Summary
我们描述了在痰热失活后进行的结核病分子细菌负荷测定测试。热失活使痰样本非传染性，并无需为结核病分子测试进行遏制3级实验室。
Abstract
结核病是由结核分枝杆菌（Mtb）引起的，这是一种被联合国列为危险的B类生物物质的病原体。为了工人的安全，所有假定携带Mtb的样品必须在密封层（CL）3实验室进行处理。TB分子细菌负荷测定（TB-MBLA）测试是一种反向转录酶定量聚合酶链反应（RT-qPCR）测试，该测试使用引物和16S rRNA的双标记探头对Mtb杆菌负荷进行定量。我们描述了使用热失活使结核病样本非传染性，同时保留核酸核酸核酸核酸核酸核酸核酸。在紧闭的15 mL离心管中，痰样本的1 mL等位在80°C、85°C或95°C下煮20分钟，以停用Mtb杆菌。培养热灭活和对照（活）样本42天证实结核病死亡。然后，用100μL的萃取控制对灭活样品进行尖峰化，然后按照标准RNA分离程序提取RNA。热处理样品的培养物没有观察到生长。分离的RNA受到实时RT-qPCR的影响，该RT-qPCR放大了Mtb 16S rRNA基因中的特定靶点，以定量周期（Cq）的形式产生结果。标准曲线用于将 Cq 转换为细菌载荷，或估计每 mL（eCFU/mL）的菌落形成单位。Cq 与样品的细菌负载之间存在反关系。其局限性是，热失活会使一些细胞产生酶，使RNA暴露在导致酸量损失的RNases上，导致10号原木10eCFU/mL（即<10 CFU/mL）的损失。进一步的研究将确定由于热失活导致假阴性结果的极低负担患者的比例。
Introduction
由结核分枝杆菌（Mtb）引起，全球报告超过7×106例结核病新发病例，其中1至106例死亡1例以上。为了扭转这一趋势，世界卫生组织（世卫组织）推出了一种三支柱方法，包括开发有效的诊断和治疗工具3。被联合国列为危险生物物质B，使用假定对Mtb呈阳性的样品需要3的密封水平（CL）。CL3 实验室的建造和维护成本高昂。因此，大多数国家在区域或国家一级集中了结核病文化服务。这意味着涂片显微镜是外围医疗机构中最可用的诊断工具。
世卫组织批准在4级卫生保健设施实施快速分子测试，如Xpert MTB/RIF，大多位于,4、5级4地区。有些地区相当大，有些人也不太容易进入。Xpert MTB/RIF 在有益的同时，通过检测 Mtb DNA工作。脱氧核糖核酸是一种稳定的分子，在细胞死亡后存活很长时间，因此不是测量对监测治疗反应55、66至关重要的活细胞的良好标准。基于RNA的测定提供了一种替代，用于精确测量活细胞787，8，9，10，11，12，13。11,12,139,10,,,RNA存在于不同稳定性的不同物种中：核糖核酸RNA（rRNA）、转移RNA（tRNA）和信使RNA（mRNA）。信使RNA与基因表达相关，因此与细胞活性和生存能力最密切。需要注意的是，基因表达的缺失并不等同于细胞死亡，因为已知Mtb等病原体存在于非活性（休眠）中，但存活状态15、16。15,因此，稳定的RNA物种（如rRNA）是活细胞活性和非活性状态的更好标记物。
使用大肠杆菌，谢里丹显示，16S rRNA按比例增加与细菌生长测量的殖民地形成单位（CFU）计数17。当大肠杆菌接触抗生素时，CFU计数和16S rRNA同时下降。细胞死亡后rRNA的下降是一个指标，它可以用来作为细胞生存能力的标记13，17。13,根据这一原理，开发结核病分子细菌负荷测定（TB-MBLA）用于靶向M.结核病16S rRNA，以测量可行的结核病杆菌负荷，作为抗结核治疗患者治疗反应的标志11、18、19。11,18,19我们进一步开发和优化了TB-MBLA，以纳入细胞提取控制，反映M.结核病杆菌的轮状，并在不同的环境环境中是健壮的20。TB-MBLA 程序要求在 CL3 实验室中执行从 Mtb 分离的 RNA 的第一步，直到 Mtb 细胞完全被分离以确保工人的安全。它还包括样品保存，用于追溯性批次分析，将4级有毒物质——瓜尼丁三角酸酯保持在-80°C。为此，我们使用热来灭活Mtb，使样品在涂片显微镜实验室中安全进行结核-MBLA。
在实验室和临床应用中使用热源已经存在了几个世纪。,22然而，一些微生物，如Mtb是很难杀死的，较短的暴露于热是不够的杀死所有的细胞23，24。23,一项研究表明，在80°C下，20分钟的结核病培养物加热，在不破坏PCR25所需的DNA的情况下杀死了所有的Mtb杆菌。随后，一些实验室DNA提取技术目前加热到95°C。我们应用了相同的原理，表明在80°C、85°C或95°C下沸腾的结核样品在保存足够的RNA以进行结核-MBLA的同时，会激活Mtb。灭活培养剂或痰可以在室温下保持紧密封闭的容器中，或在不减少可量化rRNA量的情况下冷藏7天。
目前用作研究用途（RUO）的TB-MBLA具有适应性，并已应用于不同的样品类型，包括痰、肺组织和脑脊髓液。它尚未应用于支气管性球管液、血液和其他样品类型。以痰为样本，非洲多点评价结果（未公布数据）和先前出版物18、26,26表明，MBLA的敏感性与分枝杆菌生长指标管（MGIT）液体培养物一致。然而，结核病-MBLA更快，结果以小时而不是几天或数周的培养，具体，不受非结核病微生物在样品中的影响，并定量测量疾病的严重程度。世界卫生组织最近确认结核病-MBLA为替代涂片显微镜和培养监测结核病治疗2的候选者。
在本文中，我们详细描述了在Sabiiti等人27中发表的热灭活和TB-MBLA协议。此详细协议将为全球 TB-MBLA 用户提供一站式视觉资源。
Protocol
1. 样品制备
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文化
- 在干净的长凳或 1 类舱内工作，将 1 mL 的指数级杆菌（BCG）培养成 15 mL 塑料离心管。紧紧闭管。
注：要处理整个 5 mL 样品，需要 5 个 15 mL 离心机管。
注意：使用任何结核病培养体时，需要一个生物安全柜。
- 在干净的长凳或 1 类舱内工作，将 1 mL 的指数级杆菌（BCG）培养成 15 mL 塑料离心管。紧紧闭管。
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患者痰标本
- 在通风良好的空间工作，并戴上鼻罩，小心地打开试样杯，将1 mL等位体插入15 mL塑料离心管，并紧紧关闭管子。
注：建议用宽口尖进行移液痰。使用一把剪刀，剪下1 mL尖嘴的细部分，以创建一个更宽的嘴。
- 在通风良好的空间工作，并戴上鼻罩，小心地打开试样杯，将1 mL等位体插入15 mL塑料离心管，并紧紧关闭管子。
2. 热失活
- 在样品制备之前，将水浴设置为 95°C。
注：95°C温度增加了减少RNase活性的机会，从而为下游结核-MBLA保存更多的RNA。 - 将样品管转移到浸入水浴中的保持架。确保每个样品管的四分之三浸入水中。
- 在95°C下煮20分钟，然后将管子转移到工作台上，在室温下冷却5分钟，然后开始提取RNA。
注：通过孵育热灭活样品和控制在37°C下42天，验证M.结核病杆菌和BCG完全热灭活，以验证生长。在基线处进行600nm（OD600）的光学密度测量，然后每周进行42天的潜伏期。
3. RNA 提取
注：此处描述的RNA提取过程适用于材料表中列出的RNA试剂盒。其他合适的RNA萃取试剂盒可用于不同制造商。
- 提取控制 （EC） 添加
- 将热灭活样品的 1 mL 等位值转移到 1.5 mL 管中。将 EC 的 100 μL 刺入每个样品，关闭管，并通过倒置管子倒置 3 倍混合。
注：EC 随附 TB-MBLA 重要细菌试剂盒（材料表）。
- 将热灭活样品的 1 mL 等位值转移到 1.5 mL 管中。将 EC 的 100 μL 刺入每个样品，关闭管，并通过倒置管子倒置 3 倍混合。
- 细胞沉淀
- 使用台式微离心机，在室温下以 20，000 x g的离心机 10 分钟。移液器从上清液中脱落，留下50μL的沉积物。
- 通过上下移液将950μL的液解缓冲液悬浮在950μL中的沉积物，并将整个悬浮液转移到RNA萃取试剂盒（材料表）附带的浸结基管中。确保管紧闭，并标记管的盖子和侧面。
- 对于细胞水成酶，将管子从步骤 3.2.2 转移到均质器。在 6，000 rpm 下将样品均匀化为 40 s。
- 核酸纯化
- 在室温下，将水电解质从步骤 3.3 以 12，000 x g进行 5 分钟离心。
- 准备新鲜的1 mL管，在每个管中加入300μL的氯仿。
- 在不接触压液基质的情况下，小心地将 1 mL 尖端移出上清液。
- 将上清液转移到含有管和涡旋的氯仿中5秒。离开管子沉淀5分钟或更长时间，直到三个阶段（上、中、下）清晰可见。
- 在室温下，在 12，000 x g下离心 5 分钟。小心地移移上相，并转移到新鲜的1.5 mL管中。
- 在步骤 3.4.5 中的管中，加入 500 μL 的冷 100% 乙醇，关闭管，然后轻轻倒置 3 倍混合。在-80°C孵育15分钟或-20°C30分钟，继续提取，或留在-20°C过夜，以完成第二天的提取。
- 将微离心机设置为 4°C，在开始离心之前冷却至至少 12°C。将管子装入微离心机和离心机20分钟，在13，000 x g。丢弃上清剂，用70%的冷乙醇代替，在13，000 x g下再用离心机10分钟。
注：70%乙醇应用分子级无核酸水制成。 - 丢弃步骤 3.4.7 中的所有上清液，并将管子转移到 50°C 的培养箱中。孵育20分钟，干燥RNA/DNA颗粒。保持管部分打开，使所有乙醇蒸发。
- 将 100 μL 的无核酸酸水添加到干颗粒中，并在室温下孵育 5 分钟。涡旋为3s混合的内容。
注：在此阶段，提取物可在-80°C下储存在冰箱中2~3天或更长时间，直到执行第3.5节。
- 脱氧核糖核酸去除
注：此步骤至关重要，因为提取物中存在 DNA 会使 MBLA 结果失效。本部分基于脱氧核糖核酸去除试剂盒（材料表）。- 制备酶DNase I 10倍缓冲液和DNase I酶的组合，用于样品数量（每个样品10μL缓冲液和1 μL的DNase），外加10%的额外，以覆盖移液造成的任何损失。通过涡旋混合，然后移液器11μL进入每个含有RNA提取物的管。
- 通过涡旋 3 s 混合，然后短暂旋转（10 s 在 13，000 x g下），以去除墙壁上的任何液滴。在37°C下在热块或培养箱中孵育30分钟。将另外1μL的DNase I酶直接加入每个管中，通过涡旋混合好，并在37°C下再孵育30分钟。
- 在DNase孵育结束前10分钟解冻DNase灭活试剂。Vortex 20s 确保同质乳质悬浮液，然后从步骤 3.5.2 将 10 μL 的 DNase 灭活试剂添加到每个 RNA 提取物中。
- 在室温下孵育混合物5分钟。 Vortex 3x在5分钟孵育步骤期间。
- 将混合物在 13，000 x g下离心 2 分钟。小心地将上清液转移到 1.5 mL 无纳塞自由管，而不接触任何失活基质。
- 如果在同一天运行RT-qPCR或-80°C，长期储存，则将RNA提取物储存在冰箱中。
4. 反向转录酶 qPCR
- 对于未知样品，稀释所有RNA提取物，在无Nase水中以1：10的比例使用。通过涡旋 5 s 和短暂向下旋转以去除任何液滴或气泡，混合良好。
- 对于标准曲线的标准样品，从 -80°C 冰柜中取出 Mtb 和 EC RNA 标准，并在室温下解冻。分别制作 Mtb 和 EC 标准样品的 7 倍和 6 个 10 倍稀释。在将混合物从一个管转移到另一个管子之前，先更换提示。
注：标准样品随 TB-MBLA 套件一起提供。 -
主混合准备
注：主混合 （MM） 是 PCR 试剂的解决方案，足以放大所有样品、标准和水，实现无模板控制 （NTC）。用作NTC的水应与提取和制备MM所用的水相同。确保标准、每个RNA样品及其十进制稀释被放大2倍，用于逆转录酶阳性（RT+）反应，1倍用于反向转录酶阴性（RT-）反应。RT-反应是确定脱氧核糖核酸去除效率的控制（表1）。- 将 16 μL MM 传输到每个 PCR 反应管中。
- 将4μL的RNA提取物加入每个RT+和RT-反应管和水到NTC反应管中。
- 将反应管加载到实时PCR机器中，并将PCR条件设定如下：50°C，30分钟，95°C为15分钟，40倍循环在94°C45s，60°C为1分钟，与吸入绿色和黄色通道的氟波波波进行采集。
注：绿色通道是Mtb检测荧光，黄色是提取控制检测荧光。
-
结果解释
注：确保同一样本的重复反应差异不超过 1 个标准差。Mtb 和高于 30 的 EC Cq 值被视为负值。请参阅表 2中的进一步解释详细信息。- 要解释处理响应，请使用标准曲线将 Cq 值转换为细菌负载 （eCFU/mL）。阅读治疗响应，作为治疗随访期间细菌负荷的变化。
注：治疗后细菌负荷的下降意味着积极的反应（即杀灭结核菌的抗结核药物），而细菌负荷没有变化或上升意味着负反应，这可能意味着结核菌对抗结核药物的抗药性或患者没有适当坚持其治疗剂量。TB-MBLA 测量的细菌载量下降与 MGIT 时间增加与培养积极性 （TTP） 相关。
- 要解释处理响应，请使用标准曲线将 Cq 值转换为细菌负载 （eCFU/mL）。阅读治疗响应，作为治疗随访期间细菌负荷的变化。
5. 传输电子显微镜
- 将 2 mL 热灭活培养物和控制装置转移到 2 mL 微离心管中。在 20，000 x g下离心 10 分钟。
- 丢弃上清液，将颗粒悬浮在700μL的细胞固定缓冲液中，并在室温下孵育5分钟以固定细胞。
- 在 16，000 x g下将悬架离心 30 分钟，以获得坚硬的颗粒。丢弃上清液，在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中用 1% 蔗糖代替。将颗粒储存在4°C的蔗糖中，直到分片进行电子显微镜检查。
-
切片和 TEM
注：下面的协议改编自格里菲斯等人28。- 通过在4°C下在PBS中过夜，将细胞颗粒嵌入2.1M蔗糖中，从而冷冻保护细胞颗粒。用冰冷的水洗3倍。
- 冷却液氮中的冷冻细胞颗粒，并安装低温粒。使用低温微孔，在 90 nm 处切割超薄截面。
- 使用PBS中1：1混合物的钨线环（2%甲基纤维素和2.1M蔗糖）取回切割部分。
- 将截面转移到皮奥洛形涂层 150 网状六角铜 TEM 支架（网格），并在 4°C 下存储或继续步骤 5.4.5。
- 在醋酸化薄膜中对比醋酸酯和空气干燥的电体。用冰冷的水清洗电网，然后两滴PBS超过5分钟，干燥15~30分钟。
注：除在环境温度下进行的洗涤步骤外，所有标签步骤均在冰温（液体温度）下执行。
Representative Results
热使所有M.结核病菌失去活性
控制（活细胞）的光密度（OD）随时间而增加，（0.04OD=0.85OD），热灭活样品中未观察到OD变化，分别表示生长和没有增长（图1）27。同样，在MGIT的第3天，对照临床痰变得呈阳性，而热灭活的临床样本直到孵育结束才呈阳性。MGIT Mtb在MGIT中的生长得到了齐尔-尼尔森涂片显微镜和抗原MPT6429的证实。
RNA灭活样品在37°C下稳定4天
热灭活样品在37°C孵育，以确定RNA在细胞热灭活后是否降解。热失活后立即在Day （D）0采集的RNA和在BCG培养物中分离的RNA（图2A-C）和结核病阳性痰（图2D）之间没有差异。
外源性RNase增加热灭活分数中的RNA降解率
为了确定为什么RNA不降解，RNase A酶在热失活之前和/或之后以1000U/mL被外源添加。这导致RNA损失相当于细菌负荷1.5± 0.3 -，1.8 ± 0.2 -，和1.3 ± 0.1 = 在80°C、85°C和95°C的80°C、85°C和95°C的潜伏期分别记录10 eCFU/mL。在热失活之前和/或热灭活后加入RNase的样品中，RNA降解存在差异（图3A-C）。
使用16S rRNA作为参考标记，为TB-MBLA保存足够的RNA
热失活对rRNA的影响在BCG培养物和结核病阳性患者的痰中测量。测定的细菌负荷控制BCG培养，5.3 × 0.2原10 eCFU/mL，比热灭活培养剂的5.1±0.3原热灭活培养（ANOVA p < 0.0001）高0.2±0.1原数10 eCFU/mL，温度为80°C，85°C，95°C（图4A）27。27同样，对照患者痰的细菌负荷，7.1原10 eCFU/mL，比80°C、85°C和95°C（图4B）27时的6.3~0.41原数/mL高0.8~0.1°C。 Figure 4B27在测试的两种样品中，细菌负荷降低是<1log。
Sidak 的多次比较测试显示，95 °C 的细菌负载与 80°C 和 85 °C（p = 0.001）的细菌负载之间存在显著差异。在所有温度下，结核病样本中未发现差异，p = 0.8。
大多数 Mtb 细胞中的热不会破坏细胞壁的完整性
利用传输电子显微镜（TEM），我们调查了细胞是否被热失活所变。在TEM检查之前，细胞的甲醛固定颗粒的薄段被制成并嵌入到电子丰富的介质中。在放大率较低和更高的水平对细胞进行检查后发现，细胞壁完好无损，细胞内脂质可见。细胞形态学上出现长长，但没有被分泌。图5显示了分枝杆菌细胞在不同放大倍率下的形态。前两个面板揭示了细胞内脂质体和不受阻碍的绳索状脐带，这是分枝杆菌物种的典型形态特征。较低的两个面板的放大倍率扩大脂质体的视图，并揭示一些微细胞内结构。
TB-MBLA 测量的细菌载荷与 MGIT 培养时间成正相关
对于对治疗作出反应的患者，在治疗过程中，细菌负荷每周平均下降1分10 eCFU/mL。快速响应器清除得更快，在 2 周的治疗前转换为负（零细菌负荷）。TB-MBLA 测量的细菌载量下降与 MGIT 培养时间的上升相对应为积极 （TTP）。图 6显示了细菌负载与 MGIT TTP 之间的反向相关性。然而，区别在于，TB-MBLA 结果在 4 小时内可用，结果时间与细菌负荷水平无关。这与 MGIT 文化测试的 5-25 天不同。非结核细菌的污染进一步危害了培养试验的结果。
图1：验证 BCG 在 80 °C（点型线曲线）、85 °C（点虚线模式曲线）和 95 °C（破折号模式曲线）下失活。控制（黑色曲线）是活（未加热）BCG培养成相同的生长介质。在孵化期培养的OD增加证实了控制的增长。这个数字是从萨比蒂等人27号修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：热灭活样品中可量化RNA的稳定性在37°C下孵育4天（D0+D4）。（A）， （B） 和 （C） 分别显示 BCG 培养物在 80 °C、85 °C 和 95 °C 下灭活。（D） 显示在 80°C 下灭活的结核病痰。该控件是同一样本的未处理（实时）部分。误差条 = 标准差。三次重复，每次运行复制 9 个。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：外源添加RNase A酶后，RNA降解较高。（A） 热失活 （HI） 在 80 °C， （B） HI 在 85 °C 和 （C） HI 95 °C.误差条 = 均值的标准误差。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：使用16S rRNA作为标记，保存足够的RNA，用于TB-MBLA细菌负荷测量。（A） 从体外 BCG 培养物估计的细菌载荷。（B） 从结核病阳性痰估计的细菌负荷。误差条 = 均值的标准误差（n = 18 和 20 分别复制A和B）。这个数字是从萨比蒂等人27号修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。
图5：在95°C下失活20分钟后，完整Mtb杆菌的电子显微图。用TEM观察到完好的细胞壁和无数的脂质体。顶部：一组细胞的低放大倍率图像，显示未受阻碍的支点线状脐带形态和细胞内脂质体。底部：高放大率的顶部面板，以扩大脂质体的视图，并揭示一些微细胞内结构。请点击此处查看此图形的较大版本。
图6：接受抗结核治疗的患者12周治疗反应曲线显示TB-MBLA测量细菌负荷和MGIT TTP的反向相关性。当患者对治疗做出反应时，当 TTP 上升（红色曲线）时，细菌负荷（蓝色曲线）下降。请点击此处查看此图形的较大版本。
| 主混合 | RT 阳性反应 | RT 负反应 |
| 每个反应的体积 x 否。反应 = 5 | 每个反应的体积 x 否。反应 = 5 | |
| 定量混合 | 10.0 μL | 10.0 μL |
| Mtb16S 底漆混合（F + R） | 0.4 μL | 0.4 μL |
| Mtb16S 探头 | 0.2 μL | 0.2 μL |
| EC 底漆混合（F = R） | 0.4 μL | 0.4 μL |
| EC 探头 | 0.2 μL | 0.2 μL |
| RT酶 | 0.2 μL | ------- |
| 无纳塞免费水 | 4.6 μL | 4.8 μL |
| 总容量 | 16 μL | 16 μL |
表1：TB-MBLA qPCR的主混合制备指南。
| 类型 | MTB 通道 | EC 通道 | 解释 |
| 样品 | 积极 | 积极 | 有效 |
| 样品 | 积极 | 负 | 定 |
| 样品 | 负 | 积极 | 有效 |
| 样品 | 负 | 负 | 无效 |
| MTB + 控制 | 积极 | 负 | 有效 |
| 萃取控制 （EC） | 负 | 积极 | 有效 |
| DNA控制 | 负 | 负 | 有效 |
| 负控制 （NTC） | 负 | 负 | 有效 |
表2：TB-MBLA成果解释指南。
Discussion
本文提出，在80°C、85°C和95°C下进行20分钟的热处理可有效使结核病标本失去活性，从而有可能在非CL3设施中进行结核病-MBLA，而不会给实验室工作人员带来感染风险。这些发现证实了先前研究中的观察结果，同时与一些关于Mtb25，30,30热失活的有效性的观察结果进行了对比。例如，一些报告表明，在80°C加热对高杆菌负荷样本25、31、32、3331,32,33无效。25在我们的研究中，通过确保所有痰和纯培养物以每15 mL离心管1 mL体积加热，避免了高密度的内层效应，从而提供了足够的空间，使样品的每个部分都沸腾了27。
热失活后RNA保存使得进行结核-MBLA成为可能。这一发现与两项研究一致，证明热失活后RNA保存1212，34。34表明热灭活样品中的RNA在37°C下稳定4天，这意味着实验室可以通过在室温下保持灭活样品一周进行批量测试。通过应用需要冷藏或冷冻的RNA萃取试剂盒，在室温下保持热灭活样品的能力消除了冷链和3类实验室在资源有限环境中进行TB-MBLA的需要。
使用 16S rRNA 作为标记，损失不到 1log 细菌负载。虽然活样和热灭活样品之间存在差异，但热失活损失的量太小，无法影响下游结果。温度升高不会增加RNA损失量，这意味着观察到的损失与热处理无关。高温热处理最有可能导致细胞系统化，使RNA受到RNases的降解。事实上，在热灭活分数中外生添加RNase A会增加RNA降解的速度。沸腾并没有减少RNase的活性，这意味着它是一种非常有弹性的蛋白质。
需要注意的是，平均RNA降解为1.5原10 eCFU/mL并不是一个很大的损失。为此，我们假设加热酶的Mtb杆菌的一小部分，从而暴露少量RNA到RNase。利用TEM，我们发现Mtb细胞壁的形态和完整性几乎没有受到95°C加热的影响。这意味着它可能需要各种生理因素和足够的RNases供应，如在宿主显著降解RNA35，36。,36此外，作为一种结构核糖体，16S rRNA可能不太受RNase37，38的影响。37,38单个Mtb细胞含有+700核糖体/0.1毫米3的细胞质37，这意味着每个细胞的rRNA含量更高。因此，少量的RNase可能具有较小的影响38。大量核糖体的存在使结核病-MBLA在敏感性和检测低负担结核病患者的能力方面具有优势。
TB-MBLA和MGIT培养TTP测量的细菌载荷之间存在很强的相关性。这在一定程度上证实了细菌负荷是培养积极性的驱动因素。然而，TB-MBLA的优点是直接定量样品中的细菌负荷，并且不需要在检测前进行Mtb细胞增殖。这与培养物形成鲜明对比，培养者的积极性取决于细菌负荷水平和Mtb细胞增殖率。未来的研究将评估结核病-MBLA工作流程，包括热失活，在常规的临床环境中。该研究还将探索具有一系列细菌载荷的样品，以了解从正到负（即热灭活后细菌较少的样本）的数量。
用于细菌载量分子定量的TB-MBLA协议是细菌学中首创的。该方法直接从患者痰中定量Mtb杆菌负荷，无需培养。这使得它更快，并增加了其潜力，告知临床决定病人的进展。热失活步骤降低了感染风险，并增加了TB-MBLA在没有第3类实验室的环境中的适用性。在样品热失活后，有三个协议步骤来实现TB-MBLA结果：RNA萃取、逆转录酶（RT）-qPCR和qPCR结果分析。
从患者样本中分离Mtb RNA的效率越高，结果的质量就越高。需要注意的是，痰样本的质量会影响分离的RNA量。例如，唾液痰被认为是低质量的，并且与低杆菌负荷有关。这意味着培训患者进行优质痰期望培训非常重要。为了评估提取过程的效率，提取控制（即已知数量的非Mtb细胞）在RNA提取之前被刺入样品中。提取控制检索证实了RNA提取过程的效率。RNA 分离过程无效，除非已检索提取控制。鉴于Mtb是一个有弹性的有机体，机械性结塞成为这一过程的关键部分。在存在珠子（即解缝基质）的情况下，在高速（600 rpm）下样品的均质化可有效地使细胞被解。水解物的纯化会产生含有RNA和DNA的提取物。脱氧核糖核酸是RNA提取的关键最后一步。TB-MBLA 旨在通过量化RNA来测量可行的杆菌。因此，未能去除基因组DNA意味着结果将有一个信号从DNA，这不是一个良好的标记细胞生存能力6。
RT-qPCR 是一种双工双面式运行双标记探头，用于 Mtb 和提取控制。它涉及三个步骤：在50°C下通过逆转录酶进行30分钟反向转录，在95°C下变性15分钟，在94°C和60°C下40次扩增周期。从探针中获取荧光发生在60°C（即片段伸长阶段）。请务必注意，TB-MBLA 已使用特定的 qPCR 机器进行了优化，因此使用其他 qPCR 平台的操作员应优化其设备的条件。在没有RT的情况下，通过运行每个样本的单一反应来控制脱氧核糖核酸去除的效率。这种反应的阳性结果表示DNA的不完全去除。具有高DNA量的高负担样本可能需要两倍的DNas酶才能完全去除DNA。幸运的是，在高杆菌负荷样本中，少量DNA的存在不太可能影响RNA的结果。核糖核酸RNA，TB-MBLA靶点，自然以DNA37的两倍发生。在PCR中，无模板控制（NTC），这是用于溶解PCR试剂的水，用外源DNA或RNA控制交叉污染。NTC 中的阳性信号意味着交叉污染和结果被视为无效。这意味着使用这种水构成的所有解决方案都必须丢弃，并使用一瓶新鲜的水制造新的溶液。建议将 PCR 水保持在单独的等位点中，以避免污染所有水。正控制 （Mtb RNA） 用于控制 PCR 的整体效率。
结果分析涉及使用标准曲线将PCR Cqs转化为细菌载荷（即估计每mL的菌落形成单位）。设置和优化标准曲线对于此步骤至关重要。建议标准曲线效率为 0.95⁄1。在患者或其他测试样本在机器上运行之前，应设置和优化 MTb 和提取控制的标准曲线。标准样品随 TB-MBLA 套件一起提供。推荐对PCR进行十倍的RNA提取物稀释。这意味着细菌负荷结果必须乘以 10 倍才能获得每 mL 的最终细菌载荷结果。需要注意的是，30以上的Cq被认为对结核病-MBLA呈阴性。在不同时间点测量的至少两种潜在细菌负荷结果需要对治疗反应进行推断。强烈建议在开始治疗之前，两个结果之一应为基线。然而，如果患者启动细菌负荷评估发生在治疗中途，必须有第二次点细菌负荷测量来评估治疗反应。TB-MBLA可在治疗3天的空间内区分细菌负荷，但理想的是间隔7天进行两次细菌负荷测量。
虽然该协议为治疗反应生成信息性定量结果，但它仍然在很大程度上是手动的，并且需要大量的RNA提取时间。忙碌实验室的技术人员这次可能没有。正在作出安排，以自动化RNA提取和PCR过程。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究是由欧洲和发展中国家临床试验伙伴关系（EDCTP）和泛非洲生物标志物扩展计划（PanBIOME）赠款SP.2011.41304.008资助的。还获得圣安德鲁斯大学医学院研究补助金。这份手稿和TB-MBLA议定书作为视觉资源出版，是苏格兰资助理事会和全球挑战研究基金向圣安德鲁斯大学提供资金的结果。感谢提供临床痰标本的马普托妇产医院和马瓦兰保健中心，以及帮助临床痰标本进行热灭活实验的马普托结核病治疗股小组。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat inactivation: | |||
| 15 mL Centrifuge tubes | Fisher-Scientific | 10136120 | 50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved |
| 15 mL Wire Tube rack | Fisher-Scientific | 11749128 | Other brands with similar make can be used |
| Water bath | Fisher-Scientific | 15700619 | Other brands with similar make can be used |
| RNA extraction: | |||
| Chloroform | Sigma | 372978-1L | Not necessary in other RNA extraction kit brands |
| Ethanol, absolute 99-100% | Sigma | 51976-500ML-F | Larger volume available |
| Extraction control | SOI group St Andrews | VitalbacteriaEC | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit |
| FASTRNA Pro blue Kit | MP Biomedicals | 116025050 | Supplied with lysing matrix tubes |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Qiagen, Fisherscientific can also supply same product |
| Precellys 24 homogeniser | VWR | 432-3750 | FastPrep MP Biomedicals can be used too |
| Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus | Fisher-Scientific | 15352117 | Other brands with similar capacity can be used |
| Thermomixer | Eppendorf | BLD-455-010C | Works with 1-2 mL tubes |
| TURBO DNA-free | Fisher-Scientific | AM1907M | Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures. |
| RT-qPCR: | |||
| Primers and Taqman probes | SOI group St Andrews | VitalbacteriaPP | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX. |
| QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit | Qiagen | 204845 | PCR mix plus the RT enzyme |
| RotorGene Q 5plex machine | Qiagen | 9001580 | Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc. can be used |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 mL | Qiagen | 981103 | Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed. |
| Non-heat inactivation Sample preservation materials | |||
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | 93313 | Supplied ready to use |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Many competent suppliers |
| Guanidine thiocyanate (GTC) | Promega | V2791 | Promega brand recommended for quality |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Ensures that GTC solution is free of nucleases |
| General materials (used but not specific to TB-MBLA) | |||
| 500 mL plastic containers | 734-5087 | Nalgene brand recommeded | |
| Biological waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Chemical waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Disposable gloves, chemical resistant | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-20 °C) | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-80 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fridge (0-8 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fume hood | For safe handling of toxic reagents | ||
| Laboratory scales | For accurate measurement of reagents | ||
| Measuring cylinders, plastic | To ensure accurate measurement of reagents | ||
| PCR reaction tubes | Should be suitable to the PCR instrument used | ||
| Pipettes and matching sterile filtered pipette tips, | DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended | ||
| Qiagility loading plates | Qiagen | 5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates | |
| QIAgility Pipetting Robot | Qiagen | Important for high throughput pipetting | |
| Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes | Chemical-resistant and autoclavable recommended | ||
| RNase Away (Removes RNases enzymes from working space) | Fisher Scientific | 10666421 | Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme |
| Safety goggles, chemical resistant | Fisher Scientific | Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents. | |
| Sterile Pasteur pipettes, 1.5-3 mL | Many competent suppliers | ||
| Sterile RNAse-free microtubes | 1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended | ||
| TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse | Ensure it is freshly prepared or prepared within a week | ||
| Vortex | Genie 2 brand recommended | ||
| Transmission electron microscopy | |||
| Glutaldehyde (8%) | Sigma | G7526-10ML | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| HEPES (pH 7.4, 100 mM) | Sigma | H4034-25G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Leica FCS ultracryo | Leica | Cryomicrotome for tissue sectioning | |
| Methyl cellulose | Agar Scientific | AGG6425 | Cold mounting resin |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Sigma | P6148-500G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Sucrose | Sigma | 84097-250G | Preservation and mounting medium |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | AGR1260A | Universal Electron microscopy stain |
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