Summary
Vi beskriver en tuberkulos molekylära bakteriella belastningsanalys test utförs efter värme inaktivering av sputum. Värmeinaktivering gör sputumprover icke-infektiösa och undanröjer behovet av inneslutningsnivå 3 laboratorier för tuberkulos molekylära tester.
Abstract
Tuberkulos orsakas av Mycobacterium tuberkulos (Mtb), en patogen som klassificeras av FN (FN) som en farlig kategori B biologiskt ämne. För arbetstagarnas säkerhet skall hanteringen av alla prover som antas bära Mtb utföras i ett laboratorium för inneslutningsnivå (CL) 3. Tb molekylär bakteriell belastningsanalys (TB-MBLA) test är en omvänd transkriptas kvantitativ polymeras kedjereaktion (RT-qPCR) test som kvantifierar Mtb bacillary belastning med hjälp av grundfärger och dual-märkta sonder för 16S rRNA. Vi beskriver användningen av värme inaktivering för att göra TB prover noninfectious samtidigt som RNA för TB-MBLA. En 1 ml alikvot av sputumprovet i tätt tillslutna 15 ml centrifugrör kokas i 20 min vid antingen 80 °C, 85 °C eller 95 °C för att inaktivera Mtb bacilli. Odling av värmeaktiverade och kontroll (levande) prover för 42 dagar bekräftade död TB. Det inaktiverade provet spikas sedan med 100 μL av extraktionskontrollen och RNA extraheras enligt standardinsisoleringsförfarandet för RNA. Ingen tillväxt observerades i kulturerna av värmebehandlade prover. Det isolerade RNA utsätts för rt-qPCR i realtid, vilket förstärker ett specifikt mål i Mtb 16S rRNA-genen, vilket ger resultat i form av kvantifieringscykler (Cq). En standardkurva används för att översätta Cq till bakteriebelastning, eller uppskattade kolonibildande enheter per ml (eCFU/mL). Det finns ett omvänt samband mellan Cq och bakteriebelastningen av ett prov. Begränsningen är att värme inaktivering lyses vissa celler, utsätta RNA för RNases som orsakar en förlust av <1 log10eCFU/mL (dvs., <10 CFU/mL). Ytterligare studier kommer att avgöra andelen mycket låg börda patienter som orsakar falska negativa resultat på grund av värme inaktivering.
Introduction
Orsakas av Mycobacterium tuberkulos (Mtb), över 7 x 106 nya fall av tuberkulos (TB) rapporteras globalt varav över 1 x 106 dör per år1,2. För att vända trenden lanserade Världshälsoorganisationen (WHO) en strategi med tre pelare, bland annat genom att utveckla effektiva diagnos- och behandlingsverktyg3. Klassificeras som ett farligt biologiskt ämne B av FN, arbetar med prover antas positivt för Mtb kräver en inneslutning nivå (CL) av 3. CL3 laboratorier är dyra att bygga och underhålla. Följaktligen har de flesta länder centraliserade tb-kulturtjänster på regional eller nationell nivå. Detta innebär att smetoskopi är det mest tillgängliga diagnostiska verktyget i de perifera vårdinrättningarna.
Det finns WHO:s godkännande att genomföra snabba molekylära tester som Xpert MTB/RIF på nivå 4 vårdinrättningar, mestadels belägna på distriktsnivå4,,5. Vissa distrikt är ganska stora och mindre tillgängliga för vissa människor. Xpert MTB/RIF fungerar visserligen fördelaktigt genom att detektera Mtb-DNA:t. DNA är en stabil molekyl som överlever långt efter att celler har dött och därför inte är en bra standard för att mäta livskraftiga celler som är kritiska för övervakning av behandlingssvar5,6. RNA-baserade analyser erbjuder ett alternativ för noggrann mätning av livskraftiga celler7,,8,,9,,10,,11,,12,13. RNA finns i olika arter av varierande stabilitet: ribosomal RNA (rRNA), överföring RNA (tRNA) och budbärare RNA (mRNA). Messenger RNA är associerad med genuttryck och därmed den närmast förknippade med cellaktivitet och livskraft14. Det är viktigt att notera att avsaknad av genuttryck inte motsvarar celldöd eftersom patogener som Mtb är kända för att existera i inaktiva (vilande) men livskraftiga stater15,16. Stabila RNA-arter som rRNA är därför bättre markörer för både aktiva och inaktiva tillstånd av livskraftiga celler.
Använda Escherichia coli, Sheridan visade att 16S rRNA proportionellt ökade med bakterietillväxt mätt med koloni bildar enheter (CFU) räknas17. Det fanns en samtidig nedgång i CFU räknas och 16S rRNA när E. coli bakterier exponerades för antibiotika. Nedgången i rRNA efter celldöd var en indikator på att det kunde användas som en markör för cellens livskraft13,17. Med utgångspunkt i denna princip utvecklades tbc-molekylär bakteriell belastningsanalys (TB-MBLA) för att rikta in sig på M. tuberkulos 16S rRNA för att mäta livskraftig TB bacillary-belastning som en markör för behandlingssvar för patienter vid anti-TB-behandling11,18,19. Vi har vidareutvecklat och optimerat TB-MBLA för att införliva en cellulär extraktionskontroll som återspeglar lys av M. tuberkulos bacilli och är robust i olika miljömiljöer20. Tb-MBLA-proceduren kräver att de första stegen av RNA-isolering från Mtb ska utföras i ett CL3-laboratorium tills Mtb-cellerna är helt lysted för att säkerställa arbetstagarnas säkerhet. Det omfattar också provbevarande för retrospektiv batchanalys som skall bibehållas vid -80 °C i guanidintiaocyanat, ett giftigt ämne på nivå 4. För detta ändamål har vi använt värme för att inaktivera Mtb och göra prover säkra för TB-MBLA som ska utföras i smetyrmikroskopi nivå laboratorier.
Användning av värme i laboratorie- och kliniska tillämpningar har funnits i århundraden21,22. Men vissa mikroorganismer som Mtb är svåra att döda, och kortare exponering för värme är otillräcklig för att döda alla celler23,24. En studie visade att 20 min uppvärmning av TB kulturer vid 80 ° C dödade alla Mtb bacilli utan att förstöra DNA som behövs för PCR25. Därefter värmer ett antal laboratorie-DNA-extraktionstekniker för närvarande till 95 °C. Vi har tillämpat samma princip för att visa att kokande tbc-prover vid antingen 80 °C, 85 °C eller 95 °C inaktiverar Mtb samtidigt som tillräckligt med RNA för tbc-MBLA bevaras. Inaktiverad odling eller sputum kan hållas i tätt tillslutna behållare vid rumstemperatur eller förvaras i kylskåp i 7 dagar utan att minska mängden kvantifierbar rRNA.
TB-MBLA, som för närvarande används som forskningsanvändning endast (RUO) test är anpassningsbar och har tillämpats på olika provtyper inklusive sputum, lungvävnad och cerebral spinal vätska. Det är ännu inte tillämpas på bronkial alveolar vätska, blod, och andra provtyper. Med hjälp av sputum som prov visar resultaten från multisiteutvärdering i Afrika (opublicerade data) och tidigare publikationer18,26 att känsligheten hos MBLA är förenlig med mycobacterium growth indicator tube (MGIT) flytande kultur. Tb-MBLA är dock snabbare, vilket ger resultat i timmar i motsats till dagar eller veckor av kultur, specifika, inte påverkas av icke-TB mikroorganismer i provet, och ger ett kvantitativt mått på sjukdomens svårighetsgrad. WHO har nyligen erkänt TB-MBLA som en kandidat för att ersätta smetyrmikroskopi och kultur för övervakning tb behandling2.
I den här artikeln beskriver vi i detalj värme inaktivering och TB-MBLA protokoll som publiceras i Sabiiti et al.27. Det här detaljerade protokollet ger en enda visuell resurs för TB-MBLA-användare över hela världen.
Protocol
1. Provberedning
-
Kultur
- Arbeta på en ren bänk eller klass 1 stuga, skörda 1 mL alikvoter av exponentiell fas Bacillus Calmette-Guérin (BCG) kultur i 15 ml plast centrifugrör. Stäng rören tätt.
OBS: För att bearbeta ett helt 5 ml-prov krävs fem 15 ml centrifugrör.
VARNING: Ett biosäkerhetsskåp krävs när du arbetar med någon TB-kultur.
- Arbeta på en ren bänk eller klass 1 stuga, skörda 1 mL alikvoter av exponentiell fas Bacillus Calmette-Guérin (BCG) kultur i 15 ml plast centrifugrör. Stäng rören tätt.
-
Patienten sputum exemplar
- Arbeta i ett välventilerat utrymme och bära en näsmask, öppna försiktigt provkoppen, pipett 1 mL alikvoter i 15 ml plastcentrifugrör och tätt stänga rören.
OBS: En bred mun spets rekommenderas till pipett sputum. Med hjälp av en sax, klipp av den fina delen av 1 mL spets munnen för att skapa en bredare mun.
- Arbeta i ett välventilerat utrymme och bära en näsmask, öppna försiktigt provkoppen, pipett 1 mL alikvoter i 15 ml plastcentrifugrör och tätt stänga rören.
2. Värme inaktivering
- Ställ vattenbadet till 95 °C före provberedningen.
OBS: 95 °C-temperaturen ökar risken för att RNase-aktiviteten minskas och bevaras därmed mer RNA för nedströms TB-MBLA. - Överför provrören till ett vänterrack nedsänkt i vattenbadet. Se till att tre fjärdedelar av varje provrör är nedsänkt i vattnet.
- Koka vid 95 °C i 20 min och överför sedan rören till bänken för att svalna i rumstemperatur i 5 min innan RNA-extraktionen påbörjas.
OBS: Fullständig värmeinaktivering av M. tuberkulos bacilli och BCG kontrollerades genom inkubering av värmeinaktiverade prover och kontroller vid 37 °C i 42 dagar för att kontrollera tillväxten. En optisk densitet mätning vid 600 nm (OD600) togs vid baslinjen och sedan varje vecka för 42 dagars inkubationstid.
3. RNA-extraktion
OBS: RNA-extraktionsprocessen som beskrivs här är för RNA-kitet som anges i materialförteckningen. Andra lämpliga RNA-extraktionssatser från olika tillverkare kan användas.
- Extraktionskontroll (EG) tillägg
- Överför 1 ml alikvoter av värmeaktiverade prover till 1,5 ml-rör. Spik 100 μL av EG i varje prov, stäng röret och blanda genom att vända röret upp och ner 3x.
OBS: EG levereras med TB-MBLA vitala bakterier kit (Tabell av material).
- Överför 1 ml alikvoter av värmeaktiverade prover till 1,5 ml-rör. Spik 100 μL av EG i varje prov, stäng röret och blanda genom att vända röret upp och ner 3x.
- Cellsedimentation
- Med hjälp av en bänkskiva mikrocentrifug, centrifug rören på 20.000 x g i 10 min vid rumstemperatur. Pipetten från supernatanten och lämnar 50 μL sediment.
- Suspendera sedimentet i 950 μL lysbuffert genom pipettering upp och ner och överför hela suspensionen till det lysningsmatrisrör som medföljer RNA-extraktionssatsen (Tabell över material). Se till att rören är ordentligt stängda och märk både locket och sidan av röret.
- För celllys, överför rören från steg 3.2.2 till en homogenisator. Homogenisera proverna för 40 s vid 6000 varv/min.
- Nukleinsyror rening
- Centrifugera lysate från steg 3.3 vid 12.000 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Förbered färska 1 ml-rör och tillsätt 300 μl kloroform i varje rör.
- Använd en 1 ml-spets försiktigt från supernatanten utan att vidröra lysningsmatrisen.
- Överför supernatanten till kloroformen som innehåller rör och virvel i 5 s. Låt röret nöja sig med 5 min eller längre tills tre faser (övre, mellersta och nedre) är tydligt synliga.
- Centrifugera vid 12 000 x g i 5 min vid rumstemperatur. Pipett försiktigt den övre fasen och överför till färska 1,5 ml-rör.
- Till rören i steg 3.4.5, tillsätt 500 μl lykyl 100% etanol, stäng rören och blanda genom att försiktigt vända upp och ner 3x. Inkubera rören vid -80 °C i 15 min eller -20 °C i 30 min och fortsätt extraktionen, eller låt stå -20 °C över natten för att slutföra extraktionen följande dag.
- Ställ in mikrocentrifugen på 4 °C och låt svalna till minst 12 °C innan centrifugering påbörjas. Lasta rören i mikrocentrifugen och centrifugen i 20 min vid 13 000 x g. Kasta supernatanten, byt ut med 70% iskall etanol och centrifug för ytterligare 10 min vid 13 000 x g.
OBS: 70% etanol bör göras med molekylär kvalitet nukleas fritt vatten. - Kasta all supernatant från steg 3.4.7 och överför rören till en inkubator inställd på 50 °C. Inkubera i 20 min för att torka RNA/DNA-pelleten. Håll rören delvis öppna för att möjliggöra avdunstning av all etanol.
- Tillsätt 100 μl nukleasfritt vatten i torrpellet och inkubera i 5 min vid rumstemperatur. Vortex för 3 s för att blanda innehållet.
OBS: I detta skede kan extraktet förvaras 2−3 dagar i kylskåpet eller längre vid -80 °C tills avsnitt 3.5 utförs.
- DNA-borttagning
OBS: Detta steg är avgörande eftersom förekomsten av DNA i extraktet ogiltigförklarar MBLA resultatet. Detta avsnitt är baserat på en DNA-borttagningssats (Tabell över material).- Förbered en blandning av enzymet DNase I 10x buffert och DNase I enzym för antalet prover (10 μL buffert och 1 μL DNase per prov) plus 10% extra för att täcka eventuella förluster från pipettering. Blanda genom att virvla och sedan pipett 11 μL i varje rör som innehåller RNA-extraktet.
- Blanda genom att virvla 3 s och snurra sedan kort (10 s vid 13.000 x g)för att ta bort eventuella droppar på väggarna. Inkubera vid 37 °C i 30 min i varmblocket eller inkubatorn. Tillsätt ytterligare 1 μl DNase I-enzym direkt i varje rör, blanda väl genom att virvla och inkubera i ytterligare 30 minuter vid 37 °C.
- Tina DNase-inaktiveringsreagensen 10 min före slutet av DNase-inkubationen. Vortex 20 s för att säkerställa en homogen, mjölkaktig suspension och tillsätt sedan 10 μl DNase inaktiveringsreagens i varje RNA-extrakt från steg 3.5.2.
- Inkubera blandningen vid rumstemperatur i 5 min. Vortex 3x under 5 minuters inkubationssteg.
- Centrifugera blandningen vid 13 000 x g i 2 min. Överför försiktigt supernatanten till 1,5 ml RNase-fria rör utan att vidröra någon av inaktiveringsmatrisen.
- Förvara RNA-extraktet i kylskåpet om du kör RT-qPCR samma dag eller vid -80 °C för långtidsförvaring.
4. Omvänd Transkriptas qPCR
- För okända prover späd alla RNA-extrakt som ska användas i förhållandet 1:10 i RNase fritt vatten. Blanda väl genom att virvla i 5 s och snurra kort ner för att ta bort eventuella droppar eller luftbubblor.
- För standardprover för en standardkurva, ta Mtb- och EC RNA-standarderna från frysen -80 °C och tina vid rumstemperatur. Gör sju respektive sex 10-faldiga utspädningar av Mtb respektive EG-standardprover. Byt tips innan du överför blandningen från ett rör till ett annat.
OBS: Standardprover levereras med TB-MBLA-satsen. -
Beredning av mastermix
Obs: Master mix (MM) är en lösning av PCR reagenser tillräcklig för att förstärka alla prover, standarder och vatten för en ingen mall kontroll (NTC). Det vatten som används som NTC bör vara samma vatten som används i extraktionen och för att förbereda MM. Se till att standarderna, varje RNA-prov och dess decimalutspädning förstärks 2x för den omvända transkriptaspositiva reaktionen (RT+) och 1x för den omvända transkriptasnegativa (RT-) reaktionen. RT-reaktionen är en kontroll för att fastställa effektiviteten av DNA-avlägsnande (tabell 1).- Överför 16 μl MM till varje PCR-reaktionsrör.
- Tillsätt 4 μl RNA-extrakt i varje RT+ och RT-reaktionsrör och vatten i NTC-reaktionsrören.
- Ladda reaktionsrören i en PCR-maskin i realtid och ställ in PCR-förhållandena enligt följande: 50 °C i 30 min, 95 °C i 15 min, 40x cykler vid 94 °C för 45 s och 60 °C i 1 min med förvärv med fluorofores som absorberas i gröna och gula kanaler.
OBS: Den gröna kanalen är Mtb detektion fluorofore och den gula är extraktionskontroll detektion fluorofore.
-
Tolkning av resultat
OBS: Se till att de dubbla reaktionerna från samma prov inte avviker med mer än 1 standardavvikelse. Mtb- och EC Cq-värden som är högre än 30 anses vara negativa. Se ytterligare tolkningsdetaljer i tabell 2.- För att tolka behandlingssvaret, omvandla Cq-värdena till bakteriebelastning (eCFU/mL) med hjälp av standardkurvan. Läs behandlingssvaret som förändringen i bakteriebelastningen under behandlingsuppföljningsperioden.
OBS: Nedgången i bakteriebelastningen efter behandling innebär ett positivt svar (dvs. anti-TB läkemedel som dödar tbc-bakterier) medan ingen förändring eller ökning av bakteriebelastningen innebär ett negativt svar, vilket kan innebära resistens av tbc-bakterier mot anti-TB läkemedel eller patienten inte på lämpligt sätt följa deras behandlingsdos. Nedgången i bakteriebelastning mätt med TB-MBLA korrelerar med ökningen av MGIT tid till kultur positivitet (TTP).
- För att tolka behandlingssvaret, omvandla Cq-värdena till bakteriebelastning (eCFU/mL) med hjälp av standardkurvan. Läs behandlingssvaret som förändringen i bakteriebelastningen under behandlingsuppföljningsperioden.
5. Transmission Elektronmikroskopi
- Överför 2 ml alikvoter värmeaktiverade kulturer och kontroller i 2 ml mikrocentrifugrör. Centrifug i 10 min vid 20.000 x g.
- Kasta supernatanten och suspendera pelleten i 700 μL cellfixeringsbuffert och inkubera i rumstemperatur i 5 min för att fixera cellerna.
- Centrifugera suspensionen i 30 min vid 16 000 x g för att få en hård pellet. Kassera supernatanten och byt ut med 1 % sackaros i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Förvara pelletsen i sackaros vid 4 °C tills snittningen för elektronmikroskopi.
-
Snittning och TEM
OBS: Protokollet nedan är anpassat från Griffiths et al.28.- Cryoprotect cellpelleten genom att bädda in den i 2,1 M sackaros i PBS över natten vid 4 °C. Tvätta 3x med iskallt vatten.
- Kyl kryoprotected cell pellets i flytande kväve och montera dem cryomicrotomy stubbar. Använd kryomikrotomen, skär ultratunna sektioner vid 90 nm.
- Hämta de skurna sektionerna med volframtrådsödorna på 1:1 blandning av 2% metylcellulosa och 2,1 M sackaros i PBS.
- Överför sektionerna till pioloformbelagda 150 mesh sexkantiga koppar TEM-stöd (galler) och förvara vid 4 °C eller fortsätt till steg 5.4.5.
- Kontrastgallren i uranylacetat och lufttorka i en film av metylacetat. Tvätta gallren med iskallt vatten följt av två droppar PBS över 5 min och torka i 15−30 min. Undersök sektionerna enligt TEM enligt tillverkarens riktlinjer.
OBS: Alla märkningssteg utfördes vid istemperatur (vätsketemperatur) med undantag för tvättstegen, som utfördes vid rumstemperatur.
Representative Results
Värme inaktiverar alla M. tuberkulos bacilli
Den optiska densiteten (OD) för kontroller (levande celler) ökade med tiden(0,04OD–0,85OD)och ingen OD-förändring observerades i de värmeaktiverade proverna, vilket innebar tillväxt respektive ingen tillväxt (figur 1)27. På samma sätt växte kontroll kliniska sputum positiva dag 3 i MGIT medan värme inaktiverade kliniska prover inte flagga positivt förrän i slutet av inkubation. Tillväxten av Mtb i MGIT bekräftades av Ziehl-Neelsen smeta mikroskopi och antigen MPT6429.
RNA i inaktiverade prover är stabilt vid 37 °C i 4 dagar
Värmeaktiverade prover inkuberades vid 37 °C för att avgöra om RNA försämras efter värmeinaktivering av celler. Ingen skillnad hittades mellan RNA som skördades dag (D) 0 omedelbart efter värmeaktivering och RNA isolerade vid D1, 2, 3 och 4 i båda BCG-kulturerna (figur 2A-C) och TB-positiv sputum (figur 2D).
Exogen RNase ökar graden av RNA-nedbrytning i de värmeaktiverade fraktionerna
För att avgöra varför RNA inte var förnedrande tillsatte RNase A-enzymet exogent vid 1 000 U/ml före och/eller efter värmeaktivering. Detta orsakade RNA-förlust motsvarande bakteriebelastning 1,5 ± 0,3 -, 1,8 ± 0,2 -, och 1,3 ± 0,1 – log10 eCFU/mL vid 80 °C, 85 °C respektive 95 °C under 4 dagars inkubation. Det fanns en skillnad i RNA försämras i prover där RNase tillsatts före och / eller efter värme inaktivering (figur 3A-C).
Tillräckligt med RNA bevaras för TB-MBLA med 16S rRNA som referensmarkör
Effekten av värme inaktivering på rRNA mättes i BCG kulturer och sputum från TB positiva patienter. Den uppmätta bakteriebelastningen av kontroll BCG-odling, 5,3 ± 0,2 log10 eCFU/ml, var 0,2 ± 0,1 log10 eCFU/ml högre än den kombinerade 5,1 ± 0,3 stock10 eCFU/ml värmeaktiverad odling (ANOVA p < 0,0001) vid 80 °C, 85 °C och 95 °C(figur 4A)27. På samma sätt var bakteriebelastningen av kontrollpatientens slem, 7,1 log10 eCFU/ml, 0,8 ± 0,1 log10 eCFU/mL högre än den kombinerade 6,3 ± 0,41stocken 10eCFU/mL vid 80 °C, 85 °C och 95 °C(figur 4B)27. Den bakteriella belastningsminskningen var <1log i de två testade provtyperna.
Sidaks multipeljämnjämplast visade en signifikant skillnad mellan bakteriebelastningen vid 95 °C jämfört med 80 °C och 85 °C (p = 0,001). Ingen skillnad hittades i tbc-prover vid alla temperaturer, p = 0,8.
Cellväggens integritet förstörs inte av värme i de flesta Mtb-celler
Med hjälp av transmissionselektronmikroskopi (TEM) undersökte vi om cellerna var lysed av värme inaktivering. Tunna delar av paraformaldehyd fasta pellets av celler gjordes och inbäddade i en elektron rika medium före undersökning av TEM. Inspektion av cellerna vid lägre och högre förstoring visade intakt cell vägg och synliga intracellulära lipid organ. Celler morfologiskt verkade långsträckt men inte lysed. Figur 5 illustrerar morfologin hos mykobakterierceller vid olika förstoringar. De två översta panelerna avslöjar intracellulära lipidkroppar och de lyrmade repliknande sladdar, en morfolog egenskap som är typisk för mykobakterierarter. De nedre två panelerna är högre förstoring utöka synen på lipid organ och avslöjar några mikro-intracellulära strukturer.
Bakteriebelastning mätt med TB-MBLA är omvänt korrelerad till MGIT kultur tid till positivitet
För patienter som svarar på behandlingen faller bakteriebelastningen vid i genomsnitt 1 log10 eCFU/ml per vecka under behandlingen. Snabba responders klart snabbare, konvertera till negativ (noll bakteriell belastning) med 2 veckors behandling. Nedgången i bakteriebelastning mätt med TB-MBLA motsvarade ökningen av MGIT kulturtid till positivitet (TTP). Figur 6 visar den omvända korrelationen mellan bakteriebelastning och MGIT TTP. Skillnaden är dock att TB-MBLA resultaten finns i 4 h och time-to-result är oberoende av nivån på bakteriebelastningen. Detta står i kontrast till 5–25 dagar för MGIT kulturtester. Kontaminering med icke-TB bakterier ytterligare äventyra resultaten från kulturtester.
Figur 1: Verifiering av BCG-inaktivering vid 80 °C (punktmönsterkurva), 85 °C (punkt-strecksmönsterkurva) och 95 °C (streckmönsterkurva). Kontrollen (svart kurva) var levande (ouppvärmd) BCG-odling inokulerad till samma tillväxtmedium. Tillväxten i kontrollen bekräftades av ökningen av OD av kulturen under inkubationstiden. Denna siffra ändrades från Sabiiti et al.27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Stabilitet hos kvantifierbart RNA i värmeinaktiverat prov som inkuberats vid 37 °C i 4 dagar (D0–D4). (A),(B)och(C)visar BCG-kulturer inaktiverade vid 80 °C, 85 °C respektive 95 °C. (D)visar tb-sputumet inaktiverat vid 80 °C. Kontrollen är den obehandlade (levande) fraktionen av samma prov. Felstaplar = standardavvikelse. Tre repetitioner, nio repliker per körning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Högre RNA-nedbrytning efter exogen tillsats av RNase A-enzym. (A)Värmeinaktivering (HI) vid 80 °C,(B)HI vid 85 °C och(C)HI 95 °C. Felstaplar = standardfel för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Bevarande av tillräcklig RNA för mätning av TB-MBLA-bakteriebelastning med 16S rRNA som markör. (A)Bakteriebelastning som uppskattas från in vitro BCG-kulturer. (B)Bakteriell belastning uppskattas från tuberkulos positiva slem. Felstaplar = standardfel för medelvärdet (n = 18 respektive 20 replikerar för A respektive B). Denna siffra ändrades från Sabiiti et al.27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Elektronmikrografer av intakt Mtb bacilli efter inaktivering vid 95 °C i 20 min. Klart intakt cell vägg och uppräkningsbara lipid organ observerades med TEM. Topp: låg förstoring bilder av en grupp av celler avslöjar lymfiga mycobacterial rep-liknande sladd morfologi och intracellulära lipid organ. Botten: hög förstoring av de övre panelerna för att utöka synen på lipidkroppar och avslöja några mikro-intracellulära strukturer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: 12 veckors behandling svarskurva av en patient på anti-TB terapi som visar en omvänd korrelation av TB-MBLA uppmätt bakteriell belastning och MGIT TTP. Bakteriebelastningen (blå kurvan) faller medan TTP stiger (röd kurva) när patienten svarar på behandlingen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Master mix | RT positiv reaktion | RT negativ reaktion |
| Volym per reaktion x nej. av reaktioner + 5 | Volym per reaktion x nej. av reaktioner + 5 | |
| Blandning av kvantect | 10,0 μl | 10,0 μl |
| Mtb16S primer mix (F + R) | 0,4 μl | 0,4 μl |
| Mtb16S sond | 0,2 μl | 0,2 μl |
| EG-primerblandning (F + R) | 0,4 μl | 0,4 μl |
| EG-sond | 0,2 μl | 0,2 μl |
| RT enzym | 0,2 μl | ------- |
| RNase fritt vatten | 4,6 μl | 4,8 μl |
| Total volym | 16 μl | 16 μl |
Tabell 1: Beredningsguide för mastermix för TB-MBLA qPCR.
| Typ | MTB-kanal | EG-kanal | Tolkning |
| Prov | Positiva | Positiva | Giltig |
| Prov | Positiva | Negativa | Obestämt |
| Prov | Negativa | Positiva | Giltig |
| Prov | Negativa | Negativa | Ogiltig |
| MTB + Kontroll | Positiva | Negativa | Giltig |
| Extraktionskontroll (EG) | Negativa | Positiva | Giltig |
| DNA-kontroll | Negativa | Negativa | Giltig |
| Negativ kontroll (NTC) | Negativa | Negativa | Giltig |
Tabell 2: Tolkningsguide för TB-MBLA-resultat.
Discussion
Denna artikel visar att värmebehandling i 20 min vid 80 °C, 85 °C och 95 °Caktiverar tuberkulosprover effektivt, vilket gör det möjligt att effektivt utföra TB-MBLA på en anläggning som inte är CL3 utan risk för infektion för laboratoriearbetare. Resultaten bekräftar observationer som gjorts i tidigare studier samtidigt som man kontrasterar mot vissa om effektiviteten av värme inaktivering av Mtb25,30. Vissa rapporter visar till exempel att uppvärmning vid 80 °C inte är effektivt på hög bacillarylastprover 25,31,,32,33. Den högdensitetsinokulat effekt undveks i vår studie genom att se till att alla sputum och rena kulturer värmdes upp med en 1 ml volym per 15 ml centrifugröret vilket ger tillräckligt utrymme för att utsätta varje del av provet till kokning27.
RNA-konservering efter värme inaktivering gör det möjligt att utföra TB-MBLA. Detta fynd överensstämmer med två studier som visade RNA-bevarande efter värme inaktivering12,34. Vi visade att RNA i värme inaktiverade prover är stabil vid 37 °C i 4 dagar, vilket innebär att laboratorier kan batch tester genom att upprätthålla inaktiverade prover vid rumstemperatur i en vecka. Genom att använda RNA-extraktionssatser som kräver kylning eller frysning, undanröjer förmågan att upprätthålla värme inaktiverade prover vid rumstemperatur behovet av att både kallkedjan och kategori 3-laboratorier utför TB-MBLA i resursbegränsade inställningar.
Mindre än 1log bakteriell belastning förlorades med 16S rRNA som markör. Även om det fanns en skillnad mellan levande och värme inaktiverat prov, är mängden förlorade till värme inaktivering för liten för att äventyra nedströms resultat. Ökande temperatur ökade inte mängden RNA förlorade, vilket innebär att den observerade förlusten är oberoende av värmebehandlingen. Värmebehandling vid höga temperaturer orsakar sannolikt celllys, utsätta RNA för nedbrytning av RNases. Faktum är att exogena tillägg av RNase A till värmen inaktiverad fraktion ökade graden av RNA nedbrytning. Kokning minskade inte aktiviteten hos RNase, vilket innebär att det är ett mycket motståndskraftigt protein.
Det är viktigt att notera att en genomsnittlig RNA-nedbrytning på 1,5 log10 eCFU/mL inte är en stor förlust. För detta ändamål ser vi till att uppvärmning en liten del av Mtb bacilli, vilket utsätter en liten mängd RNA för RNase. Med hjälp av TEM visade vi att Mtb cell morfologi och integritet cellväggarna knappast påverkas av uppvärmning vid 95 °C . Detta innebär att det kan kräva olika fysiologiska faktorer och tillräcklig tillgång på RNases såsom i värden för att avsevärt försämra RNA35,36. Dessutom är 16S rRNA potentiellt mindre känsligt för RNase37,,38. En enda Mtb cell innehåller ~ 700 ribosomer/0,1 mm3 av cytoplasman37, vilket innebär att det finns större mängder rRNA per cell. Mindre mängder RNase kan således ha en mindre inverkan38. Förekomsten av ett stort antal ribosomer ger en fördel för TB-MBLA när det gäller känslighet och förmåga att upptäcka låg belastning TB patienter.
Det fanns en stark korrelation mellan bakteriell belastning mätt med TB-MBLA och MGIT kultur TTP. Detta bekräftar bakteriebelastning som drivkraft för kultur positivitet i viss utsträckning. Fördelen med TB-MBLA är dock att den direkt kvantifierar bacillary belastning som finns i provet och inte kräver Mtb cellproliferation före detektion. Detta kontrasterar med kultur vars tid till positivitet beror på nivån av bakteriell belastning och graden av Mtb cellproliferation. Framtida studier kommer att utvärdera TB-MBLA-arbetsflödet, inklusive värmeinaktivering, i rutinmässiga kliniska inställningar. Studien kommer också att undersöka prover med en rad bakteriebelastningar för att förstå antalet som kan förändras från positiva till negativa (dvs. de med färre bakterier efter värme inaktivering).
TB-MBLA-protokollet för molekylär kvantifiering av bakteriebelastning är det första i sitt slag i bakteriologi. Metoden kvantifierar direkt Mtb bacillary belastning från patienten sputum och kräver ingen kultur för att göra det. Detta gör det snabbare och ökar dess potential att informera ett kliniskt beslut om patientens framsteg. Värmeaktiveringssteget minskar risken för infektion och ökar tillämpligheten av TB-MBLA i miljöer som inte har ett kategori 3-laboratorium. Efter värmeinaktivering av provet finns det tre protokollsteg för att uppnå TB-MBLA-resultat: RNA-extraktion, omvänd transkriptas (RT)-qPCR och qPCR-resultatanalys.
Ju högre effektivitet isolera Mtb RNA från ett patientprov, desto högre kvalitet på resultaten. Det är viktigt att notera att sputumprovets kvalitet påverkar mängden RNA-isolerat. Till exempel, salivary sputum anses låg kvalitet och har associerats med låg bacillary belastning. Detta innebär att utbildning av patienten för kvalitet sputum expectoration är viktigt. För att bedöma extraktionsprocessens effektivitet spetsas en extraktionskontroll (dvs. det kända antalet icke-Mtb-celler) i provet före RNA-extraktion. Hämtning av extraktionskontrollen bekräftar effektiviteten i RNA-extraktionsprocessen. RNA-isoleringsprocessen kan inte vara giltig om inte extraktionskontrollen har hämtats. Med tanke på att Mtb är en motståndskraftig organism gör mekanisk lys en avgörande del av processen. Homogenisering av provet vid hög hastighet (600 rpm) i närvaro av pärlor (dvs. lysingmatris) lyser effektivt cellerna. Rening av lysate ger ett extrakt som innehåller både RNA och DNA. Avlägsnande av DNA är ett avgörande sista steg i RNA-extraktionen. TB-MBLA syftar till att mäta livskraftig bacill genom att kvantifiera RNA. Således innebär underlåtenhet att ta bort genomiskt DNA att resultaten kommer att ha en signal från DNA, vilket inte är en bra markör för cellens livskraft6.
RT-qPCR är en duplex som kör dubbla märkta sonder för Mtb och extraktionskontroll. Det omfattar tre steg: 30 min omvänd transkription genom omvänd transkriptas vid 50 °C, 15 min denaturering vid 95 °C och 40 förstärkningscykler vid 94 °C och 60 °C. Förvärv av fluorescens från sonderna sker vid 60 °C (dvs. fragmentröjningsstadiet). Det är viktigt att notera att TB-MBLA har optimerats med hjälp av en viss qPCR-maskin, så operatörer som använder andra qPCR-plattformar bör optimera förutsättningarna för sin utrustning. Effektiviteten av DNA-borttagning kontrolleras för genom att köra en enda reaktion per prov i avsaknad av RT. Ett positivt resultat från denna reaktion innebär ofullständigt avlägsnande av DNA. Hög belastning prover som har stora mängder DNA kan kräva dubbla mängden DNase enzym för att helt ta bort DNA. Lyckligtvis, i höga bacillary belastning prover, förekomsten av små mängder DNA är mindre sannolikt att påverka resultatet från RNA. Ribosomal RNA, TB-MBLA målet, förekommer naturligt i dubbelt så mycket DNA37. I PCR, en ingen mall kontroll (NTC), som är det vatten som används för att lösa upp PCR reagenser, kontroller för korskontaminering med exogena DNA eller RNA. En positiv signal i NTC innebär korskontaminering och resultatet anses ogiltigt. Detta innebär att alla lösningar som utgörs av detta vatten måste kasseras och nya göras med hjälp av en färsk flaska vatten. Det är lämpligt att hålla PCR vatten i separata alikvoter för att undvika förorening av allt vatten. En positiv kontroll (Mtb RNA) används för att kontrollera den totala effektiviteten i PCR.
Resultatanalys innebär omvandling av PCR Cqs till bakteriebelastning (dvs. den uppskattade kolonin bildar enheter per ml) med hjälp av standardkurvan. Att ställa in och optimera standardkurvan är avgörande för detta steg. En standardkurva effektivitet på 0,95-1 rekommenderas. Standardkurvor för MTb och extraktionskontroll bör ställas in och optimeras innan patienter eller andra testprover körs på maskinen. Standardprover är försedda med TB-MBLA-satsen. En tiofaldig utspädning av RNA-extraktet rekommenderas för PCR. Detta innebär att resultatet för bakteriebelastningen måste multipliceras med en faktor på 10 för att erhålla det slutliga bakteriebelastningsresultatet per ml. Det är viktigt att notera att Cqs över 30 anses vara negativa för TB-MBLA. Minst två prospektiva bakteriebelastningsresultat som mäts vid olika tidpunkter krävs för att dra en slutsats om behandlingssvar. Det rekommenderas starkt att ett av de två resultaten ska vara baslinjen innan behandlingen påbörjas. Men om patienten inledde bakteriell belastning bedömning sker halvvägs genom behandling, måste det finnas en andra tidpunkt bakteriell belastning mätning för att utvärdera behandlingssvaret. TB-MBLA kan skilja bakteriebelastningen inom 3 dagar på behandling men idealet är två mätningar av bakteriebelastningen som tas med 7 dagars mellanrum.
Medan protokollet genererar informativa kvantitativa resultat för behandling svar, det är fortfarande till stor del manuell och kräver betydande händer i tid för RNA utvinning. Tekniker i upptagna laboratorier kanske inte har den här gången. Arrangemang pågår för att automatisera RNA-extraktions- och PCR-processerna.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Studien möjliggjordes genom finansiering från European and U Countries Clinical Trials Partnership (EDCTP) – Pan African Biomarker Expansion programme (PanBIOME) grant SP.2011.41304.008. Stöd erhölls också University of St Andrews School of Medicine forskningsanslag. Publiceringen av detta manuskript och TB-MBLA-protokollet som en visuell resurs har möjliggjorts genom finansiering från Scottish Funding Council och Global Challenges Research Fund till University of St Andrews. Tack vare Maputo Maternal hospital och Mavalane Health Centre som tillhandahöll de kliniska sputumproverna, och Maputo Tuberculosis Treatment Unit team som hjälpte till med värmeinaktiveringsexperiment av kliniska sputumprover.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat inactivation: | |||
| 15 mL Centrifuge tubes | Fisher-Scientific | 10136120 | 50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved |
| 15 mL Wire Tube rack | Fisher-Scientific | 11749128 | Other brands with similar make can be used |
| Water bath | Fisher-Scientific | 15700619 | Other brands with similar make can be used |
| RNA extraction: | |||
| Chloroform | Sigma | 372978-1L | Not necessary in other RNA extraction kit brands |
| Ethanol, absolute 99-100% | Sigma | 51976-500ML-F | Larger volume available |
| Extraction control | SOI group St Andrews | VitalbacteriaEC | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit |
| FASTRNA Pro blue Kit | MP Biomedicals | 116025050 | Supplied with lysing matrix tubes |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Qiagen, Fisherscientific can also supply same product |
| Precellys 24 homogeniser | VWR | 432-3750 | FastPrep MP Biomedicals can be used too |
| Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus | Fisher-Scientific | 15352117 | Other brands with similar capacity can be used |
| Thermomixer | Eppendorf | BLD-455-010C | Works with 1-2 mL tubes |
| TURBO DNA-free | Fisher-Scientific | AM1907M | Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures. |
| RT-qPCR: | |||
| Primers and Taqman probes | SOI group St Andrews | VitalbacteriaPP | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX. |
| QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit | Qiagen | 204845 | PCR mix plus the RT enzyme |
| RotorGene Q 5plex machine | Qiagen | 9001580 | Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc. can be used |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 mL | Qiagen | 981103 | Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed. |
| Non-heat inactivation Sample preservation materials | |||
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | 93313 | Supplied ready to use |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Many competent suppliers |
| Guanidine thiocyanate (GTC) | Promega | V2791 | Promega brand recommended for quality |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Ensures that GTC solution is free of nucleases |
| General materials (used but not specific to TB-MBLA) | |||
| 500 mL plastic containers | 734-5087 | Nalgene brand recommeded | |
| Biological waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Chemical waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Disposable gloves, chemical resistant | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-20 °C) | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-80 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fridge (0-8 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fume hood | For safe handling of toxic reagents | ||
| Laboratory scales | For accurate measurement of reagents | ||
| Measuring cylinders, plastic | To ensure accurate measurement of reagents | ||
| PCR reaction tubes | Should be suitable to the PCR instrument used | ||
| Pipettes and matching sterile filtered pipette tips, | DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended | ||
| Qiagility loading plates | Qiagen | 5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates | |
| QIAgility Pipetting Robot | Qiagen | Important for high throughput pipetting | |
| Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes | Chemical-resistant and autoclavable recommended | ||
| RNase Away (Removes RNases enzymes from working space) | Fisher Scientific | 10666421 | Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme |
| Safety goggles, chemical resistant | Fisher Scientific | Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents. | |
| Sterile Pasteur pipettes, 1.5-3 mL | Many competent suppliers | ||
| Sterile RNAse-free microtubes | 1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended | ||
| TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse | Ensure it is freshly prepared or prepared within a week | ||
| Vortex | Genie 2 brand recommended | ||
| Transmission electron microscopy | |||
| Glutaldehyde (8%) | Sigma | G7526-10ML | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| HEPES (pH 7.4, 100 mM) | Sigma | H4034-25G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Leica FCS ultracryo | Leica | Cryomicrotome for tissue sectioning | |
| Methyl cellulose | Agar Scientific | AGG6425 | Cold mounting resin |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Sigma | P6148-500G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Sucrose | Sigma | 84097-250G | Preservation and mounting medium |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | AGR1260A | Universal Electron microscopy stain |
References
- World Health Organization. END TB Global Tuberculosis Report 2017. World Health Organization. , (2017).
- World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. World Health Organization. , (2018).
- World Health Organization. TB Elimination in Low-Incidence Countries. World Health Organization. , (2014).
- Boehme, C. C., et al. diagnostic accuracy, and effectiveness of decentralised use of the Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistance: a multicentre implementation study. The Lancet. 377, 1495-1505 (2011).
- World Health Organization. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children. World Health Organization. , (2010).
- Friedrich, S. O., et al. Assessment of the sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF assay as an early sputum biomarker of response to tuberculosis treatment. The Lancet Respiratory Medicine. 1, 462-470 (2013).
- Desjardin, L. E., et al. Measurement of Sputum Mycobacterium tuberculosis Messenger RNA as a Surrogate for Response to Chemotherapy. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 160, 203-210 (1999).
- Hellyer, T. J., et al. Detection of Viable Mycobacterium tuberculosis by Reverse Transcriptase-Strand Displacement Amplification of mRNA. Journal of Clinical Microbiology. 37, 518-523 (1999).
- Honeyborne, I., et al. Molecular Bacterial Load Assay , a Culture-Free Biomarker for Rapid and Accurate Quantification of Sputum Mycobacterium tuberculosis Bacillary Load during Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).
- Li, L., et al. Sputum Mycobacterium tuberculosis mRNA as a Marker of Bacteriologic Clearance in Response to Antituberculosis Therapy. Journal of Clinical Microbiology. 48, 46-51 (2010).
- Honeyborne, I., et al. The Molecular Bacterial Load Assay Replaces Solid Culture for Measuring Early Bactericidal Response to Antituberculosis Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).
- Hellyer, T. J., Jardin, L. E. D. E. S., Hehman, G. L., Cave, M. D. Quantitative Analysis of mRNA as a Marker for Viability of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology. 37, 290-295 (1999).
- Aellen, S., Que, Y., Guignard, B., Haenni, M., Moreillon, P. Detection of Live and Antibiotic-Killed Bacteria by Quantitative Real-Time PCR of Specific Fragments of rRNA. Antimicrobial agents chemotherapy. 50, 1913-1920 (2006).
- Deutscher, M. P. Degradation of RNA in bacteria: Comparison of mRNA and stable RNA. Nucleic Acids Research. 34, 659-666 (2006).
- Gupta, R. K., Srivastava, R. Resuscitation Promoting Factors: A Family of Microbial Proteins in Survival and Resuscitation of Dormant Mycobacteria. Indian Journal of Microbiology. 52, 114-121 (2012).
- Mukamolova, G. V., Turapov, O., Malkin, J., Woltmann, G., Barer, M. R. Resuscitation-promoting factors reveal an occult population of tubercle bacilli in sputum. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 181, 174-180 (2010).
- Sheridan, G. E. C., Masters, C. I., Shallcross, J. A., Mackey, B. M. Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coliCells Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coli Cells. Applied Environment Microbiology. 64, 1313-1318 (1998).
- Honeyborne, I., et al. Molecular bacterial load assay, a culture-free biomarker for rapid and accurate quantification of sputum Mycobacterium tuberculosis bacillary load during treatment. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).
- Sabiiti, W., et al. Molecular Bacterial Load Assay: a Fast and Accurate Means for Monitoring Tuberculosis Treatment Response. BMJ Global Health. 2, 1-8 (2017).
- Gillespie, H., Stephen, S. W., Oravcova, K. Mybacterial Load Assay. Diagnostic Bacteriology. Methods and Protocols. Bishop, A. K. , Humana Press. Totowa, NJ. 89-105 (2017).
- Juffs, H., Deeth, H. Scientific Evaluation of Pasteurisation for Pathogen Reduction in Milk and Milk Products. Food Standards Australia New Zealand. , Wellington, New Zealand. (2007).
- Holmes, C. J., Degremont, A., Kubey, W. Effectiveness of Various Chemical Disinfectants versus Cleaning Combined with Heat Disinfection on Pseudomonas Biofi lm. Blood Purification. 22, 461-468 (2004).
- Chedore, P., et al. Method for inactivating and fixing unstained smear preparations of Mycobacterium tuberculosis for improved laboratory safety. Journal of Clinical Microbiology. 40, 4077-4080 (2002).
- Cardoso, C. L., et al. Survival of Tubercle Bacilli in Heat-fixed and Stained Sputum Smears. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 96, 277-280 (2001).
- Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Pathology. 55, 778-779 (2002).
- Honeyborne, I., et al. The molecular bacterial load assay replaces solid culture for measuring early bactericidal response to antituberculosis treatment. Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).
- Sabiiti, W., et al. Heat Inactivation Renders Sputum Safe and Preserves Mycobacterium tuberculosis RNA for Downstream Molecular tests. Journal of Clinical Microbiology. , 1-8 (2019).
- Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrasructure Research. 89, 65-78 (1984).
- Kumar, V. G., Urs, T. A., Ranganath, R. R. MPT 64 Antigen detection for Rapid confirmation of M. tuberculosis isolates. BMC Research Notes. 4, 79 (2011).
- Zwadyk, P., Down, J. A., Myers, N., Dey, M. S. Rendering of mycobacteria safe for molecular diagnostic studies and development of a lysis method for strand displacement amplification and PCR. Journal of Clinical Microbiology. 32, 2140-2146 (1994).
- Blackwood, K. S., et al. Viability testing of material derived from Mycobacterium tuberculosis prior to removal from a Containment Level-III Laboratory as part of a Laboratory Risk Assessment Program. BMC Infectious Diseases. 5, 3-9 (2005).
- Somerville, W., Thibert, L., Schwartzman, K., Behr, M. A. Extraction of Mycobacterium tuberculosis DNA: a Question of Contaiment. Journal of Clinical Microbiology. 43, 2996-2997 (2005).
- Bemer-Melchior, P., Drugeon, H. B. Inactivation of Mycobacterium tuberculosis for DNA typing analysis. Journal of Clinical Microbiology. 37, 2350-2351 (1999).
- McKillip, J. L., Jaykus, L. A., Drake, M. rRNA stability in heat killed and UV-irradiated enterotoxigenic Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157:H7. Journal of Appied Environmental Microbiology. 64, 4264-4268 (1998).
- Blank, A., Dekker, C. A. Ribonucleases of Human Serum, Urine, Cerebrospinal Fluid, and Leukocytes. Activity Staining following Electrophoresis in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels. Biochemistry. 20, 2261-2267 (1981).
- O'Leary, T. J. Reducing the impact of endogenous ribonucleases on reverse transcription-PCR assay systems. Clinical Chemistry. 45, 449-450 (1999).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes per 0.1 fl of cytoplasm. PLoS One. 10, 1-14 (2015).
- Yang, K., et al. Structural insights into species-specific features of the ribosome from the human pathogen Mycobacterium tuberculosis. Nucleic Acids Research. 45, 10884-10894 (2017).
