Summary
Мы описываем тест анализа молекулярной бактериальной нагрузки на туберкулез, проведенный после тепловой инактивации косточки. Тепловая инактивация делает образцы косточки неинфекционными и устраняет необходимость в лабораториях 3-го уровня сдерживания для молекулярных тестов на туберкулез.
Abstract
Туберкулез вызывается микобактериями туберкулеза (МТБ), патогена, классифицируемого Организацией Объединенных Наций (ООН) как опасное биологическое вещество категории В. В целях безопасности рабочих обработка всех образцов, предположительно перевосоставляемых на Mtb, должна проводиться в лаборатории сдерживания (CL) 3. Тест на молекулярную бактериальную нагрузку на ТБ (TB-MBLA) представляет собой тест обратной транскриптазной количественной полимеразы (RT-qPCR), который количественно оценивает bacillary нагрузку Mtb с использованием грунтовок и двухмаркированных зондов для 16S rRNA. Мы описываем использование тепловой инактивации для того, чтобы сделать образцы туберкулеза неинфекционными, сохраняя РНК для ТБ-МБЛА. Аликот 1 мл образца манкуса в плотно закрытых 15 мл центрифуговых труб кипятят в течение 20 минут при температуре 80 градусов по Цельсию, 85 кВ или 95 градусов по Цельсию, чтобы инактивировать бациллы Mtb. Культивирование теплового инактивированных и контрольных (живых) образцов в течение 42 дней подтвердили смерть от туберкулеза. Инактивированный образец затем шипами с 100 зл из контроля добычи и РНК извлекается в соответствии со стандартной процедурой изоляции РНК. Роста в культурах теплообработанных образцов не наблюдалось. Изолированная РНК подвергается в режиме реального времени RT-qPCR, что усиливает конкретную цель в гене Mtb 16S rRNA, что дает результаты в виде циклов количественной оценки (Cq). Стандартная кривая используется для перевода Cq в бактериальную нагрузку, или расчетливые единицы формирования колонии на мл (eCFU/mL). Существует обратная связь между Cq и бактериальной нагрузки образца. Ограничение состоит в том, что теплоинактивация лизает некоторые клетки, подвергая РНК RNases, которые вызывают потерю lt;1 журнал10eCFU/mL (т.е., lt;10 CFU/mL). Дальнейшие исследования определят долю пациентов с очень низкой нагрузкой, которые вызывают ложные отрицательные результаты из-за тепловой инактивации.
Introduction
Вызванные микобактериями туберкулеза (Mtb), более 7 х 106 новых случаев туберкулеза (ТБ) регистрируются во всем мире, из которых более 1 х 106 умирают в год1,2. Чтобы обратить вспять эту тенденцию, Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) запустила трехстоловый подход, включающий разработку эффективных диагностических и лечебных инструментов3. Классифицированный как опасное биологическое вещество B ООН, работа с образцами, предположительно положительными для Mtb, требует уровня сдерживания (CL) 3. Лаборатории CL3 являются дорогостоящими в строительстве и обслуживании. Вследствие этого большинство стран имеют централизованные культурные службы по борьбе с туберкулезом на региональном или национальном уровнях. Это означает, что мазковая микроскопия является наиболее доступным диагностическим инструментом в периферийных медицинских учреждениях.
Существует одобрение ВОЗ на осуществление быстрых молекулярных тестов, таких как Xpert MTB/RIF на уровне 4 медицинских учреждений, в основном расположенных на районных уровнях4,,5. Некоторые районы довольно большие и менее доступны для некоторых людей. В то время как полезно, Xpert MTB / RIF работает путем обнаружения ДНК Mtb. ДНК является стабильной молекулы, которая выживает долго после клетки умерли и, таким образом, не является хорошим стандартом для измерения жизнеспособных клеток решающее значение для мониторинга лечения ответ5,6. Анализы на основе РНК предлагают альтернативу для точного измерения жизнеспособных ячеек77,8,,9,,10,,11,,12,,13. РНК существует в различных видах различной устойчивости: рибосомальной РНК (рнка), переносица РНК (tRNA) и рнке-мессенджере (мРНК). Messenger РНК связана с экспрессией генов и, таким образом, наиболее тесно связана с активностью клеток и жизнеспособностью14. Важно отметить, что отсутствие экспрессии генов не эквивалентно гибели клеток, потому что патогенные микроорганизмы, как Mtb, как известно, существуют в неактивных (спящих), но жизнеспособных состояний15,16. Стабильные виды РНК, такие как рнка, являются лучшими маркерами как активных, так и неактивных состояний жизнеспособных клеток.
Использование Escherichia coli , Шериданпоказал, что 16S rRNA пропорционально увеличилось с бактериальным ростом измеряется колонии формирования единиц (CFU) насчитывает17. Одновременно езстало снижение количества CFU и 16S rRNA, когда бактерии кишечной палочки подвергались воздействию антибиотиков. Падение rRNA после смерти клетки было индикатором что оно смогло быть использовано как маркер для жизнеспособностиклетки 13,,17. Исходя из этого принципа, анализ молекулярной бактериальной нагрузки на туберкулез (TB-MBLA) был разработан для ориентации M. tuberculosis 16S rRNA для измерения жизнеспособной нагрузки на туберкулез ную ч. 00 м. в качестве маркера ответной меры на лечение пациентов на противотуберкулезную терапию11,18,19. Мы дополнительно разработали и оптимизировали TB-MBLA, чтобы включить контроль клеточной экстракции, который отражает лисис бациллы M. tuberculosis и является надежным в различных экологических условиях20. Процедура TB-MBLA требует, чтобы первые шаги изоляции РНК от Mtb проводились в лаборатории CL3 до тех пор, пока клетки Mtb не будут полностью лиизированы для обеспечения безопасности работников. Она также включает в себя сохранение образцов для ретроспективного пакетного анализа, который будет поддерживаться при -80 градусов по Цельсию в гуанидине тиоцианате, токсичном веществе уровня 4. С этой целью мы использовали тепло для инактивации Mtb и сделать образцы безопасными для TB-MBLA, которые будут выполняться в лабораториях уровня мазка микроскопии.
Использование тепла в лабораторных и клинических приложениях было вокруг на протяжениивеков 21,22. Тем не менее, некоторые микроорганизмы, как Mtb трудно убить, и короче воздействие тепла недостаточно, чтобы убить все клетки23,24. Исследование показало, что 20 мин нагрева тБ культур на 80 градусов по Цельсию убил все Mtb бациллы, не разрушая ДНК, необходимые для ПЦР25. Впоследствии, ряд методов лабораторной добычи ДНК в настоящее время тепла до 95 градусов по Цельсию. Мы применили тот же принцип, чтобы показать, что кипячение образцов Туберкулеза при температуре 80 градусов по Цельсию, 85 градусов по Цельсию или 95 градусов по Цельсию инактивирует Mtb, сохраняя при этом достаточную РНК для ТБ-МБЛА. Инактивированная культура или мокрота могут поддерживаться в плотно закрытых контейнерах при комнатной температуре или храниться в холодильнике в течение 7 дней без уменьшения количества количественной rRNA.
TB-MBLA, в настоящее время используется в качестве исследования использовать только (RUO) тест адаптируется и был применен к различным типам образцов, включая косму, ткани легких, и спинномозговой жидкости. Он еще предстоит нанести на бронхиальной альвеолярной жидкости, крови и других типов образцов. Использование sputum в качестве образца, результаты многоузловой оценки в Африке (неопубликованные данные) и предыдущих публикаций18,26 показывают, что чувствительность MBLA согласуется с микобактериями индикатор ажиотажа (MGIT) жидкой культуры. Тем не менее, TB-MBLA быстрее, давая результаты в часах, в отличие от дней или недель культуры, конкретные, не пострадавших от нетбных микроорганизмов в выборке, и дает количественную меру тяжести заболевания. Недавно ВОЗ признала TB-MBLA кандидатом на замену мазковой микроскопии и культуры для мониторинга лечения туберкулеза2.
В этой статье мы подробно описываем тепловую инактивацию и протокол TB-MBLA, опубликованный в Sabiiti et al.27. Этот подробный протокол обеспечит единый визуальный ресурс для пользователей TB-MBLA по всему миру.
Protocol
1. Подготовка образцов
-
Культуры
- Работая на чистой скамейке или кабине класса 1, урожай 1 мл aliquots экспоненциальной фазы Bacillus Calmette-Gurin (BCG) культуры в 15 мл пластиковых центрифуг труб. Плотно закройте трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обработки всего образца 5 мл требуется пять центрифугных труб 15 мл.
ВНИМАНИЕ: При работе с любой культурой туберкулеза требуется кабинет биобезопасности.
- Работая на чистой скамейке или кабине класса 1, урожай 1 мл aliquots экспоненциальной фазы Bacillus Calmette-Gurin (BCG) культуры в 15 мл пластиковых центрифуг труб. Плотно закройте трубки.
-
Образец эмпоны пациента
- Работая в хорошо проветриваемом пространстве и надев носовую маску, тщательно откройте чашку образца, пипетку 1 мл aliquots в пластиковые центрифуги 15 мл и плотно закройте трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Широкий кончик рта рекомендуется пипетка sputum. Используя ножницы, клип от тонкой части 1 мл кончик рот, чтобы создать более широкий рот.
- Работая в хорошо проветриваемом пространстве и надев носовую маску, тщательно откройте чашку образца, пипетку 1 мл aliquots в пластиковые центрифуги 15 мл и плотно закройте трубки.
2. Теплоинактивация
- Перед подготовкой образца установите водяную ванну до 95 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура 95 градусов по Цельсию повышает вероятность снижения активности RNase и тем самым сохраняет больше РНК для тБ-MBLA ниже по течению. - Перенесите пробные трубки в стойку для хранения, погруженную в водяную ванну. Убедитесь, что три четверти каждой пробной трубки погружается в воду.
- Отварить при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 20 мин, затем перенесите трубки на скамейку, чтобы охладить при комнатной температуре в течение 5 минут перед началом извлечения РНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полная тепловая инактивация бацилл M. tuberculosis и BCG была проверена путем инкубации теплового инактивированных образцов и контроля при температуре 37 градусов по Цельсию в течение 42 дней для проверки роста. Измерение оптической плотности на уровне 600 нм (OD600)было проведено на базовом уровне, а затем еженедельно в течение 42-дневного инкубационного периода.
3. Добыча РНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс извлечения РНК, описанный здесь, предназначен для комплекта РНК, перечисленных в таблице материалов. Другие подходящие комплекты извлечения РНК различными производителями могут быть использованы.
- Контроль добычи (EC) добавление
- Передача 1 мл aliquots теплоинактивированных образцов на 1,5 мл труб. Спайк 100 л ЕС в каждом образце, закрыть трубку, и смешать путем инвертирования трубки вверх дном 3x.
ПРИМЕЧАНИЕ: EC поставляется с комплектом жизненно важных бактерий TB-MBLA(Таблица материалов).
- Передача 1 мл aliquots теплоинактивированных образцов на 1,5 мл труб. Спайк 100 л ЕС в каждом образце, закрыть трубку, и смешать путем инвертирования трубки вверх дном 3x.
- Отложения клеток
- Используя микроцентрифуги на скамейке, центрифуги труб на 20000 х г в течение 10 минут при комнатной температуре. Пипетка от супернатанта, оставляя 50 л отложений.
- Приостановить осадок в 950 л люцис буфера путем pipetting вверх и вниз, и передать всю подвеску в лизины матричной трубки поставляется с комплектом извлечения РНК (Таблица материалов). Убедитесь, что трубки плотно закрыты и этикетки как крышка и сторона трубки.
- При клеточном лизе перенесите трубки со ступени 3.2.2 на гомогенизатор. Гомогенизировать образцы на 40 с при 6000 об/мин.
- Очистка нуклеиновой кислоты
- Центрифуги лизат от шага 3.3 на 12000 х г в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Приготовьте свежие трубки 1 мл и добавьте в каждую трубку 300 лл хлороформа.
- Использование 1 мл наконечник тщательно pipette от супернатанта, не касаясь lysing матрицы.
- Перенесите супернатант на хлороформ, содержащий трубки и вихрь в течение 5 с. Оставьте трубку, чтобы поселиться в течение 5 минут или дольше, пока не будут хорошо видны три фазы (верхняя, средняя и нижняя).
- Центрифуга при температуре 12 000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Тщательно pipette верхней части и передать в свежие 1,5 мл труб.
- К трубам в шаге 3.4.5, добавьте 500 qL ледяного 100% этанола, закройте пробки, и смешайте, мягко перевернув вверх ногами 3x. Инкубировать трубки при -80 градусов по Цельсию в течение 15 мин или -20 градусов по Цельсию в течение 30 минут и продолжить добычу, или оставить при -20 градусов на ночь, чтобы завершить добычу на следующий день.
- Установите микроцентрифуги до 4 градусов по Цельсию и оставьте остыть, по крайней мере, до 12 градусов по Цельсию до начала центрифугации. Загрузите трубки в микроцентрифугу и центрифугу в течение 20 мин при 13 000 х г. Откажитесь от супернатанта, замените 70% ледяного этанола и центрифугу еще на 10 мин при 13 000 х г.
ПРИМЕЧАНИЕ: 70% этанола должны быть сделаны с молекулярным классом нуклеаза свободной воды. - Откажитесь от всех супернатантов со ступени 3.4.7 и перенесите трубки в инкубатор, установленный при 50 градусах Цельсия. Инкубировать в течение 20 минут, чтобы высушить ГРАнулы РНК/ДНК. Держите трубки частично открытыми, чтобы обеспечить испарение всего этанола.
- Добавьте 100 кл/л безнуточной воды в сухие гранулы и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре. Vortex для 3 s, чтобы смешать содержимое.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе экстракт может храниться 2–3 дня в холодильнике или дольше при -80 градусов по Цельсию до тех пор, пока не будет выполненраздел 3.5.
- Удаление ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение, поскольку наличие ДНК в экстракте недействительным результат MBLA. Этот раздел основан на наборе удаления ДНК (Таблица материалов).- Подготовьте смесь фермента DNase I 10x буфера и фермента DNase I для количества образцов (10 зл буфера и 1 Зл DNase в образец) плюс 10% дополнительно для покрытия любых потерь от трубачки. Смешайте путем вихря, а затем пипетка 11 Зл в каждой трубке, содержащей экстракт РНК.
- Смешайте путем вихря 3 с, а затем спина кратко (10 с на 13000 х г),чтобы удалить любые капли на стенах. Инкубировать при 37 градусах По цельсию в течение 30 минут в горячем блоке или инкубаторе. Добавьте еще 1 qL фермента DNase I непосредственно в каждую трубку, хорошо перемешайте путем вихря и инкубируйте еще 30 минут при 37 градусах Цельсия.
- Оттепель DNase инактивации реагента 10 минут до конца инкубации DNase. Vortex 20 s, чтобы обеспечить однородную, молочно-молочную суспензию, а затем добавить 10 злитроагента реактивного реагента DNase в каждый экстракт РНК с шага 3.5.2.
- Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 5 мин. Vortex 3x во время 5 мин инкубационного шага.
- Центрифуга смесь на 13000 х г в течение 2 мин. Тщательно передать супернатант 1,5 мл RNase свободных труб, не касаясь любой из инактивации матрицы.
- Храните экстракт РНК в холодильнике при запуске RT-qPCR в тот же день или при -80 градусов по Цельсию для длительного хранения.
4. Обратная транскриптаза qPCR
- Для неизвестных образцов, разбавить все экстракты РНК, которые будут использоваться в соотношении 1:10 в свободной воде RNase. Хорошо перемешать путем вихря в течение 5 с и кратко спина вниз, чтобы удалить любые капли или пузырьки воздуха.
- Для стандартных образцов для стандартной кривой возьмите стандарты Mtb и EC RNA из морозильной камеры -80 градусов и оттаивайте при комнатной температуре. Сделайте 7 и 6 10 раз разбавления стандартных образцов Mtb и EC соответственно. Измените кончики перед переносом смеси из одной трубки в другую.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартные образцы поставляются с комплектом TB-MBLA. -
Мастер микс подготовки
ПРИМЕЧАНИЕ: Master mix (MM) является раствором рагентов ПЦР, достаточных для усиления всех образцов, стандартов и воды для управления шаблонами (NTC). Вода, используемая в качестве NTC, должна быть той же водой, используемой в извлечении и для подготовки MM. Убедитесь, что стандарты, каждый образец РНК, и его десятичное разбавление усиливаются в 2x для обратной реакции транскриптазы (РТЗ) и 1x для обратной транскриптазной отрицательной реакции (RT-) реакции. РЕАКЦИЯ RT является контроль для определения эффективности удаления ДНК (Таблица 1).- Передача 16 Зл ММ в каждую трубку реакции ПЦР.
- Добавьте 4 qL экстракта РНК в каждую трубку реакции РТЗ и RT- и воду в трубки реакции NTC.
- Загрузите реакционные трубки в машину ПЦР в реальном времени и установите условия ПЦР следующим образом: 50 градусов по Цельсию в течение 30 мин, 95 градусов по Цельсию в течение 15 мин, 40x циклов при 94 градусах по Цельсию для 45 с и 60 градусов по Цельсию в течение 1 мин с приобретением флюорофорами, которые поглощают в зеленых и желтых каналах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Зеленый канал mtb обнаружения фторофора и желтый является удаление контроля обнаружения фторофора.
-
Интерпретация результатов
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что дублирующие реакции одного и того же образца не отличаются более чем на 1 стандартное отклонение. Значения Mtb и EC Cq выше 30 считаются отрицательными. Подробнее о интерпретации читайте в таблице 2.- Чтобы интерпретировать реакцию на лечение, преобразуйте значения Cq в бактериальную нагрузку (eCFU/mL) с помощью стандартной кривой. Прочитайте реакцию обработки как изменение в бактериальной нагрузке над периодом прослежения обработки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Падение бактериальной нагрузки после лечения означает положительную реакцию (т.е. противотуберкулезные препараты, убивающие бактерии туберкулеза), в то время как отсутствие изменений или повышения бактериальной нагрузки предполагает негативную реакцию, которая может означать устойчивость бактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам или пациента, не соответствующего соблюдению их дозы лечения. Падение бактериальной нагрузки, измеряемое TB-MBLA, коррелирует с увеличением времени МГИТ на культурный позитив (ТТП).
- Чтобы интерпретировать реакцию на лечение, преобразуйте значения Cq в бактериальную нагрузку (eCFU/mL) с помощью стандартной кривой. Прочитайте реакцию обработки как изменение в бактериальной нагрузке над периодом прослежения обработки.
5. Трансмиссия Электронная микроскопия
- Передача 2 мл aliquots тепла инактивированных культур и управления в 2 мл микроцентрифуговых труб. Центрифуга в течение 10 мин при 20000 х г.
- Откажитесь от супернатанта и приостановить гранулы в 700 л буфера фиксации клеток и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут, чтобы исправить клетки.
- Centrifuge подвески в течение 30 минут на 16000 х г, чтобы получить жесткий гранулы. Откажитесь от супернатанта и замените 1% сахарозой фосфатно-буферизированным сольем (PBS). Храните гранулы в сахарозе при 4 градусах По Цельсию до сечения для электронной микроскопии.
-
Секционирование и TEM
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол ниже адаптирован из Гриффитс и др.28.- Криозащита клеточных гранул путем встраивания его в 2,1 М сахарозы в PBS ночь на 4 градусов по Цельсию. Вымойте 3x ледяной водой.
- Охладить криозащищенные клеточные гранулы в жидком азоте и смонтировать их криомикротомии заглушки. Используя криомикротом, вырежьте ультратонкие секции на 90 нм.
- Извлекайте разделы отрезока используя петли провода вольфрама 1:1 смеси 2% целлюлозы метила и 2.1 M сахарозы в PBS.
- Перенесите секции на пиолоформу с покрытием 150 сетчатых шестиугольных медных медных медных опор TEM (сетки) и храните при 4 градусах Цельсия или переходите к шагу 5.4.5.
- Сравните сетки в уранил ацетат и воздух-сухой в пленке метил ацетата. Вымойте сетки ледяной водой, за которой следуют две капли PBS в течение 5 мин и высушите в течение 15-30 мин. Изучите разделы в соответствии с TEM в соответствии с руководящими принципами производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы маркировки выполнялись при температуре льда (температура жидкости), за исключением стирки, которые выполнялись при температуре окружающей среды.
Representative Results
Тепло инактивирует все бациллы M. tuberculosis
Оптическая плотность (OD) элементов управления (живые клетки) увеличилась с течением времени, (0.04OD-0.85OD)и никаких изменений OD не наблюдалось в теплоинактивированных образцах, что означает рост и отсутствие роста соответственно (Рисунок 1)27. Аналогичным образом, контроль клинической sputum вырос положительным на 3 день в MGIT в то время как тепло инактивированных клинических образцов не флаг положительный до конца инкубации. Рост Mtb в MGIT был подтвержден циль-Нилсен мазка микроскопии и антигенА MPT6429.
РНК в инактивированных образцах стабильна при 37 градусах по Цельсию в течение 4 дней
Теплоинактивированные образцы были инкубированы при температуре 37 градусов по Цельсию, чтобы определить, деградирует ли РНК после тепловой инактивации клеток. Не было найдено никакой разницы между РНК, собранной в день (D) 0 сразу после тепловой инактивации и РНК изолированы на D1, 2, 3 и 4 в обеих культурах BCG(Рисунок 2A-C) и ТБ положительный sputum (Рисунок 2D).
Экзогенный RNase увеличивает скорость деградации РНК в теплоинактивированных фракциях
Чтобы определить, почему РНК не деградирует, фермент RNase A был экзогенно добавлен на 1000 U/mL до и/или после тепловой инактивации. Это привело к потере РНК, эквивалентной бактериальной нагрузке 1,5 и 0,3 -, 1,8 и 0,2 -, и 1,3 и 0,1 - журнал10 eCFU/mL при 80 градусах По Цельсия, 85 градусов по Цельсию и 95 градусов соответственно в течение 4 дней инкубации. Существовала разница в РНК деградировали в образцах, где RNase был добавлен до и / или после тепловой инактивации(рисунок 3A-C).
Достаточная РНК сохраняется для TB-MBLA с использованием 16S rRNA в качестве эталонного маркера
Влияние тепловой инактивации на РРНК измерялось в культурах BCG и sputum от больных туберкулезом. Измеренная бактериальная нагрузка культуры управления BCG, 5,3 и 0,227журнала10 eCFU/mL, была 0,2 и 0,1 бревна10 eCFU/mL выше, чем комбинированные 5,1 и 0,3 бревены10 eCFU/mL теплаFigure 4Aв активированной культуре (ANOVA p qlt; 0.0001) при 80 Аналогичным образом, бактериальная нагрузка контрольного пациента, 7,1 журнала10 eCFU/mL, была 0,8 и 0,1 журнала10 eCFU/mL выше, чем комбинированные 6,3 и 0,41 журнала10eCFU/mL при 80 C, 85 C, и 95 C (Рисунок 4B)27. Снижение бактериальной нагрузки было сокращено в двух типах проверенных образцов.
Тест несколько сравнений Сидака выявил существенную разницу между бактериальной нагрузкой на уровне 95 градусов по Цельсию по сравнению с 80 градусов по Цельсию и 85 градусов по Цельсию (р- 0,001). Никакой разницы в пробах туберкулеза при всех температурах не обнаружено, р- 0,8.
Целостность клеточной стенки не разрушается теплом в большинстве клеток Mtb
Используя электронную микроскопию передачи (TEM), мы исследовали, были ли клетки лизинировать тепловой инактивацией. Тонкие участки параформальдегида фиксированные гранулы клеток были сделаны и встроены в богатую электроном среду до исследования TEM. Осмотр клеток при нижнем и более высоком увеличении выявил нетронутую клеточную стенку и видимые внутриклеточные липидные тела. Клетки морфологически появились удлиненные, но не лисиченые. Рисунок 5 иллюстрирует морфологию клеток микобактерий при различных увеличениях. Две верхние панели показывают внутриклеточные липидные тела и беспрепятственную веревку, похожую на проводку, морфологическую характеристику, характерную для видов микобактерий. Нижние две панели имеют более высокое увеличение, расширяющее вид липидных тел и раскрывающее некоторые микровнутриклеточные структуры.
Бактериальная нагрузка, измеренная TB-MBLA, обратно коррелирует с временем культуры MGIT с позитивом
Для пациентов, реагируя на терапию, бактериальная нагрузка падает в среднем на 1 журнал10 eCFU/mL в неделю в течение лечения. Быстрые ответчики очищаются быстрее, превращаясь в отрицательную (нулевую бактериальную нагрузку) на 2 недели лечения. Падение бактериальной нагрузки, измеряемое ТБ-МБЛА, соответствовало росту времени культуры МГИТ до положительности (ТТП). Рисунок 6 демонстрирует обратную корреляцию между бактериальной нагрузкой и МГИТ ТТП. Разница, однако, заключается в том, что результаты ТБ-МБЛА доступны в 4 ч и время к результату не зависит от уровня бактериальной нагрузки. Это контрастирует с 5-25 дней для мгитовых культурных тестов. Загрязнение бактериями, не внедёмыми в ТБ, еще больше подрывает результаты культурных тестов.
Рисунок 1: Проверка инактивации BCG на уровне 80 градусов по Цельсию (кривая точечного шаблона), 85 градусов по Цельсию (кривая шаблона dot-dash) и 95 градусов по Цельсию (кривая шаблона тире). Контроль (черная кривая) была живой (неотапливаемой) культурой BCG, привитой в ту же среду роста. Рост контроля был подтвержден увеличением ОД культуры в течение инкубационного периода. Эта цифра была изменена с Sabiiti и др.27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Стабильность количественной РНК в теплоинактивированном образце инкубируется при температуре 37 градусов по Цельсию в течение 4 дней (D0-D4). (A), (B), и (C) показать BCG культур инактивированы на 80 C, 85 C, и 95 C соответственно. (D) показывает, что туберая гнусная часть инактивирована при 80 градусах Цельсия. Контроль представляет собой необработанную (живую) часть одного и того же образца. Бары ошибок - стандартное отклонение. Три повтора, девять повторов за пробег. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Более высокая деградация РНК после экзогенного добавления фермента RNase A. (A) Тепло инактивации (HI) при 80 c, (B) HI при 85 C, и (C) HI 95 C. Бары ошибок - стандартная ошибка среднего. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Сохранение достаточной РНК для измерения бактериальной нагрузки TB-MBLA с использованием 16S rRNA в качестве маркера. (A) Бактериальная нагрузка оценивается из культур in vitro BCG. (B) Бактериальная нагрузка оценивается от туберкулеза положительной косточки. Бары ошибок - стандартная ошибка среднего значения (n No 18 и 20 репликатов для A и B соответственно). Эта цифра была изменена с Sabiiti и др.27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Электронные микрографы нетронутых btb бацилл после инактивации при 95 градусах по Цельсию в течение 20 минут. Чистая нетронутая клеточная стенка и перечисленные липидные тела наблюдались с помощью TEM. Вверху: низкое увеличение изображения группы клеток выявления непрерывный микобактериальной веревки, как кордивная морфология и внутриклеточного липидных органов. Внизу: высокое увеличение верхних панелей для расширения зрения липидных тел и выявления некоторых микровнутриклеточных структур. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: 12-недельная кривая реакции на лечение пациента на противотуберкулезную терапию, показывающая обратную корреляцию измеренная бактериальная нагрузка TB-MBLA и МГИТ ТТП. Бактериальная нагрузка (синяя кривая) падает в то время как ТТП поднимается (красная кривая), как пациент реагирует на лечение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Мастер микс | Позитивная реакция RT | Негативная реакция RT |
| Объем на реакцию x no. реакций No 5 | Объем на реакцию x no. реакций No 5 | |
| Квантитектная смесь | 10,0 л | 10,0 л |
| Mtb16S грунтовка микс (F и R) | 0,4 л | 0,4 л |
| Зонд Mtb16S | 0,2 л л | 0,2 л л |
| EC грунтовка микс (F и R) | 0,4 л | 0,4 л |
| EC зонд | 0,2 л л | 0,2 л л |
| Фермент RT | 0,2 л л | ------- |
| RNase бесплатная вода | 4,6 л л. | 4,8 л л |
| Общий объем | 16 Зл | 16 Зл |
Таблица 1: Мастер-микс-руководство по подготовке к TB-MBLA qPCR.
| Тип | Канал МТБ | Канал ЕС | Интерпретации |
| Образец | Положительные | Положительные | Действительны |
| Образец | Положительные | Отрицательные | Неопределенное |
| Образец | Отрицательные | Положительные | Действительны |
| Образец | Отрицательные | Отрицательные | Недопустимый |
| МТБ - Контроль | Положительные | Отрицательные | Действительны |
| Контроль добычи (EC) | Отрицательные | Положительные | Действительны |
| Контроль ДНК | Отрицательные | Отрицательные | Действительны |
| Отрицательный контроль (NTC) | Отрицательные | Отрицательные | Действительны |
Таблица 2: Руководство по интерпретации результатов ТБ-МБЛА.
Discussion
В этой статье показано, что тепловая обработка в течение 20 мин при температуре 80 градусов по Цельсию, 85 градусов по Цельсию и 95 градусов по Цельсию эффективно инактивирует образцы туберкулеза, что позволяет ТБ-МБЛА проводиться в не-CL3 объекте без риска заражения лабораторных работников. Выводы подтверждают наблюдения, сделанные в предыдущих исследованиях, в отличие от некоторых по эффективности тепловой инактивации Mtb25,30. Например, некоторые сообщения показывают, что отопление при 80 градусах Цельсия не эффективно на образцах высокой бацилллярной нагрузки25,,31,,32,,33. Эффект инокулума высокой плотности удалось избежать в нашем исследовании, гарантируя, что все песка и чистых культур нагреваются при 1 мл объема на 15 мл центрифуги трубки, обеспечивая достаточное пространство, чтобы подвергать каждую часть образца кипения27.
Сохранение РНК после тепловой инактивации позволяет провести ТБ-МБЛА. Этот вывод совпадает с двумя исследованиями, которые продемонстрировали сохранение РНК после тепловой инактивации12,34. Мы показали, что РНК в теплоинактивированных пробах стабильна при температуре 37 градусов по Цельсию в течение 4 дней, что означает, что лаборатории могут проводить пакетные тесты путем поддержания инактивированных образцов при комнатной температуре в течение недели. Применяя комплекты для экстракции РНК, требующие охлаждения или замораживания, способность поддерживать теплоинактивированные пробы при комнатной температуре устраняет необходимость как для холодовой цепи, так и для лабораторий категории 3 для выполнения TB-MBLA в ограниченных ресурсах условиях.
Менее 1лог бактериальной нагрузки был потерян с помощью 16S rRNA в качестве маркера. Хотя существует разница между живым и теплоинактивированным образцом, количество потерянных в результате тепловой инактивации слишком мало, чтобы поставить под угрозу результаты вниз по течению. Повышение температуры не увеличило количество потерянных РНК, подразумевая, что наблюдаемая потеря не зависит от тепловой обработки. Тепловая обработка при высоких температурах, скорее всего, вызывает лизис клеток, подвергая РНК деградации RNases. Действительно, экзогенное добавление RNase A к тепловой инактивированной фракции увеличило скорость деградации РНК. Кипение не снизило активность RNase, подразумевая, что это очень устойчивый белок.
Важно отметить, что средняя деградация РНК 1,5 журнала10 eCFU/mL не является большой потерей. С этой целью мы предполагаем, что нагревание лизирует небольшую часть бацилл Mtb, тем самым подвергая небольшое количество РНК RNase. Используя TEM, мы показали, что морфология Mtb клеток и целостность стенок клеток практически не зависят от нагрева при 95 градусах Цельсия. Это означает, что это может потребовать различных физиологических факторов и достаточного питания RNases, таких как в принимающей значительно ухудшить РНК35,36. Кроме того, будучи структурной рибосомы, 16S rRNA потенциально менее восприимчивы к RNase37,38. Одна ячейка Mtb содержит 700 рибосом/0,1 мм3 цитоплазмы37,что означает, что на одну клетку содержится больше рРНК. Таким образом, меньшее количество RNase может иметь меньшее влияние38. Наличие большого количества рибосом дает преимущество TB-MBLA с точки зрения чувствительности и способности выявлять низкое бремя больных туберкулезом.
Существует тесная корреляция между бактериальной нагрузкой, измеренной ТТП культуры ТТР ТТР ТТР ТТР ТТР. Это подтверждает бактериальную нагрузку как драйвер культурного позитива в некоторой степени. Однако преимущество TB-MBLA заключается в том, что она непосредственно количественно оценивает бациллную нагрузку, присутствуюую в образце, и не требует пролиферации клеток Mtb до обнаружения. Это контрастирует с культурой, время которой в позитиве зависит от уровня бактериальной нагрузки и скорости пролиферации клеток Mtb. Будущие исследования будут оценивать рабочий процесс TB-MBLA, включая тепловую инактивацию, в обычных клинических условиях. Исследование будет также изучить образцы с рядом бактериальных нагрузок, чтобы понять количество, которое может измениться от положительного к отрицательному (т.е. те, с меньшим количеством бактерий после тепловой инактивации).
Протокол TB-MBLA для молекулярной количественной оценки бактериальной нагрузки является первым в своем роде в бактериологии. Метод непосредственно количественно Mtb бациллы нагрузки от пациента sputum и не требует культуры, чтобы сделать это. Это ускоряет его и увеличивает его потенциал для информирования клинического решения о прогрессе пациента. Шаг тепловой инактивации снижает риск заражения и повышает применимость ТБ-МБЛА в условиях, где нет лаборатории категории 3. После тепловой инактивации образца, есть три протокольных шага для достижения результатов TB-MBLA: экстракция РНК, обратная транскриптаза (RT)-qPCR и анализ результатов qPCR.
Чем выше эффективность изоляции РНК Mtb от образца пациента, тем выше качество результатов. Важно отметить, что качество образца косы влияет на количество РНК изолированы. Например, слюнная слюнная слюнная слюнная выпуклость считается низкокачественной и была связана с низкой бацильной нагрузкой. Это означает, что обучение пациента для получения ожидаемого качества sputum имеет важное значение. Для оценки эффективности процесса экстракции в образец до извлечения проводится контроль добычи (т.е. известное количество не-МТБ-клеток). Извлечение контроля добычи подтверждает эффективность процесса извлечения РНК. Процесс изоляции РНК не может быть действительным, если контроль извлечения не был извлечен. Учитывая тот факт, что Mtb является устойчивым организмом делает механический лисис важной частью процесса. Гомогенизация образца на высокой скорости (600 об/мин) при наличии бисера (т.е. лизирующей матрицы) эффективно лизает клетки. Очистка лизата дает экстракт, содержащий как РНК, так и ДНК. Удаление ДНК является важным последним шагом экстракции РНК. TB-MBLA стремится измерить жизнеспособные бациллы путем количественной оценки РНК. Таким образом, неспособность удалить геномную ДНК означает, что результаты будут иметь сигнал от ДНК, который не является хорошим маркером для жизнеспособности клеток6.
RT-qPCR представляет собой дуплекс, работающий с двойными маркированными зондами для Mtb и контроля добычи. Она включает в себя три этапа: 30 минут обратной транскрипции путем обратной транскрипции при 50 градусах По квадроцита, 15 мин денатурации при 95 градусах Цельсия и 40 циклов усиления при 94 градусах И 60 градусов по Цельсию. Приобретение флуоресценции у зондов происходит при 60 градусах Цельсия (т.е. стадии удлинения фрагмента). Важно отметить, что TB-MBLA был оптимизирован с помощью конкретной машины qPCR, поэтому операторы, использующие другие платформы qPCR, должны оптимизировать условия для своего оборудования. Эффективность удаления ДНК контролируется путем запуска одной реакции на образец в отсутствие RT. Положительный результат этой реакции означает неполное удаление ДНК. Высокое бремя образцов, которые имеют большое количество ДНК может потребовать в два раза больше фермента DNase, чтобы полностью удалить ДНК. К счастью, в образцах высокой бацилловой нагрузки наличие небольших количеств ДНК менее вероятно, повлияет на результат РНК. Рибосомальная РНК, цель TB-MBLA, естественно, происходит в два раза больше ДНК37. В ПЦР, нет шаблона управления (NTC), который является вода, используемая для растворения рагентов ПЦР, контроль для перекрестного загрязнения с экзогенной ДНК или РНК. Положительный сигнал в НТЦ подразумевает перекрестное загрязнение, и результат считается недействительным. Это означает, что все решения, образовавшиеся с помощью этой воды, должны быть отброшены, а новые, сделанные с использованием свежего флакона с водой. Рекомендуется держать пЧр воды в отдельных aliquots, чтобы избежать загрязнения всей воды. Положительный контроль (Mtb RNA) используется для контроля для общей эффективности ПЦР.
Анализ результатов включает в себя преобразование ПЦР Cqs в бактериальную нагрузку (т.е. расчетные единицы формирования колонии на мл) с использованием стандартной кривой. Настройка и оптимизация стандартной кривой имеет решающее значение для этого шага. Рекомендуется стандартная эффективность кривой 0,95-1. Стандартные кривые для MTb и контроля извлечения должны быть настроены и оптимизированы до того, как пациенты или другие тестовые образцы будут запущены на машине. Стандартные образцы оснастят комплектом TB-MBLA. Десятикратное разбавление экстракта РНК рекомендуется для ПЦР. Это означает, что результат бактериальной нагрузки должен быть умножен на 10 раз, чтобы получить конечный результат бактериальной нагрузки на мл. Важно отметить, что Cqs выше 30 считаются отрицательными для TB-MBLA. Минимум два перспективных результатов бактериальной нагрузки измеряется в разных точках времени требуется сделать вывод о реакции лечения. Настоятельно рекомендуется, чтобы один из двух результатов должен быть базовым, до начала лечения. Однако, если пациент инициировал оценку бактериальной нагрузки происходит в середине лечения, должно быть второе время точки бактериального измерения нагрузки для оценки реакции лечения. TB-MBLA может различать бактериальную нагрузку в течение 3 дней на лечение, но в идеале два бактериальных измерений нагрузки приняты 7 дней друг от друга.
Хотя протокол генерирует информативные количественные результаты для лечения ответ, он по-прежнему в значительной степени руководство и требует существенных рук на время для извлечения РНК. Техники в занятых лабораториях, возможно, не на этот раз. В настоящее время принимаются меры по автоматизации процессов экстрапроизводства РНК и ПЦР.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Исследование стало возможным благодаря финансированию со стороны Европейских и развивающихся стран клинических испытаний партнерства (EDCTP) - Панафриканский биомаркер расширение программы (PanBIOME) грант SP.2011.41304.008. Поддержка была также получена Университет Сент-Эндрюс школы медицины научно-исследовательский грант. Публикация этой рукописи и протокола TB-MBLA в качестве визуального ресурса стала возможной благодаря финансированию из Шотландского совета по финансированию и Исследовательского фонда глобальных вызовов Университету Сент-Эндрюса. Благодаря Мапуту материнской больницы и Мавалане медицинский центр, который предоставил клинические образцы моспы, и Мапуту лечения туберкулеза группы, которые помогли с тепловисактивации экспериментов клинических образцов мопуты.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat inactivation: | |||
| 15 mL Centrifuge tubes | Fisher-Scientific | 10136120 | 50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved |
| 15 mL Wire Tube rack | Fisher-Scientific | 11749128 | Other brands with similar make can be used |
| Water bath | Fisher-Scientific | 15700619 | Other brands with similar make can be used |
| RNA extraction: | |||
| Chloroform | Sigma | 372978-1L | Not necessary in other RNA extraction kit brands |
| Ethanol, absolute 99-100% | Sigma | 51976-500ML-F | Larger volume available |
| Extraction control | SOI group St Andrews | VitalbacteriaEC | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit |
| FASTRNA Pro blue Kit | MP Biomedicals | 116025050 | Supplied with lysing matrix tubes |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Qiagen, Fisherscientific can also supply same product |
| Precellys 24 homogeniser | VWR | 432-3750 | FastPrep MP Biomedicals can be used too |
| Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus | Fisher-Scientific | 15352117 | Other brands with similar capacity can be used |
| Thermomixer | Eppendorf | BLD-455-010C | Works with 1-2 mL tubes |
| TURBO DNA-free | Fisher-Scientific | AM1907M | Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures. |
| RT-qPCR: | |||
| Primers and Taqman probes | SOI group St Andrews | VitalbacteriaPP | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX. |
| QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit | Qiagen | 204845 | PCR mix plus the RT enzyme |
| RotorGene Q 5plex machine | Qiagen | 9001580 | Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc. can be used |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 mL | Qiagen | 981103 | Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed. |
| Non-heat inactivation Sample preservation materials | |||
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | 93313 | Supplied ready to use |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Many competent suppliers |
| Guanidine thiocyanate (GTC) | Promega | V2791 | Promega brand recommended for quality |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Ensures that GTC solution is free of nucleases |
| General materials (used but not specific to TB-MBLA) | |||
| 500 mL plastic containers | 734-5087 | Nalgene brand recommeded | |
| Biological waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Chemical waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Disposable gloves, chemical resistant | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-20 °C) | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-80 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fridge (0-8 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fume hood | For safe handling of toxic reagents | ||
| Laboratory scales | For accurate measurement of reagents | ||
| Measuring cylinders, plastic | To ensure accurate measurement of reagents | ||
| PCR reaction tubes | Should be suitable to the PCR instrument used | ||
| Pipettes and matching sterile filtered pipette tips, | DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended | ||
| Qiagility loading plates | Qiagen | 5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates | |
| QIAgility Pipetting Robot | Qiagen | Important for high throughput pipetting | |
| Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes | Chemical-resistant and autoclavable recommended | ||
| RNase Away (Removes RNases enzymes from working space) | Fisher Scientific | 10666421 | Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme |
| Safety goggles, chemical resistant | Fisher Scientific | Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents. | |
| Sterile Pasteur pipettes, 1.5-3 mL | Many competent suppliers | ||
| Sterile RNAse-free microtubes | 1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended | ||
| TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse | Ensure it is freshly prepared or prepared within a week | ||
| Vortex | Genie 2 brand recommended | ||
| Transmission electron microscopy | |||
| Glutaldehyde (8%) | Sigma | G7526-10ML | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| HEPES (pH 7.4, 100 mM) | Sigma | H4034-25G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Leica FCS ultracryo | Leica | Cryomicrotome for tissue sectioning | |
| Methyl cellulose | Agar Scientific | AGG6425 | Cold mounting resin |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Sigma | P6148-500G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Sucrose | Sigma | 84097-250G | Preservation and mounting medium |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | AGR1260A | Universal Electron microscopy stain |
References
- World Health Organization. END TB Global Tuberculosis Report 2017. World Health Organization. , (2017).
- World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. World Health Organization. , (2018).
- World Health Organization. TB Elimination in Low-Incidence Countries. World Health Organization. , (2014).
- Boehme, C. C., et al. diagnostic accuracy, and effectiveness of decentralised use of the Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistance: a multicentre implementation study. The Lancet. 377, 1495-1505 (2011).
- World Health Organization. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children. World Health Organization. , (2010).
- Friedrich, S. O., et al. Assessment of the sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF assay as an early sputum biomarker of response to tuberculosis treatment. The Lancet Respiratory Medicine. 1, 462-470 (2013).
- Desjardin, L. E., et al. Measurement of Sputum Mycobacterium tuberculosis Messenger RNA as a Surrogate for Response to Chemotherapy. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 160, 203-210 (1999).
- Hellyer, T. J., et al. Detection of Viable Mycobacterium tuberculosis by Reverse Transcriptase-Strand Displacement Amplification of mRNA. Journal of Clinical Microbiology. 37, 518-523 (1999).
- Honeyborne, I., et al. Molecular Bacterial Load Assay , a Culture-Free Biomarker for Rapid and Accurate Quantification of Sputum Mycobacterium tuberculosis Bacillary Load during Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).
- Li, L., et al. Sputum Mycobacterium tuberculosis mRNA as a Marker of Bacteriologic Clearance in Response to Antituberculosis Therapy. Journal of Clinical Microbiology. 48, 46-51 (2010).
- Honeyborne, I., et al. The Molecular Bacterial Load Assay Replaces Solid Culture for Measuring Early Bactericidal Response to Antituberculosis Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).
- Hellyer, T. J., Jardin, L. E. D. E. S., Hehman, G. L., Cave, M. D. Quantitative Analysis of mRNA as a Marker for Viability of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology. 37, 290-295 (1999).
- Aellen, S., Que, Y., Guignard, B., Haenni, M., Moreillon, P. Detection of Live and Antibiotic-Killed Bacteria by Quantitative Real-Time PCR of Specific Fragments of rRNA. Antimicrobial agents chemotherapy. 50, 1913-1920 (2006).
- Deutscher, M. P. Degradation of RNA in bacteria: Comparison of mRNA and stable RNA. Nucleic Acids Research. 34, 659-666 (2006).
- Gupta, R. K., Srivastava, R. Resuscitation Promoting Factors: A Family of Microbial Proteins in Survival and Resuscitation of Dormant Mycobacteria. Indian Journal of Microbiology. 52, 114-121 (2012).
- Mukamolova, G. V., Turapov, O., Malkin, J., Woltmann, G., Barer, M. R. Resuscitation-promoting factors reveal an occult population of tubercle bacilli in sputum. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 181, 174-180 (2010).
- Sheridan, G. E. C., Masters, C. I., Shallcross, J. A., Mackey, B. M. Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coliCells Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coli Cells. Applied Environment Microbiology. 64, 1313-1318 (1998).
- Honeyborne, I., et al. Molecular bacterial load assay, a culture-free biomarker for rapid and accurate quantification of sputum Mycobacterium tuberculosis bacillary load during treatment. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).
- Sabiiti, W., et al. Molecular Bacterial Load Assay: a Fast and Accurate Means for Monitoring Tuberculosis Treatment Response. BMJ Global Health. 2, 1-8 (2017).
- Gillespie, H., Stephen, S. W., Oravcova, K. Mybacterial Load Assay. Diagnostic Bacteriology. Methods and Protocols. Bishop, A. K. , Humana Press. Totowa, NJ. 89-105 (2017).
- Juffs, H., Deeth, H. Scientific Evaluation of Pasteurisation for Pathogen Reduction in Milk and Milk Products. Food Standards Australia New Zealand. , Wellington, New Zealand. (2007).
- Holmes, C. J., Degremont, A., Kubey, W. Effectiveness of Various Chemical Disinfectants versus Cleaning Combined with Heat Disinfection on Pseudomonas Biofi lm. Blood Purification. 22, 461-468 (2004).
- Chedore, P., et al. Method for inactivating and fixing unstained smear preparations of Mycobacterium tuberculosis for improved laboratory safety. Journal of Clinical Microbiology. 40, 4077-4080 (2002).
- Cardoso, C. L., et al. Survival of Tubercle Bacilli in Heat-fixed and Stained Sputum Smears. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 96, 277-280 (2001).
- Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Pathology. 55, 778-779 (2002).
- Honeyborne, I., et al. The molecular bacterial load assay replaces solid culture for measuring early bactericidal response to antituberculosis treatment. Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).
- Sabiiti, W., et al. Heat Inactivation Renders Sputum Safe and Preserves Mycobacterium tuberculosis RNA for Downstream Molecular tests. Journal of Clinical Microbiology. , 1-8 (2019).
- Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrasructure Research. 89, 65-78 (1984).
- Kumar, V. G., Urs, T. A., Ranganath, R. R. MPT 64 Antigen detection for Rapid confirmation of M. tuberculosis isolates. BMC Research Notes. 4, 79 (2011).
- Zwadyk, P., Down, J. A., Myers, N., Dey, M. S. Rendering of mycobacteria safe for molecular diagnostic studies and development of a lysis method for strand displacement amplification and PCR. Journal of Clinical Microbiology. 32, 2140-2146 (1994).
- Blackwood, K. S., et al. Viability testing of material derived from Mycobacterium tuberculosis prior to removal from a Containment Level-III Laboratory as part of a Laboratory Risk Assessment Program. BMC Infectious Diseases. 5, 3-9 (2005).
- Somerville, W., Thibert, L., Schwartzman, K., Behr, M. A. Extraction of Mycobacterium tuberculosis DNA: a Question of Contaiment. Journal of Clinical Microbiology. 43, 2996-2997 (2005).
- Bemer-Melchior, P., Drugeon, H. B. Inactivation of Mycobacterium tuberculosis for DNA typing analysis. Journal of Clinical Microbiology. 37, 2350-2351 (1999).
- McKillip, J. L., Jaykus, L. A., Drake, M. rRNA stability in heat killed and UV-irradiated enterotoxigenic Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157:H7. Journal of Appied Environmental Microbiology. 64, 4264-4268 (1998).
- Blank, A., Dekker, C. A. Ribonucleases of Human Serum, Urine, Cerebrospinal Fluid, and Leukocytes. Activity Staining following Electrophoresis in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels. Biochemistry. 20, 2261-2267 (1981).
- O'Leary, T. J. Reducing the impact of endogenous ribonucleases on reverse transcription-PCR assay systems. Clinical Chemistry. 45, 449-450 (1999).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes per 0.1 fl of cytoplasm. PLoS One. 10, 1-14 (2015).
- Yang, K., et al. Structural insights into species-specific features of the ribosome from the human pathogen Mycobacterium tuberculosis. Nucleic Acids Research. 45, 10884-10894 (2017).
