Fisher-Scientific | AM1907M | Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures. |
| RT-qPCR: | |||
| Primers and Taqman probes | SOI group St Andrews | VitalbacteriaPP | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX. |
| QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit | Qiagen | 204845 | PCR mix plus the RT enzyme |
| RotorGene Q 5plex machine | Qiagen | 9001580 | Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc. can be used |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 mL | Qiagen | 981103 | Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed. |
| Non-heat inactivation Sample preservation materials | |||
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | 93313 | Supplied ready to use |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Many competent suppliers |
| Guanidine thiocyanate (GTC) | Promega | V2791 | Promega brand recommended for quality |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Ensures that GTC solution is free of nucleases |
| General materials (used but not specific to TB-MBLA) | |||
| 500 mL plastic containers | 734-5087 | Nalgene brand recommeded | |
| Biological waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Chemical waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Disposable gloves, chemical resistant | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-20 °C) | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-80 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fridge (0-8 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fume hood | For safe handling of toxic reagents | ||
| Laboratory scales | For accurate measurement of reagents | ||
| Measuring cylinders, plastic | To ensure accurate measurement of reagents | ||
| PCR reaction tubes | Should be suitable to the PCR instrument used | ||
| Pipettes and matching sterile filtered pipette tips, | DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended | ||
| Qiagility loading plates | Qiagen | 5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates | |
| QIAgility Pipetting Robot | Qiagen | Important for high throughput pipetting | |
| Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes | Chemical-resistant and autoclavable recommended | ||
| RNase Away (Removes RNases enzymes from working space) | Fisher Scientific | 10666421 | Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme |
| Safety goggles, chemical resistant | Fisher Scientific | Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents. | |
| Sterile Pasteur pipettes, 1.5-3 mL | Many competent suppliers | ||
| Sterile RNAse-free microtubes | 1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended | ||
| TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse | Ensure it is freshly prepared or prepared within a week | ||
| Vortex | Genie 2 brand recommended | ||
| Transmission electron microscopy | |||
| Glutaldehyde (8%) | Sigma | G7526-10ML | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| HEPES (pH 7.4, 100 mM) | Sigma | H4034-25G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Leica FCS ultracryo | Leica | Cryomicrotome for tissue sectioning | |
| Methyl cellulose | Agar Scientific | AGG6425 | Cold mounting resin |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Sigma | P6148-500G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Sucrose | Sigma | 84097-250G | Preservation and mounting medium |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | AGR1260A | Universal Electron microscopy stain |
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