Summary
Vi beskriver en tuberkulosemolekylær bakteriell belastningsanalysetest utført etter varmeinaktivering av sputum. Varmeinaktivering gjør sputumprøver ikke-smittsomme og hindrer behovet for inneslutningsnivå 3 laboratorier for tuberkulosemolekylære tester.
Abstract
Tuberkulose er forårsaket av Mycobacterium tuberculosis (Mtb), et patogen klassifisert av FN (FN) som en farlig kategori B biologisk stoff. Av hensyn til arbeidernes sikkerhet må håndtering av alle prøver som antas å bære Mtb utføres i et inneslutningsnivå (CL) 3-laboratorium. TB molekylær bakteriell belastninganalyse (TB-MBLA) test er en omvendt transkripsjonase kvantitativ polymerase kjedereaksjon (RT-qPCR) test som kvantifiserer Mtb bacillary belastning ved hjelp av primere og dual-merkede sonder for 16S rRNA. Vi beskriver bruken av varmeinaktivering for å gjøre TB-prøver ikke-smittsomme samtidig som vi beholder RNA for TB-MBLA. En 1 ml aliquot av sputumprøven i tett lukkede 15 ml sentrifugerør kokes i 20 min ved enten 80 °C, 85 °C eller 95 °C for å deaktivere Mtb bacilli. Dyrking av varmeinaktiverte og kontroll (levende) prøver i 42 dager bekreftet dødsfallet til TB. Den inaktiverte prøven blir deretter spiked med 100 μL av ekstraksjonskontrollen og RNA ekstraheres etter standard RNA-isolasjonsprosedyre. Det ble ikke observert noen vekst i kulturer av varmebehandlede prøver. Den isolerte RNA er utsatt for sanntid RT-qPCR, som forsterker et bestemt mål i Mtb 16S rRNA genet, noe som gir resultater i form av kvantifisering sykluser (Cq). En standardkurve brukes til å oversette Cq til bakteriell belastning, eller estimertkoloniformingsenheter per ml (eCFU/ml). Det er et omvendt forhold mellom Cq og bakteriell belastning av en prøve. Begrensningen er at varmeinaktivering lyser noen celler, utsette RNA for RNases som forårsaker tap av <1 logg10eCFU/ml (dvs. <10 CFU/ml). Videre studier vil avgjøre andelen svært lav byrde pasienter som forårsaker falske negative resultater på grunn av varmeinaktivering.
Introduction
Forårsaket av Mycobacterium tuberculosis (Mtb), over 7 x 106 nye tilfeller av tuberkulose (TB) rapporteres globalt hvorav over 1 x 106 dør per år1,2. For å reversere trenden lanserte Verdens helseorganisasjon (WHO) en tre-søyle tilnærming, inkludert utvikling av effektive diagnostiske og behandlingsverktøy3. Klassifisert som et farlig biologisk stoff B av FN, krever arbeid med prøver som antas positivt for Mtb et inneslutningsnivå (CL) på 3. CL3 laboratorier er dyre å bygge og vedlikeholde. Derfor har de fleste land sentralisert tb kulturtjenester på regionalt eller nasjonalt nivå. Dette betyr at smøremikroskopi er det mest tilgjengelige diagnostiske verktøyet i de perifere helsefasilitetene.
Det er WHO godkjenning for å implementere raske molekylære tester som Xpert MTB / RIF på nivå 4 helseinstitusjoner, for det meste ligger på distriktsnivå4,5. Noen distrikter er ganske store og mindre tilgjengelige for noen mennesker. Mens gunstig, Xpert MTB / RIF fungerer ved å oppdage Mtb DNA. DNA er et stabilt molekyl som overlever lenge etter at cellene har dødd, og er dermed ikke en god standard for måling av levedyktige celler som er kritiske for overvåking av behandlingsrespons5,6. RNA-baserte analyser tilbyr et alternativ for nøyaktig måling av levedyktige celler7,,8,9,10,11,12,13. RNA finnes i forskjellige arter av varierende stabilitet: ribosomal RNA (rRNA), overføring RNA (tRNA) og messenger RNA (mRNA). Messenger RNA er forbundet med genuttrykk og dermed den mest nært forbundet med celleaktivitet og levedyktighet14. Det er viktig å merke seg at fravær av genuttrykk ikke tilsvarer celledød fordi patogener som Mtb er kjent for å eksistere i inaktive (sovende), men levedyktige tilstander15,16. Stabile RNA-arter som rRNA er derfor bedre markører for både aktive og inaktive tilstander av levedyktige celler.
Ved hjelp av Escherichia coliviste Sheridan at 16S rRNA proporsjonalt økt med bakteriell vekst målt ved kolonidannende enheter (CFU) teller17. Det var en samtidig nedgang i CFU-tellinger og 16S rRNA da E. coli-bakterier ble utsatt for antibiotika. Fallet i rRNA etter celledød var en indikator på at den kunne brukes som markør for cellelevedyktighet13,17. Tegning fra dette prinsippet, TB molekylær bakteriell belastning analyse (TB-MBLA) ble utviklet for målretting M. tuberkulose 16S rRNA å måle levedyktig TB bacillary belastning som en markør for behandlingsrespons for pasienter på anti-TB terapi11,18,19. Vi har videreutviklet og optimalisert TB-MBLA for å innlemme en cellulær ekstraksjonskontroll som reflekterer lysis av M. tuberkulose bacilli og er robust i ulike miljømiljøer20. TB-MBLA-prosedyren krever at de første trinnene i RNA-isolasjon fra Mtb utføres i et CL3-laboratorium til Mtb-cellene er helt lysed for å sikre arbeidernes sikkerhet. Det inkluderer også prøvebevaring for retrospektiv batched analyse som skal opprettholdes ved -80 °C i guanidin tiocyanat, et nivå 4 giftig stoff. For dette formål har vi brukt varme til å inaktivere Mtb og gjøre prøver trygge for TB-MBLA som skal utføres i smøremikroskopinivålaboratorier.
Bruk av varme i laboratorie- og kliniske applikasjoner har eksistert i århundrer21,,22. Imidlertid er noen mikroorganismer som Mtb vanskelig å drepe, og kortere eksponering for varme er utilstrekkelig til å drepe alle cellene23,24. En studie viste at 20 min oppvarming av TB kulturer på 80 °C drepte alle Mtb bacilli uten å ødelegge DNA som trengs for PCR25. Deretter varmes en rekke laboratorie-DNA-ekstraksjonsteknikker for tiden til 95 °C. Vi har brukt det samme prinsippet for å vise at kokende TB-prøver ved enten 80 °C, 85 °C eller 95 °C inaktiverer Mtb samtidig som det bevares tilstrekkelig RNA for tb-MBLA som skal utføres. Inaktivert kultur eller sputum kan opprettholdes i tett lukkede beholdere ved romtemperatur eller nedkjølt i 7 dager uten å redusere mengden kvantifiserbar rRNA.
TB-MBLA, som for tiden brukes som en forskningsbrukstest (RUO) er tilpasningsdyktig og har blitt brukt på forskjellige prøvetyper, inkludert sputum, lungevev og cerebral spinalvæske. Det er ennå ikke brukt på bronkial alveolær væske, blod og andre prøvetyper. Ved hjelp av sputum som prøve, resultater fra multisite evaluering i Afrika (upubliserte data) og tidligere publikasjoner18,26 viser at følsomheten til MBLA er i samsvar med mycobacterium vekst indikatorrør (MGIT) flytende kultur. TB-MBLA er imidlertid raskere, noe som gir resultater i timer i motsetning til dager eller uker med kultur, spesifikke, ikke påvirket av ikke-TB mikroorganismer i prøven, og gir et kvantitativt mål på sykdomsalvorlighetsgrad. WHO har nylig anerkjent TB-MBLA som en kandidat til å erstatte smøremikroskopi og kultur for overvåking av TB-behandling2.
I denne artikkelen beskriver vi i detalj varmeinaktivering og TB-MBLA-protokollen publisert i Sabiiti et al.27. Denne detaljerte protokollen vil gi en one-stop visuell ressurs for TB-MBLA-brukere over hele verden.
Protocol
1. Prøveforberedelse
-
Kultur
- Ved å arbeide på en ren benk eller klasse 1 hytte, høste 1 ml aliquots av eksponentiell fase Bacillus Calmette-Guérin (BCG) kultur i 15 ml plast sentrifuge rør. Lukk rørene tett.
MERK: For å behandle en hel 5 ml prøve, er det nødvendig med fem 15 ml sentrifugerør.
FORSIKTIG:Et biosikkerhetsskap er nødvendig når du arbeider med en hvilken som helst TB-kultur.
- Ved å arbeide på en ren benk eller klasse 1 hytte, høste 1 ml aliquots av eksponentiell fase Bacillus Calmette-Guérin (BCG) kultur i 15 ml plast sentrifuge rør. Lukk rørene tett.
-
Pasientsputumprøve
- Arbeider i et godt ventilert rom og iført en nesemaske, åpne forsiktig prøvekoppen, pipette 1 ml aliquots i 15 ml plastsentrifugerør og tett lukk rørene.
MERK: En bred munn spiss anbefales å pipette sputum. Ved hjelp av en saks, klipp av den fine delen av 1 ml tips munnen for å skape en bredere munn.
- Arbeider i et godt ventilert rom og iført en nesemaske, åpne forsiktig prøvekoppen, pipette 1 ml aliquots i 15 ml plastsentrifugerør og tett lukk rørene.
2. Varmeinaktivering
- Før prøveforberedelse, sett vannbadet til 95 °C.
MERK: Temperaturen på 95 °C øker sjansen for å redusere RNase-aktiviteten og dermed bevare mer RNA for nedstrøms TB-MBLA. - Overfør prøverørene til et holdestativ nedsenket i vannbadet. Sørg for at tre fjerdedeler av hvert prøverør er nedsenket i vannet.
- Kok ved 95 °C i 20 min, og overfør deretter rørene til benken for å avkjøles ved romtemperatur i 5 min før du starter RNA-ekstraksjonen.
MERK: Fullstendig varmeinaktivering av M. tuberkulose bacilli og BCG ble verifisert ved å inkubere varmeinaktiverte prøver og kontroller ved 37 °C i 42 dager for å verifisere veksten. En optisk tetthetsmåling ved 600 nm (OD600)ble tatt ved baseline og deretter ukentlig for 42 dagers inkubasjonsperiode.
3. RNA-ekstraksjon
MERK: RNA-ekstraksjonsprosessen som er beskrevet her, er for RNA-settet som er oppført i materialtabellen. Andre egnede RNA-ekstraksjonssett fra forskjellige produsenter kan brukes.
- Ekstraksjonskontroll (EC) tillegg
- Overfør 1 ml aliquots av varmeinaktiverte prøver til 1,5 ml rør. Spike 100 μL av EC i hver prøve, lukk røret og bland ved å invertere røret opp ned 3x.
MERK: EC leveres med TB-MBLA vitale bakteriesett (Materialtabell).
- Overfør 1 ml aliquots av varmeinaktiverte prøver til 1,5 ml rør. Spike 100 μL av EC i hver prøve, lukk røret og bland ved å invertere røret opp ned 3x.
- Cellesedimentering
- Ved hjelp av en mikrocentrifuge på benkeplaten, sentrifugerrørrørene ved 20 000 x g i 10 min ved romtemperatur. Pipette av supernatant, forlater 50 μL av sediment.
- Suspender sedimentet i 950 μL lysisbuffer ved å pipe opp og ned, og overfør hele suspensjonen til lysing matriserøret som følger med RNA-ekstraksjonssettet (Materialtabellen). Pass på at rørene er tett lukket og merker både lokket og siden av røret.
- For cellelysis, overfør rørene fra trinn 3.2.2 til en homogenisator. Homogeniserprøvene for 40 s ved 6000 o/min.
- Rensing av nukleinsyre
- Sentrifugerlysatet fra trinn 3,3 ved 12 000 x g i 5 min ved romtemperatur.
- Forbered friske 1 ml rør og tilsett 300 μL kloroform i hvert rør.
- Bruk en 1 ml spiss forsiktig pipette av supernatant uten å berøre lysing matrisen.
- Overfør supernatanten til kloroformen som inneholder rør og vortex i 5 s. La røret bosette seg i 5 min eller lenger til tre faser (øvre, midtre og nedre) er godt synlige.
- Sentrifuge på 12.000 x g i 5 min ved romtemperatur. Pipetter forsiktig den øvre fasen og overfør til friske 1,5 ml rør.
- Til rørene i trinn 3,4,5, tilsett 500 μL iskald 100% etanol, lukk rørene og bland ved å forsiktig invertere opp ned 3x. Inkuber rørene ved -80 °C i 15 min eller -20 °C i 30 min og fortsett utvinningen, eller la det stå ved -20 °C over natten for å fullføre utvinningen neste dag.
- Sett mikrocentrifugen til 4 °C og la den avkjøles til minst 12 °C før du veder sentrifugering. Legg rørene inn i mikrocentrifuge og sentrifuge i 20 min ved 13 000 x g. Kast supernatanten, erstatt med 70% iskald etanol og sentrifuge i ytterligere 10 min ved 13.000 x g.
MERK: Den 70% etanol bør gjøres med molekylær karakter nuclease fritt vann. - Kast all supernatanten fra trinn 3.4.7 og overfør rørene til en inkubator satt til 50 °C. Inkuber i 20 min for å tørke RNA/DNA-pelleten. Hold rørene delvis åpne for å muliggjøre fordampning av all etanol.
- Tilsett 100 μL nukleosefritt vann til den tørre pelleten og inkuber i 5 min ved romtemperatur. Vortex i 3 s for å blande innholdet.
MERK: På dette stadiet kan ekstraktet oppbevares 2-3 dager i kjøleskapet eller lenger ved -80 °C til pkt. 3.5 utføres.
- DNA-fjerning
MERK: Dette trinnet er avgjørende fordi tilstedeværelsen av DNA i ekstraktet ugyldiggjør MBLA-resultatet. Denne delen er basert på et DNA-fjerningssett (Materialtabellen).- Forbered en blanding av enzymet DNase I 10x buffer og DNase I-enzymet for antall prøver (10 μL buffer og 1 μL DNase per prøve) pluss 10% ekstra for å dekke eventuelle tap av pipettering. Bland ved å virvle og deretter pipette 11 μL i hvert rør som inneholder RNA-ekstraktet.
- Bland ved å vortexing 3 s og deretter spinne kort (10 s på 13.000 x g)for å fjerne eventuelle dråper på veggene. Inkuber ved 37 °C i 30 min i varmeblokken eller inkubatoren. Tilsett ytterligere 1 μL DNase I-enzymet direkte i hvert rør, bland godt ved virvlende, og inkuber i ytterligere 30 min ved 37 °C.
- Tin DNase inaktiveringsreagens 10 min før slutten av DNase inkubasjonen. Vortex 20 s for å sikre en homogen, melkeaktig suspensjon og tilsett deretter 10 μL DNase inaktiveringsreagens i hver RNA-ekstrakt fra trinn 3.5.2.
- Inkuber blandingen ved romtemperatur i 5 min. Vortex 3x under 5 min inkubasjonstrinn.
- Sentrifuge blandingen på 13.000 x g i 2 min. Overfør supernatanten forsiktig til 1,5 ml RNase frie rør uten å berøre noen av inaktiveringsmatrisen.
- Oppbevar RNA-ekstraktet i kjøleskapet hvis du kjører RT-qPCR på samme dag eller ved -80 °C for langtidslagring.
4. Omvendt transkripsjonase qPCR
- For ukjente prøver fortynner du alle RNA-ekstrakter som skal brukes i et 1:10-forhold i RNase fritt vann. Bland godt ved å vortexing for 5 s og kort spinne ned for å fjerne eventuelle dråper eller luftbobler.
- For standardprøver for en standardkurve, ta Mtb- og EC RNA-standardene fra fryseren -80 °C og tin ved romtemperatur. Lag syv og seks 10-fold fortynninger av mtb og EC standard prøver henholdsvis. Endre tipsene før du overfører blandingen fra ett rør til et annet.
MERK: Standardprøver leveres med TB-MBLA-settet. -
Forberedelse av masterblanding
MERK: Master mix (MM) er en løsning av PCR-reagenser som er tilstrekkelige til å forsterke alle prøver, standarder og vann for en ingen malkontroll (NTC). Vannet som brukes som NTC bør være det samme vannet som brukes i ekstraksjonen og for å forberede MM. Sørg for at standardene, hver RNA-prøve og desimalfortynning forsterkes 2x for omvendt transkripsjonspositiv (RT+) reaksjon og 1x for omvendt transkripsjonsnegativ (RT-) reaksjon. RT-reaksjonen er en kontroll for å bestemme effektiviteten av DNA-fjerning (Tabell 1).- Overfør 16 μL MM til hvert PCR-reaksjonsrør.
- Tilsett 4 μL RNA-ekstrakt i hvert RT+ og RT-reaksjonsrør og vann i NTC-reaksjonsrørene.
- Legg reaksjonsrørene i en PCR-maskin i sanntid og sett PCR-forholdene slik: 50 °C i 30 min, 95 °C i 15 min, 40x sykluser ved 94 °C i 45 s og 60 °C i 1 min med oppkjøp med fluoroforforer som absorberer i grønne og gule kanaler.
MERK: Den grønne kanalen er Mtb deteksjon fluorophore og den gule er ekstraksjonskontroll deteksjon fluorophore.
-
Resultattolkning
MERK: Kontroller at de dupliserte reaksjonene i samme prøve ikke er forskjellige med mer enn 1 standardavvik. Mtb og EC Cq verdier høyere enn 30 anses negative. Se ytterligere tolkningsdetaljer i tabell 2.- For å tolke behandlingsresponsen, konverter Cq-verdiene til bakteriell belastning (eCFU/ml) ved hjelp av standardkurven. Les behandlingsresponsen som endring i bakteriell belastning over behandlingsoppfølgingsperioden.
MERK: Fallet i bakteriell belastning etter behandling betyr en positiv respons (dvs. anti-TB-legemidler som dreper TB-bakteriene) mens ingen endring eller økning i bakteriell belastning innebærer en negativ respons, noe som kan bety resistens av TB-bakterier mot anti-TB-legemidler eller pasienten som ikke er hensiktsmessig å følge behandlingsdosen. Fallet i bakteriebelastning målt ved TB-MBLA korrelerer med økningen i MGIT tid til kulturpositivitet (TTP).
- For å tolke behandlingsresponsen, konverter Cq-verdiene til bakteriell belastning (eCFU/ml) ved hjelp av standardkurven. Les behandlingsresponsen som endring i bakteriell belastning over behandlingsoppfølgingsperioden.
5. Overføring Elektron Mikroskopi
- Overfør 2 ml aliquots av varmeinaktiverte kulturer og kontroller til 2 ml mikrocentrifugerør. Sentrifuge i 10 min ved 20.000 x g.
- Kast supernatanten og suspender pelleten i 700 μL cellefikseringsbuffer og inkuber ved romtemperatur i 5 min for å fikse cellene.
- Sentrifugeringen i 30 min ved 16 000 x g for å få en hard pellet. Kast supernatanten og skift ut med 1 % sukrose i fosfatbufret saltvann (PBS). Oppbevar pellets i sukrose ved 4 °C til snitting for elektronmikroskopi.
-
Snitting og TEM
MERK: Protokollen nedenfor er tilpasset fra Griffiths et al.28.- Cryoprotect cellen pellet ved å bygge den inn i 2,1 M sukrose i PBS over natten ved 4 °C. Vask 3x med iskaldt vann.
- Kjøl kryobeskyttede cellepellets i flytende nitrogen og monter dem kryomikrotomi. Bruk kryomikrotomen til å kutte ultratynne seksjoner på 90 nm.
- Hent snittene ved hjelp av wolframtrådløkkene på 1:1-blandingen av 2% metylcellulose og 2,1 M sukrose i PBS.
- Overfør seksjonene til pioloform belagt 150 mesh sekskantet kobber TEM støtter (rutenett) og lagre ved 4 °C eller fortsett til trinn 5.4.5.
- Sammenlign rutenettene i uranylacetat og lufttørk i en film av metylacetat. Vask gittermed iskaldt vann etterfulgt av to dråper PBS over 5 min og tørk i 15-30 min. Undersøk seksjonene under TEM etter produsentens retningslinjer.
MERK: Alle merkingstrinn ble utført ved istemperatur (væsketemperatur) med unntak av vasketrinnene, som ble utført ved omgivelsestemperatur.
Representative Results
Varme inaktiverer alle M. tuberkulose bacilli
Den optiske tettheten (OD) av kontroller (levende celler) økte over tid, (0,04OD–0,85OD)og ingen OD-endring ble observert i varmeinaktiverte prøver, noe som betyr vekst og ingen vekst henholdsvis (Figur 1)27. På samme måte ble kontrollklinisk sputum positivt ved dag 3 i MGIT, mens varmeinaktiverte kliniske prøver ikke flagget positivt før inkubasjonen var over. Veksten av Mtb i MGIT ble bekreftet av Ziehl-Neelsen smøre mikroskopi og antigen ETMPT6429.
RNA i inaktiverte prøver er stabil ved 37 °C i 4 dager
Varmeinaktiverte prøver ble inkubert ved 37 °C for å avgjøre om RNA forringer etter varmeinaktivering av celler. Det ble ikke funnet noen forskjell mellom RNA høstet på dag (D) 0 umiddelbart etter varmeinaktivering og RNA isolert ved D1, 2, 3 og 4 i begge BCG-kulturer (Figur 2A-C) og TB positiv sputum (Figur 2D).
Eksogene RNase øker frekvensen av RNA-nedbrytning i varmeinaktiverte fraksjoner
For å finne ut hvorfor RNA ikke var nedverdigende, ble RNase A-enzymet eksogene tilsatt ved 1000 E/ml før og/eller etter varmeinaktivering. Dette førte til at RNA-tap tilsvarende bakteriebelastning 1,5 ± 0,3 -, 1,8 ± 0,2 -og 1,3 ± 0,1 – logg10 eCFU/ml ved henholdsvis 80 °C, 85 °C og 95 °C over 4 dager med inkubasjon. Det var forskjell i RNA degradert i prøver der RNase ble lagt til før og/eller etter varmeinaktivering (figur 3A-C).
Tilstrekkelig RNA er bevart for TB-MBLA ved bruk av 16S rRNA som referansemarkør
Effekten av varmeinaktivering på rRNA ble målt i BCG kulturer og sputum fra TB positive pasienter. Den målte bakterielle kontrolllasten BCG-kulturen, 5,3 ± 0,2 log10 eCFU/ml, var 0,2 ± 0,1 log10 eCFU/ml høyere enn den kombinerte 5,1 ± 0,3 log10 eCFU/ml varmeinaktivert kultur (ANOVA p < 0,0001) ved 80 °C, 85 °C og 95 °C (4A7) . Tilsvarende var bakteriebelastningen av kontroll pasientsputum, 7,1 log10 eCFU/ml, 0,8 ± 0,1 log10 eCFU/ml høyere enn den kombinerte 6,3 ± 0,41 log10eCFU/ml ved 80 °C, 85 °C og 95 °C (figur 4B)27. Bakterielastreduksjonen var <1log i de to prøvetypene som ble testet.
Sidaks test for flere sammenligninger viste en signifikant forskjell mellom bakteriebelastningen ved 95 °C sammenlignet med 80 °C og 85 °C (p = 0,001). Det ble ikke funnet noen forskjell i TB-prøver ved alle temperaturer, p = 0,8.
Cell vegg integritet er ikke ødelagt av varme i de fleste Mtb celler
Ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM) undersøkte vi om celler ble lysed av varmeinaktivering. Tynne deler av paraformaldehyd faste pellets av celler ble laget og innebygd i et elektronrikt medium før undersøkelse av TEM. Inspeksjon av cellene ved lavere og høyere forstørrelse avslørte intakt cellevegg og synlige intracellulære lipidlegemer. Celler morfologisk dukket opp langstrakt, men ikke lysed. Figur 5 illustrerer morfologien til mycobacterium-celler ved forskjellige forstørrelser. De to øverste panelene avslører intracellulære lipidlegemer og den uhemmet taulignende ledningen, en morfologisk egenskap som er typisk for mycobacterium arter. De nedre to panelene er høyere forstørrelse utvide utsikten over lipid organer og avsløre noen mikro-intracellulære strukturer.
Bakteriell belastning målt ved TB-MBLA er omvendt korrelert til MGIT kultur tid til positivitet
For pasienter som responderer på behandling, faller bakteriebelastningen med gjennomsnittlig 1 logg10 eCFU/ml per uke i løpet av behandlingen. Raske respondere fjerner raskere, og konverterer til negativ (null bakteriell belastning) med 2 ukers behandling. Fallet i bakteriebelastning målt ved TB-MBLA tilsvarte økningen i MGIT-kulturtid til positivitet (TTP). Figur 6 viser den inverse korrelasjonen mellom bakteriell belastning og MGIT TTP. Forskjellen er imidlertid at TB-MBLA-resultatene er tilgjengelige i 4 timer og tid-til-resultat er uavhengig av nivået av bakteriell belastning. Dette står i kontrast til 5–25 dager for MGIT-kulturtester. Kontaminering med ikke-TB-bakterier ytterligere kompromittere resultatene fra kulturtester.
Figur 1: Verifisering av BCG-inaktivering ved 80 °C (punktmønsterkurve), 85 °C (mønsterkurve for prikk-dash) og 95 °C (dashbordmønsterkurve). Kontrollen (svart kurve) ble levende (uoppvarmet) BCG kultur inokulert til samme vekst medium. Veksten i kontrollen ble bekreftet av økningen i OD av kulturen over inkubasjonsperioden. Dette tallet ble endret fra Sabiiti et al.27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Stabilitet av kvantifiserbar RNA i varmeinaktivert prøve inkubert ved 37 °C i 4 dager (D0–D4). (A), (B) og (C) viser BCG kulturer inaktivert ved 80 °C, 85 °C og 95 °C. (D) viser TB-sputumet inaktivert ved 80 °C. Kontrollen er den ubehandlede (levende) fraksjonen av samme prøve. Feilfelt = standardavvik. Tre repetisjoner, ni repliker per løp. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Høyere RNA-nedbrytning etter eksogene tilsetning av RNase A-enzymet. (A) Varmeinaktivering (HI) ved 80 °C, (B) HI ved 85 °C og (C) HI 95 °C. Feilfelt = standardfeil for gjennomsnittet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Bevaring av tilstrekkelig RNA for TB-MBLA bakteriell belastningsmåling ved hjelp av 16S rRNA som markør. (A) Bakteriell belastning estimert fra in vitro BCG kulturer. (B) Bakteriell belastning anslått fra tuberkulose positiv sputum. Feilfelt = standardfeil for gjennomsnittet (n = henholdsvis 18 og 20 replikater for henholdsvis A og B). Dette tallet ble endret fra Sabiiti et al.27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Elektronmikrografer av intakt Mtb bacilli etter inaktivering ved 95 °C i 20 min. Klar intakt cellevegg og opplisting av lipidlegemer ble observert med TEM. Topp: lav forstørrelse bilder av en gruppe celler som avslører uhemmet mykobakteriell tau-lignende cording morfologi og intracellulære lipid organer. Bunn: høy forstørrelse av de øverste panelene for å utvide visningen av lipidlegemer og avsløre noen mikro-intracellulære strukturer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: 12 ukers behandlingsresponskurve hos en pasient ved anti-TB-behandling som viser en omvendt korrelasjon av TB-MBLA målt bakteriell belastning og MGIT TTP. Bakteriebelastningen (blå kurve) faller mens TTP stiger (rød kurve) mens pasienten reagerer på behandlingen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Master mix | RT positiv reaksjon | RT negativ reaksjon |
| Volum per reaksjon x nr. reaksjoner + 5 | Volum per reaksjon x nr. reaksjoner + 5 | |
| Mengdeblanding | 10,0 μL | 10,0 μL |
| Mtb16S primer mix (F + R) | 0,4 μL | 0,4 μL |
| Mtb16S-sonde | 0,2 μL | 0,2 μL |
| EC primer blanding (F + R) | 0,4 μL | 0,4 μL |
| EC-sonde | 0,2 μL | 0,2 μL |
| RT-enzym | 0,2 μL | ------- |
| RNase fritt vann | 4,6 μL | 4,8 μL |
| Totalt volum | 16 μL (16 μL) | 16 μL (16 μL) |
Tabell 1: Master mix forberedelse guide for TB-MBLA qPCR.
| Type | MTB-kanal | EC-kanal | Tolkning |
| Eksempel | Positive | Positive | Gyldig |
| Eksempel | Positive | Negative | Ubestemte |
| Eksempel | Negative | Positive | Gyldig |
| Eksempel | Negative | Negative | Ugyldig |
| MTB + Kontroll | Positive | Negative | Gyldig |
| Ekstraksjonskontroll (Ec) | Negative | Positive | Gyldig |
| DNA-kontroll | Negative | Negative | Gyldig |
| Negativ kontroll (NTC) | Negative | Negative | Gyldig |
Tabell 2: Tolkningsveiledning for TB-MBLA-resultater.
Discussion
Denne artikkelen viser at varmebehandling i 20 min ved 80 °C, 85 °C og 95 °C inaktiverer tuberkuloseprøver effektivt, noe som gjør det mulig for TB-MBLA å bli utført i et ikke-CL3-anlegg uten risiko for infeksjon hos laboratoriearbeidere. Funnene bekrefter observasjoner gjort i tidligere studier mens de står i kontrast til noen om effektiviteten av varmeinaktivering av Mtb25,30. For eksempel indikerer noen rapporter at oppvarming ved 80 °C ikke er effektiv på høye bacillary lastprøver25,31,32,33. Den høytetthets inoculum effekten ble unngått i vår studie ved å sikre at alle sputum og rene kulturer ble oppvarmet på en 1 ml volum per 15 ml sentrifuge rør gir tilstrekkelig plass til å utsette alle deler av prøven til koking27.
RNA-bevaring etter varmeinaktivering gjør det mulig for TB-MBLA å bli utført. Dette funnet er enig med to studier som viste RNA bevaring etter varmeinaktivering12,34. Vi viste at RNA i varmeinaktiverte prøver er stabil ved 37 °C i 4 dager, noe som tyder på at laboratorier kan batchtester ved å opprettholde inaktiverte prøver ved romtemperatur i en uke. Ved å bruke RNA-ekstraksjonssett som krever kjøling eller frysing, hindrer evnen til å opprettholde varmeinaktiverte prøver ved romtemperatur behovet for både kjølekjede og kategori 3 laboratorier for å utføre TB-MBLA i ressursbegrensede innstillinger.
Mindre enn 1log bakteriell belastning gikk tapt ved hjelp av 16S rRNA som en markør. Selv om det var forskjell på levende og varmeinaktivert prøve, er mengden tapt for varmeinaktivering for liten til å kompromittere nedstrøms resultater. Økende temperatur økte ikke mengden RNA tapt, noe som tyder på at det observerte tapet er uavhengig av varmebehandlingen. Varmebehandling ved høye temperaturer forårsaker mest sannsynlig cellelyse, utsette RNA for nedbrytning av RNases. Faktisk økte eksogene tillegg av RNase A til varmeinaktivert fraksjon frekvensen av RNA nedbrytning. Koking reduserte ikke aktiviteten til RNase, noe som antyder at det er et veldig motstandsdyktig protein.
Det er viktig å merke seg at en gjennomsnittlig RNA-nedbrytning på 1,5 log10 eCFU/ml ikke er et stort tap. For dette formål hypoteser vi at oppvarming lysers en liten andel av Mtb bacilli, og dermed utsette en liten mengde RNA til RNase. Ved hjelp av TEM viste vi at Mtb celle morfologi og integritet av celleveggene er neppe påvirket av oppvarming ved 95 °C. Dette betyr at det kan kreve ulike fysiologiske faktorer og tilstrekkelig tilførsel av RNases som i verten for å betydelig forringe RNA35,36. Videre, å være en strukturell ribosom, 16S rRNA er potensielt mindre utsatt for RNase37,38. En enkelt Mtb celle inneholder ~ 700 ribosomer / 0,1 mm3 av cytoplasma37, noe som tyder på at det er høyere mengder rRNA per celle. Dermed kan mindre mengder RNase ha en mindre innvirkning38. Eksistensen av høyt antall ribosomer gir en fordel for TB-MBLA når det gjelder følsomhet og evne til å oppdage lavbyrde TB-pasienter.
Det var en sterk sammenheng mellom bakteriell belastning målt ved TB-MBLA og MGIT kultur TTP. Dette bekrefter bakteriell belastning som driver av kulturpositivitet til en viss grad. Fordelen med TB-MBLA er imidlertid at den direkte kvantifiserer bacillary belastning som finnes i prøven og ikke krever Mtb cellespredning før deteksjon. Dette står i kontrast til kultur hvis tid til positivitet avhenger av nivået av bakteriell belastning og hastigheten på Mtb cellespredning. Fremtidige studier vil evaluere TB-MBLA-arbeidsflyten, inkludert varmeinaktivering, i rutinemessige kliniske omgivelser. Studien vil også utforske prøver med en rekke bakterielle belastninger for å forstå antallet som kan endres fra positiv til negativ (dvs. de med færre bakterier etter varmeinaktivering).
TB-MBLA-protokollen for molekylær kvantifisering av bakteriell belastning er den første av sitt slag i bakteriologi. Metoden kvantifiserer direkte Mtb bacillary belastning fra pasient sputum og krever ingen kultur for å gjøre det. Dette gjør det raskere og øker potensialet til å informere en klinisk beslutning om pasientens fremgang. Varmeinaktiveringstrinnet reduserer risikoen for infeksjon og øker anvendelsen av TB-MBLA i innstillinger som ikke har et kategori 3-laboratorium. Etter varmeinaktivering av prøven er det tre protokolltrinn for å oppnå TB-MBLA-resultater: RNA-ekstraksjon, revers transkripsjonase (RT)-qPCR og qPCR-resultatanalyse.
Jo høyere effektivitet for å isolere Mtb RNA fra en pasientprøve, desto høyere kvalitet på resultatene. Det er viktig å merke seg at kvaliteten på sputumprøven påvirker mengden RNA isolert. For eksempel anses spyttsputum av lav kvalitet og har vært forbundet med lav bacillary belastning. Dette betyr at opplæring av pasienten for kvalitetssputumexpectorasjon er viktig. For å vurdere effektiviteten av utvinningsprosessen, er en ekstraksjonskontroll (dvs. det kjente antallet ikke-Mtb-celler) spiked inn i prøven før RNA-ekstraksjon. Henting av ekstraksjonskontrollen bekrefter effektiviteten av RNA-utvinningsprosessen. RNA-isolasjonsprosessen kan ikke være gyldig med mindre ekstraksjonskontrollen er hentet. Gitt det faktum at Mtb er en spenstig organisme gjør mekanisk lysis en avgjørende del av prosessen. Homogenisering av prøven ved høy hastighet (600 rpm) i nærvær av perler (dvs. lysing matrise) effektivt lyser cellene. Rensing av lysatgir et ekstrakt som inneholder både RNA og DNA. Fjerning av DNA er et avgjørende siste trinn i RNA-utvinningen. TB-MBLA har som mål å måle levedyktig bacilli ved å kvantifisere RNA. Dermed betyr unnlatelse av å fjerne genomisk DNA at resultatene vil ha et signal fra DNA, som ikke er en god markør for cellelevedyktighet6.
RT-qPCR er en tosidig kjøring av doble merkede sonder for Mtb og ekstraksjonskontroll. Det innebærer tre trinn: 30 min omvendt transkripsjon ved omvendt transkripsjon ved 50 °C, 15 min denaturering ved 95 °C og 40 sykluser med forsterkning ved 94 °C og 60 °C. Oppkjøp av fluorescens fra sondene skjer ved 60 °C (dvs. fragmentforlengelsesstadiet). Det er viktig å merke seg at TB-MBLA er optimalisert ved hjelp av en bestemt qPCR-maskin, slik at operatører som bruker andre qPCR-plattformer, bør optimalisere betingelsene for utstyret sitt. Effektiviteten av DNA-fjerning styres ved å kjøre en enkelt reaksjon per prøve i fravær av RT. Et positivt resultat fra denne reaksjonen betyr ufullstendig fjerning av DNA. Høye byrdeprøver som har store mengder DNA kan kreve dobbelt så mye mengde DNase-enzym for å fjerne DNA fullstendig. Heldigvis, i høye bacillary lastprøver, er tilstedeværelsen av små mengder DNA mindre sannsynlig å påvirke resultatet fra RNA. Ribosomal RNA, TB-MBLA-målet, forekommer naturlig i dobbelt så stor mengde DNA37. I PCR, en ingen mal kontroll (NTC), som er vannet som brukes til å oppløse PCR reagenser, kontroller for krysskontaminering med eksogene DNA eller RNA. Et positivt signal i NTC innebærer krysskontaminering og resultatet anses som ugyldig. Dette betyr at alle løsninger som utgjorde bruk av dette vannet må kastes og nye må gjøres ved hjelp av et friskt hetteglass med vann. Det anbefales å holde PCR vann i separate aliquots for å unngå forurensning av alt vannet. En positiv kontroll (Mtb RNA) brukes til å kontrollere for den generelle effektiviteten til PCR.
Resultatanalyse innebærer konvertering av PCR Cqs til bakteriell belastning (dvs. de estimerte kolonidannende enhetene per ml) ved hjelp av standardkurven. Innstilling og optimalisering av standardkurven er avgjørende for dette trinnet. En standard kurveeffektivitet på 0,95–1 anbefales. Standardkurver for MTb og ekstraksjonskontroll bør settes opp og optimaliseres før pasienter eller andre testprøver kjøres på maskinen. Standardprøver følger med TB-MBLA-settet. En tigangers fortynning av RNA-ekstraktet anbefales for PCR. Dette innebærer at bakterielastresultatet må multipliseres med en faktor på 10 for å oppnå det endelige bakterielastresultatet per ml. Det er viktig å merke seg at Cqs over 30 anses som negative for TB-MBLA. Minst to potensielle bakterielle belastningsresultater målt på forskjellige tidspunkter er nødvendig for å gjøre en slutning på behandlingsrespons. Det anbefales sterkt at ett av de to resultatene bør være baseline, før behandlingsstart. Men hvis pasienten initierte bakteriell belastningsvurdering oppstår midtveis gjennom behandlingen, må det være en andre gangspunkt bakteriell belastningsmåling for å evaluere behandlingsresponsen. TB-MBLA kan skille bakteriell belastning i et rom på 3 dager på behandling, men idealet er to bakterielle belastningsmålinger tatt 7 dager fra hverandre.
Selv om protokollen genererer informative kvantitative resultater for behandlingsrespons, er den fortsatt i stor grad manuell og krever betydelige hender i tide for RNA-ekstraksjon. Teknikere i travle laboratorier har kanskje ikke denne gangen. Det pågår ordninger for å automatisere RNA-ekstraksjonen og PCR-prosessene.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Studien ble gjort mulig ved finansiering fra European and Developing Countries Clinical Trials Partnership (EDCTP) – Pan African Biomarker Expansion program (PanBIOME) grant SP.2011.41304.008. Støtte ble også innhentet University of St Andrews School of Medicine forskningsstipend. Utgivelsen av dette manuskriptet og TB-MBLA-protokollen som en visuell ressurs har blitt gjort mulig ved finansiering fra Scottish Funding Council og Global Challenges Research Fund til University of St Andrews. Takket være Maputo Maternal sykehus og Mavalane Health Centre som ga de kliniske sputumprøvene, og Maputo Tuberculosis Treatment Unit-teamet som hjalp til med varmeinaktiveringsforsøkene til kliniske sputumprøver.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat inactivation: | |||
| 15 mL Centrifuge tubes | Fisher-Scientific | 10136120 | 50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved |
| 15 mL Wire Tube rack | Fisher-Scientific | 11749128 | Other brands with similar make can be used |
| Water bath | Fisher-Scientific | 15700619 | Other brands with similar make can be used |
| RNA extraction: | |||
| Chloroform | Sigma | 372978-1L | Not necessary in other RNA extraction kit brands |
| Ethanol, absolute 99-100% | Sigma | 51976-500ML-F | Larger volume available |
| Extraction control | SOI group St Andrews | VitalbacteriaEC | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit |
| FASTRNA Pro blue Kit | MP Biomedicals | 116025050 | Supplied with lysing matrix tubes |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Qiagen, Fisherscientific can also supply same product |
| Precellys 24 homogeniser | VWR | 432-3750 | FastPrep MP Biomedicals can be used too |
| Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus | Fisher-Scientific | 15352117 | Other brands with similar capacity can be used |
| Thermomixer | Eppendorf | BLD-455-010C | Works with 1-2 mL tubes |
| TURBO DNA-free | Fisher-Scientific | AM1907M | Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures. |
| RT-qPCR: | |||
| Primers and Taqman probes | SOI group St Andrews | VitalbacteriaPP | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX. |
| QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit | Qiagen | 204845 | PCR mix plus the RT enzyme |
| RotorGene Q 5plex machine | Qiagen | 9001580 | Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc. can be used |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 mL | Qiagen | 981103 | Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed. |
| Non-heat inactivation Sample preservation materials | |||
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | 93313 | Supplied ready to use |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Many competent suppliers |
| Guanidine thiocyanate (GTC) | Promega | V2791 | Promega brand recommended for quality |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Ensures that GTC solution is free of nucleases |
| General materials (used but not specific to TB-MBLA) | |||
| 500 mL plastic containers | 734-5087 | Nalgene brand recommeded | |
| Biological waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Chemical waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Disposable gloves, chemical resistant | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-20 °C) | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-80 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fridge (0-8 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fume hood | For safe handling of toxic reagents | ||
| Laboratory scales | For accurate measurement of reagents | ||
| Measuring cylinders, plastic | To ensure accurate measurement of reagents | ||
| PCR reaction tubes | Should be suitable to the PCR instrument used | ||
| Pipettes and matching sterile filtered pipette tips, | DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended | ||
| Qiagility loading plates | Qiagen | 5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates | |
| QIAgility Pipetting Robot | Qiagen | Important for high throughput pipetting | |
| Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes | Chemical-resistant and autoclavable recommended | ||
| RNase Away (Removes RNases enzymes from working space) | Fisher Scientific | 10666421 | Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme |
| Safety goggles, chemical resistant | Fisher Scientific | Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents. | |
| Sterile Pasteur pipettes, 1.5-3 mL | Many competent suppliers | ||
| Sterile RNAse-free microtubes | 1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended | ||
| TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse | Ensure it is freshly prepared or prepared within a week | ||
| Vortex | Genie 2 brand recommended | ||
| Transmission electron microscopy | |||
| Glutaldehyde (8%) | Sigma | G7526-10ML | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| HEPES (pH 7.4, 100 mM) | Sigma | H4034-25G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Leica FCS ultracryo | Leica | Cryomicrotome for tissue sectioning | |
| Methyl cellulose | Agar Scientific | AGG6425 | Cold mounting resin |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Sigma | P6148-500G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Sucrose | Sigma | 84097-250G | Preservation and mounting medium |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | AGR1260A | Universal Electron microscopy stain |
References
- World Health Organization. END TB Global Tuberculosis Report 2017. World Health Organization. , (2017).
- World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. World Health Organization. , (2018).
- World Health Organization. TB Elimination in Low-Incidence Countries. World Health Organization. , (2014).
- Boehme, C. C., et al. diagnostic accuracy, and effectiveness of decentralised use of the Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistance: a multicentre implementation study. The Lancet. 377, 1495-1505 (2011).
- World Health Organization. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children. World Health Organization. , (2010).
- Friedrich, S. O., et al. Assessment of the sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF assay as an early sputum biomarker of response to tuberculosis treatment. The Lancet Respiratory Medicine. 1, 462-470 (2013).
- Desjardin, L. E., et al. Measurement of Sputum Mycobacterium tuberculosis Messenger RNA as a Surrogate for Response to Chemotherapy. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 160, 203-210 (1999).
- Hellyer, T. J., et al. Detection of Viable Mycobacterium tuberculosis by Reverse Transcriptase-Strand Displacement Amplification of mRNA. Journal of Clinical Microbiology. 37, 518-523 (1999).
- Honeyborne, I., et al. Molecular Bacterial Load Assay , a Culture-Free Biomarker for Rapid and Accurate Quantification of Sputum Mycobacterium tuberculosis Bacillary Load during Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).
- Li, L., et al. Sputum Mycobacterium tuberculosis mRNA as a Marker of Bacteriologic Clearance in Response to Antituberculosis Therapy. Journal of Clinical Microbiology. 48, 46-51 (2010).
- Honeyborne, I., et al. The Molecular Bacterial Load Assay Replaces Solid Culture for Measuring Early Bactericidal Response to Antituberculosis Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).
- Hellyer, T. J., Jardin, L. E. D. E. S., Hehman, G. L., Cave, M. D. Quantitative Analysis of mRNA as a Marker for Viability of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology. 37, 290-295 (1999).
- Aellen, S., Que, Y., Guignard, B., Haenni, M., Moreillon, P. Detection of Live and Antibiotic-Killed Bacteria by Quantitative Real-Time PCR of Specific Fragments of rRNA. Antimicrobial agents chemotherapy. 50, 1913-1920 (2006).
- Deutscher, M. P. Degradation of RNA in bacteria: Comparison of mRNA and stable RNA. Nucleic Acids Research. 34, 659-666 (2006).
- Gupta, R. K., Srivastava, R. Resuscitation Promoting Factors: A Family of Microbial Proteins in Survival and Resuscitation of Dormant Mycobacteria. Indian Journal of Microbiology. 52, 114-121 (2012).
- Mukamolova, G. V., Turapov, O., Malkin, J., Woltmann, G., Barer, M. R. Resuscitation-promoting factors reveal an occult population of tubercle bacilli in sputum. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 181, 174-180 (2010).
- Sheridan, G. E. C., Masters, C. I., Shallcross, J. A., Mackey, B. M. Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coliCells Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coli Cells. Applied Environment Microbiology. 64, 1313-1318 (1998).
- Honeyborne, I., et al. Molecular bacterial load assay, a culture-free biomarker for rapid and accurate quantification of sputum Mycobacterium tuberculosis bacillary load during treatment. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).
- Sabiiti, W., et al. Molecular Bacterial Load Assay: a Fast and Accurate Means for Monitoring Tuberculosis Treatment Response. BMJ Global Health. 2, 1-8 (2017).
- Gillespie, H., Stephen, S. W., Oravcova, K. Mybacterial Load Assay. Diagnostic Bacteriology. Methods and Protocols. Bishop, A. K. , Humana Press. Totowa, NJ. 89-105 (2017).
- Juffs, H., Deeth, H. Scientific Evaluation of Pasteurisation for Pathogen Reduction in Milk and Milk Products. Food Standards Australia New Zealand. , Wellington, New Zealand. (2007).
- Holmes, C. J., Degremont, A., Kubey, W. Effectiveness of Various Chemical Disinfectants versus Cleaning Combined with Heat Disinfection on Pseudomonas Biofi lm. Blood Purification. 22, 461-468 (2004).
- Chedore, P., et al. Method for inactivating and fixing unstained smear preparations of Mycobacterium tuberculosis for improved laboratory safety. Journal of Clinical Microbiology. 40, 4077-4080 (2002).
- Cardoso, C. L., et al. Survival of Tubercle Bacilli in Heat-fixed and Stained Sputum Smears. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 96, 277-280 (2001).
- Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Pathology. 55, 778-779 (2002).
- Honeyborne, I., et al. The molecular bacterial load assay replaces solid culture for measuring early bactericidal response to antituberculosis treatment. Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).
- Sabiiti, W., et al. Heat Inactivation Renders Sputum Safe and Preserves Mycobacterium tuberculosis RNA for Downstream Molecular tests. Journal of Clinical Microbiology. , 1-8 (2019).
- Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrasructure Research. 89, 65-78 (1984).
- Kumar, V. G., Urs, T. A., Ranganath, R. R. MPT 64 Antigen detection for Rapid confirmation of M. tuberculosis isolates. BMC Research Notes. 4, 79 (2011).
- Zwadyk, P., Down, J. A., Myers, N., Dey, M. S. Rendering of mycobacteria safe for molecular diagnostic studies and development of a lysis method for strand displacement amplification and PCR. Journal of Clinical Microbiology. 32, 2140-2146 (1994).
- Blackwood, K. S., et al. Viability testing of material derived from Mycobacterium tuberculosis prior to removal from a Containment Level-III Laboratory as part of a Laboratory Risk Assessment Program. BMC Infectious Diseases. 5, 3-9 (2005).
- Somerville, W., Thibert, L., Schwartzman, K., Behr, M. A. Extraction of Mycobacterium tuberculosis DNA: a Question of Contaiment. Journal of Clinical Microbiology. 43, 2996-2997 (2005).
- Bemer-Melchior, P., Drugeon, H. B. Inactivation of Mycobacterium tuberculosis for DNA typing analysis. Journal of Clinical Microbiology. 37, 2350-2351 (1999).
- McKillip, J. L., Jaykus, L. A., Drake, M. rRNA stability in heat killed and UV-irradiated enterotoxigenic Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157:H7. Journal of Appied Environmental Microbiology. 64, 4264-4268 (1998).
- Blank, A., Dekker, C. A. Ribonucleases of Human Serum, Urine, Cerebrospinal Fluid, and Leukocytes. Activity Staining following Electrophoresis in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels. Biochemistry. 20, 2261-2267 (1981).
- O'Leary, T. J. Reducing the impact of endogenous ribonucleases on reverse transcription-PCR assay systems. Clinical Chemistry. 45, 449-450 (1999).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes per 0.1 fl of cytoplasm. PLoS One. 10, 1-14 (2015).
- Yang, K., et al. Structural insights into species-specific features of the ribosome from the human pathogen Mycobacterium tuberculosis. Nucleic Acids Research. 45, 10884-10894 (2017).
