Summary
Balgamın ısı inaktivasyonundan sonra yapılan tüberküloz moleküler bakteriyel yük testini tanımladık. Isı inaktivasyonu balgam örneklerini enfeksiyöz olmayan hale getirir ve tüberküloz moleküler testleri için 3 laboratuvarları kapsama ihtiyacını ortadan kılmaktadır.
Abstract
Tüberküloz, Birleşmiş Milletler (BM) tarafından tehlikeli bir Kategori B biyolojik maddesi olarak sınıflandırılan bir patojen olan Mycobacterium tuberculosis (Mtb) neden olur. İşçilerin güvenliği için, Mtb taşıdığı sanılan tüm numunelerin işlenmesi bir koruma seviyesi (CL) 3 laboratuarında yapılmalıdır. Tüberküloz moleküler bakteri yük testi (TB-MBLA) testi, 16S rRNA için astar ve çift etiketli problar kullanarak Mtb basil yükünü ölçen ters transkriptaz nicel polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) testidir. TB-MBLA için RNA'yı korurken Tüberküloz örneklerini bulaşıcı hale getirmek için ısı inaktivasyonu nun kullanımını açıklıyoruz. Sıkıca kapatmış 15 mL santrifüj tüpteki balgam numunesinin 1 mL aliquot'u, Mtb basilini inaktive etmek için 80 °C, 85 °C veya 95 °C'de 20 dakika kaynatılır. 42 gün boyunca ısı inaktive ve kontrol (canlı) örnekleri ekimi Tüberküloz ölümü doğruladı. İnaktive numune daha sonra ekstraksiyon kontrolünün 100 μL'si ile çivilenir ve standart RNA izolasyon prosedürü nden sonra RNA ayıklanır. Isıl işlem görmüş numune kültürlerinde büyüme gözlenmedi. İzole RNA, Mtb 16S rRNA genindeki belirli bir hedefi yükselten ve niceleme döngüleri (Cq) şeklinde sonuçlar veren gerçek zamanlı RT-qPCR'ye maruz kalır. Standart bir eğri bakteriyel yük veya mL başına tahmini koloni şekillendirme birimleri (eCFU / mL) içine Cq çevirmek için kullanılır. Cq ile numunenin bakteriyel yükü arasında ters bir ilişki vardır. Sınırlama, ısı inaktivasyonunun bazı hücreleri etkisiz hale getirmesi ve RNA'yı <1 log10eCFU/mL (yani<10 CFU/mL) kaybına neden olan RNA'lara maruz bırakmasıdır. Daha ileri çalışmalar ısı inaktivasyonu nedeniyle yanlış negatif sonuçlara neden çok düşük yük hastaların oranını belirleyecektir.
Introduction
Mycobacterium tuberculosis (Mtb) neden, 7 x 106 yeni tüberküloz vakası (TB) üzerinde yılda 1 x 106 ölmek küresel rapor edilir1,2. Eğilimi tersine çevirmek için, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) etkili tanı ve tedavi araçları geliştirme dahil olmak üzere üç ayaklı bir yaklaşım başlattı3. BM tarafından tehlikeli bir biyolojik madde olarak sınıflandırılan B, Mtb için pozitif olduğu sanılan numunelerle çalışmak için 3'lük bir çevreleme düzeyi (CL) gerekir. CL3 laboratuvarlarının inşası ve bakımı pahalıdır. Sonuç olarak, çoğu ülke bölgesel veya ulusal düzeyde tüberküloz kültür hizmetlerini merkezileştirmiş. Bu, yayma mikroskobunun çevre sağlık tesislerinde en uygun tanı aracı olduğu anlamına gelir.
Düzey 4 sağlık tesislerinde Xpert MTB / RIF gibi hızlı moleküler testler uygulamak için DSÖ onayı vardır, çoğunlukla ilçe düzeylerinde yer4,5. Bazı ilçeler oldukça büyük ve bazı insanlar için daha az erişilebilir. Yararlı olmakla birlikte, Xpert MTB/RIF Mtb DNA'sını tespit ederek çalışır. DNA hücreleri öldükten sonra uzun süre hayatta kalır ve böylece tedavi yanıtı izlemek için kritik canlı hücreleri ölçmek için iyi bir standart değildir istikrarlı bir moleküldür5,6. RNA tabanlı tahliller canlı hücrelerin doğru ölçümü için bir alternatif sunuyoruz7,8,9,10,11,12,13. RNA farklı stabilite türlerinde bulunur: ribozomal RNA (rRNA), transfer RNA (tRNA) ve haberci RNA (mRNA). Messenger RNA gen ekspresyonu ile ilişkilidir ve böylece en yakından hücre aktivitesi ve canlılık ile ilişkili14. Mtb gibi patojenlerin inaktif (atıl) ama yaşanabilir devletlerde var olduğu bilindiği için gen ekspresyonunun yokluğunun hücre ölümüyle eşdeğer olmadığını belirtmek önemlidir15,16. RRNA gibi kararlı RNA türleri bu nedenle canlı hücrelerin hem aktif hem de inaktif durumlarının daha iyi belirteçleridir.
Escherichia colikullanarak, Sheridan 16S rRNA orantılı koloni oluşturan birimleri (CFU) sayıları ile ölçülen bakteri üreme sayar17arttı gösterdi. E. coli bakterisi antibiyotiklere maruz kaldığında CFU sayılarında ve 16S rRNA'da eşzamanlı bir düşüş yaşandı. Hücre ölümünün ardından rRNA'daki düşüş, hücre canlılığı için bir belirteç olarak kullanılabileceğinin bir göstergesiydi13,17. Bu ilkeden yola çıkarak, Anti-TB tedavisi olan hastalar için tedavi yanıtının bir göstergesi olarak m. tüberküloz 16S rRNA'yı hedeflemek için Tüberküloz moleküler bakteri yükü (TB-MBLA),18,19geliştirilmiştir. Biz daha da geliştirdik ve M. tüberküloz basili lysis yansıtan bir hücresel ekstraksiyon kontrolü dahil etmek için TB-MBLA optimize ve farklı çevre ortamlarında sağlam20. TB-MBLA prosedürü, Mtb hücrelerinin işçilerin güvenliğini sağlamak için tamamen lysed kadar Mtb'den RNA izolasyonunun ilk adımlarının CL3 laboratuvarında yapılmasını gerektirir. Ayrıca guanidin tiyosiyanat, bir seviye 4 toksik madde -80 °C'de muhafaza edilecek retrospektif toplu analiz için örnek koruma içerir. Bu amaçla, Mtb'yi inaktive etmek ve örnekleri kobi mikroskop seviyesi laboratuvarlarında yapılacak Tüberküloz-MBLA için güvenli hale getirmek için ısı kullandık.
Laboratuvar ve klinik uygulamalarda ısı kullanımı yüzyıllardır21,22civarında olmuştur. Ancak, Mtb gibi bazı mikroorganizmalar öldürmek zordur, ve ısı ya daha kısa maruz kalma tüm hücreleri öldürmek için yetersizdir23,24. Yapılan bir çalışmada, 80 °C'de Tüberküloz kültürlerinin 20 dk ısıtmapcr25için gerekli DNA'yı yok etmeden tüm Mtb basillerini öldürdüğü ortaya konmıştır. Daha sonra, laboratuvar DNA çıkarma teknikleri bir dizi şu anda 95 °C ısı. Aynı prensibi, 80 °C, 85 °C veya 95 °C'de kaynayan Tüberküloz örneklerinin MTB'yi inaktive ettiğini ve TB-MBLA için yeterli RNA'yı koruduğunu göstermek için uyguladık. Inaktive kültür veya balgam oda sıcaklığında sıkıca kapalı kaplarda muhafaza edilebilir veya ölçülebilir rRNA miktarını azaltmadan 7 gün buzdolabında.
TB-MBLA, şu anda sadece bir araştırma kullanımı olarak kullanılan (RUO) testi uyarlanabilir ve balgam, akciğer dokusu ve serebral spinal sıvı dahil olmak üzere farklı örnek tipleri uygulanmıştır. Bronşiyal alveoler sıvı, kan ve diğer örnek tiplerine henüz uygulanmamıştır. Örnek olarak balgam kullanılması, Afrika'da çok siteli değerlendirme (yayınlanmamış veriler) ve önceki yayınlar18,26 sonuçları MBLA duyarlılığı nın mikobacterium büyüme göstergesi tüpü (MGIT) sıvı kültürü ile tutarlı olduğunu göstermektedir. Ancak, TB-MBLA daha hızlıdır, kültür gün veya hafta aksine saat sonuçları veren, özel, örnekte olmayan Tüberküloz mikroorganizmalar etkilenmez, ve hastalığın şiddetini nicel bir ölçü verir. DSÖ son zamanlarda tb tedavisi2izlenmesi için smear mikroskobu ve kültür yerine aday olarak TB-MBLA tanıdı.
Bu yazıda Sabiiti ve ark.27'deyayınlanan ısı inaktivasyonu ve TB-MBLA protokolünü ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu ayrıntılı protokol, dünya genelinde KiRemit kullanıcıları için tek noktadan görsel bir kaynak sağlayacaktır.
Protocol
1. Örnek Hazırlama
-
Kültür
- Temiz bir tezgah veya sınıf 1 kabin üzerinde çalışan, 15 mL plastik santrifüj tüpler içine üstel faz Bacillus Calmette-Guérin (BCG) kültürünün 1 mL aliquots hasat. Tüpleri sıkıca kapatın.
NOT: 5 mL numunenin tamamını işlemek için beş tane 15 mL santrifüj tüp gereklidir.
DİkKAT: Herhangi bir tüberküloz kültürü ile çalışırken biyogüvenlik kabinesi gereklidir.
- Temiz bir tezgah veya sınıf 1 kabin üzerinde çalışan, 15 mL plastik santrifüj tüpler içine üstel faz Bacillus Calmette-Guérin (BCG) kültürünün 1 mL aliquots hasat. Tüpleri sıkıca kapatın.
-
Hasta balgam örneği
- İyi havalandırılan bir alanda çalışan ve burun maskesi takan, numune kabını dikkatlice açın, pipet 1 mL aliquots 15 mL plastik santrifüj tüpler içine ve sıkıca tüpleri kapatın.
NOT: Geniş bir ağız ucu pipet balgam önerilir. Bir makas kullanarak, daha geniş bir ağız oluşturmak için 1 mL ucu ağzın ince kısmını kırpın.
- İyi havalandırılan bir alanda çalışan ve burun maskesi takan, numune kabını dikkatlice açın, pipet 1 mL aliquots 15 mL plastik santrifüj tüpler içine ve sıkıca tüpleri kapatın.
2. Isı İnaktivasyonu
- Numune hazırlamadan önce su banyosunu 95 °C'ye ayarlayın.
NOT: 95 °C sıcaklık, RNase aktivitesini azaltma şansını artırır ve böylece tb-MBLA'nın aşağı sıcanında daha fazla RNA korur. - Örnek tüpleri su banyosuna daldırılmış bir tutucu rafa aktarın. Her numune tüpünün dörtte üçünün suya daldırıldığından emin olun.
- 20 dk için 95 °C'de kaynatın, rna ekstraksiyonbaşlamadan önce oda sıcaklığında 5 dakika soğuması için tezgah tüpleri aktarın.
NOT: M. tüberküloz basili ve BCG'nin tam ısı inaktivasyonu, büyümeyi doğrulamak için 37 °C'de 37 °C'de ısı inaktive edilen numune ve kontrollerin kuluçkaya yatırılarak doğrulandı. 600 nm (OD600)optik yoğunluk ölçümü taban çizgisinde ve daha sonra 42 günlük kuluçka dönemi için haftalık olarak alınmıştır.
3. RNA Çıkarma
NOT: Burada açıklanan RNA çıkarma işlemi, Malzeme Tablosu'ndalistelenen RNA kiti içindir. Farklı üreticiler tarafından diğer uygun RNA ekstraksiyon kitleri kullanılabilir.
- Ekstraksiyon kontrolü (EC) ilavesi
- Isı inaktive örneklerinin 1 mL aliquots'u 1,5 mL tüplere aktarın. Her numuneye 100°L'lik BIR AK saplayın, tüpü kapatın ve tüpü ters 3 kat ters çevirerek karıştırın.
NOT: EC TB-MBLA hayati bakteri kiti(Tablo Malzemeler)ile birlikte verilir.
- Isı inaktive örneklerinin 1 mL aliquots'u 1,5 mL tüplere aktarın. Her numuneye 100°L'lik BIR AK saplayın, tüpü kapatın ve tüpü ters 3 kat ters çevirerek karıştırın.
- Hücre sedimantasyonu
- Bir tezgah üstü mikrocentrifuge kullanarak, oda sıcaklığında 10 dakika için 20.000 x g tüplersanrifuge. Pipet süpernatant kapalı, tortu 50 μL bırakarak.
- Tortuyu 950 μL lysis tamponunda yukarı ve aşağı borular oluşturarak askıya alın ve tüm süspansiyonu RNA ekstraksiyon kiti(Malzeme Tablosu)ile birlikte verilen lysing matris tüpüne aktarın. Tüplerin sıkıca kapatıldığından emin olun ve hem kapağı hem de tüpün yan tarafını etiketlayın.
- Hücre lizisi için tüpleri adım 3.2.2'den homogenizer aktarın. 6,000 rpm'de 40 s için örnekleri homojenize.
- Nükleik asit saflaştırma
- Oda sıcaklığında 5 dk için 12.000 x g adım 3.3 den lysate santrifüj.
- Taze 1 mL tüpler hazırlayın ve her tüpe 300 μL kloroform ekleyin.
- 1 mL'lik bir ucu nilya lama matrisine dokunmadan süpernatanttandan dikkatlice pipet kullanın.
- 5 s. Için tüpler ve girdap içeren klorotant transfer üç faz (üst, orta ve alt) açıkça görülebilir kadar 5 dakika veya daha uzun yerleşmek için tüp bırakın.
- Oda sıcaklığında 5 dk için 12.000 x g santrifüj. Üst fazı dikkatlice pipetle ve taze 1,5 mL tüplere aktarın.
- Adım 3.4.5 tüpler için, buz gibi% 100 etanol 500 μL ekleyin, tüpleri kapatın ve yavaşça baş aşağı 3x ters çevirerek karıştırın. Tüpleri 15 dakika veya -20 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın ve ekstraksiyona devam edin veya ertesi gün ekstraksiyonu tamamlamak için gece boyunca -20 °C'de bırakın.
- Mikrocentrifuge'u 4 °C'ye ayarlayın ve santrifüje başlamadan önce en az 12 °C'ye soğumaya bırakın. 13.000 x g20 dk için mikrocentrifuge ve santrifüj içine tüpler yükleyin. Supernatant atın,% 70 buz gibi etanol ile değiştirin ve 13.000 x gbaşka bir 10 dakika için santrifüj .
NOT: %70 etanol moleküler sınıf nükleaz içermeyen su ile yapılmalıdır. - 3.4.7 adımdaki tüm süpernatant'ı atın ve tüpleri 50 °C'de ayarlanmış bir kuluçka makinesine aktarın. RNA/DNA peletini kurutmak için 20 dk kuluçkaya yatırın. Tüm etanol buharlaşma sağlamak için tüpler kısmen açık tutun.
- Kuru peletve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka için nükleaz serbest su 100 μL ekleyin. Girdap için 3 s içeriğini karıştırmak için.
NOT: Bu aşamada ekstre buzdolabında 2−3 gün veya -80 °C'de 3.5 bölümü yapılana kadar saklanabilir.
- DNA kaldırma
NOT: Ekstrede DNA varlığı MBLA sonucunu geçersiz kıldığı için bu adım çok önemlidir. Bu bölüm DNA kaldırma kiti(Malzeme Tablosu)dayanmaktadır.- Numune sayısı için DNase I 10x tampon ve DNase I enziminin bir karışımını hazırlayın (numune başına 10 μL tampon ve 1 μL DNase) artı pipetlemeden kaynaklanan herhangi bir kaybı karşılamak için %10 ekstra. RNA ekstresi içeren her tüp içine girdap ve daha sonra pipet 11 μL ile karıştırın.
- 3 s girdap tarafından karıştırın ve sonra kısaca spin (10 s at 13,000 x g) duvarlarda herhangi bir damlacıkları kaldırmak için. Sıcak blok veya kuluçka makinesinde 30 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Her tüpe doğrudan 1 000 Adet DNase I enzimi ekleyin, girdap yaparak iyice karıştırın ve 37 °C'de 30 dakika daha kuluçkaya yatırın.
- DNase kuluçka süresinin bitiminden 10 dk önce DNase inaktivasyon reaktifini eritin. Vortex 20 s homojen, sütlü süspansiyon sağlamak ve sonra adım 3.5.2 her RNA ekstresi içine DNase inaktivasyon reaktif10 μL ekleyin.
- 5 dk kuluçka adımı sırasında 5 dk. Vortex 3x oda sıcaklığında karışımı kuluçka.
- Karışımı 13.000 x g'de 2 dk. Dikkatli bir şekilde süpernatant'ı 1,5 mL RNase serbest tüpe inaktivasyon matrisine dokunmadan aktarın.
- RT-qPCR'ı aynı gün veya uzun süreli depolama için -80 °C'de çalıştırıyorsanız RNA ekstresini buzdolabında saklayın.
4. Ters Transkriptaz qPCR
- Bilinmeyen numuneler için, rna içermeyen suda 1:10 oranında kullanılmak üzere tüm RNA ekstrelerini seyreltin. 5 s için girdap tarafından iyice karıştırın ve kısaca herhangi bir damlacık veya hava kabarcıkları kaldırmak için aşağı spin.
- Standart bir eğri için standart numuneler için -80 °C'lik dondurucudan Mtb ve EC RNA standartlarını alın ve oda sıcaklığında çözülün. Mtb ve EC standart numunelerinin sırasıyla yedi ve altı 10 kat seyreltmesini yapın. Karışımı bir tüpten diğerine aktarmadan önce ipuçlarını değiştirin.
NOT: Standart numuneler TB-MBLA kiti ile birlikte verilir. -
Master karışım hazırlama
NOT: Ana karışım (MM), hiçbir şablon denetimi (NTC) için tüm numuneleri, standartları ve suyu yükseltmek için yeterli PCR reaktiflerinin bir çözümüdür. NTC olarak kullanılan su, ekstraksiyonda ve MM'nin hazırlanmasında kullanılan suyla aynı olmalıdır. RT- reaksiyonu DNA çıkarma etkinliğini belirlemek için bir kontroldür (Tablo 1).- Her PCR reaksiyon tüpüne 16 μL MM aktarın.
- Her RT+ ve RT- reaksiyon tüpüne 4 μL RNA ekstresi ve NTC reaksiyon tüplerine su ekleyin.
- Reaksiyon tüplerini gerçek zamanlı bir PCR makinesine yükleyin ve PCR koşullarını şu şekilde ayarlayın: 30 dakika için 50 °C, 15 dakika için 95 °C, 45 s için 94 °C'de 40x döngüler ve yeşil ve sarı kanallarda emilen floroforlarla 1 dk için 60 °C.
NOT: Yeşil kanal Mtb algılama florofor ve sarı ekstraksiyon kontrol algılama florofor olduğunu.
-
Sonuç yorumu
NOT: Aynı örneğin yinelenen reaksiyonlarının 1'den fazla standart sapma ile farklılık sağlamadığından emin olun. Mtb ve 30'dan büyük EC Cq değerleri negatif olarak kabul edilir. Tablo 2'dekidiğer yorumlama ayrıntılarına bakın.- Tedavi yanıtını yorumlamak için, standart eğriyi kullanarak Cq değerlerini bakteriyel yüke (eCFU/mL) dönüştürün. Tedavi takip süresi boyunca bakteriyel yükteki değişim olarak tedavi yanıtını okuyun.
NOT: Tedaviden sonra bakteriyel yükteki düşüş olumlu bir yanıtı (yani, anti-TB ilaçların Tüberküloz bakterisini öldürmesi) gösterirken, bakteriyel yükte herhangi bir değişiklik veya artış olumsuz bir yanıt anlamına gelmez, bu da Tüberküloz lu bakterilerin anti-Tüberküloz ilaçlarına veya hastanın tedavi dozuna uygun şekilde bağlı kalarak direnç anlamına gelebilir. TB-MBLA ile ölçülen bakteriyel yükteki düşüş, MGIT zamanının artmasıyla kültür pozitifliği (TTP) ile ilişkilidir.
- Tedavi yanıtını yorumlamak için, standart eğriyi kullanarak Cq değerlerini bakteriyel yüke (eCFU/mL) dönüştürün. Tedavi takip süresi boyunca bakteriyel yükteki değişim olarak tedavi yanıtını okuyun.
5. İletim Elektron Mikroskobu
- 2 mL ısı aliquots ısı inaktive kültürler ve kontrolleri 2 mL mikrosantrifüj tüpler içine aktarın. 20.000 x g10 dakika santrifüj .
- Supernatant atın ve hücre fiksasyon tampon 700 μL pelet askıya ve hücreleri düzeltmek için 5 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
- Sert bir pelet elde etmek için 16.000 x g 30 dk için süspansiyon santrifüj. Supernatant atın ve fosfat tamponlu salin % 1 sakaroz ile değiştirin (PBS). Elektron mikroskobu için kesit edinene kadar peletleri 4 °C'de saklayın.
-
Kesit ve TEM
NOT: Aşağıdaki protokol Griffiths ve ark.28'denuyarlanmıştır.- Hücre peletini 4 °C'de bir gecede PBS'de 2,1 M sakaroza katıştırarak kriyokoruma. 3 x buz gibi suyla yıkayın.
- Sıvı nitrojen dondurucu korumalı hücre peletleri serin ve onları kriyomikrotomi saplama monte. Kriyomikrotomu kullanarak, ultra ince bölümleri 90 nm'de kesin.
- PBS'de %2 metil selüloz ve 2,1 M sakaroz karışımının 1:1 karışımıtungsten tel döngüleri kullanarak kesme kesitlerini alın.
- Bölümleri pioloform kaplamalı 150 örgü altıgen bakır TEM desteklerine (ızgaralara) aktarın ve 4 °C'de saklayın veya 5.4.5 adıma geçin.
- Metil asetat bir film uranyl asetat ve hava-kuru ızgaraları kontrast. Izgaraları buz gibi suyla yıkayın ve ardından 5 dk üzerinden iki damla PBS ve 15−30 dk kurulayın.
NOT: Tüm etiketleme adımları ortam sıcaklığında yapılan yıkama adımları dışında buz sıcaklığında (sıvı sıcaklık) gerçekleştirildi.
Representative Results
Isı tüm M. tüberküloz basilini inaktive eder
Kontrollerin (canlı hücrelerin) optik yoğunluğu(OD)zamanla artmış, (0.04 OD –0.85OD)ve ısı inaktive numunelerinde OD değişimi gözlenmedi, bu da büyümeyi ve büyümeyi işaret eder(Şekil 1)27. Benzer şekilde, MGIT'de kontrol klinik balgam 3. MGIT Mtb büyüme Ziehl-Neelsen yayma mikroskopisi ve antijen MPT6429tarafından doğrulandı.
İnaktive numunelerde RNA 37 °C'de 4 gün stabil
Isı inaktive örnekleri 37 °C'de, Hücrelerin ısı inaktivasyonu sonrasında RNA'nın bozulup bozulmadığını belirlemek için inkünot edildi. Her iki BCG kültüründe(Şekil 2A-C)ve TB pozitif balgamda(Şekil 2D)ısı inaktivasyonundan hemen sonra 0.gün hasat edilen RNA ile D1, 2, 3 ve 4'te izole edilen RNA arasında fark saptanmadı.
Eksojen RNase ısı inaktive fraksiyonları RNA bozulma oranını artırır
RNA'nın neden bozulmadığını belirlemek için, RNase A enzimi ısı inaktivasyonundan önce ve/veya sonra 1.000 U/mL'ye ekolarak eklenmiştir. Bu durum, 4 günlük kuluçka süresi boyunca sırasıyla 1,5 ± 0,3 - 1,8 ± 0,2 ve 1,3 ± 0,1 -log10 eCFU/mL 80 °C, 85 °C ve 95 °C'ye eşdeğer RNA kaybına neden oldu. RNa'nın ısı inaktivasyonundan önce ve/veya sonra eklendiği örneklerde rna'da bir fark vardı (Şekil 3A-C).
Referans işaretçisi olarak 16S rRNA kullanılarak TB-MBLA için yeterli RNA korunur
Isı inaktivasyonunun rRNA üzerindeki etkisi BCG kültürlerinde ve balgamda Tüberküloz pozitif hastalarda ölçüldü. Ölçülen bakteriyel kontrol yükü BCG kültürü, 5.3 ± 0.2 log10 eCFU/mL, 0.2 ± 0.1 log10 eCFU/mL,5.1 ± 0.3 log10 eCFU/mL ısı inaktive kültür (ANOVA p < 0.0001) 80 °C, 85 C ve 95 °C (4AŞekil2 )daha yüksektir . Benzer şekilde, kontrol hasta balgam, 7.1 log10 eCFU/mL bakteriyel yük, 0.8 ± 0.1 log10 eCFU / mL kombine 6.3 ± 0.41 log10eCFU/mL 80 °C, 85 °C ve 95 °C(Şekil 4B)27daha yüksek . Bakteriyel yük azaltma test edilen iki tip numunede <1log idi.
Sidak'ın çoklu karşılaştırma testi, 95 °C'deki bakteri yükü ile 80 °C ile 85 °C (p = 0.001) arasındaki önemli farkı ortaya koymuştur. Tüm sıcaklıklarda Tüberküloz örneklerinde p = 0.8'de fark saptamamaz.
Hücre duvar bütünlüğü Mtb hücrelerinin çoğunda ısı tarafından tahrip edilmez
İletim elektron mikroskobu (TEM) kullanarak hücrelerin ısı inaktivasyonu ile lysed olup olmadığını araştırdık. TEM tarafından incelenmeden önce paraformaldehit sabit hücre peletlerinin ince bölümleri yapılmış ve elektron bakımından zengin bir ortama gömülmüştür. Alt ve yüksek büyütme hücrelerinin incelenmesi bozulmamış hücre duvarı ve görünür hücre içi lipid organları ortaya. Hücreler morfolojik olarak uzamış olarak ortaya çıktılar ama düzgün değil. Şekil 5 farklı büyütmelerde mikobacterium hücrelerinin morfolojisini göstermektedir. Üst iki paneller hücre içi lipid organları ve engellenmemiş halat benzeri kablolama ortaya, micobacterium türlerintipik bir morfolojik karakteristik. Alt iki panel lipid organlarının görünümünü genişleten ve bazı mikro-hücre içi yapıları ortaya yüksek büyütme vardır.
TB-MBLA ile ölçülen bakteriyel yük, MGIT kültür zamanı ile pozitiflik ile ters orantılıdır
Tedaviye yanıt veren hastalar için, bakteriyel yük tedavi süresince haftada ortalama 1 günlük10 eCFU/mL'ye düşer. Hızlı yanıt layıcılar daha hızlı temizler ve 2 haftalık tedavi ile negatife (sıfır bakteriyel yük) dönüşür. TB-MBLA ile ölçülen bakteriyel yükteki düşüş, MGIT kültür süresinin pozitifliğe (TTP) yükselmesine karşılık gelmektedir. Şekil 6 bakteriyel yük ile MGIT TTP arasında bulunan ters korelasyon göstermektedir. Ancak aradaki fark, TB-MBLA sonuçlarının 4 saat içinde mevcut olması ve sonuç lanma süresinin bakteriyel yük seviyesinden bağımsız olmasıdır. Bu mgit kültür testleri için 5-25 gün aksine. Tüberküloz olmayan bakterilerle kontaminasyon, kültür testlerinin sonuçlarını daha da tehlikeye atabilir.
Şekil 1: BCG inaktivasyonunun 80 °C (nokta desen eğrisi), 85 °C (nokta-çizgi desen eğrisi) ve 95 °C (çizgi desen eğrisi) olarak doğrulanması. Kontrol (siyah eğri) canlı (ısıtılmamış) BCG kültürü aynı büyüme ortamına aşılanmış oldu. Kontroldeki büyüme, kuluçka döneminde kültürün OD'sindeki artışla doğrulandı. Bu rakam Sabiiti ve ark.27'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 37 °C'de 4 gün (D0-D4) kuluçkaya yatırılabilen ısı inaktive numunesinde ölçülebilir RNA stabilitesi. (A), (B), ve (C) BCG kültürlerini sırasıyla 80 °C, 85 °C ve 95 °C'de inaktive gösterirler. (D) 80 °C'de inaktive edilmiş Tüberküloz balgamını gösterir. Denetim, aynı örneğin işlenmemiş (canlı) fraksiyonudur. Hata çubukları = standart sapma. Üç tekrar, dokuz kopya her koşu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: RNase A enziminin eksojen eklenmesinden sonra yüksek RNA yıkımı. (A) Isı inaktivasyonu (HI) 80 °C' de, (B) HI 85 °C' de ve (C) HI 95 °C. Hata çubukları = ortalamastandart hata. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Marker olarak 16S rRNA kullanılarak TB-MBLA bakteriyel yük ölçümü için yeterli RNA'nın korunması. (A) In vitro BCG kültürlerinden bakteriyel yük tahmini. (B) Tüberküloz pozitif balgamdan bakteriyel yük olarak tahmin edilmektedir. Hata çubukları = ortalamanın standart hatası (sırasıyla A ve B için n = 18 ve 20 çoğalır). Bu rakam Sabiiti ve ark.27'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 95 °C'de 20 dk.'da inaktivasyon dan sonra bozulmamış Mtb basilinin elektron mikrografları. TEM ile berrak sağlam hücre duvarı ve sayısal lipid cisimleri gözlendi. Üst: engellenmemiş mikobakteriyel halat benzeri kordon morfolojisi ve hücre içi lipid organları ortaya koyan bir grup hücrenin düşük büyütme görüntüleri. Alt: lipid organlarının görünümünü genişletmek ve bazı mikro-hücre içi yapıları ortaya çıkarmak için üst panellerin yüksek büyütme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Anti-TB tedavisi gören bir hastanın 12 haftalık tedavi yanıt eğrisi, Ölçülen TB-MBLA bakteriyel yük ve MGIT TTP'nin ters korelasyonunu gösterir. Hasta tedaviye yanıt verirken TTP yükselirken bakteri yükü (mavi eğri) düşer. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Ana karışım | RT pozitif reaksiyon | RT negatif reaksiyon |
| Reaksiyon başına hacim x no. reaksiyonların + 5 | Reaksiyon başına hacim x no. reaksiyonların + 5 | |
| Quantitect karışımı | 10.0 μL | 10.0 μL |
| Mtb16S astar karışımı (F + R) | 0,4 μL | 0,4 μL |
| Mtb16S sondası | 0,2 μL | 0,2 μL |
| EC astar karışımı (F + R) | 0,4 μL | 0,4 μL |
| AK soruşturması | 0,2 μL | 0,2 μL |
| RT enzimi | 0,2 μL | ------- |
| RNase ücretsiz su | 4.6 μL | 4.8 μL |
| Toplam hacim | 16 μL | 16 μL |
Tablo 1: TB-MBLA qPCR için master karışım hazırlama kılavuzu.
| Türü | MTB kanalı | AK kanalı | Yorumu |
| Örnek | Pozitif | Pozitif | Geçerli |
| Örnek | Pozitif | Negatif | Belirsiz |
| Örnek | Negatif | Pozitif | Geçerli |
| Örnek | Negatif | Negatif | Geçersiz |
| MTB + Kontrol | Pozitif | Negatif | Geçerli |
| Ekstraksiyon Kontrolü (EC) | Negatif | Pozitif | Geçerli |
| DNA kontrolü | Negatif | Negatif | Geçerli |
| Negatif Kontrol (NTC) | Negatif | Negatif | Geçerli |
Tablo 2: TB-MBLA sonuçları yorumlama kılavuzu.
Discussion
Bu makale, tüberküloz örneklerini 80 °C, 85 °C ve 95 °C'de 20 dk ısıl işlemin etkili bir şekilde inaktive ettiğini ve tb-MBLA'nın laboratuvar çalışanlarına enfeksiyon riski olmadan CL3 dışı bir tesiste yapılmasını mümkün kılabilir. Bulgular mtb25,,30ısı inaktivasyonu etkinliği bazı tezat ise önceki çalışmalarda yapılan gözlemler ilerler. Örneğin, bazı raporlar 80 °C'deısıtmanınyüksek basil yük örnekleri 25,31,3232,33'teetkili olmadığını göstermektedir. Çalışmamızda tüm balgam ve saf kültürlerin 15 mL santrifüj tüp başına 1 mL hacimde ısıtılmasını sağlayarak numunenin her bir parçasını kaynamaya maruz bırakmak için yeterli alan sağlanarak yüksek yoğunluklu inokül etkisi önlenmiştir27.
Isı inaktivasyonu ndan sonra RNA'nın korunması, TB-MBLA'nın yapılmasını mümkün kılar. Bu bulgu ısı inaktivasyonu12,,34sonra RNA korunması gösterdi iki çalışma ile aynı fikirde . Isı yalıtımlı numunelerde RNA'nın 37 °C'de 4 gün boyunca stabil olduğunu gösterdik, bu da laboratuvarların bir hafta oda sıcaklığında inaktive numuneler tutarak toplu testler yapabileceğini ima etti. Soğutma veya donma gerektiren RNA ekstraksiyon kitleri uygulayarak, oda sıcaklığında ısı inaktive numuneleri muhafaza yeteneği, hem soğuk zincir hem de Kategori 3 laboratuvarlarının kaynak sınırlı ayarlarında TB-MBLA'yı gerçekleştirmesi gereğini ortadan kaldırabilir.
1log'dan daha az bakteriyel yük, işaretleyici olarak 16S rRNA kullanılarak kaybedildi. Canlı ve ısı inaktive numunesi arasında fark olmasına rağmen, ısı inaktivasyonunda kaybedilen miktar akış aşağı sonuçlarını tehlikeye atamayacak kadar küçüktür. Artan sıcaklık, gözlenen kaybın ısıl işlemden bağımsız olduğunu ima ederek kaybedilen RNA miktarını artırmadı. Yüksek sıcaklıklarda ısıl işlem büyük olasılıkla hücre lysis neden olur, RNA RNas tarafından bozulmasına maruz. Gerçekten de, ısı inaktive fraksiyonu RNa A eksojen eklenmesi RNA bozulma oranını artırdı. Kaynama, çok esnek bir protein olduğunu ima, RNase aktivitesini azaltmadı.
Bu 1.5 günlük10 eCFU / mL ortalama RNA bozulması büyük bir kayıp olmadığını unutmayın. Bu amaçla, ısıtmanın Mtb basilinin küçük bir kısmını eşitleyerek az miktarda RNA'yı RNa'ya maruz bıraktığı varsayımında bulunmaktadır. TEM ile Mtb hücre morfolojisi ve hücre duvarlarının bütünlüğünün 95 °C'de ısıtıldıktan etkilenmediğini gösterdik. Bu önemli ölçüde RNA,35,36düşürmek için ev sahibi gibi çeşitli fizyolojik faktörler ve RNases yeterli kaynağı gerektirebilir anlamına gelir. Ayrıca, yapısal bir ribozom olmak, 16S rRNA potansiyel olarak daha az RNaseduyarlıdır 37,38. Tek bir Mtb hücresi ~ 700 ribozom/0.1 mm3 sitoplazma37içerir , hücre başına rRNA yüksek miktarlarda olduğunu ima. Böylece, RNase küçük miktarlarda daha küçük bir etkisiolabilir 38. Ribozomların yüksek sayıda varlığı duyarlılık ve düşük yük Tüberküloz hastaları tespit yeteneği açısından TB-MBLA için bir avantaj sağlar.
Tüberküloz-MBLA ile ölçülen bakteriyel yük ile MGIT kültürü TTP arasında güçlü bir korelasyon vardı. Bu bir ölçüde kültür pozitifliği sürücüsü olarak bakteriyel yük doğrular. Ancak, TB-MBLA'nın avantajı, numunede bulunan basil yükünü doğrudan ölçmesi ve tespit edilmeden önce Mtb hücre çoğalmasını gerektirmemesidir. Bu, pozitifliğe olan zamanı bakteriyel yük seviyesine ve Mtb hücre çoğalma hızına bağlı olan kültürle tezat oluşturuyor. Gelecekteki çalışmalar, ısı inaktivasyonu da dahil olmak üzere TB-MBLA iş akışını rutin klinik ortamlarda değerlendirecektir. Çalışma da pozitif negatif (yani, ısı inaktivasyonu aşağıdaki daha az bakteri olanlar) değişebilir sayısını anlamak için bakteri yükleri bir dizi örnekleri araştıracaktır.
Bakteriyel yükün moleküler olarak ölçülmesi için TB-MBLA protokolü bakteriyolojide türünün ilk türünün ilk günüdür. Bu yöntem hasta balgamından mtb basil yükünü doğrudan ölçer ve bunu yapmak için kültür gerektirmez. Bu daha hızlı yapar ve hastanın ilerleme hakkında bir klinik karar bilgilendirmek için potansiyelini artırır. Isı inaktivasyon adımı enfeksiyon riskini azaltır ve kategori 3 laboratuarı olmayan ortamlarda TB-MBLA'nın uygulanabilirliğini artırır. Numunenin ısı inaktivasyonundan sonra, TB-MBLA sonuçlarını elde etmek için üç protokol adımı vardır: RNA ekstraksiyonu, ters transkriptaz (RT)-qPCR ve qPCR sonuç analizi.
Mtb RNA'yı hasta örneğinden yalıtma etkinliği ne kadar yüksekse, sonuçların kalitesi de o kadar yüksek olur. Balgam numunesinin kalitesinin izole edilen RNA miktarını etkilediğini belirtmek önemlidir. Örneğin, tükürük balgam düşük kaliteli olarak kabul edilir ve düşük basil yükü ile ilişkili olmuştur. Bu da hastanın kaliteli balgam beklentisi için eğitilmesinin önemli olduğu anlamına gelir. Çıkarma işleminin verimliliğini değerlendirmek için, rna ekstraksiyonundan önce numuneye bir ekstraksiyon kontrolü (yani Mtb dışı hücrelerin bilinen sayısı) ekilir. Çıkarma kontrolünün alınması RNA çıkarma işleminin verimliliğini doğrular. Çıkarma denetimi alınmadıkça RNA yalıtım işlemi geçerli olamaz. Mtb'nin dirençli bir organizma olduğu göz önüne alındığında mekanik bir lisis ilerletmek sürecin önemli bir parçasıdır. Numunenin yüksek hızda homojenleştirilmesi (600 rpm) boncuk varlığında (yani, lysing matrisi) hücreleri etkili bir şekilde doğrular. Lysate saflaştırma rna ve DNA hem de içeren bir ekstre verir. DNA'nın çıkarılması RNA çıkarmanın son adımıdır. TB-MBLA, RNA'yı ölçerek uygulanabilir basilleri ölçmeyi amaçlamaktadır. Böylece, genomik DNA'nın çıkarılamaması, sonuçların DNA'dan bir sinyal alacağı anlamına gelir, bu da hücre canlılığı için iyi bir belirteç değildir6.
RT-qPCR, Mtb ve ekstraksiyon kontrolü için çift etiketli problar çalıştıran bir dublekstir. Üç adım içerir: 50 °C'de ters transkripsiyon ile 30 dk ters transkripsiyon, 95 °C'de 15 dk denatürasyon ve 94 °C ve 60 °C'de 40 döngü amplifikasyon. Problardan floresan elde edilmesi 60 °C'de (yani parça uzama aşamasında) gerçekleşir. TB-MBLA'nın belirli bir qPCR makinesi kullanılarak optimize edildiğini, bu nedenle diğer qPCR platformlarını kullanan operatörlerin ekipmanlarının koşullarını optimize etmesi gerektiğini unutmayın. DNA çıkarma nın etkinliği, RT yokluğunda numune başına tek bir reaksiyon çalıştırılarak kontrol edilir. Bu reaksiyondan elde edilen olumlu sonuç DNA'nın eksik çıkarılmasıanlamına geliyor. Yüksek miktarda DNA'ya sahip yüksek yük örnekleri, DNA'yı tamamen çıkarmak için iki kat DNase enzimi gerektirebilir. Neyse ki, yüksek basilleryük örneklerinde, az miktarda DNA'nın varlığı RNA'dan kaynaklanan sonucu etkileme olasılığı daha düşüktür. Ribozomal RNA, TB-MBLA hedef, doğal dna37iki katı miktarda oluşur. PCR'de, PCR reaktiflerini eritmek için kullanılan su olan bir şablon kontrolü (NTC), eksojen DNA veya RNA ile çapraz kontaminasyon için kontrol eder. NTC'deki olumlu bir sinyal çapraz kontaminasyon ve geçersiz kabul edilen sonucu ima eder. Bu, bu su kullanılarak oluşturulan tüm çözeltilerin atılması ve taze bir su şişesi kullanılarak yenilerinin üretilmesi gerektiği anlamına gelir. Tüm suyun kirlenmesini önlemek için PCR suyunu niçin ayrı ayrı tutmanı tavsiye edilir. PCR'nin genel verimliliğini kontrol etmek için pozitif kontrol (Mtb RNA) kullanılır.
Sonuç analizi, STANDART eğriyi kullanarak PCR Cq'ların bakteriyel yüke (yani mL başına tahmini koloni şekillendirme ünitelerine) dönüştürülmesini içerir. Standart eğrinin ayarlanması ve optimize edilmesi bu adım için çok önemlidir. Standart eğri verimliliği 0.95-1 önerilir. MTb ve ekstraksiyon kontrolü için standart eğriler, hastalar veya diğer test numuneleri makinede çalıştırılmadan önce kurulmalı ve optimize edilmelidir. Standart numuneler TB-MBLA kiti ile birlikte verilir. PCR için RNA ekstresinin on kat seyreltilmesi önerilir. Bu, mL başına nihai bakteriyel yük sonucunu elde etmek için bakteriyel yük sonucunun 10 faktörle çarpılması gerektiği anlamına gelir. 30'un üzerindeki Cq'ların TB-MBLA için negatif kabul edilir. Tedavi yanıtı üzerinde bir çıkarım yapmak için farklı zaman noktalarında ölçülen en az iki prospektif bakteriyel yük sonuçları gereklidir. Tedaviye başlamadan önce iki sonuçtan birinin temel olması kuvvetle tavsiye edilir. Ancak, hasta ya da tedavinin ortasında bakteriyel yük değerlendirmesi başlatılırsa, tedavi yanıtını değerlendirmek için ikinci bir zaman noktası bakteriyel yük ölçümü yapılmalıdır. TB-MBLA tedavi de 3 günlük bir alanda bakteriyel yük ayırt edebilirsiniz ama ideal iki bakteriyel yük ölçümleri 7 gün arayla alınan.
Protokol tedavi yanıtı için bilgilendirici kantitatif sonuçlar üretirken, hala büyük ölçüde manuel dir ve RNA ekstraksiyonu için zamanında önemli eller talep eder. Meşgul laboratuvarlarda Teknisyenler bu kez olmayabilir. RNA çıkarma ve PCR işlemlerini otomatikleştirmek için düzenlemeler devam etmektedir.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Çalışma, Avrupa ve Gelişmekte Olan Ülkeler Klinik Deneyler Ortaklığı (EDCTP) – Pan Afrika Biyomarker Genişletme programı (PanBIOME) hibeS.2011.41304.008'den gelen finansman la mümkün kılındı. Destek de Üniversitesi St Andrews Tıp Fakültesi araştırma hibe elde edildi. Bu makalenin ve TB-MBLA protokolünün görsel bir kaynak olarak yayınlanması, İskoç Finansman Konseyi ve Küresel Zorluklar Araştırma Fonu'ndan St Andrews Üniversitesi'ne yapılan fonla mümkün kılınmıştır. Klinik balgam örnekleri sağlayan Maputo Maternal hastanesi ve Mavalane Sağlık Merkezi ve klinik balgam örneklerinin ısı inaktivasyon deneylerine yardımcı olan Maputo Tuberculosis Tedavi Birimi ekibi sayesinde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat inactivation: | |||
| 15 mL Centrifuge tubes | Fisher-Scientific | 10136120 | 50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved |
| 15 mL Wire Tube rack | Fisher-Scientific | 11749128 | Other brands with similar make can be used |
| Water bath | Fisher-Scientific | 15700619 | Other brands with similar make can be used |
| RNA extraction: | |||
| Chloroform | Sigma | 372978-1L | Not necessary in other RNA extraction kit brands |
| Ethanol, absolute 99-100% | Sigma | 51976-500ML-F | Larger volume available |
| Extraction control | SOI group St Andrews | VitalbacteriaEC | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit |
| FASTRNA Pro blue Kit | MP Biomedicals | 116025050 | Supplied with lysing matrix tubes |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Qiagen, Fisherscientific can also supply same product |
| Precellys 24 homogeniser | VWR | 432-3750 | FastPrep MP Biomedicals can be used too |
| Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus | Fisher-Scientific | 15352117 | Other brands with similar capacity can be used |
| Thermomixer | Eppendorf | BLD-455-010C | Works with 1-2 mL tubes |
| TURBO DNA-free | Fisher-Scientific | AM1907M | Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures. |
| RT-qPCR: | |||
| Primers and Taqman probes | SOI group St Andrews | VitalbacteriaPP | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX. |
| QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit | Qiagen | 204845 | PCR mix plus the RT enzyme |
| RotorGene Q 5plex machine | Qiagen | 9001580 | Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc. can be used |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 mL | Qiagen | 981103 | Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed. |
| Non-heat inactivation Sample preservation materials | |||
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | 93313 | Supplied ready to use |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Many competent suppliers |
| Guanidine thiocyanate (GTC) | Promega | V2791 | Promega brand recommended for quality |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Ensures that GTC solution is free of nucleases |
| General materials (used but not specific to TB-MBLA) | |||
| 500 mL plastic containers | 734-5087 | Nalgene brand recommeded | |
| Biological waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Chemical waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Disposable gloves, chemical resistant | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-20 °C) | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-80 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fridge (0-8 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fume hood | For safe handling of toxic reagents | ||
| Laboratory scales | For accurate measurement of reagents | ||
| Measuring cylinders, plastic | To ensure accurate measurement of reagents | ||
| PCR reaction tubes | Should be suitable to the PCR instrument used | ||
| Pipettes and matching sterile filtered pipette tips, | DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended | ||
| Qiagility loading plates | Qiagen | 5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates | |
| QIAgility Pipetting Robot | Qiagen | Important for high throughput pipetting | |
| Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes | Chemical-resistant and autoclavable recommended | ||
| RNase Away (Removes RNases enzymes from working space) | Fisher Scientific | 10666421 | Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme |
| Safety goggles, chemical resistant | Fisher Scientific | Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents. | |
| Sterile Pasteur pipettes, 1.5-3 mL | Many competent suppliers | ||
| Sterile RNAse-free microtubes | 1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended | ||
| TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse | Ensure it is freshly prepared or prepared within a week | ||
| Vortex | Genie 2 brand recommended | ||
| Transmission electron microscopy | |||
| Glutaldehyde (8%) | Sigma | G7526-10ML | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| HEPES (pH 7.4, 100 mM) | Sigma | H4034-25G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Leica FCS ultracryo | Leica | Cryomicrotome for tissue sectioning | |
| Methyl cellulose | Agar Scientific | AGG6425 | Cold mounting resin |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Sigma | P6148-500G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Sucrose | Sigma | 84097-250G | Preservation and mounting medium |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | AGR1260A | Universal Electron microscopy stain |
References
- World Health Organization. END TB Global Tuberculosis Report 2017. World Health Organization. , (2017).
- World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. World Health Organization. , (2018).
- World Health Organization. TB Elimination in Low-Incidence Countries. World Health Organization. , (2014).
- Boehme, C. C., et al. diagnostic accuracy, and effectiveness of decentralised use of the Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistance: a multicentre implementation study. The Lancet. 377, 1495-1505 (2011).
- World Health Organization. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children. World Health Organization. , (2010).
- Friedrich, S. O., et al. Assessment of the sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF assay as an early sputum biomarker of response to tuberculosis treatment. The Lancet Respiratory Medicine. 1, 462-470 (2013).
- Desjardin, L. E., et al. Measurement of Sputum Mycobacterium tuberculosis Messenger RNA as a Surrogate for Response to Chemotherapy. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 160, 203-210 (1999).
- Hellyer, T. J., et al. Detection of Viable Mycobacterium tuberculosis by Reverse Transcriptase-Strand Displacement Amplification of mRNA. Journal of Clinical Microbiology. 37, 518-523 (1999).
- Honeyborne, I., et al. Molecular Bacterial Load Assay , a Culture-Free Biomarker for Rapid and Accurate Quantification of Sputum Mycobacterium tuberculosis Bacillary Load during Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).
- Li, L., et al. Sputum Mycobacterium tuberculosis mRNA as a Marker of Bacteriologic Clearance in Response to Antituberculosis Therapy. Journal of Clinical Microbiology. 48, 46-51 (2010).
- Honeyborne, I., et al. The Molecular Bacterial Load Assay Replaces Solid Culture for Measuring Early Bactericidal Response to Antituberculosis Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).
- Hellyer, T. J., Jardin, L. E. D. E. S., Hehman, G. L., Cave, M. D. Quantitative Analysis of mRNA as a Marker for Viability of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology. 37, 290-295 (1999).
- Aellen, S., Que, Y., Guignard, B., Haenni, M., Moreillon, P. Detection of Live and Antibiotic-Killed Bacteria by Quantitative Real-Time PCR of Specific Fragments of rRNA. Antimicrobial agents chemotherapy. 50, 1913-1920 (2006).
- Deutscher, M. P. Degradation of RNA in bacteria: Comparison of mRNA and stable RNA. Nucleic Acids Research. 34, 659-666 (2006).
- Gupta, R. K., Srivastava, R. Resuscitation Promoting Factors: A Family of Microbial Proteins in Survival and Resuscitation of Dormant Mycobacteria. Indian Journal of Microbiology. 52, 114-121 (2012).
- Mukamolova, G. V., Turapov, O., Malkin, J., Woltmann, G., Barer, M. R. Resuscitation-promoting factors reveal an occult population of tubercle bacilli in sputum. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 181, 174-180 (2010).
- Sheridan, G. E. C., Masters, C. I., Shallcross, J. A., Mackey, B. M. Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coliCells Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coli Cells. Applied Environment Microbiology. 64, 1313-1318 (1998).
- Honeyborne, I., et al. Molecular bacterial load assay, a culture-free biomarker for rapid and accurate quantification of sputum Mycobacterium tuberculosis bacillary load during treatment. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).
- Sabiiti, W., et al. Molecular Bacterial Load Assay: a Fast and Accurate Means for Monitoring Tuberculosis Treatment Response. BMJ Global Health. 2, 1-8 (2017).
- Gillespie, H., Stephen, S. W., Oravcova, K. Mybacterial Load Assay. Diagnostic Bacteriology. Methods and Protocols. Bishop, A. K. , Humana Press. Totowa, NJ. 89-105 (2017).
- Juffs, H., Deeth, H. Scientific Evaluation of Pasteurisation for Pathogen Reduction in Milk and Milk Products. Food Standards Australia New Zealand. , Wellington, New Zealand. (2007).
- Holmes, C. J., Degremont, A., Kubey, W. Effectiveness of Various Chemical Disinfectants versus Cleaning Combined with Heat Disinfection on Pseudomonas Biofi lm. Blood Purification. 22, 461-468 (2004).
- Chedore, P., et al. Method for inactivating and fixing unstained smear preparations of Mycobacterium tuberculosis for improved laboratory safety. Journal of Clinical Microbiology. 40, 4077-4080 (2002).
- Cardoso, C. L., et al. Survival of Tubercle Bacilli in Heat-fixed and Stained Sputum Smears. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 96, 277-280 (2001).
- Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Pathology. 55, 778-779 (2002).
- Honeyborne, I., et al. The molecular bacterial load assay replaces solid culture for measuring early bactericidal response to antituberculosis treatment. Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).
- Sabiiti, W., et al. Heat Inactivation Renders Sputum Safe and Preserves Mycobacterium tuberculosis RNA for Downstream Molecular tests. Journal of Clinical Microbiology. , 1-8 (2019).
- Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrasructure Research. 89, 65-78 (1984).
- Kumar, V. G., Urs, T. A., Ranganath, R. R. MPT 64 Antigen detection for Rapid confirmation of M. tuberculosis isolates. BMC Research Notes. 4, 79 (2011).
- Zwadyk, P., Down, J. A., Myers, N., Dey, M. S. Rendering of mycobacteria safe for molecular diagnostic studies and development of a lysis method for strand displacement amplification and PCR. Journal of Clinical Microbiology. 32, 2140-2146 (1994).
- Blackwood, K. S., et al. Viability testing of material derived from Mycobacterium tuberculosis prior to removal from a Containment Level-III Laboratory as part of a Laboratory Risk Assessment Program. BMC Infectious Diseases. 5, 3-9 (2005).
- Somerville, W., Thibert, L., Schwartzman, K., Behr, M. A. Extraction of Mycobacterium tuberculosis DNA: a Question of Contaiment. Journal of Clinical Microbiology. 43, 2996-2997 (2005).
- Bemer-Melchior, P., Drugeon, H. B. Inactivation of Mycobacterium tuberculosis for DNA typing analysis. Journal of Clinical Microbiology. 37, 2350-2351 (1999).
- McKillip, J. L., Jaykus, L. A., Drake, M. rRNA stability in heat killed and UV-irradiated enterotoxigenic Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157:H7. Journal of Appied Environmental Microbiology. 64, 4264-4268 (1998).
- Blank, A., Dekker, C. A. Ribonucleases of Human Serum, Urine, Cerebrospinal Fluid, and Leukocytes. Activity Staining following Electrophoresis in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels. Biochemistry. 20, 2261-2267 (1981).
- O'Leary, T. J. Reducing the impact of endogenous ribonucleases on reverse transcription-PCR assay systems. Clinical Chemistry. 45, 449-450 (1999).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes per 0.1 fl of cytoplasm. PLoS One. 10, 1-14 (2015).
- Yang, K., et al. Structural insights into species-specific features of the ribosome from the human pathogen Mycobacterium tuberculosis. Nucleic Acids Research. 45, 10884-10894 (2017).
