Summary
痰の熱不活化後に行われる結核分子細菌負荷検定試験について述べている。熱不活性化は痰サンプルを非感染にし、結核分子試験のための封じ込めレベル3の実験室の必要性を排除する。
Abstract
結核は、国連(UN)によって Mycobacterium tuberculosis危険なカテゴリーB生物学的物質として分類される病原体である結核菌(Mtb)によって引き起こされる。労働者の安全のために、Mtbを運ぶと推定されるすべてのサンプルの取り扱いは、封じ込めレベル(CL)3の実験室で行われなければならない。TB分子細菌負荷アッセイ(TB-MBLA)試験は、16S rRNAのプライマーおよび二重標識プローブを使用してMtbバシラリー負荷を定量化する逆転写酵素定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)試験です。我々は、TB-MBLAのRNAを保存しながら、結核サンプルを非感染性にレンダリングするために熱不活性化の使用を説明する。密閉された15 mL遠心分離管中の痰サンプルの1 mLのアリコートは、Mtbバチルを不活性化するために80°C、85°C、または95°Cのいずれかで20分間沸騰する。42日間の不活化および制御(生)サンプルの培養は、結核の死亡を確認した。不活性化されたサンプルは、抽出制御の100 μLでスパイクされ、RNAは標準的なRNAの分離手順に従って抽出されます。熱処理サンプルの培養では増殖は認められなかった。この単離されたRNAは、リアルタイムRT-qPCRを受け、Mtb 16S rRNA遺伝子中の特定の標的を増幅し、定量サイクル(Cq)の形で結果を生じる。標準曲線は、Cqを細菌負荷、またはmL当たりのコロニー形成単位(eCFU/mL)の推定コロニーに変換するために使用されます。Cqとサンプルの細菌負荷との間には逆の関係があります。制限は、熱不活性化が一部の細胞をライスし、RNAをRNasesにさらして<1 log10eCFU/mL(すなわち、<10 CFU/mL)を失うということです。さらなる研究は、熱不活性化による偽陰性の結果を引き起こす非常に低負担患者の割合を決定する。
Introduction
1,結核菌(Mtb)によって引き起こされ、結核の新しい症例(TB)の7 x10以上が世界的に報告されています。この傾向を逆転させるために、世界保健機関(WHO)は、効果的な診断および治療ツールの開発を含む3つの柱のアプローチを開始しました 3.国連によって危険な生物学的物質Bに分類され、Mtbに陽性と推定されるサンプルを扱うには、3の封じ込めレベル(CL)が必要です。CL3の実験室は造り、維持するために高価である。その結果、ほとんどの国は地域または国レベルで集中した結核文化サービスを提供しています。これは、スミア顕微鏡が周辺医療施設で最も利用可能な診断ツールであることを意味します。
レベル4の医療施設で、Xpert MTB/RIFのような迅速な分子試験を実施するWHOの承認があります, 主に地区レベル4に位置しています,5.一部の地区は非常に大きく、一部の人々にはアクセスが少ないです。有益ながら、Xpert MTB/RIFはMtb DNAを検出することによって働く。DNAは細胞が死んだ後に長く生存する安定した分子であり、したがって治療応答55,66を監視するために重要な生存細胞を測定するための良い基準ではない。RNAベースのアッセイは、,生存細胞7、8、9、10、11、12、138,9の正確な測定のための代替手段,10,1112を13提供する。7RNAは、リボソームRNA(rRNA)、転写RNA(tRNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)など、様々な安定性の異なる種に存在します。メッセンジャーRNAは、遺伝子発現に関連しており、したがって細胞活性および生存率14と最も密接に関連している。Mtbのような病原体は不活性(休止状態)に存在することが知られているが、生存可能な状態15、16であるため、16遺伝子発現の欠如は細胞死と同等ではないことに注意することが重要である。したがって、rRNAのような安定したRNA種は、生存細胞の活性状態と不活性状態の両方のより良いマーカーである。
大腸菌を用いて、シェリダンはコロニー形成単位(CFU)によって測定された細菌増殖に比例して16S rRNAが17を数える。CFU数と大腸菌が抗生物質にさらされたときの16S rRNAの同時減少があった。細胞死後のrRNAの低下は、細胞生存率13,17,17のマーカーとして使用することができる指標であった。この原理から、結核分子細菌負荷アッセイ(TB-MBLA)は、抗結核療法11、18、19,18,19の患者に対する治療応答のマーカーとして生じる結核菌負荷を測定するためにM.結核16S rRNAを標的にするために開発された。我々はさらに、結核菌のリシスを反映し、異なる環境環境における堅牢性を有する細胞抽出制御を組み込むためにTB-MBLAを開発し、最適化した。TB-MBLAの手順では、Mtb細胞が作業者の安全性を確保するために完全にlysedされるまで、MtbからのRNA単離の第一歩をCL3の実験室で行う必要があります。また、レベル4の有毒物質であるグアニジンチオシアネートにおいて−80°Cで維持される遡及バッチ分析のためのサンプル保存も含まれる。このため、熱を使用してMtbを不活性化し、サンプルを安全にレンダリングし、塗抹顕微鏡レベルの実験室で行います。
実験室や臨床応用における熱の使用は、何世紀にも及ぶ21、22,22の周りにあった。しかし、Mtbのような一部の微生物は殺しにくく、熱への暴露が短くてすべての細胞23,24,24を殺すには不十分である。ある研究では、80°Cでの結核培養の20分加熱は、PCR25に必要なDNAを破壊することなく、すべてのMtbバチルを殺したことを明らかにした。続いて、多くの実験室DNA抽出技術が現在95°Cに加熱されている。同じ原理を適用して、80°C、85°C、または95°Cでの沸騰中の結核サンプルが、結核-MBLAを行うのに十分なRNAを維持しながらMtbを不活性化することを示しています。不活性化培養または痰は、定量化可能なrRNAの量を減らすことなく、室温で密閉容器内で維持したり、7日間冷蔵することができます。
現在研究用(RUO)試験として使用されているTB-MBLAは適応可能であり、痰、肺組織、脳脊髄液を含む異なるサンプルタイプに適用されている。気管支肺胞液、血液、その他のサンプルタイプにはまだ適用されていません。サンプルとして痰を用い、アフリカにおけるマルチサイト評価(未発表データ)および以前の出版物18,26の結果は、MBLA26の感受性が抗酸菌増殖指標チューブ(MGIT)液培養と一致することを示している。しかしながら、TB-MBLAは、より速く、数日または数週間の培養とは対照的に数時間の結果を与え、特異的、試料中の非結核微生物の影響を受けない、及び疾患重症度の定量的尺度を与える。WHOは最近、結核治療2を監視するためのスミア顕微鏡と培養に代わる候補としてTB-MBLAを認識している。
この記事では、サビティらで公開された熱不活性化とTB-MBLAプロトコルについて詳細に説明します。この詳細なプロトコルは、世界中の TB-MBLA ユーザーにワンストップのビジュアル リソースを提供します。
Protocol
1. サンプルの準備
-
文化
- クリーンベンチまたはクラス1のキャビンで働き、指数相バチルス・カルメット・ゲリン(BCG)培養物の1mLのアリコートを15mLプラスチック遠心管に収穫します。チューブをしっかりと閉じます。
注:5 mL サンプル全体を処理するには、5 本の 15 mL 遠心分離チューブが必要です。
注意: 結核の文化を扱う場合は、バイオセーフティキャビネットが必要です。
- クリーンベンチまたはクラス1のキャビンで働き、指数相バチルス・カルメット・ゲリン(BCG)培養物の1mLのアリコートを15mLプラスチック遠心管に収穫します。チューブをしっかりと閉じます。
-
患者痰標本
- 換気の良い空間で作業し、鼻マスクを着用し、慎重に標本カップを開き、ピペット1 mLアリコートを15 mLプラスチック遠心管に入れ、チューブをしっかりと閉じます。
注:広口先端は、ピペット痰に推奨されます。はさみを使用して、1 mL先端口の細かい部分を切り取り、より広い口を作ります。
- 換気の良い空間で作業し、鼻マスクを着用し、慎重に標本カップを開き、ピペット1 mLアリコートを15 mLプラスチック遠心管に入れ、チューブをしっかりと閉じます。
2. 熱不活性化
- 試料調製の前に、水浴を95°Cに設定します。
注:95°Cの温度はRNase活性を低下させる可能性を高め、従って下流のTB-MBLAのためのより多くのRNAを保存する。 - サンプルチューブを、水浴に浸したホールディングラックに移します。各サンプルチューブの4分の3が水中に浸かっていることを確認してください。
- 95°Cで20分間沸騰させ、チューブをベンチに移して室温で5分間冷却してから、RNA抽出を開始します。
注:結核菌およびBCGの完全な熱不活性化は、増殖を確認するために37°Cで37°Cの熱不活性化サンプルおよびコントロールをインキュベートすることによって検証された。600 nm (OD600)で光学密度測定を行い、その後、42日間のインキュベーション期間について毎週行った。
3. RNA抽出
注:ここで説明する RNA 抽出プロセスは、材料表に記載されている RNA キットに関するものです。異なる製造業者による他の適切なRNA抽出キットを使用することができます。
- 抽出制御 (EC) の追加
- 熱不活性化サンプルの1 mLアリコートを1.5mLチューブに移します。ECの100μLを各サンプルにスパイクし、チューブを閉じ、チューブを上下逆さまに3倍に反転して混ぜます。
注:ECはTB-MBLAの重要な細菌キット(材料のテーブル)と供給されます。
- 熱不活性化サンプルの1 mLアリコートを1.5mLチューブに移します。ECの100μLを各サンプルにスパイクし、チューブを閉じ、チューブを上下逆さまに3倍に反転して混ぜます。
- 細胞沈下
- ベンチトップのマイクロ遠心分離機を使用して、室温で10分間20,000 x gのチューブを遠心します。上清からピペットを取り除き、50 μLの堆積物を残す。
- 上下にピペットを入れ、950μLのリシスバッファーに沈降を中断し、RNA抽出キットに付属のライジングマトリックスチューブに懸濁液全体を移す(材料表)。チューブがしっかりと閉まっていることを確認し、蓋とチューブの側面の両方にラベルを付けます。
- 細胞のリシスの場合、工程3.2.2からホモジナイザーにチューブを移します。サンプルを6,000rpmで40sに均質化します。
- 核酸精製
- ステップ3.3からリセートを室温で5分間12,000 x gで遠心分離します。
- 新鮮な1 mLチューブを準備し、各チューブに300 μLのクロロホルムを加えます。
- 1 mL チップを使用して、上清を慎重にピペットを取り除き、ラッシングマトリックスに触れることなく。
- 上清をチューブと渦を含むクロロホルムに5分間移動し、3段階(上、中央、底部)がはっきりと見えるまで5分以上落ち着きます。
- 室温で5分間12,000 x gで遠心分離機。慎重に上相をピペットし、新鮮な1.5 mLチューブに移します。
- ステップ3.4.5のチューブに、氷冷100%エタノールの500 μLを加え、チューブを閉じ、3倍の逆さまに軽く反転して混ぜます。チューブを-80°Cで-80°Cで15分間、または-20°Cで30分間インキュベートし、抽出を継続するか、-20°Cで一晩放置して翌日抽出を完了します。
- マイクロ遠心分離機を4°Cに設定し、遠心分離を開始する前に少なくとも12°Cに冷やします。チューブをマイクロ遠心分離機と遠心分離機に20分間13,000 x gでロードします。上清を捨て、70%の氷冷エタノールに置き換え、遠心分離機を13,000 x gでさらに10分間交換してください。
注:70%エタノールは、分子グレードヌクレアーゼフリー水で作られるべきです。 - ステップ3.4.7からすべての上清を捨て、50°Cに設定されたインキュベーターにチューブを移します。RNA/DNAペレットを乾燥させるために20分間インキュベートします。チューブを部分的に開けて、すべてのエタノールの蒸発を可能にします。
- 乾燥ペレットに100μLのヌクレアーゼフリー水を加え、室温で5分間インキュベートします。3 sの渦は内容物を混合する。
注:この段階では、抽出物は、セクション3.5が実行されるまで-80°Cで2〜3日間、または-80°Cで長期間保存され得る。
- DNA除去
注:抽出内の DNA の存在は MBLA の結果を無効にするため、このステップは重要です。このセクションは、DNA除去キット(材料表)に基づいています。- サンプル数(10μLのバッファーと1サンプル当たり1μL)に加えて、ピペットによる損失をカバーするために、酵素DNase I 10xバッファーとDNase I酵素の混合物を調製します。ボルテックスで混合し、その後、RNA抽出物を含む各チューブにピペット11μLを混合します。
- 3 sをボルテックスして混ぜてから、短時間回転(13,000 x gで10s)、壁の液滴を除去します。ホットブロックまたはインキュベーターで30分間37°Cでインキュベートします。各チューブに直接1μLのDNase I酵素を加え、ボルテックスでよく混ぜ合わせ、さらに30分間37°Cでインキュベートします。
- DNaseインキュベーション終了の10分前にDNase不活性化試薬を解凍する。ボルテックス20 sは、均質で乳白色の懸濁液を確保し、ステップ3.5.2から各RNA抽出物に10μLのDNase不活性化試薬を加えた。
- 5分間のインキュベーション工程中に室温で5分間ボルテックス3倍をインキュベートします。
- 2分間13,000 x gで混合物を遠心分離します。
- RT-qPCRを同日または-80°Cで実行して長期保存する場合は、RNA抽出物を冷蔵庫に保管してください。
4. 逆転写酵素 qPCR
- 未知のサンプルの場合、RNaseフリーウォーターで1:10比で使用されるすべてのRNA抽出物を希釈します。5sの渦によってよく混ぜ、一時的に回転して液滴や気泡を取り除きます。
- 標準曲線の標準サンプルの場合は、-80°Cの冷凍庫からMtbおよびEC RNA標準を取り、室温で解凍します。MtbおよびEC標準サンプルの7個と6個の10倍希釈液をそれぞれ作ります。1つのチューブから別のチューブに混合物を転送する前に、チップを変更します。
注:標準サンプルは TB-MBLA キットと共に提供されます。 -
マスターミックスの準備
注:マスターミックス(MM)は、テンプレートなし制御(NTC)のすべてのサンプル、標準、および水を増幅するのに十分なPCR試薬の溶液です。NTCとして使用される水は、抽出およびMMの調製に使用されるのと同じ水である必要があります。RT-反応とは、DNA除去の効率を決定する制御である(表1)。- 各PCR反応チューブに16μLのMMを移します。
- 各RT+反応チューブとRT-反応チューブに4μLのRNA抽出物を加え、NTC反応管に水を加えます。
- 反応管をリアルタイムPCR機にセットし、PCR条件を設定する:30分間50°C、15分間95°C、45sの94°Cで40倍のサイクル、緑と黄色のチャネルで吸収するフルオロフォアでの取得で1分間60°C。
注:緑色のチャネルはMtb検出フルオロフォアで、黄色は抽出制御検出フルオロフォアです。
-
結果解釈
注:同じサンプルの重複する反応が 1 標準偏差より大きく異ならないようにしてください。Mtb および EC Cq の値が 30 より大きい場合は、負と見なされます。表 2の詳細な解釈を参照してください。- 治療応答を解釈するには、標準曲線を使用してCq値を細菌負荷(eCFU/mL)に変換します。治療フォローアップ期間における細菌負荷の変化として治療応答を読み取る。
注:治療後の細菌負荷の低下は陽性反応(すなわち、結核菌を殺す抗結核薬)を意味するが、細菌負荷の変化または上昇は否定的な反応を意味し、抗結核薬または患者に対する結核菌の耐性を意味するかもしれない。TB-MBLAによって測定された細菌負荷の低下は、MGIT時間の増加と培養陽性(TTP)と相関する。
- 治療応答を解釈するには、標準曲線を使用してCq値を細菌負荷(eCFU/mL)に変換します。治療フォローアップ期間における細菌負荷の変化として治療応答を読み取る。
5. 透過電子顕微鏡
- 2 mL の熱不活化培養液およびコントロールのアリコートを 2 mL マイクロ遠心分離管に移します。20,000 x gで10分間の遠心分離機.
- 上清を捨て、ペレットを700μLの細胞固定バッファーにサスペンドし、室温で5分間インキュベートして細胞を固定します。
- 懸濁液を16,000xgで30分間遠心しg、硬質ペレットを得た。上清を捨て、リン酸緩衝生理食塩(PBS)で1%スクロースに交換します。ペレットをスクロースに4°Cで保管し、電子顕微鏡用に切り離します。
-
セッティングとTEM
注:以下のプロトコルはグリフィスら28.- 細胞ペレットをPBS中の2.1Mスクロースに一晩4°Cで埋め込んで凍結保護する。氷冷水で3倍洗います。
- 液体窒素中の凍結保護された細胞ペレットを冷却し、それらを凍結ミクロトミースタブをマウントします。クライオミクロトームを使用して、90nmで超薄切片を切断する。
- PBSで2%メチルセルロースと2.1 Mスクロースの1:1混合物のタングステンワイヤーループを使用して切断されたセクションを取得します。
- ピオロホルムコーティング150メッシュ六角形の銅TEMサポート(グリッド)にセクションを移し、4°Cで保存するか、ステップ5.4.5に進みます。
- 酢酸メチルのフィルムでウラニル酢酸塩と空気乾燥のグリッドを対比します。氷冷水でグリッドを洗浄し、その後にPBSを5分間2滴、15〜30分間乾燥させます。
注:全てのラベリングステップは、周囲温度で行った洗浄工程を除き、氷温(液温)で行った。
Representative Results
熱はすべての結核菌を不活性化する
コントロール(生細胞)の光学密度(OD)は時間の経過とともに増加し、(0.04OD-0.85OD)、熱不活化サンプルではOD変化が認められず、それぞれ成長と成長がないことを示す(図1)27。同様に、対照臨床痰はMGITで3日目までに陽性に成長したが、熱不活性化臨床サンプルはインキュベーションの終わりまで陽性にフラグを立てなかった。MGITにおけるMtbの成長は、Ziehl-Neelsenのスミア顕微鏡および抗原MPT6429によって確認された。
不活性化サンプル中のRNAは37°Cで4日間安定
熱不活性化サンプルを37°Cでインキュベートし、細胞の熱不活化後にRNAが分解するかどうかを判断した。熱不活性化直後のDay(D)0で回収されたRNAと、D1、2、3、および4で単離されたRNAとの間には、BCG培養物(図2A-C)とTB陽性痰の間に違いは見つからなかった(図2D)。
外因性RNaseは、熱不活化画分におけるRNA分解速度を増加させる
RNAが分解しない理由を特定するために、RNase A酵素は熱不活性化の前および/または後に1,000 U/mLで外因的に添加されました。これにより、4日間のインキュベーションで、細菌負荷1.5 ±0.3-、1.8±0.2-、1.3±0.1-log10 eCFU/mLを80°C、85°C、95°Cでそれぞれ発生しました。RNaseが熱不活性化の前および/または後に添加されたサンプルで分解されるRNAに違いがあった(図3A-C)。
16S rRNAを基準マーカーとして使用する TB-MBLA に対して十分な RNA が保存される
rRNAに対する熱不活性化の影響は、結核陽性患者からのBCG培養および痰で測定された。測定された対照BCG培養の細菌負荷は、5.3±0.2ログ10 eCFU/mL、0.2±0.1ログ10 eCFU/mLを合わせた熱不活化培養物(ANOVA p<0.0001)で80°C、85°C、および10 25°C)Figure 4A同様に、対照患者痰の細菌負荷は、7.1ログ10 eCFU/mL、80°C、85°C、および95°Cで組み合わせた6.3±0.41ログ10eCFU/mLよりも高い0.8±0.1ログ10 eCFU/mLであった(10 図4B)27。細菌負荷低減は、試験した2種類のサンプルで<1logであった。
シダックの多重比較試験では、95°Cの細菌負荷と80°Cと85°C(p = 0.001)の間に有意な差が見られた。すべての温度でTBサンプルに差は見つからなかった、p = 0.8。
細胞壁の完全性は、Mtb細胞の大部分の熱によって破壊されない
透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、細胞が熱不活性化によって細胞を取り上げたかどうかを調べた。細胞のパラホルムアルデヒド固定ペレットの薄い部分を作り、TEMによる検査の前に電子リッチ培地に埋め込んだ。より低いおよびより高い倍率で細胞を検査すると、無傷の細胞壁および目に見える細胞内脂質体が明らかになった。細胞は形態学的に細長く現れたが、lysedは現れていない。図5は、異なる倍率でのマイコバクテリウム細胞の形態を示す。上の2つのパネルは、細胞内脂質体と、抗酸菌種の典型的な形態学的特徴である妨げられていないロープ状のコードを明らかにする。下の2つのパネルは、脂質体の視野を拡大し、いくつかのマイクロ細胞内構造を明らかにする高い倍率である。
TB-MBLAによって測定された細菌負荷は、MGIT培養時間と陽性に反比例する
治療に応答する患者の場合、細菌の負荷は治療の過程で週平均1ログ10 eCFU / mLで低下します。高速応答者はより速くクリアし、2週間の治療によって負(細菌負荷ゼロ)に変換する。TB-MBLAによって測定された細菌負荷の低下は、MGIT培養時間の陽性(TTP)の上昇に対応した。図 6は、細菌負荷と MGIT TTP との間に見られる逆相関を示しています。しかし、違いは、TB-MBLAの結果は4時間で利用可能であり、結果までの時間は細菌負荷のレベルとは無関係であるということです。これは MGIT の培養テストの 5 ~ 25 日とは対照的です。非結核菌の汚染は、培養試験の結果をさらに損なう。
図1:80°C(ドットパターン曲線)、85°C(ドット・ダッシュパターン曲線)、95°C(破線曲線)におけるBCG不活性化の検証。コントロール(黒曲線)を、同じ増殖培地に接種したBCG培養物を生きた(非加熱)した。コントロールの成長は、培養期間にわたる培養のODの増加によって確認された。この図は、Sabiitiら27.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:37°Cで4日間インキュベートされた熱不活化サンプル中の定量可能なRNAの安定性(D0-D4)。(A)、(B)および(C)は、BCG培養物をそれぞれ80°C、85°C、および95°Cで不活性化した。AB(D)は、80°Cで不活性化された結核痰を示す。コントロールは、同じサンプルの未処理 (ライブ) 分数です。誤差範囲 = 標準偏差。3回の繰り返し、1回の実行につき9回の反復。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:RNaseA酵素の外因性添加後のRNA分解が高い。(A)80 °Cでの熱不活性化(HI)、85°CでのHi、および(C)HI95°C。B誤差範囲 = 平均の標準誤差。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:マーカーとして16S rRNAを用いたTB-MBLA細菌負荷測定に十分なRNAを保存する。(A)インビトロBCG培養から推定される細菌負荷。(B)結核陽性痰から推定される細菌負荷。誤差範囲 = 平均の標準誤差 (n = 18 と 20は、それぞれ A とBの反復)この図は、Sabiitiら27.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:95°Cで20分間不活性化した後のインタクトMtbバチルの電子顕微鏡写真。TEMでは、透明な無傷の細胞壁および列挙可能な脂質体が観察された。上:細胞群の低倍率画像は、妨げられていないマイコバクテリアロープ状のコード形態および細胞内脂質体を明らかにする。下:トップパネルの高倍率は、脂質体の視野を拡大し、いくつかのマイクロ細胞内構造を明らかにする。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:結核治療における患者の12週間の治療応答曲線は、結核-MBLA測定細菌負荷とMGIT TTPの逆相関を示す。患者が治療に反応すると、細菌負荷(青曲線)が低下し、TTPが上昇する(赤い曲線)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| マスターミックス | RT陽性反応 | RTネガティブ反応 |
| 反応あたりの体積 x no.反応の + 5 | 反応あたりの体積 x no.反応の + 5 | |
| 数量混合 | 10.0 μL | 10.0 μL |
| Mtb16S プライマーミックス (F + R) | 0.4 μL | 0.4 μL |
| Mtb16Sプローブ | 0.2 μL | 0.2 μL |
| ECプライマーミックス(F+ R) | 0.4 μL | 0.4 μL |
| ECプローブ | 0.2 μL | 0.2 μL |
| RT酵素 | 0.2 μL | ------- |
| RNaseフリーウォーター | 4.6 μL | 4.8 μL |
| 総量 | 16 μL | 16 μL |
表 1: TB-MBLA qPCR のマスター ミックス準備ガイド
| 型 | MTB チャネル | ECチャンネル | 解釈 |
| サンプル | 正 | 正 | 有効 |
| サンプル | 正 | 負 | 不確定 |
| サンプル | 負 | 正 | 有効 |
| サンプル | 負 | 負 | 無効です |
| MTB + コントロール | 正 | 負 | 有効 |
| 抽出制御 (EC) | 負 | 正 | 有効 |
| DNA制御 | 負 | 負 | 有効 |
| ネガティブ コントロール (NTC) | 負 | 負 | 有効 |
表 2: TB-MBLA 結果解釈ガイド
Discussion
この記事では、80°C、85°C、95°Cで20分間の熱処理により結核標本が効果的に不活性化し、実験室の作業員に感染するリスクのない非CL3施設で結核-MBLAを行うことを可能にする。この知見は、Mtb25,30の熱不活性化の有効性に関するいくつかの対照的に、以前の研究で行われた観察を確認する。例えば、いくつかの報告は、80°Cでの加熱が高いバシラリー負荷サンプル25、31、32、3331,32,33に有効ではないことを示している。25高密度接種効果は、すべての喀痰および純粋な培養物を15mL遠心管当たり1mL体積で加熱し、サンプルのあらゆる部分を沸騰27に曝す十分なスペースを提供することによって、我々の研究で回避された。
熱不活性化後のRNA保存は、TB-MBLAを行うことを可能にする。この発見は、熱不活性化後のRNA保存を実証した2つの研究と一致する12,34。12,熱不活化サンプル中のRNAは37°Cで4日間安定していることを示し、実験室は室温で不活性化されたサンプルを1週間維持することによって一括検査できることを示唆した。冷凍または凍結を必要とするRNA抽出キットを適用することにより、室温で不活化したサンプルを維持する能力により、コールドチェーンとカテゴリー3の両方のラボが資源制限のある設定でTB-MBLAを実行する必要性が排除されます。
16S rRNAをマーカーとして使用して1log未満の細菌負荷が失われた。生検と熱不活性化サンプルの間には差がありましたが、熱不活性化に失われる量は小さすぎて下流の結果を損なう可能性があります。温度の上昇は、失われたRNAの量を増加させなかった、観察された損失は熱処理から独立していることを意味する。高温での熱処理は、細胞リシスを引き起こし、RNAをRNasesによる分解にさらす可能性が最も高い。実際、RNase Aを熱不活化画分に外因性添加すると、RNA分解の速度が上昇した。沸騰はRNaseの活性を低下させることなく、非常に弾力性のあるタンパク質であることを示唆した。
1.5 log10 eCFU/mL の平均 RNA 分解は大きな損失ではありません。この結果、加熱はMtbバチルのごく一部をライスし、少量のRNAをRNaseに曝露すると仮定しています。TEMを用いて、95°Cの加熱によってMtb細胞の形態および完全性が影響を受けにくいことが示された。これは、RNA35,36を著しく分解するために宿主内等の様々な生理学的要因および十分なRNasesの供給を必要と36し得ることを意味する。さらに、16S rRNAは、構造リボソームであるため、RNase37,38,38の影響を受けにくい可能性がある。単一のMtb細胞は、細胞質37の約700リボソーム/0.1mm3を含み、細胞当たりのrRNAの量が多いことを示唆している。3したがって、RNaseの量が小さいほど、影響が小さくなる可能性があります38.リボソームの数が多いの存在は、感受性と低負担結核患者を検出する能力の点でTB-MBLAに有利です。
TB-MBLAとMGIT培養TTPによって測定された細菌負荷との間には強い相関関係があった。これは、ある程度の培養陽性のドライバーとして細菌の負荷を確認します。しかし、TB-MBLAの利点は、試料中に存在するバシラリー負荷を直接定量し、検出前にMtb細胞増殖を必要としないことである。これは、陽性までの時間が細菌の負荷のレベルとMtb細胞増殖の速度に依存する培養とは対照的である。今後の研究では、定期的な臨床現場での熱不活性化を含むTB-MBLAワークフローを評価します。研究はまた、細菌負荷の範囲を持つサンプルを探索し、陽性から負(すなわち、熱不活性化後の細菌が少ない数)に変化する可能性のある数を理解する。
細菌負荷の分子定量のためのTB-MBLAプロトコルは、細菌学におけるその種の最初のものである。この方法は、患者痰からのMtbバシラリー負荷を直接定量化し、培養を必要としない。これはより速く、患者の進歩についての臨床決定を知らせる潜在能力を高める。熱不活性化ステップは、感染のリスクを低減し、カテゴリ3の実験室を持たない設定でTB-MBLAの適用性を増加させます。サンプルの熱不活性化後、結核-MBLAの結果を達成するための3つのプロトコルステップがあります:RNA抽出、逆転写酵素(RT)-qPCR、およびqPCR結果分析。
Mtb RNAを患者のサンプルから分離する効率が高いほど、結果の品質が高くなります。痰サンプルの品質は、分離されたRNAの量に影響を与えることを注意することが重要です。例えば、唾液痰は低品質と考えられ、低いバシラリー負荷に関連付けられている。これは、質の高い痰の期待のために患者を訓練することが重要であることを意味します。抽出プロセスの効率を評価するために、抽出制御(すなわち、既知の数の非Mtb細胞)が、RNA抽出の前にサンプルにスパイクされる。抽出制御の検索は、RNA抽出プロセスの効率を確認します。RNAの分離プロセスは、抽出制御が取得されていない限り有効ではありません。Mtbが弾力性のある生物であるという事実を考えると、機械的なリシスはプロセスの重要な部分になります。ビーズの存在下での高速(600rpm)での試料の均質化(すなわち、マトリックスを分解する)は、細胞を効果的に分解する。このライセートの精製は、RNAとDNAの両方を含む抽出物を生み出す。DNAの除去は、RNA抽出の重要な最後のステップです。TB-MBLAは、RNAを定量化することによって生存可能なバチルを測定することを目指しています。したがって、ゲノムDNAを除去できなくなったことは、結果がDNAからのシグナルを有することを意味し、これは細胞生存率6に対する良好なマーカーではない。
RT-qPCR は、Mtb および抽出制御用のデュアルラベル付きプローブを実行するデュプレックスです。それは3つのステップを伴う:50°Cで逆転写酵素による30分の逆転写酵素、95°Cで15分の変性、94°Cおよび60°Cでの増幅の40サイクル。プローブからの蛍光の獲得は、60°C(すなわち、フラグメント伸長段階)で起こる。TB-MBLAは特定のqPCRマシンを使用して最適化されているので、他のqPCRプラットフォームを使用するオペレータは、機器の条件を最適化する必要があることに注意してください。DNA除去の効率は、RTの不在時にサンプル当たり1回の反応を実行することによって制御される。この反応から肯定的な結果は、DNAの不完全な除去を意味する。DNAの量が多い高い負荷サンプルは、DNAを完全に除去するためにDNase酵素の2倍の量を必要とするかもしれません。幸いなことに、高いバシラリー負荷サンプルでは、少量のDNAの存在がRNAからの結果に影響を与える可能性が低い。リボソームRNAは、TB-MBLA標的を、DNA37の2倍の量で自然に生じる。PCRでは、PCR試薬を溶解するために使用される水であるテンプレートなし制御(NTC)が、外因性DNAまたはRNAとの交差汚染を制御します。NTC の正のシグナルは、交差汚染を意味し、結果は無効と見なされます。これは、この水を使用して構成されるすべての溶液を廃棄し、水の新鮮なバイアルを使用して作られた新しいものを意味します。すべての水の汚染を避けるために、PCR水を別々のアリコートに保管することをお勧めします。PCRの全体的な効率を制御するために正のコントロール(Mtb RNA)が使用されます。
結果分析は、標準的な曲線を使用して、PCR Cqsを細菌負荷(すなわち、mL当たりの推定コロニー形成単位)に変換することを含む。このステップでは、標準曲線の設定と最適化が重要です。0.95–1 の標準曲線効率を推奨します。MTbおよび抽出制御の標準曲線は、患者または他の試験サンプルが機械で実行される前に設定および最適化する必要があります。標準サンプルは TB-MBLA キットに付属しています。PCRには、RNA抽出物の10倍希釈が推奨されます。これは、細菌負荷の結果がmL当たりの最終的な細菌負荷結果を得るために10の係数を掛ける必要があることを意味します。30 を超える Cq は TB-MBLA では負であると考えられることに注意してください。治療応答の推論を行うためには、異なる時点で測定された少なくとも2つの将来の細菌負荷結果が必要です。治療開始前に、2つの結果のうちの1つをベースラインにすることを強くお勧めします。しかし、患者が治療の途中で細菌負荷評価を開始した場合、治療応答を評価するために第2の時点の細菌負荷測定が必要である。TB-MBLAは、治療上の3日間の空間で細菌負荷を区別することができますが、理想的なのは7日間離れて撮影された2つの細菌負荷測定です。
このプロトコルは、治療応答のための有益な定量的結果を生成しますが、それはまだ大部分が手動であり、RNA抽出のために時間通りにかなりの手を必要とします。忙しいラボの技術者は、この時間を持っていない可能性があります。RNA抽出およびPCRプロセスを自動化するための取り決めが進められている。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、欧州および発展途上国の臨床試験パートナーシップ(EDCTP)からの資金提供によって可能になりました - パンアフリカンバイオマーカー拡張プログラム(PanBIOME)はSP.2011.41304.008を付与します。サポートはまた、セントアンドリュース大学医学部研究助成金を得ました.この原稿とTB-MBLAプロトコルを視覚的なリソースとして公開することは、スコットランド資金評議会とグローバルチャレンジ研究基金からセントアンドリュース大学への資金提供によって可能になりました。臨床痰標本を提供したマプト母方病院とマヴァレーン保健センターと、臨床痰標本の熱不活性化実験を支援したマプト結核治療ユニットチームのおかげです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat inactivation: | |||
| 15 mL Centrifuge tubes | Fisher-Scientific | 10136120 | 50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved |
| 15 mL Wire Tube rack | Fisher-Scientific | 11749128 | Other brands with similar make can be used |
| Water bath | Fisher-Scientific | 15700619 | Other brands with similar make can be used |
| RNA extraction: | |||
| Chloroform | Sigma | 372978-1L | Not necessary in other RNA extraction kit brands |
| Ethanol, absolute 99-100% | Sigma | 51976-500ML-F | Larger volume available |
| Extraction control | SOI group St Andrews | VitalbacteriaEC | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit |
| FASTRNA Pro blue Kit | MP Biomedicals | 116025050 | Supplied with lysing matrix tubes |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Qiagen, Fisherscientific can also supply same product |
| Precellys 24 homogeniser | VWR | 432-3750 | FastPrep MP Biomedicals can be used too |
| Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus | Fisher-Scientific | 15352117 | Other brands with similar capacity can be used |
| Thermomixer | Eppendorf | BLD-455-010C | Works with 1-2 mL tubes |
| TURBO DNA-free | Fisher-Scientific | AM1907M | Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures. |
| RT-qPCR: | |||
| Primers and Taqman probes | SOI group St Andrews | VitalbacteriaPP | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX. |
| QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit | Qiagen | 204845 | PCR mix plus the RT enzyme |
| RotorGene Q 5plex machine | Qiagen | 9001580 | Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc. can be used |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 mL | Qiagen | 981103 | Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed. |
| Non-heat inactivation Sample preservation materials | |||
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | 93313 | Supplied ready to use |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Many competent suppliers |
| Guanidine thiocyanate (GTC) | Promega | V2791 | Promega brand recommended for quality |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Ensures that GTC solution is free of nucleases |
| General materials (used but not specific to TB-MBLA) | |||
| 500 mL plastic containers | 734-5087 | Nalgene brand recommeded | |
| Biological waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Chemical waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Disposable gloves, chemical resistant | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-20 °C) | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-80 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fridge (0-8 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fume hood | For safe handling of toxic reagents | ||
| Laboratory scales | For accurate measurement of reagents | ||
| Measuring cylinders, plastic | To ensure accurate measurement of reagents | ||
| PCR reaction tubes | Should be suitable to the PCR instrument used | ||
| Pipettes and matching sterile filtered pipette tips, | DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended | ||
| Qiagility loading plates | Qiagen | 5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates | |
| QIAgility Pipetting Robot | Qiagen | Important for high throughput pipetting | |
| Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes | Chemical-resistant and autoclavable recommended | ||
| RNase Away (Removes RNases enzymes from working space) | Fisher Scientific | 10666421 | Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme |
| Safety goggles, chemical resistant | Fisher Scientific | Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents. | |
| Sterile Pasteur pipettes, 1.5-3 mL | Many competent suppliers | ||
| Sterile RNAse-free microtubes | 1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended | ||
| TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse | Ensure it is freshly prepared or prepared within a week | ||
| Vortex | Genie 2 brand recommended | ||
| Transmission electron microscopy | |||
| Glutaldehyde (8%) | Sigma | G7526-10ML | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| HEPES (pH 7.4, 100 mM) | Sigma | H4034-25G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Leica FCS ultracryo | Leica | Cryomicrotome for tissue sectioning | |
| Methyl cellulose | Agar Scientific | AGG6425 | Cold mounting resin |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Sigma | P6148-500G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Sucrose | Sigma | 84097-250G | Preservation and mounting medium |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | AGR1260A | Universal Electron microscopy stain |
References
- World Health Organization. END TB Global Tuberculosis Report 2017. World Health Organization. , (2017).
- World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. World Health Organization. , (2018).
- World Health Organization. TB Elimination in Low-Incidence Countries. World Health Organization. , (2014).
- Boehme, C. C., et al. diagnostic accuracy, and effectiveness of decentralised use of the Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistance: a multicentre implementation study. The Lancet. 377, 1495-1505 (2011).
- World Health Organization. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children. World Health Organization. , (2010).
- Friedrich, S. O., et al. Assessment of the sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF assay as an early sputum biomarker of response to tuberculosis treatment. The Lancet Respiratory Medicine. 1, 462-470 (2013).
- Desjardin, L. E., et al. Measurement of Sputum Mycobacterium tuberculosis Messenger RNA as a Surrogate for Response to Chemotherapy. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 160, 203-210 (1999).
- Hellyer, T. J., et al. Detection of Viable Mycobacterium tuberculosis by Reverse Transcriptase-Strand Displacement Amplification of mRNA. Journal of Clinical Microbiology. 37, 518-523 (1999).
- Honeyborne, I., et al. Molecular Bacterial Load Assay , a Culture-Free Biomarker for Rapid and Accurate Quantification of Sputum Mycobacterium tuberculosis Bacillary Load during Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).
- Li, L., et al. Sputum Mycobacterium tuberculosis mRNA as a Marker of Bacteriologic Clearance in Response to Antituberculosis Therapy. Journal of Clinical Microbiology. 48, 46-51 (2010).
- Honeyborne, I., et al. The Molecular Bacterial Load Assay Replaces Solid Culture for Measuring Early Bactericidal Response to Antituberculosis Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).
- Hellyer, T. J., Jardin, L. E. D. E. S., Hehman, G. L., Cave, M. D. Quantitative Analysis of mRNA as a Marker for Viability of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology. 37, 290-295 (1999).
- Aellen, S., Que, Y., Guignard, B., Haenni, M., Moreillon, P. Detection of Live and Antibiotic-Killed Bacteria by Quantitative Real-Time PCR of Specific Fragments of rRNA. Antimicrobial agents chemotherapy. 50, 1913-1920 (2006).
- Deutscher, M. P. Degradation of RNA in bacteria: Comparison of mRNA and stable RNA. Nucleic Acids Research. 34, 659-666 (2006).
- Gupta, R. K., Srivastava, R. Resuscitation Promoting Factors: A Family of Microbial Proteins in Survival and Resuscitation of Dormant Mycobacteria. Indian Journal of Microbiology. 52, 114-121 (2012).
- Mukamolova, G. V., Turapov, O., Malkin, J., Woltmann, G., Barer, M. R. Resuscitation-promoting factors reveal an occult population of tubercle bacilli in sputum. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 181, 174-180 (2010).
- Sheridan, G. E. C., Masters, C. I., Shallcross, J. A., Mackey, B. M. Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coliCells Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coli Cells. Applied Environment Microbiology. 64, 1313-1318 (1998).
- Honeyborne, I., et al. Molecular bacterial load assay, a culture-free biomarker for rapid and accurate quantification of sputum Mycobacterium tuberculosis bacillary load during treatment. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).
- Sabiiti, W., et al. Molecular Bacterial Load Assay: a Fast and Accurate Means for Monitoring Tuberculosis Treatment Response. BMJ Global Health. 2, 1-8 (2017).
- Gillespie, H., Stephen, S. W., Oravcova, K. Mybacterial Load Assay. Diagnostic Bacteriology. Methods and Protocols. Bishop, A. K. , Humana Press. Totowa, NJ. 89-105 (2017).
- Juffs, H., Deeth, H. Scientific Evaluation of Pasteurisation for Pathogen Reduction in Milk and Milk Products. Food Standards Australia New Zealand. , Wellington, New Zealand. (2007).
- Holmes, C. J., Degremont, A., Kubey, W. Effectiveness of Various Chemical Disinfectants versus Cleaning Combined with Heat Disinfection on Pseudomonas Biofi lm. Blood Purification. 22, 461-468 (2004).
- Chedore, P., et al. Method for inactivating and fixing unstained smear preparations of Mycobacterium tuberculosis for improved laboratory safety. Journal of Clinical Microbiology. 40, 4077-4080 (2002).
- Cardoso, C. L., et al. Survival of Tubercle Bacilli in Heat-fixed and Stained Sputum Smears. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 96, 277-280 (2001).
- Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Pathology. 55, 778-779 (2002).
- Honeyborne, I., et al. The molecular bacterial load assay replaces solid culture for measuring early bactericidal response to antituberculosis treatment. Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).
- Sabiiti, W., et al. Heat Inactivation Renders Sputum Safe and Preserves Mycobacterium tuberculosis RNA for Downstream Molecular tests. Journal of Clinical Microbiology. , 1-8 (2019).
- Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrasructure Research. 89, 65-78 (1984).
- Kumar, V. G., Urs, T. A., Ranganath, R. R. MPT 64 Antigen detection for Rapid confirmation of M. tuberculosis isolates. BMC Research Notes. 4, 79 (2011).
- Zwadyk, P., Down, J. A., Myers, N., Dey, M. S. Rendering of mycobacteria safe for molecular diagnostic studies and development of a lysis method for strand displacement amplification and PCR. Journal of Clinical Microbiology. 32, 2140-2146 (1994).
- Blackwood, K. S., et al. Viability testing of material derived from Mycobacterium tuberculosis prior to removal from a Containment Level-III Laboratory as part of a Laboratory Risk Assessment Program. BMC Infectious Diseases. 5, 3-9 (2005).
- Somerville, W., Thibert, L., Schwartzman, K., Behr, M. A. Extraction of Mycobacterium tuberculosis DNA: a Question of Contaiment. Journal of Clinical Microbiology. 43, 2996-2997 (2005).
- Bemer-Melchior, P., Drugeon, H. B. Inactivation of Mycobacterium tuberculosis for DNA typing analysis. Journal of Clinical Microbiology. 37, 2350-2351 (1999).
- McKillip, J. L., Jaykus, L. A., Drake, M. rRNA stability in heat killed and UV-irradiated enterotoxigenic Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157:H7. Journal of Appied Environmental Microbiology. 64, 4264-4268 (1998).
- Blank, A., Dekker, C. A. Ribonucleases of Human Serum, Urine, Cerebrospinal Fluid, and Leukocytes. Activity Staining following Electrophoresis in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels. Biochemistry. 20, 2261-2267 (1981).
- O'Leary, T. J. Reducing the impact of endogenous ribonucleases on reverse transcription-PCR assay systems. Clinical Chemistry. 45, 449-450 (1999).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes per 0.1 fl of cytoplasm. PLoS One. 10, 1-14 (2015).
- Yang, K., et al. Structural insights into species-specific features of the ribosome from the human pathogen Mycobacterium tuberculosis. Nucleic Acids Research. 45, 10884-10894 (2017).
