Summary
Nous décrivons un test d’essai moléculaire de charge bactérienne de la tuberculose effectué après l’inactivation de chaleur des expectorations. L’inactivation de la chaleur rend les échantillons d’expectorations non infectieux et évite la nécessité de laboratoires de confinement de niveau 3 pour les tests moléculaires de la tuberculose.
Abstract
La tuberculose est causée par Mycobacterium tuberculosis (Mtb), un agent pathogène classé par les Nations Unies (ONU) comme une substance biologique dangereuse de catégorie B. Pour des raisons de sécurité des travailleurs, la manipulation de tous les échantillons présumés porteurs de Mtb doit être effectuée dans un laboratoire de confinement (CL) 3. Le test de l’analyse de la charge bactérienne moléculaire de la tuberculose (TB-MBLA) est un test de réaction en chaîne de polymérase quantitative de transcriptase inverse (RT-qPCR) qui quantifie la charge bacillaire de Mtb à l’aide d’amorces et de sondes à double étiquette pour l’ARR 16S. Nous décrivons l’utilisation de l’inactivation de la chaleur pour rendre les échantillons de tuberculose non infectieux tout en préservant l’ARN pour la TB-MBLA. Un aliquot de 1 mL de l’échantillon d’expectoration dans des tubes de centrifugeuse étroitement fermés de 15 mL est bouilli pendant 20 min à 80 oC, soit 95 oC pour inactiver le bacille de Mtb. La culture de la chaleur inactivée et le contrôle (live) des échantillons pendant 42 jours a confirmé le décès de la tuberculose. L’échantillon inactivé est ensuite piqué avec 100 lil du contrôle d’extraction et l’ARN est extrait suivant la procédure standard d’isolement de l’ARN. Aucune croissance n’a été observée dans les cultures des échantillons traités par la chaleur. L’ARN isolé est soumis à rt-qPCR en temps réel, qui amplifie une cible spécifique dans le gène Mtb 16S rRNA, donnant des résultats sous forme de cycles de quantification (Cq). Une courbe standard est utilisée pour traduire Cq en charge bactérienne, ou des unités de formation de colonies estimées par ml (eCFU/mL). Il y a une relation inverse entre Cq et la charge bactérienne d’un échantillon. La limitation est que l’inactivation de la chaleur lyse certaines cellules, exposant l’ARN à RNases qui causent une perte de 'lt;1 journal10eCFU/mL (c.-à-d., 'lt;10 CFU/mL). D’autres études détermineront la proportion de patients à très faible charge qui causent de faux résultats négatifs en raison de l’inactivation de la chaleur.
Introduction
Causée par mycobacterium tuberculosis (Mtb), plus de 7 x 106 nouveaux cas de tuberculose (TB) sont signalés dans le monde entier dont plus de 1 x 106 meurent par an1,2. Pour inverser la tendance, l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) a lancé une approche à trois piliers comprenant le développement d’outils efficaces de diagnostic et de traitement3. Classé comme substance biologique dangereuse B par l’ONU, le travail avec des échantillons présumés positifs pour le Mtb nécessite un niveau de confinement (CL) de 3. Les laboratoires CL3 sont coûteux à construire et à entretenir. Par conséquent, la plupart des pays ont centralisé les services de culture de la tuberculose aux niveaux régional ou national. Cela signifie que la microscopie par frottis est l’outil de diagnostic le plus disponible dans les établissements de soins de santé périphériques.
Il est approuvé par l’OMS de mettre en œuvre des tests moléculaires rapides comme Xpert MTB/RIF dans les établissements de soins de santé de niveau 4, principalement situés au niveau du district4,,5. Certains districts sont assez grands et moins accessibles à certaines personnes. Bien que bénéfique, Xpert MTB/RIF agit en détectant l’ADN de Mtb. L’ADN est une molécule stable qui survit longtemps après la mort des cellules et n’est donc pas une bonne norme pour mesurer les cellules viables critiques pour surveiller la réponse du traitement5,6. Les essais à base d’ARN offrent une alternative pour la mesure précise des cellules viables7,8,9,10,11,12,13. L’ARN existe dans différentes espèces de stabilité variable : ARN ribosomal (ARR), ARN de transfert (ARN) et ARN messager (ARNm). L’ARN messager est associé à l’expression des gènes et donc au plus étroitement associé à l’activité cellulaire et à la viabilité14. Il est important de noter que l’absence d’expression génique n’est pas équivalente à la mort cellulaire parce que des agents pathogènes comme le Mtb sont connus pour exister dans les états inactifs (dormants) mais viables15,16. Les espèces stables d’ARN telles que l’ARR sont donc de meilleurs marqueurs des états actifs et inactifs des cellules viables.
Utilisant Escherichia coli, Sheridan a montré que 16S rRNA proportionnellement augmenté avec la croissance bactérienne mesurée par les unités de formation de colonies (CFU) compte17. Il y a eu une baisse simultanée du nombre d’ACF et de l’ARR 16S lorsque les bactéries E. coli ont été exposées à des antibiotiques. La chute de l’ARR après la mort cellulaire a été un indicateur qu’il pourrait être utilisé comme un marqueur pour la viabilité cellulaire13,17. S’appuyant sur ce principe, l’analyse de la charge bactérienne moléculaire de la tuberculose (TB-MBLA) a été développée pour cibler M. tuberculosis 16S rRNA afin de mesurer la charge bacillaire tuberculose viable comme marqueur de la réponse de traitement pour les patients sous traitement anti-tuberculose11,18,19. Nous avons développé et optimisé la TB-MBLA pour intégrer un contrôle d’extraction cellulaire qui reflète la lyse de M. bacilles de tuberculose et est robuste dans différents milieux environnementaux20. La procédure TB-MBLA exige que les premières étapes de l’isolement de l’ARN du Mtb soient menées dans un laboratoire CL3 jusqu’à ce que les cellules de Mtb soient complètement lysed pour assurer la sécurité des travailleurs. Il comprend également la conservation de l’échantillon pour l’analyse par lots rétrospectives à maintenir à -80 oC dans le thiocyanate de guanidine, une substance toxique de niveau 4. À cette fin, nous avons utilisé la chaleur pour inactiver le Mtb et rendre les échantillons sûrs pour la TB-MBLA à effectuer dans les laboratoires de niveau de microscopie de frottis.
L’utilisation de la chaleur dans les applications de laboratoire et cliniques a été autour pendant des siècles21,22. Cependant, certains micro-organismes comme le Mtb sont difficiles à tuer, et une exposition plus courte à la chaleur est insuffisante pour tuer toutes les cellules23,24. Une étude a révélé que 20 min de chauffage des cultures tuberculeuses à 80 oC a tué tous les bacilles de Mtb sans détruire l’ADN nécessaire pour PCR25. Par la suite, un certain nombre de techniques d’extraction d’ADN en laboratoire chauffent actuellement à 95 oC. Nous avons appliqué le même principe pour montrer que les échantillons de tuberculose bouillant à 80 oC, 85 oC ou 95 oC inactive le Mtb tout en préservant suffisamment d’ARN pour la TB-MBLA à effectuer. La culture ou l’expectoration inactivée peut être maintenue dans des contenants étroitement fermés à température ambiante ou réfrigérées pendant 7 jours sans réduire la quantité d’ARR quantifiable.
Le test TB-MBLA, actuellement utilisé comme test d’utilisation de la recherche seulement (RUO) est adaptable et a été appliqué à différents types d’échantillons, y compris les expectorations, les tissus pulmonaires et le liquide céphalo-rachidien. Il doit encore être appliqué sur le liquide alvéolaire bronchique, le sang, et d’autres types d’échantillon. En utilisant les expectorations comme échantillon, les résultats de l’évaluation multisite en Afrique (données non publiées) et les publications précédentes18,26 montrent que la sensibilité de MBLA est compatible avec la culture liquide du tube d’indicateur de croissance du mycobacterium (MGIT). Cependant, tb-MBLA est plus rapide, donnant des résultats en heures par opposition à des jours ou des semaines de culture, spécifiques, non affectés par des micro-organismes non-TB dans l’échantillon, et donne une mesure quantitative de la gravité de la maladie. L’OMS a récemment reconnu tb-MBLA comme un candidat pour remplacer la microscopie par frottis et la culture pour le suivi du traitement de la tuberculose2.
Dans cet article, nous décrivons en détail l’inactivation de la chaleur et le protocole TB-MBLA publié dans Sabiiti et al.27. Ce protocole détaillé fournira une ressource visuelle unique pour les utilisateurs de TB-MBLA à travers le monde.
Protocol
1. Préparation de l’échantillon
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Culture
- Travaillant sur un banc propre ou une cabine de classe 1, récoltez 1 mL d’aliquots de phase exponentielle Bacillus Calmette-Guérin (BCG) en tubes de centrifugeuse en plastique de 15 mL. Fermez fermement les tubes.
REMARQUE: Pour traiter un échantillon entier de 5 ml, cinq tubes de centrifugeuse de 15 ml sont nécessaires.
CAUTION: Une armoire de biosécurité est requise lorsqu’on travaille avec n’importe quelle culture de la tuberculose.
- Travaillant sur un banc propre ou une cabine de classe 1, récoltez 1 mL d’aliquots de phase exponentielle Bacillus Calmette-Guérin (BCG) en tubes de centrifugeuse en plastique de 15 mL. Fermez fermement les tubes.
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Spécimen d’expectoration patient
- Travaillant dans un espace bien ventilé et portant un masque nasal, ouvrez soigneusement la tasse de spécimen, pipette 1 mL aliquots dans des tubes de centrifugeuse en plastique de 15 ml et fermez étroitement les tubes.
REMARQUE: Une large pointe buccale est recommandée pour les crachats de pipette. À l’aide d’une paire de ciseaux, couper la partie fine de la bouche pointe de 1 mL pour créer une bouche plus large.
- Travaillant dans un espace bien ventilé et portant un masque nasal, ouvrez soigneusement la tasse de spécimen, pipette 1 mL aliquots dans des tubes de centrifugeuse en plastique de 15 ml et fermez étroitement les tubes.
2. Inactivation de la chaleur
- Avant la préparation de l’échantillon, réglez le bain d’eau à 95 oC.
REMARQUE: La température de 95 oC augmente les chances de réduire l’activité de RNase et ainsi préserver plus d’ARN pour la TB-MBLA en aval. - Transférer les tubes d’échantillon dans un support de retenue immergé dans le bain d’eau. Assurez-vous que les trois quarts de chaque tube d’échantillon sont immergés dans l’eau.
- Faire bouillir à 95 oC pendant 20 minutes, puis transférer les tubes sur le banc pour refroidir à température ambiante pendant 5 minutes avant de commencer l’extraction de l’ARN.
REMARQUE: L’inactivation complète de la chaleur des bacillis de tuberculose et du BCG a été vérifiée en incuber des échantillons et des contrôles inactivés par la chaleur à 37 oC pendant 42 jours pour vérifier la croissance. Une mesure de densité optique à 600 nm (OD600) a été prise à la ligne de base, puis chaque semaine pour la période d’incubation de 42 jours.
3. Extraction d’ARN
REMARQUE: Le processus d’extraction de l’ARN décrit ici est pour le kit d’ARN énumérés dans la Table des Matériaux. D’autres kits d’extraction d’ARN appropriés par différents fabricants peuvent être utilisés.
- Ajout de contrôle d’extraction (CE)
- Transférer 1 mL d’aliquots de la chaleur dans des tubes inactivés de 1,5 mL. Spike 100 L de l’EC dans chaque échantillon, fermer le tube, et mélanger en inversant le tube à l’envers 3x.
REMARQUE: Les CE sont fournis avec le kit de bactéries vitales TB-MBLA(Tableau des matériaux).
- Transférer 1 mL d’aliquots de la chaleur dans des tubes inactivés de 1,5 mL. Spike 100 L de l’EC dans chaque échantillon, fermer le tube, et mélanger en inversant le tube à l’envers 3x.
- Sédimentation cellulaire
- À l’aide d’une microcentrifugeuse de table, centrifuger les tubes à 20 000 x g pendant 10 minutes à température ambiante. Pipette hors du supernatant, laissant 50 L de sédiments.
- Suspendre les sédiments dans 950 L de tampon de lyse en tuyautant de haut en bas, et transférer la suspension entière dans le tube de matrice de lysing fourni avec le kit d’extraction d’ARN (Tableau des matériaux). Assurez-vous que les tubes sont bien fermés et étiquetez le couvercle et le côté du tube.
- Pour la lyse cellulaire, transférer les tubes de l’étape 3.2.2 à un homogénéisateur. Homogénéiser les échantillons pour 40 s à 6.000 tr/min.
- Purification de l’acide nucléique
- Centrifuge le lysate de l’étape 3.3 à 12.000 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Préparer des tubes frais de 1 mL et ajouter 300 L de chloroforme dans chaque tube.
- À l’aide d’une pointe de 1 ml soigneusement pipette hors du supernatant sans toucher la matrice lysing.
- Transférer le supernatant au chloroforme contenant des tubes et du vortex pendant 5 s. Laisser le tube se contenter de 5 minutes ou plus jusqu’à ce que trois phases (en haut, au milieu et au fond) soient clairement visibles.
- Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Pipette soigneusement la phase supérieure et le transfert dans des tubes frais de 1,5 mL.
- Aux tubes de l’étape 3.4.5, ajouter 500 'L d’éthanol glacé à 100%, fermer les tubes et mélanger en inversant doucement à l’envers 3x. Incuber les tubes à -80 oC pendant 15 minutes ou -20 oC pendant 30 min et poursuivre l’extraction, ou laisser à -20 oC pendant la nuit pour terminer l’extraction le lendemain.
- Réglez la microcentrifugeuse à 4 oC et laisser refroidir à au moins 12 oC avant de commencer la centrifugation. Chargez les tubes dans la microcentrifugeuse et la centrifugeuse pendant 20 min à 13 000 x g. Jetez le supernatant, remplacez par 70% d’éthanol glacé et la centrifugeuse pour un autre 10 min à 13.000 x g.
REMARQUE: L’éthanol de 70 % doit être fabriqué avec de l’eau sans nucléase de qualité moléculaire. - Jetez tous les supernatants de l’étape 3.4.7 et transférez les tubes à un incubateur fixé à 50 oC. Incuber pendant 20 min pour sécher le granule d’ARN/ADN. Gardez les tubes partiellement ouverts pour permettre l’évaporation de tout l’éthanol.
- Ajouter 100 L d’eau sans nucléase au granule sec et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. Vortex pour 3 s pour mélanger le contenu.
REMARQUE: À ce stade, l’extrait peut être stocké de 2 à 3 jours au réfrigérateur ou plus à -80 oC jusqu’à ce que la section 3.5 soit effectuée.
- Suppression de l’ADN
REMARQUE : Cette étape est cruciale parce que la présence d’ADN dans l’extrait invalide le résultat de MBLA. Cette section est basée sur une trousse d’enlèvementd’ADN (Tableau des matériaux).- Préparer un mélange de l’enzyme DNase I 10x tampon et DNase I enzyme pour le nombre d’échantillons (10 L de tampon et 1 'L de DNase par échantillon) plus 10% supplémentaire pour couvrir toute perte de tuyauterie. Mélanger par vortexing puis pipette 11 L dans chaque tube contenant l’extrait d’ARN.
- Mélanger en vortexing 3 s, puis tourner brièvement (10 s à 13.000 x g)pour enlever les gouttelettes sur les murs. Incuber à 37 oC pendant 30 minutes dans le bloc chaud ou l’incubateur. Ajouter une enzyme supplémentaire de 1 L de DNase I directement dans chaque tube, bien mélanger par vortexing, et incuber pour un autre 30 min à 37 oC.
- Décongeler le réactif d’inactivation DNase 10 min avant la fin de l’incubation DNase. Vortex 20 s pour assurer une suspension homogène et laiteuse, puis ajouter 10 l 'L de réactif d’inactivation DNase dans chaque extrait d’ARN de l’étape 3.5.2.
- Incuber le mélange à température ambiante pendant 5 min. Vortex 3x pendant l’étape d’incubation de 5 min.
- Centrifugez le mélange à 13 000 x g pendant 2 min. Transférer soigneusement le supernatant à 1,5 mL de tubes libres RNase sans toucher aucune de la matrice d’inactivation.
- Conservez l’extrait d’ARN dans le réfrigérateur si vous exécutez le RT-qPCR le même jour ou à -80 oC pour le stockage à long terme.
4. Retranscrits inversés qPCR
- Pour les échantillons inconnus, diluer tous les extraits d’ARN à utiliser dans un rapport de 1:10 dans l’eau libre de RNase. Bien mélanger en vortexing pendant 5 s et tourner brièvement vers le bas pour enlever les gouttelettes ou les bulles d’air.
- Pour les échantillons standard pour une courbe standard, prenez les normes de Mtb et d’ARN EC du congélateur de -80 oC et décongeler à température ambiante. Faire sept et six dilutions 10 fois des échantillons standard de Mtb et EC respectivement. Modifier les conseils avant de transférer le mélange d’un tube à l’autre.
REMARQUE: Les échantillons standard sont fournis avec la trousse TB-MBLA. -
Préparation de mélange de maître
REMARQUE : Le mélange principal (MM) est une solution de réactifs PCR suffisante pour amplifier tous les échantillons, normes et eau pour un contrôle sans modèle (CNT). L’eau utilisée comme CNT devrait être la même eau utilisée dans l’extraction et pour la préparation du MM. Assurez-vous que les normes, chaque échantillon d’ARN et sa dilution décimale sont amplifiés 2x pour la réaction positive à la transcriptase inversée (RT) et 1x pour la réaction négative à la transcriptase inverse (RT-). La réaction DE RT est un contrôle pour déterminer l’efficacité de l’élimination de l’ADN(tableau 1).- Transférer 16 L de MM dans chaque tube de réaction PCR.
- Ajoutez 4 L d’extrait d’ARN dans chaque tube et eau de réaction RT et RT dans les tubes de réaction du CNT.
- Chargez les tubes de réaction dans une machine PCR en temps réel et définissez les conditions PCR comme suit : 50 oC pour 30 min, 95 oC pour 15 minutes, cycles 40x à 94 oC pour 45 s, et 60 oC pour 1 min avec acquisition avec des fluorophores qui absorbent dans les canaux verts et jaunes.
REMARQUE: Le canal vert est le fluorophore de détection de Mtb et le jaune est le fluorophore de détection de contrôle d’extraction.
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Interprétation des résultats
REMARQUE : Assurez-vous que les réactions en double d’un même échantillon ne diffèrent pas par plus d’un écart standard. Les valeurs de Mtb et DE EC Cq supérieures à 30 sont considérées comme négatives. Voir d’autres détails d’interprétation dans le tableau 2.- Pour interpréter la réponse au traitement, convertir les valeurs Cq en charge bactérienne (eCFU/mL) à l’aide de la courbe standard. Lisez la réponse au traitement comme changement de charge bactérienne au cours de la période de suivi du traitement.
REMARQUE: La chute de la charge bactérienne après le traitement signifie une réponse positive (c.-à-d. les médicaments antituberculeux tuant les bactéries tuberculeuses) alors qu’aucun changement ou augmentation de la charge bactérienne n’implique une réponse négative, ce qui peut signifier une résistance des bactéries tuberculeuses aux médicaments antituberculeux ou le patient qui n’adhère pas convenablement à sa dose de traitement. La baisse de la charge bactérienne mesurée par TB-MBLA est en corrélation avec l’augmentation du temps MGIT à la positivité de la culture (TTP).
- Pour interpréter la réponse au traitement, convertir les valeurs Cq en charge bactérienne (eCFU/mL) à l’aide de la courbe standard. Lisez la réponse au traitement comme changement de charge bactérienne au cours de la période de suivi du traitement.
5. Microscopie électronique de transmission
- Transférer 2 mL d’aliquots de chaleur dans les cultures et les contrôles dans des tubes de microcentrifugeuse de 2 ml. Centrifugeuse pour 10 min à 20 000 x g.
- Jetez le supernatant et suspendez la granule dans 700 l de tampon de fixation cellulaire et incuber à température ambiante pendant 5 minutes pour réparer les cellules.
- Centrifuge la suspension pour 30 min à 16.000 x g pour obtenir une boulette dure. Jetez le supernatant et remplacez par 1% de saccharose dans le salin tamponné par phosphate (PBS). Conserver les granulés dans le saccharose à 4 oC jusqu’à la section pour la microscopie électronique.
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Sectionnement et TEM
REMARQUE : Le protocole ci-dessous est adapté de Griffiths et coll.28.- Cryoprotect la pastille de cellules en l’intégrant dans 2,1 M saccharose dans PBS pendant la nuit à 4 oC. Laver 3x avec de l’eau glacée.
- Refroidir les granulés de cellules cryotés dans de l’azote liquide et les monter des talons cryomicrotomy. À l’aide de la cryomicrotome, couper les sections ultrathin à 90 nm.
- Récupérez les sections coupées à l’aide des boucles de fil de tungstène de 1:1 mélange de 2% de cellulose méthyle et 2,1 M de saccharose dans PBS.
- Transférer les sections à 150 supports TEM en cuivre hexagonal en treillis (grilles) et conserver à 4 oC ou passer à l’étape 5.4.5.
- Comparez les grilles en acétate d’uranyl et sèche-l’air dans un film d’acétate de méthyle. Laver les grilles avec de l’eau glacée suivie de deux gouttes de PBS sur 5 min et sécher pendant 15-30 min. Examiner les sections sous TEM en suivant les lignes directrices du fabricant.
REMARQUE: Toutes les étapes d’étiquetage ont été effectuées à température de glace (température liquide) à l’exception des étapes de lavage, qui ont été effectuées à température ambiante.
Representative Results
La chaleur inactive tous les bacilles M. tuberculosis
La densité optique (OD) des contrôles (cellules vivantes) a augmenté au fil du temps, (0,04OD-0,85OD) et aucun changement d’OD n’a été observé dans les échantillons inactivés par la chaleur, signifiant la croissance et aucune croissance respectivement (figure 1)27. De même, l’expectoration clinique de commande s’est développée positive au jour 3 dans le MGIT tandis que les échantillons cliniques inactivés de chaleur n’ont pas signalé positif jusqu’à la fin de l’incubation. La croissance du Mtb dans le MGIT a été confirmée par la microscopie de frottis Ziehl-Neelsen et l’antigène MPT6429.
L’ARN dans les échantillons inactivés est stable à 37 oC pendant 4 jours
Des échantillons inactivés par la chaleur ont été incubés à 37 oC pour déterminer si l’ARN se dégrade après l’inactivation de la chaleur des cellules. Aucune différence n’a été constatée entre l’ARN récolté au jour (D) 0 immédiatement après l’inactivation de la chaleur et l’ARN isolé à D1, 2, 3 et 4 dans les deux cultures BCG(figure 2A-C) et l’expectoration positive de la tuberculose(figure 2D).
Exogène RNase augmente le taux de dégradation de l’ARN dans la chaleur inactivée fractions
Pour déterminer pourquoi l’ARN ne se dégradait pas, l’enzyme RNase A a été ajoutée exogènement à 1 000 U/mL avant et/ou après l’inactivation de la chaleur. Cela a causé une perte d’ARN équivalente à la charge bactérienne de 1,5 à 0,3 -, 1,8 à 0,2 -, et de 1,3 à 0,1 - journal10 eCFU/mL à 80 oC, 85 oC et 95 oC respectivement sur 4 jours d’incubation. Il y avait une différence dans l’ARN dégradé dans les échantillons où RNase a été ajouté avant et/ou après l’inactivation de la chaleur(figure 3A-C).
L’ARN suffisant est conservé pour TB-MBLA utilisant 16S rRNA comme marqueur de référence
L’effet de l’inactivation de chaleur sur l’ARR a été mesuré dans les cultures de BCG et les expectorations des patients positifs de tb.tb. La charge bactérienne mesurée de la culture BCG de contrôle, 5,3 à 0,2 journal10 eCFU/mL, était de 0,2 journal de 0,1 journal10 eCFU/mL supérieur à la combinaison 5,1 à 0,3 journal10 eCFU/mL de la culture inactivée par la chaleur (ANOVA p 'lt; 0.0001) à 80 'C, 85 'C, et 95 'C (Figure 4A)27. De même, la charge bactérienne d’expectoration des patients témoins, 7,1 log10 eCFU/mL, était de 0,8 à 0,1 journal10 eCFU/mL plus haut que le total 6,3 à 0,41 journal10eCFU/mL à 80 oC, 85 oC, et 95 c(figure 4B)27 La réduction de la charge bactérienne a été 'lt;1log dans les deux types d’échantillons testés.
Le test de comparaisons multiples de Sidak a révélé une différence significative entre la charge bactérienne à 95 oC par rapport à celle de 80 oC et de 85 oC (p - 0,001). Aucune différence n’a été constatée dans les échantillons de tuberculose à toutes les températures, p - 0,8.
L’intégrité des parois cellulaires n’est pas détruite par la chaleur dans la majorité des cellules du Mtb
À l’aide de la microscopie électronique de transmission (TEM), nous avons étudié si les cellules étaient analysées par inactivation de la chaleur. De fines sections de granulés fixes de paraformaldéhyde de cellules ont été faites et incorporées dans un milieu riche en électrons avant l’examen par TEM. L’inspection des cellules au grossissement inférieur et supérieur a indiqué la paroi cellulaire intacte et les corps intracellulaires visibles de lipide. Les cellules sont apparues morphologiquement allongées mais non lysées. La figure 5 illustre la morphologie des cellules mycobactéries lors de différents grossissements. Les deux premiers panneaux révèlent les corps lipidiques intracellulaires et le cordonnage sans entraves, une caractéristique morphologique typique des espèces de mycobacterium. Les deux panneaux inférieurs sont un grossissement plus élevé élargissant la vue des corps lipidiques et révélant quelques structures micro-intracellulaires.
La charge bactérienne mesurée par TB-MBLA est inversement corrélée au temps de culture MGIT à la positivité
Pour les patients qui répondent à un traitement, la charge bactérienne tombe à une moyenne de 1 journal10 eCFU/mL par semaine au cours du traitement. Les répondeurs rapides se dégagent plus rapidement, se convertissant en négatif (charge bactérienne zéro) par 2 semaines de traitement. La baisse de la charge bactérienne mesurée par TB-MBLA correspondait à l’augmentation du temps de culture MGIT à la positivité (TTP). La figure 6 démontre la corrélation inverse trouvée entre la charge bactérienne et le TTP MGIT. La différence, cependant, est que les résultats TB-MBLA sont disponibles en 4 h et le temps de résultat est indépendant du niveau de charge bactérienne. Cela contraste avec 5 à 25 jours pour les tests de culture MGIT. La contamination par des bactéries non tuberculeuses compromette davantage les résultats des tests de culture.
Figure 1 : Vérification de l’inactivation du BCG à 80 oC (courbe de modèle de point), de 85 oC (courbe de modèle de tableau de bord) et de 95 oC (courbe de modèle de tableau de bord). Le contrôle (courbe noire) était vivant (non chauffé) culture BCG inoculé dans le même milieu de croissance. La croissance du contrôle a été confirmée par l’augmentation de l’OD de la culture au cours de la période d’incubation. Ce chiffre a été modifié à partir de Sabiiti et al.27. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Stabilité de l’ARN quantifiable dans l’échantillon inactivé à la chaleur incubé à 37 oC pendant 4 jours (D0-D4). (A), (B), et (C) montrent des cultures BCG inactivées à 80 oC, 85 oC, et 95 oC respectivement. (D) montre l’expectoration de la tuberculose inactivée à 80 oC. Le contrôle est la fraction non traitée (en direct) du même échantillon. Barres d’erreur et déviation standard. Trois répétitions, neuf répliques par course. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Dégradation plus élevée d’ARN après ajout exogène de l’enzyme de RNase A. (A) Inactivation thermique (HI) à 80 oC, (B) HI à 85 oC, et (C) HI 95 oC. Barres d’erreur et erreur standard de la moyenne. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : La préservation d’un ARN suffisant pour la mesure de la charge bactérienne TB-MBLA à l’aide de l’ARR 16S comme marqueur. (A) Charge bactérienne estimée à partir de cultures in vitro BCG. (B) Charge bactérienne estimée à partir d’expectorations positives de tuberculose. Barres d’erreur - erreur standard de la moyenne (n 18 et 20 répliques pour A et B respectivement). Ce chiffre a été modifié à partir de Sabiiti et al.27. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Micrographes électroniques de bacilles de Mtb intacts après inactivation à 95 oC pendant 20 min. La paroi intacte claire de cellules et les corps enumerables de lipide ont été observés avec TEM. Haut : images de faible grossissement d’un groupe de cellules révélant une morphologie mycobactérienne sans entraves en ce qui amebilisant la corde et les corps lipidiques intracellulaires. En bas : grossissement élevé des panneaux supérieurs pour élargir la vue des corps lipidiques et révéler quelques structures micro-intracellulaires. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : La courbe de réponse de traitement de 12 semaines d’un patient sur la thérapie anti-tuberculose montrant une corrélation inverse de la charge bactérienne mesurée de TB-MBLA et de TTP de MGIT. La charge bactérienne (courbe bleue) tombe tandis que le TTP monte (courbe rouge) pendant que le patient répond au traitement. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Master mix | Réaction positive de RT | Réaction négative de RT |
| Volume par réaction x non. des réactions no 5 | Volume par réaction x non. des réactions no 5 | |
| Mélange Quantitect | 10,0 l | 10,0 l |
| Mélange d’amorce Mtb16S (F et R) | 0,4 l | 0,4 l |
| Sonde Mtb16S | 0,2 l | 0,2 l |
| Mélange d’amorce EC (F et R) | 0,4 l | 0,4 l |
| Sonde EC | 0,2 l | 0,2 l |
| Enzyme RT | 0,2 l | ------- |
| Eau libre RNase | 4.6 L | 4.8 L |
| Volume total | 16 l | 16 l |
Tableau 1 : Guide de préparation à la combinaison principale pour le TB-MBLA qPCR.
| Type | Chaîne VTT | Canal EC | Interprétation |
| Échantillon | Positif | Positif | Valide |
| Échantillon | Positif | Négatif | Indéterminé |
| Échantillon | Négatif | Positif | Valide |
| Échantillon | Négatif | Négatif | Non valide |
| VTT et contrôle | Positif | Négatif | Valide |
| Contrôle d’extraction (CE) | Négatif | Positif | Valide |
| Contrôle de l’ADN | Négatif | Négatif | Valide |
| Contrôle négatif (CNT) | Négatif | Négatif | Valide |
Tableau 2 : Guide d’interprétation des résultats tb-MBLA.
Discussion
Cet article montre que le traitement thermique pendant 20 min à 80 oC, 85 oC et 95 oC inactive efficacement les échantillons de tuberculose, ce qui permet d’effectuer la tuberculose-MBLA dans une installation non-CL3 sans risque d’infection pour les travailleurs de laboratoire. Les résultats confirment les observations faites dans des études précédentes tout en contrastant avec certains sur l’efficacité de l’inactivation de la chaleur de Mtb25,30. Par exemple, certains rapports indiquent que le chauffage à 80 oC n’est pas efficace sur les échantillons de charge bacillaire élevé25,31,32,33. L’effet d’inoculum à haute densité a été évité dans notre étude en veillant à ce que toutes les cultures de crachats et de purs aient été chauffées à un volume de 1 mL par tube de centrifugeuse de 15 ml fournissant un espace adéquat pour exposer chaque partie de l’échantillon àl’ébullition 27.
La préservation de l’ARN après l’inactivation de la chaleur permet d’effectuer tb-MBLA. Cette conclusion est d’accord avec deux études qui ont démontré la préservation de l’ARN après l’inactivation de chaleur12,34. Nous avons montré que l’ARN dans les échantillons inactivés de chaleur est stable à 37 oC pendant 4 jours, ce qui implique que les laboratoires pourraient passer des tests en maintenant des échantillons inactivés à température ambiante pendant une semaine. En appliquant des trousses d’extraction d’ARN qui nécessitent une réfrigération ou une congélation, la capacité de maintenir la chaleur inactivée des échantillons à température ambiante évite la nécessité pour les laboratoires de la chaîne du rhume et de la catégorie 3 d’effectuer tb-MBLA dans des milieux limités dans les ressources limitées.
Moins de 1log charge bactérienne a été perdu en utilisant le rRNA 16S comme marqueur. Bien qu’il y ait eu une différence entre l’échantillon vivant et l’échantillon inactivé par la chaleur, la quantité perdue à cause de l’inactivation de la chaleur est trop faible pour compromettre les résultats en aval. L’augmentation de la température n’a pas augmenté la quantité d’ARN perdu, ce qui implique que la perte observée est indépendante du traitement thermique. Le traitement thermique à des températures élevées provoque très probablement la lyse cellulaire, exposant l’ARN à la dégradation par les RNases. En effet, l’ajout exogène de RNase A à la fraction inactivée de chaleur a augmenté le taux de dégradation d’ARN. L’ébullition n’a pas réduit l’activité de RNase, ce qui implique qu’il s’agit d’une protéine très résistante.
Il est important de noter qu’une dégradation moyenne de l’ARN de 1,5 journal10 eCFU/mL n’est pas une perte importante. À cette fin, nous émettons l’hypothèse que le chauffage lyse une petite proportion de bacilles de Mtb, exposant ainsi une petite quantité d’ARN à RNase. En utilisant TEM, nous avons montré que la morphologie et l’intégrité des cellules de Mtb sont à peine affectées par le chauffage à 95 oC. Cela signifie qu’il peut nécessiter divers facteurs physiologiques et un approvisionnement suffisant de RNases tels que dans l’hôte de dégrader considérablement l’ARN35,36. En outre, étant un ribosome structurel, 16S rRNA est potentiellement moins sensible à RNase37,38. Une seule cellule de Mtb contient 700 ribosomes/0,1 mm3 de cytoplasme37,ce qui implique qu’il existe des quantités plus élevées d’ARR par cellule. Ainsi, de plus petites quantités de RNase peuvent avoir un impact plus faible38. L’existence d’un grand nombre de ribosomes donne un avantage à tb-MBLA en termes de sensibilité et de capacité à détecter les patients tuberculeux à faible charge.
Il y avait une forte corrélation entre la charge bactérienne mesurée par TB-MBLA et la culture MGIT TTP. Cela confirme la charge bactérienne en tant que conducteur de la positivité de la culture dans une certaine mesure. Cependant, l’avantage de TB-MBLA est qu’il quantifie directement la charge bacillaire présente dans l’échantillon et ne nécessite pas la prolifération des cellules de Mtb avant la détection. Cela contraste avec la culture dont le temps de positivité dépend du niveau de charge bactérienne et du taux de prolifération des cellules de Mtb. De futures études évalueront le flux de travail TB-MBLA, y compris l’inactivation de la chaleur, dans des milieux cliniques de routine. L’étude explorera également des échantillons ayant une gamme de charges bactériennes pour comprendre le nombre qui pourrait passer du positif au négatif (c.-à-d. ceux qui ont moins de bactéries après l’inactivation de la chaleur).
Le protocole TB-MBLA pour la quantification moléculaire de la charge bactérienne est le premier du genre en bactériologie. La méthode quantifie directement la charge bacillaire de Mtb de l’expectoration patiente et ne nécessite aucune culture pour le faire. Cela le rend plus rapide et augmente son potentiel d’éclairer une décision clinique sur les progrès des patients. L’étape d’inactivation de la chaleur réduit le risque d’infection et augmente l’applicabilité de la TB-MBLA dans des milieux qui n’ont pas de laboratoire de catégorie 3. Après l’inactivation de la chaleur de l’échantillon, il y a trois étapes de protocole pour réaliser des résultats tb-MBLA : extraction d’ARN, transcriptase inverse (RT)-qPCR, et analyse des résultats de QPCR.
Plus l’efficacité de l’isolement de l’ARN de Mtb à partir d’un échantillon de patient est élevée, plus la qualité des résultats est élevée. Il est important de noter que la qualité de l’échantillon d’expectoration affecte la quantité d’ARN isolé. Par exemple, les expectorations salivaires sont considérées comme de mauvaise qualité et ont été associées à une faible charge bacillaire. Cela signifie que la formation du patient pour l’expectoration de expectoration d’expectoration d’expectoration d’expectoration d’expectoration d’expectoration d’expectoration de crachat de qualité est Pour évaluer l’efficacité du processus d’extraction, un contrôle d’extraction (c.-à-d. le nombre connu de cellules non-Mtb) est piqué dans l’échantillon avant l’extraction de l’ARN. La récupération du contrôle d’extraction confirme l’efficacité du processus d’extraction de l’ARN. Le processus d’isolement de l’ARN ne peut pas être valide à moins que le contrôle d’extraction n’ait été récupéré. Étant donné que le Mtb est un organisme résilient fait de la lyse mécanique une partie cruciale du processus. L’homogénéisation de l’échantillon à grande vitesse (600 tr/min) en présence de perles (c.-à-d. matrice de lysing) lyse efficacement les cellules. La purification du lysate donne un extrait contenant à la fois l’ARN et l’ADN. L’ablation de l’ADN est une dernière étape cruciale de l’extraction de l’ARN. TB-MBLA vise à mesurer les bacilles viables en quantifiant l’ARN. Ainsi, l’omission d’enlever l’ADN génomique signifie que les résultats auront un signal de l’ADN, qui n’est pas un bon marqueur pour la viabilité cellulaire6.
Le RT-qPCR est un duplex en cours d’exécution deux sondes étiquetées pour le Mtb et le contrôle d’extraction. Il s’agit de trois étapes : 30 min de transcription inversée par transcriptase inverse à 50 oC, 15 min de dénaturation à 95 oC et 40 cycles d’amplification à 94 oC et 60 oC. L’acquisition de la fluorescence des sondes se fait à 60 oC (c.-à-d. le stade d’allongement des fragments). Il est important de noter que le TB-MBLA a été optimisé à l’aide d’un appareil QPCR particulier, de sorte que les opérateurs utilisant d’autres plates-formes qPCR devraient optimiser les conditions de leur équipement. L’efficacité de l’élimination de l’ADN est contrôlée par l’exécution d’une seule réaction par échantillon en l’absence de RT. Un résultat positif de cette réaction signifie l’ablation incomplète de l’ADN. Les échantillons à forte charge qui ont des quantités élevées d’ADN peuvent nécessiter le double de la quantité d’enzyme DNase pour enlever complètement l’ADN. Heureusement, dans les échantillons de charge bacillaire élevé, la présence de petites quantités d’ADN est moins susceptible d’affecter le résultat de l’ARN. L’ARN ribosomal, la cible TB-MBLA, se produit naturellement dans deux fois la quantité d’ADN37. Dans le PCR, un contrôle sans modèle (CNT), qui est l’eau utilisée pour dissoudre les réactifs PCR, contrôle la contamination croisée par l’ADN exogène ou l’ARN. Un signal positif dans le CNT implique la contamination croisée et le résultat considéré comme invalide. Cela signifie que toutes les solutions constituées à l’aide de cette eau doivent être jetées et de nouvelles apportées à l’aide d’une flacon d’eau fraîche. Il est conseillé de conserver l’eau PCR dans des aliquots séparés pour éviter la contamination de toute l’eau. Un contrôle positif (ARN Mtb) est utilisé pour contrôler l’efficacité globale du PCR.
L’analyse des résultats comprend la conversion de PCR Cqs en charge bactérienne (c.-à-d. la colonie estimée formant des unités par ml) à l’aide de la courbe standard. La définition et l’optimisation de la courbe standard sont cruciales pour cette étape. Une efficacité de courbe standard de 0,95-1 est recommandée. Les courbes standard pour le VTt et le contrôle d’extraction doivent être configurées et optimisées avant que les patients ou d’autres échantillons d’essai soient exécutés sur la machine. Des échantillons standard sont fournis avec la trousse TB-MBLA. Une dilution décuplée de l’extrait d’ARN est recommandée pour PCR. Cela implique que le résultat de la charge bactérienne doit être multiplié par un facteur de 10 pour obtenir le résultat final de la charge bactérienne par ml. Il est important de noter que les Cqs au-dessus de 30 sont considérés comme négatifs pour TB-MBLA. Un minimum de deux résultats de charge bactérienne prospective mesurés à différents moments est nécessaire pour faire une inférence sur la réponse au traitement. Il est fortement recommandé que l’un des deux résultats soit la ligne de base, avant le début du traitement. Cependant, si le patient a commencé l’évaluation de la charge bactérienne se produit à mi-chemin par le traitement, il doit y avoir une deuxième mesure de charge bactérienne de point de temps pour évaluer la réponse de traitement. TB-MBLA peut distinguer la charge bactérienne en l’espace de 3 jours sur le traitement, mais l’idéal est deux mesures de charge bactérienne prises à 7 jours d’intervalle.
Bien que le protocole génère des résultats quantitatifs informatifs pour la réponse au traitement, il est encore largement manuel et exige des mains substantielles sur le temps pour l’extraction de l’ARN. Les techniciens des laboratoires occupés n’ont peut-être pas ce temps. Des dispositions sont en cours pour automatiser les processus d’extraction de l’ARN et de PCR.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
L’étude a été rendue possible grâce au financement du Partenariat d’essais cliniques des pays européens et en développement (EDCTP) - Subvention du programme d’expansion des biomarqueurs panafricains (PanBIOME) SP.2011.41304.008. Un soutien a également été obtenu à la subvention de recherche de l’École de médecine de l’Université de St Andrews. La publication de ce manuscrit et du protocole TB-MBLA en tant que ressource visuelle a été rendue possible grâce au financement du Scottish Funding Council et du Global Challenges Research Fund à l’Université de St Andrews. Merci à l’hôpital maternel de Maputo et au Centre de santé Mavalane qui a fourni les échantillons cliniques d’expectorations, et à l’équipe de l’Unité de traitement de la tuberculose de Maputo qui a participé aux expériences d’inactivation de la chaleur de spécimens cliniques d’expectoration.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat inactivation: | |||
| 15 mL Centrifuge tubes | Fisher-Scientific | 10136120 | 50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved |
| 15 mL Wire Tube rack | Fisher-Scientific | 11749128 | Other brands with similar make can be used |
| Water bath | Fisher-Scientific | 15700619 | Other brands with similar make can be used |
| RNA extraction: | |||
| Chloroform | Sigma | 372978-1L | Not necessary in other RNA extraction kit brands |
| Ethanol, absolute 99-100% | Sigma | 51976-500ML-F | Larger volume available |
| Extraction control | SOI group St Andrews | VitalbacteriaEC | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit |
| FASTRNA Pro blue Kit | MP Biomedicals | 116025050 | Supplied with lysing matrix tubes |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Qiagen, Fisherscientific can also supply same product |
| Precellys 24 homogeniser | VWR | 432-3750 | FastPrep MP Biomedicals can be used too |
| Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus | Fisher-Scientific | 15352117 | Other brands with similar capacity can be used |
| Thermomixer | Eppendorf | BLD-455-010C | Works with 1-2 mL tubes |
| TURBO DNA-free | Fisher-Scientific | AM1907M | Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures. |
| RT-qPCR: | |||
| Primers and Taqman probes | SOI group St Andrews | VitalbacteriaPP | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX. |
| QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit | Qiagen | 204845 | PCR mix plus the RT enzyme |
| RotorGene Q 5plex machine | Qiagen | 9001580 | Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc. can be used |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 mL | Qiagen | 981103 | Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed. |
| Non-heat inactivation Sample preservation materials | |||
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | 93313 | Supplied ready to use |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Many competent suppliers |
| Guanidine thiocyanate (GTC) | Promega | V2791 | Promega brand recommended for quality |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Ensures that GTC solution is free of nucleases |
| General materials (used but not specific to TB-MBLA) | |||
| 500 mL plastic containers | 734-5087 | Nalgene brand recommeded | |
| Biological waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Chemical waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Disposable gloves, chemical resistant | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-20 °C) | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-80 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fridge (0-8 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fume hood | For safe handling of toxic reagents | ||
| Laboratory scales | For accurate measurement of reagents | ||
| Measuring cylinders, plastic | To ensure accurate measurement of reagents | ||
| PCR reaction tubes | Should be suitable to the PCR instrument used | ||
| Pipettes and matching sterile filtered pipette tips, | DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended | ||
| Qiagility loading plates | Qiagen | 5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates | |
| QIAgility Pipetting Robot | Qiagen | Important for high throughput pipetting | |
| Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes | Chemical-resistant and autoclavable recommended | ||
| RNase Away (Removes RNases enzymes from working space) | Fisher Scientific | 10666421 | Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme |
| Safety goggles, chemical resistant | Fisher Scientific | Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents. | |
| Sterile Pasteur pipettes, 1.5-3 mL | Many competent suppliers | ||
| Sterile RNAse-free microtubes | 1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended | ||
| TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse | Ensure it is freshly prepared or prepared within a week | ||
| Vortex | Genie 2 brand recommended | ||
| Transmission electron microscopy | |||
| Glutaldehyde (8%) | Sigma | G7526-10ML | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| HEPES (pH 7.4, 100 mM) | Sigma | H4034-25G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Leica FCS ultracryo | Leica | Cryomicrotome for tissue sectioning | |
| Methyl cellulose | Agar Scientific | AGG6425 | Cold mounting resin |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Sigma | P6148-500G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Sucrose | Sigma | 84097-250G | Preservation and mounting medium |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | AGR1260A | Universal Electron microscopy stain |
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