Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Celkweek op siliciumnitride membranen en Cryopreparation voor Synchrotron X-Ray fluorescentie nano-analyse

Published: December 10, 2019 doi: 10.3791/60461
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 2, 1,2
1Inserm, UA7, Synchrotron Radiation for Biomedicine (STROBE), Université Grenoble Alpes, 2ID16A Beamline, ESRF, The European Synchrotron

Summary

Hier is een protocol voor celkweek op siliciumnitride membranen en Plunge-bevriezing voorafgaand aan röntgenfluorescentie Imaging met een Synchrotron cryogene X-Ray nanoprobe. Wanneer alleen kamertemperatuur nano-analyse wordt verstrekt, kunnen de bevroren monsters verder gevriesdroogd worden. Dit zijn cruciale stappen om informatie te verkrijgen over de intracellulaire Elemental Composition.

Abstract

Er is weinig bekend over de verdeling van metaalionen op subcellulair niveau. Echter, die chemische elementen hebben essentiële regelgevende functies en hun verstoorde homeostase is betrokken bij verschillende ziekten. State-of-the-art Synchrotron X-Ray fluorescentie nanoprobes bieden de vereiste gevoeligheid en ruimtelijke resolutie om de tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) verdeling en de concentratie van metalen in hele cellen op de organel niveau. Dit opent nieuwe spannende wetenschappelijke onderzoeksgebieden over de rol van metalen in de fysioathologie van de cel. De cellulaire voorbereiding is een belangrijke en vaak ingewikkelde procedure, met name voor basisanalyse. Hoewel röntgenfluorescentie technieken nu wijdverbreid zijn en verschillende bereidingsmethoden zijn gebruikt, hebben zeer weinig studies het behoud van het elementaire gehalte van cellen op zijn best onderzocht en geen stapsgewijs gedetailleerd protocol voor de cryopreparatie van Er zijn tot nu toe aanhechting cellen voor röntgenfluorescentie nanoprobes vrijgegeven. Dit is een beschrijving van een protocol dat de stapsgewijze cellulaire voorbereiding voor snelle Cryofixatie biedt om Synchrotron X-Ray fluorescentie nano-analyse van cellen in een bevroren gehydrateerde toestand mogelijk te maken wanneer een cryogene omgeving en overdracht beschikbaar is. Indien nano-analyse bij kamertemperatuur moet worden uitgevoerd, wordt een aanvullende procedure voor het bevriezen van het vriesdrogen van de cryovaste aanhanger van het cellulaire preparaat verstrekt. De voorgestelde protocollen zijn met succes gebruikt in eerdere werken, meest recentelijk bij het bestuderen van de 2D-en 3D-intracellulaire distributie van een organomtaalverbinding in borstkankercellen.

Introduction

Nieuw ontworpen Synchrotron X-Ray fluorescentie (SR-XRF) nanoprobes toestaan visualisatie van de subcellulaire verdeling van elementen in een volledig kwantitatieve manier. Als voorbeeld, deze analytische mogelijkheid maakt onderzoek naar de opname van nanodeeltjes1 of organometopolische moleculen zoals osmium-gebaseerde complexen2, het verstrekken van inzicht in de intracellulaire opname van metaal gebaseerde moleculen met krachtige antikanker eigenschappen. Als een techniek met meerdere elementen biedt SR-XRF3 met een nanoprobe een manier om intracellulair meest biologisch belangrijke elementen, waaronder fosfor, zwavel, kalium, calcium, ijzer, koper en zink, gelijktijdig te kwantificeren en lokaliseren. Inderdaad, het gebruik van harde röntgenstralen zorgt voor een grote penetratie diepte om hele diepgevroren gehydrateerde cellen in een etiket vrije mode te kunnen afbeelen. Bovendien, het verstrekken van toegang tot de K-rand van de meeste elementen van belang, de X-Ray fluorescentie is zeer efficiënt opgewonden. Het gebruik van cryogene benaderingen maakt vermindering van stralings schade en optimalisatie van het behoud van de celstructuur en elementaire distributie mogelijk.

De meeste beschikbare ruimtelijk opgeloste analytische technieken om metalen in cellen te bestuderen zijn oppervlaktetechnieken waarvoor zeer dunne en vlakke delen van cellen moeten worden geproduceerd. Dit omvat voornamelijk Scanning transmissie elektronenmicroscopie met energiedispersieve Röntgen analyse (STEM-EDX), energie-gefilterde transmissie elektronenmicroscopie (EF-TEM) en nanoschaal secundaire Ion massaspectrometrie (nano Sims). De laatste kan niet worden uitgevoerd op bevroren, gehydrateerde celgedeelten terwijl Cryo-analyse kan worden gedaan met elektronenmicroscopie met onovertroffen ruimtelijke resolutie, maar met een slechte elementair gevoeligheid. Door deeltjes geïnduceerde röntgenstraling (PIXE) heeft de studie van elementaire distributies in hele cellen toegestaan. Het heeft het voordeel dat het volledig kwantitatief is met een eerlijke elementaire gevoeligheid op de micron schaal en zelfs op submicron resolutie4, maar lijdt aan stralings schade en gebrek aan cryogene capaciteiten om diepgevroren cellen te bestuderen. Al deze analytische technieken vullen elkaar aan in de elementaire beeldvorming van cellen, maar voor alle technieken is de monster voorbereidingsprocedure een cruciale stap. Het moet eenvoudig worden gehouden om mogelijke verontreiniging te beperken, evenals elementaire herverdeling en/of lekkage om zinvolle resultaten te verkrijgen. Zoals aangetoond in elektronenmicroscopie, een cryogene workflow, met inbegrip van Cryo-immobilisatie van de cel en cryotransfer naar een cryoscanning fase, maakt een optimaal elementair behoud op subcellulaire niveaus zo dicht mogelijk bij de inheemse staat5,6,7,8,9,10. Dit begrip is met succes geïmplementeerd in de ontwikkeling van Synchrotron Cryo-Soft X-Ray microscopie (bijv. volledige veld microscopen en scanning microscopen) om Ultrastructurele beeldvorming van volledige diepgevroren cellen in 2D of 3D te produceren. Verschillende cryogene workflows werden ontwikkeld11 voor Soft X-Ray microscopen op beamline 2,1 (XM-2) van de geavanceerde lichtbron bij Lawrence Berkeley National Laboratory12, BEAMLINE U41-XM bij de Electron Storage ring Bessy II (Duitsland)13, beamline Mistral van de Alba Light Source (Spanje)14, en bij beamline B24 van de Diamond Light Source15, onder andere. Een vergelijkbare workflow werd onlangs aangetoond als de meest betrouwbare voorbereidings-en conserveringsmethode voor intracellulaire elementale analyse met behulp van X-Ray microprobes16,17.

Hoewel X-Ray nanoprobe-technieken op grote schaal worden gebruikt voor cellulaire elementair onderzoek, met name met de komst van cryogene SR-XRF-capaciteiten, is er tot dusver geen stapsgewijs Protocol verspreid naar de onderzoeksgemeenschap. Hier wordt een gedetailleerde procedure gegeven om cryovaste hecht cellen te bereiden als monolagen op siliciumnitride membranen die onder Cryogene omstandigheden moeten worden geanalyseerd. Een Vries droog stap die moet worden toegepast na het protocol voor het geval de Röntgen analyse bij kamertemperatuur moet worden uitgevoerd, is ook aanwezig. Hoewel het voorgestelde protocol met succes is gebruikt met humane borstkankercellen MD-MB-2312 en het vriesdrogen onder andere op muis neuronen18,20,21is aangetoond, kan het gemakkelijk worden uitgebreid tot verschillende soorten menselijke of dierlijke cellen.

Protocol

Experimentele procedures werden goedgekeurd door de Dierenzorg Commissie van de afdeling Life Sciences van de CEA (CETEA, A14-006). Zij zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Franse wetgeving en de richtlijn van de Europese Gemeenschap van 24 november 1986 (86/609/EEG).

1. siliciumnitride (si3N4) voorbereiding van membraan ondersteuning

Opmerking: omdat het membraan fragiel en delicaat is, moet de steun (200 μm dik silicium frame) voorzichtig worden behandeld, idealiter met een dun Carbon pincet of Dumont pincet #5, rechte zelfsluitende fijne tips. Dit protocol gebruikte siliciumnitride membranen met een frame van 5 mm x 5 mm en een membraan grootte van 1,5 mm x 1,5 mm. Het membraan moet ongeveer 12 uur vóór aanvang van het experiment worden bereid (d.w.z. celseeding). Membranen kunnen worden bereid aan het einde van de dag en drogen 's nachts onder een klasse II laminaire flow Hood zodat ze klaar zijn om de volgende ochtend te gebruiken. Een silicium frame dikte van 200 μm is standaard voor de meeste bedrijven die siliciumnitride ramen verkopen. Als het in dit Protocol gebruikte product niet beschikbaar is, kan een membraan grootte van 0,5 − 1,5 mm worden gebruikt met een standaard framegrootte van 5 mm x 5 mm. De grotere membraan grootte heeft de voorkeur wanneer X-Ray tomografie wordt gebruikt. TEM grid type siliciumnitride ramen met een membraan grootte van 0,5 mm en een dikte van 50 nm kan ook worden gebruikt.

  1. Open de capsule met de si3N4 membraan steun (Figuur 1). Knijp zachtjes in de capsule om de steun lichtjes los te maken.
  2. Houd een van de hoeken van het siliconen frame vast met behulp van de dunne pincet. Let op dat u het si3N4 membraan in het midden niet aanraakt. De 200 of 500 nm dik membraan kan gemakkelijk worden beschadigd.
  3. Gebruik de dunne pincet en plaats de si3N4 membraan steun voorzichtig in een steriele glazen Petri schaal, vlak oppervlak van het siliciumnitride venster naar boven gericht (d.w.z. de holte naar de bodem van de schotel).
  4. Verwijder de deksel van de Petri schaal en laat de membranen onder UV-licht gedurende 25 − 30 minuten onder de laminaire flowkast.
    Opmerking: het UVC-lampje (254 nm) is meestal ingesteld op 200 μW/cm2.
  5. Plaats 10 μL poly-L-lysine op het membraan. De druppel moet het si3N4 membraan goed bedekken en kan een beetje verspreiden over het silicium frame. Laat het bij 37 °C gedurende 25 minuten in de standaard weefselkweek incubator bij 100% relatieve vochtigheid en 95% lucht, 5% CO2.
    Opmerking: in dit geval werd een poly-L-lysine coating gebruikt voor de MDA-MB-231 borstkanker cellen. Afhankelijk van het type cellijn kunnen verschillende coatings worden gebruikt, en deze stap moet dienovereenkomstig worden geoptimaliseerd.
  6. Vul in een steriele 48 putplaat verschillende putjes met 200 − 250 μL Ultra zuiver en ultra-Trace water gefilterd door een 0,22 μm steriel filter. Typisch, elk goed kan worden gebruikt om te spoelen tot 2 − 3 membranen. Met behulp van fijne pincet, pick-up de membraan ondersteuning op een hoek van het silicium frame. Spoel het membraan zachtjes door het verticaal samen te voegen 10 s in drie opeenvolgende putjes.
    Opmerking: de membraan dragers worden uit de incubator gehaald en kunnen op kamertemperatuur worden verwerkt, met de temperatuur en de vochtigheid die wordt bepaald door een laminaire stroom afzuigkap van klasse II.
  7. Zet de membraan steun verticaal in een lege put van een steriele 96 goed plaat, dek het af en laat het 's nachts drogen onder een klasse II laminaire stroom afzuigkap.

2. celseeding

  1. In een steriele 4 goed plaat, plaats de membranen met hun platte kant naar boven gericht.
  2. MDA-MB-231 cellen worden gehandhaafd in een monolaag cultuur in DMEM met fenolrood/glutamax I, aangevuld met 10% foetaal kalf serum en 1% penicillaire en streptomycine bij 37 ° c in een 5% Co2 lucht bevoficeerde incubator.
  3. Wanneer de cellen 60 − 70% confluentie bereiken, verwijdert u de media uit de schaal of de kolf.
  4. Was 1x met 10 ml van de fosfaatgebufferde zoutoplossing van Dulbecco zonder CA2 + of mg2 +.
  5. Voeg 3 ml/T75 kolf van 0,05% trypsine/EDTA-oplossing toe en zorg ervoor dat de gehele monolaag bedekt is met de trypsine-oplossing.
  6. Inincuberen gedurende 3 − 5 minuten bij 37 °C totdat de cellen beginnen te ontkoppelen. Zorg moet worden genomen om niet te overdreven trypsinize de cellen en niet dwingen de cellen te voortijdig loskoppelen.
  7. Voeg toe 8 ml DMEM aangevuld met 10% foetaal kalf serum en 1% penicillaire en streptomycine of volledige media en verzamel de cellen door pipetteren. Het serum in de media zal de trypsine neutraliseren.
  8. Spin naar beneden bij 250 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Aspireren het supernatant.
  9. Voeg 8 ml verse volledige media toe aan de buis van 15 ml die de celpellet bevat en Pipet de cellen omhoog en omlaag totdat de cellen zijn gedispergeerd in één celsuspensie.
  10. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en Verdun tot een concentratie van 5 x 106 cellen per ml in volledige media (DMEM met fenolrood/1% van een 200 mm l-alanyl-L-glutamine dipeptide in 0,85% NaCl oplossing aangevuld met 10% foetaal kalf serum en 1% penicillaire en streptomycine).
  11. Neem 10 μL van de MDA-MB-231 celsuspensie en stort deze op het membraan. Dit komt overeen met 50.000 cellen/10 μL voor MDA-MB-231. De druppel moet het si3N4 membraan goed bedekken en kan een beetje verspreiden op het silicium frame. Zorg moet worden genomen om het si3N4 membraan niet aanraken met de punt van de micro pipet.
    Opmerking: afhankelijk van het type cellijn en experimenten of metingen kan de celdichtheid variëren en moet dienovereenkomstig worden getest. Hier werd de voorgestelde celdichtheid voor het zaaien van het si3N4 -membraan optimaal gevonden voor de experimentele omstandigheden en verder SR-XRF nano-analyse van de mda-MB-231-cellen2.
  12. Voor hippocampal neuronen (hn), verwijder het hersenweefsel van de hippocampus van embryonale dag 18,5 muizen en verteren het in 0,25% trypsine in Hepes-HBSS (5,3 mm KCl, 0,44 mm KH2po4, 137,9 mm NaCl, 0,34 mm Nah2po4, 5,56 mm glucose) bij 37 °c gedurende 15 min18,19.
  13. Gebruik een P1000 pipet met een P1000 Tip en een P200 tip om de mechanische dissociatie uit te voeren door de kegel inhoud meerdere malen met de pipet te tekenen en los te laten. Tijdens deze stap moet u oppassen dat u geen luchtbellen in het medium creëert, omdat luchtbellen giftig zijn voor neuronen.
  14. Wacht een paar minuten totdat het aggregaat aan de onderkant van de buis is vereffent.
  15. Breng het supernatant met de verspreide cellen over naar een steriel Eppendorf-buisje. Laat ~ 25 μl kweekmedium met het aggregaat.
  16. Tel de gezien cellen met behulp van een hemocytometer. Geïsoleerde HN neuronen worden verguld met een concentratie van 7 x 104 cellen cm-2 op poly-l-lysine (1 mg/ml poly-l-lysine)-gecoat siliciumnitride membraan.
  17. Alleen voor membranen met HN, incuberen de neuronen in eerste DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum. Een h na plating HN in DMEM, het medium wordt veranderd in neurobasal plating media (200 mm l-alanyl-L-glutamine dipeptide in 0,85% NaCl-oplossing, en B27 supplement d = 1/50 verdund in neurobasal)18,19.
  18. Voor de MDA-MB-231 cellen, het membraan ondersteunt bij 37 ° c in de incubator (100% relatieve vochtigheid, 95% lucht en 5% CO2) gedurende 25 min. Hierdoor kunnen de cellen zich vestigen en beginnen te hechten aan het substraat. Dit kan worden aangepast afhankelijk van de gebruikte cellijn.
  19. Voeg 1 mL van het vereiste volledige kweekmedium toe (DMEM met fenolrood/1% van een 200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide in 0,85% NaCl-oplossing aangevuld met 10% foetaal kalf serum en 1% penicillaire en streptomycine) in elk putje van de MDA-MB-231 cellen door de pipetpunt tegen de wand van de kunststof te plaatsen en het medium heel langzaam los te laten terwijl het het membraan bedekt.
  20. Zet het membraan verticaal tegen de wand van de 4 goed plaat om eventuele luchtbelletjes die gevangen zitten in de put holte van het si3N4 membraan weg te nemen (Figuur 2). Om dit te doen, gebruik fijne pincet en duw de bel zeer zachtjes, parallel aan de si3N4 achterzijde frame om te voorkomen dat aanraken en beschadiging van het membraan.
  21. Plaats het membraan op de bodem van de put horizontaal en laat de 4 goed plaat in de incubator voor de vereiste tijd, afhankelijk van de groeisnelheid van de gebruikte cellijn. De MDA-MB-231 cellen werden 's nachts geïnineerd.

3. behandeling of middelmatige verandering

  1. Verwijder het medium van de 4 goed plaat.
  2. Spoel één keer af met 1 mL PBS-oplossing bij 37 °C. Gooi de PBS weg en voeg 1 mL opgewarmd volledig vers medium toe in aanwezigheid of bij afwezigheid (controles) van de gewenste behandeling met behulp van een pipetpunt van 1 mL, waarbij de vloeistof zeer langzaam wordt losgemaakt tegen de wand van de goed plaat. Het si3N4 membraan moet langzaam worden ondergedompeld zonder enige verstoring om membraan beweging of opheffing te voorkomen.

4. Cryo-immobilisatie van de cellulaire voorbereiding door het invriezen

Opmerking: aan het einde van de vereiste incubatietijd, in aanwezigheid of afwezigheid van behandeling, moeten de cellen zorgvuldig worden gespoeld en cryovaste. Ongeveer 30 minuten voordat u begint met spoelen en DEP de cellulaire voorbereiding vóór het invriezen, eerst instellen en afkoelen van de automatische duik vriezer machine. Wanneer u cryogenen manipuleert, zijn het gebruik van geschikte cryogene handschoenen, veiligheidsbril, gesloten schoenen en een laboratoriumlaag vereist. Vloeibare stikstof moet in passende Dewars worden vervoerd en de werkplaats moet voldoende worden geventileerd met de aanwezigheid van een zuurstofmonitor. Idealiter helpt een lage hygrometrieniveau van 20 − 30% om de ijsbesmetting van de materialen, Dewars en cryogenen te beperken, wat schadelijk is voor de verglavering van de monsters (d.w.z. een amorfe ijslaag). Idealiter kan, afhankelijk van het ervaringsniveau van de onderzoeker, tot 10 − 12 monsters voor één sessie worden bereid met dezelfde secundaire cryogene vloeibare ethaan beker voor vitrificatie. Tussen de sessies vereist de automatische Dompel vriezer een automatische Bake-out procedure van 1 uur. Idealiter moeten monsters worden verwerkt met identieke incubatie condities. Toch kunnen besturingselementen eerst worden verwerkt, gevolgd door de monsters met een bepaalde behandelings voorwaarde.

Opmerking: voor het invriezen van de volgende stappen gelden zowel MDA-MB-231 als HN-cellen.

  1. Stel de cryoplunger in voor snelle Cryofixatie van cellen.
    1. Schakel de automatische Dompel vriezer in.
    2. Voer de parameters in (bijv. temperatuur, percentage vochtigheidsgraad, droogzet tijd als automatische blotting wordt gebruikt, en positie voor het optillen van het monster naar het oppervlak van de cryogene om de overdracht naar een cryogeen container te vergemakkelijken) direct vanaf de console en parameters menu instellingen. In het onderhavige geval werden de parameters van de vochtigheids kamer ingesteld op 37 °C en 80% luchtvochtigheid.
      Opmerking: voor dit protocol en Röntgen beeldvorming zijn betere vitrificatie resultaten verkregen met snelle en zorgvuldige handmatige blotting. Het protocol maakt dus geen gebruik van een automatisch blotting sequence-programma.
    3. Bevestig de bevochtiger kamer en bewaar de luchtvochtigheid eerst met een injectiespuit met 60 mL dubbel gedestilleerd water en vervolgens 20 mL zoals gevraagd op de automatische Dompel vriezer console.
      Opmerking: Vermijd het gebruik van ultrapuur water omdat het het vaporizer systeem kan beschadigen. Sluit de klep en laat de slang aan de achterzijde van de bevochtiger.
    4. Plaats de zwarte ethaan Cup in de houder en dek deze af met de plastic doppen.
    5. Vul de Dewar van de koude kamer met LN2, waardoor het op het niveau van het rooster binnen het werkgebied wordt gebracht.
    6. Zet een speciale Cryo-box om de membranen na Cryofixatie in de transfer container op de speciale locatie in het em-GP werkgebied en dicht bij de ethaan bekerhouder op te slaan.
      Let op: de speciale Cryo-box is een in-house ontwikkeling op de nanoprobe beamline ID16A van de Europese synchrotronstraling in Grenoble. Tekeningen met specificaties zijn beschikbaar op aanvraag (Figuur 3). Ze kunnen vier tegelijk worden opgeslagen in een conische buis van 50 mL voor lange termijn opslag in een LN2 Dewar. Een alternatieve mogelijkheid bestaat uit het gebruik van een kleine 0,2 mL reguliere PCR dunne wand buis met Dome caps om één si3N4 membraan ondersteuning op te slaan. U moet een gat van ~ 2 mm in het bovenste deel van de wand buis boren met behulp van een verwarmde spuit naald om LN2 in staat te stellen de buis te vullen.
    7. Vul de transfer container met LN2 en dek deze af met het speciale aluminium deksel. Blijf de koelkamer vullen met LN2 (meestal ~ 2 L is nodig) houd bij 100% het ln2 niveau monitor display op de console. Wacht tot de laatste vereiste temperatuur is bereikt.
    8. Verwijder de plastic dop en dek de ethaan beker af met de lifier die is aangesloten op de ethaan fles. Wacht tot de temperatuur van de ethaan-beker naar de ingestelde temperatuur is. Wanneer bereikt, begin met het gebruik van de secundaire cryogene (dat wil zeggen, vloeibaar gemaakt ethaan).
      NB: het gebruikte instelpunt was-180 °C, iets boven het ethaan smeltpunt (-182,8 °C). U hoeft de ethaan vloeiaar niet vooraf te maken omdat het een bron van vorst vorming en verontreiniging van de ethaan beker kan zijn.
    9. Open het hoofd ventiel van de ethaan-fles met hoge zuiverheid en open de drukregelaar zeer langzaam totdat u een langzame mist van ethaan krijgt. Houd deze zeer lage stroom totdat vloeibaar ethaan opbouwt. Vul de beker tot aan de bovenrand. Sluit de drukregelaar en de hoofdklep van de ethaan-fles. Verwijder de Leica lifier voorzichtig en laat het opzij op een kleine polystyreen steun onder de rook afzuigkap. Houd het werkgebied losjes bedekt met de zwarte polystyreen dop voorzien van de machine om vorst verontreiniging van het werkgebied en de ethaan container te voorkomen.
    10. Vlak voorhand matige blotting van het monster, verwijder de zwarte polystyreen dop en uit het menu van de console druk op "onderste kamer", die brengt de milieu kamer in contact met het cryogene werkgebied.
  2. Voorbereiding om het monster te wissen.
    1. Bereid de adequate buffer voor het verwijderen van sporen van zouten uit het kweekmedium. Voor dit protocol werd ammoniumacetaat buffer gebruikt voor het spoelen van de MDA-MB-231 cellen.
      Opmerking: ammonium acetaatbuffer is geschikt voor de meeste celtypen, en het voegt niet toe aan het röntgenfluorescentie signaal (gezien elementen met Z > 9). Sommige specifieke cellijnen zoals neuronale cellen kunnen het gebruik van een speciale buffer vereisen. Bijvoorbeeld, voor primaire corticale neuronen, een zoutoplossing bestaande uit 1,8 volume van 0,5 M na2HPO4 en 1,9 volume van 0,5 m Nah2po4 kan worden gebruikt15. Aan de andere kant zal fosfor of chloor in de buffer bijdragen aan het XRF-spectrum. Deze beperking van valse X-Ray-emissie lijnen moet in gedachten worden gehouden, afhankelijk van de elementen die van belang zijn om te worden opgespoord.
    2. Bereid een 150 mm ammoniumacetaat oplossing van ammoniumacetaat ultrapuur oplossing en controleer op pH (7,0 – 7.3) en osmolariteit (270 – 300 mosm/kg)
      Opmerking: de bovengenoemde osmolariteit komt overeen met Dulbecco's fosfaatbuffer Saline (D-PBS) zonder calcium en magnesium en kan worden gecontroleerd met behulp van een micro-osmometer.
    3. Vul het vereiste aantal putten van een 12-put plastic plaat met de ammoniumacetaat-buffer.
    4. Knip een kwart van het filtreerpapier af voor het blotting, van No. 1 filtreerpapier met een voorgesneden gat, of van handmatig geperforeerd filtreerpapier van een 55 mm diameter met een 15 mm centraal gat.
    5. Neem het vereiste monster dat in de incubator is opgeslagen op 37 °C op het laatste moment voor het spoelen en het invriezen van het membraan.
    6. Ontgrendel de pincet met behulp van de zwarte klemring van de Quick-release pincet (meestal een Dumont Spanring High-Precision Medical pincet) en pak de si3N4 membraan ondersteuning van de cultuurgoed.
      Opmerking: pak het midden van het siliconen frame, houd de punt van de pincet in de buurt van het membraan. Beweeg de zwarte klemring naar de eerste strepen om de pincet te vergrendelen.
    7. Dompel de si3N4 membraan ondersteuning verticaal in de ammoniumacetaat bufferoplossing bewaard bij 37 °c voor ~ 5 s.
      Opmerking: de ondersteuning moet verticaal blijven in de buffer. Merk op dat de bufferoplossing in elke put van de plaat kan worden gebruikt voor maximaal drie membranen voor dezelfde incubatie condities.
    8. DEP handmatig met filtreerpapier om de overtollige buffer uit de membraan spoeloplossing (Figuur 4) af te voeren om een dunne en homogene laag ammoniumacetaat waterige oplossing te laten die de cellen bedekt.
      Let op: om dit te doen, druk eerst op de achterzijde van het venster op het filterpapier om bijna alle waterige buffer resten in de put en de achterkant van het membraan te verwijderen. Ten tweede, DEP de voorzijde, beginnend aan beide zijden van de pincet, dan aan elke kant van het frame (Figuur 4). Raak het membraan nooit aan. Het teveel aan buffer afvoer kan worden bewaakt met het aureool dat op het filtreerpapier is gevormd.
    9. Open de deur van het milieu kamer en monteer de pincet snel, schuif deze in de Tang vergrendeling en sluit de deur (Figuur 5).
    10. Druk op "Blot/A Plunge". De pincet die het si3N4 -membraan vasthoudt, wordt snel in het cryogene gedompeld.
    11. Verwijder de deksel van de transfer container met de voorgekookte Tang.
    12. Druk op "Transfer". Het si3N4 membraan zal licht worden verplaatst boven de cryogene.
    13. In een enkele snelle beweging koppelt u de pincet los door ze uit de pincet vergrendeling te schuiven en de vergrendeling enigszins te kantelen om rechtstreeks in een lege sleuf van de Cryo-box te brengen in de overdrachts container gevuld met LN2. Laat de zwarte klemring los om het membraan vrij te maken (Figuur 5).
      Opmerking: de overboekings container moet altijd worden gedekt door LN2. Wanneer een vulling nodig is, bedek de ethaan-beker met het plastic deksel dat bij de machine wordt meegeleverd om te voorkomen dat LN2 en ethaan worden gemengd.
    14. Bedek de transfer container met een deksel en gebruik een kleine witte polystyreen beker gevuld met LN2 om deze over te brengen naar een piepschuim doos gevuld met ln2.
      Opmerking: de Cryo-box of tube met de membranen kan vervolgens worden opgeslagen in 50 mL conische buizen gevuld met LN2 en overgebracht naar een lange termijn opslag LN2 Dewar. Voordat u begint met het invriezen van het volgende monster, opwarmen alle koude en matte pincet met een haardroger of een kookplaat/cryotools droger (45 °C) om besmetting met ijskristallen te voorkomen.

5. vriesdrogen van diepgevroren cellen gekweekt op siliciumnitride membranen

Opmerking: voor vriesdrogen zijn de volgende stappen van toepassing op zowel MDA-MB-231 als HN-cellen. Om de vriesdroger af te koelen, moet u ongeveer 40 min tot 1 uur wachten.

  1. De vriesdroger instellen
    1. Schakel het apparaat in met de tuimelschakelaar op het achterpaneel van het apparaat.
    2. Begin met het invoeren van de parameters na het LCD-menu: segment 1 = 2 uur bij-120 °C; Segment 2 = 2 uur helling van-120 °C tot-80 °C; Segment 3 = 2 uur bij-80 °C; Segment 4 = 2 uur helling van-80 °C tot 50 °C; Segment 5 = 2 uur bij-50 °C; Segment 6 = 6 uur helling van-50 °C tot 30 °C.
    3. Na afloop van de parametrering slaat u de instellingen op, sluit u het deksel van de kamer en drukt u op "StarT".
    4. Het apparaat zal tot 1,10-5 mbar pompen. Wanneer deze druk is bereikt, zal de commandoregel van het display "Start Cooling Now, start to continue" tonen.
    5. Vul de vloeibare stikstof Dewar regelmatig om af te koelen het podium onder de temperatuur triple punt instelling.
      Let op: de stage Triple Point temperatuur is ingesteld op-140 °C. Voor het laden van het monster voor dit protocol, is het het beste om te wachten over 1 h en een temperatuur fase van-160 °C.
    6. Op het display wordt "Press EnteR" weergegeven als u klaar bent om "monster te laden".
    7. Afkoelen tot vloeibare stikstof temperatuur binnen een LN2 gevulde polystyreen Dewar, de monster Transfer houder verstrekt door de leverancier, en de twee extra messing cilindrische si3N4 membraan houders.
    8. Monteer de si3N4 membraan messing houder bovenop de monster Transfer houder verstrekt door de leverancier in de polystyreen Dewar (Figuur 6A). Houd het niveau van LN2 tot ongeveer 1 − 2 mm onder de bovenrand van het eerste messing stuk.
    9. Neem een si3N4 membraan sample ondersteuning van de Cryo-box of de PCR-buis met behulp van voorgekookte zelfsluitende pincet in inox of met Teflon coating.
    10. Stort het membraan met de cellen monster zijde naar boven in de koperen houder genummerde holte.
    11. Dek de montage af met het tweede koperen stuk als deksel (Figuur 6C).
      Let op: we hebben twee koperen schijven ontworpen met een dikte van 5 mm, een diameter van 50 mm en een centrale opening met een diameter van 11 mm. De eerste koperen schijf heeft 14 bewerkte rechthoekige (8 mm x 6 mm) locaties voor dragers (5 mm x 5 mm). Elke sleuf heeft een vlakke en gepolijste put met een diepte van 2 mm. De tweede koperen schijf is plat om de si3N4 membraan Brass ondersteuning te bedekken en fungeert als een koude trap behuizing.
    12. Precool de transfer stang in de LN2 gevulde piepschuim doos en gebruik deze om de volledige montage te vergrendelen (Figuur 6D, E).
    13. Druk op "EnteR" op het voorpaneel van de vriesdroger.
    14. De Turbo-en roterende pompen stoppen en de kamer wordt opgeschoond met droog stikstofgas, zodat het deksel van de kamer kan worden geopend.
    15. Breng de monster Transfer eenheid met de veerbelaste Transfer stang in de kamer van de vriesdroger en klem deze op de koperen LN2 koude fase.
      Opmerking: laat de volledige montage met de transfer stang in de kamer.
    16. Sluit onmiddellijk de deksel van de kamer van de vriesdroger en druk op "StarT" om verder te gaan met de vriesdroog cyclus.
    17. Vul het LN2 reservoir van de vriesdroger handmatig om de 2 uur.
      Opmerking: een automatisch LN2 -vulsysteem kan op dit reservoir worden aangesloten.
    18. Druk aan het einde van de vriesdroog cyclus op "StoP" om de kamer te ventileren en verwijder de volledige assemblage om toegang te krijgen tot de gevriesdroogde monsters.

Representative Results

Een typische optische video Microscoop weergave van bevroren gehydrateerde MDA-MB-231 cellen die op een poly-L-lysine gecoate si3N4 membraan ondersteuning werden gesubcultureerd, wordt weergegeven in Figuur 7a. De optische weergave van het monster in de vacuümkamer werd verkregen in reflectie modus met behulp van de speciale online video Microscoop van de ID16A beamline van de ESRF22. Terwijl elektron of zachte X-Ray microscopie vereist dat de ijslaag de cel insluit om zo dun mogelijk te zijn (meestal < 0,5 μm), hebben harde röntgenstralen (> 10 keV) het voordeel van een veel hogere penetratie diepte en lagere dosis depositie. De ijsdikte kan daarom groter zijn, meestal < 10 μm inclusief de cel, zodat de ijsinsluiting van de cel een paar μm dik is. Dit kan worden geschat door de gemeten Röntgen intensiteit in transmissie in vergelijking met de intensiteit zonder het monster, rekening houdend met de absorptie van het 500 nm dikke si3N4 membraan. Deze ijsdikte kan worden bereikt door handmatige blotting zoals beschreven in het huidige protocol. In de Newton Rings-regio kan de ijsdikte nog dunner zijn (niet gemeten).

De röntgenfluorescentie Elemental mapping van de bevroren gehydrateerde cel wordt weergegeven in Figuur 7B met de representatieve verdelingen van fysiologische elementen zoals kalium (K), zwavel (S) en zink (Zn). Deze kaarten vertegenwoordigen de elementaire areale massa (d.w.z. elementair geprojecteerde massa). Hoewel dit niet gebeurt in het onderhavige geval, kunnen dergelijke kaarten worden genormaliseerd via X-Ray propagatie-gebaseerde fase contrast beeldvorming die de schatting van het voorbeeld van de geprojecteerde massa23biedt. Zoals gerapporteerd door vele onderzoeken, werd verondersteld dat het sterk diffundeerbaar K-ion in cellen in de in de nabije omgeving bewaarde toestand homogeen verdeeld was over de gehele cel23,24,16. Zoals weergegeven in de 2D röntgenfluorescentie Elemental beelden in Figuur 7B, de strak gebonden element S was gelijkmatig verdeeld in de cel, vergelijkbaar met K, en vertegenwoordigt een goede schatting van het cellulaire massa profiel. De Zn-verdeling had een hoger signaal in de Nucleus dan in de cytosol en duidelijk de Nucleus geschetst. Er kan worden opgemerkt dat kleine Zn-verrijkte gebieden kunnen worden gedetecteerd bij de ruimtelijke resolutie (50 nm) in het nucleaire gebied.

De bestaande X-Ray nanoprobes of degenen die moeten worden gebouwd, zijn niet noodzakelijkerwijs geschikt voor cryogene capaciteiten. In dit geval is het beste alternatief voor het verkrijgen van röntgenfluorescentie beelden van cellen bij sub-100 nm ruimtelijke resoluties het uitvoeren van een vriesdrogen procedure beschreven in dit protocol na het invriezen van de cel. Figuur 8a toont een typisch helderveld microscopie weergave van resulterende gevriesdroogde primaire muis hippocampal neuronen direct gekweekt op de si3N4 membraan. In dit geval, indien opgeslagen in een schone, drooggeveerde kamer, kunnen de monsters 1 − 2 weken van tevoren worden bereid en worden geobserveerd met een gewone, rechtopstaande optische Microscoop voor de registratie van interessante gebieden. Zorg moet worden genomen om blootstelling aan de omgevingsvochtigheid te voorkomen, omdat het kan worden opgevangen door het gevriesdroogde monster en leiden tot schade onder de Röntgen nano straal. Deze procedure werd met succes toegepast op zeer gevoelige cellen (d.w.z. neuronale cellen) en zelfs betere resultaten werden verkregen met andere robuustere soorten cellen, zoals kankercellen. Wat de diepgevroren cellen betreft, zijn de röntgenfluorescentie beelden van K, S en Zn op het gehele gevriesdroogde celdisplay vergelijkbaar met die welke hierboven zijn beschreven. Ze zijn representatief voor de Elemental distributies te vinden in verschillende soorten gevriesdroogde cellen bij 50 − 100 nm ruimtelijke resolutie. Terwijl het bevriezen van hele cellen een alternatief is om elementaire integriteit te behouden, is het ten koste van een perfect behoud van de celmorfologie16, met name celmembranen.

Figure 1
Figuur 1: typische sample ondersteuning voor röntgenfluorescentie nano-analyse. Een si3N4 membraan ondersteuning in de beschermende capsule. Dit type substraat kan zowel worden gebruikt voor kamertemperatuur analyse (dompel-Vries cellulaire bereiding gevolgd door lage temperatuur en laag vacuüm vriesdroogproces) of voor cryogene röntgenfluorescentie-analyse. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: schematische weergave van de ramen siliciumnitride na het zaaien van de cel. De cellen worden rechtstreeks op de poly-L-lysine gecoate vlakke oppervlak van de si3N4 membraan ondersteuning gekweekt. Soms kunnen luchtbellen worden gevangen in de achterzijholte van de si3N4 membraan ondersteuning en moeten worden verwijderd zoals beschreven in het protocol. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: in-house ontwikkelde 3D gedrukte Cryo-box voor lange termijn opslag van Dompel bevroren si3N4 membraan ondersteunt in vloeibare stikstof Dewar. (A) Cryo-Box gedemonteerd met de houder en de doppen (onderste deel) en (B) de gemonteerde Cryo-box met vergrendelde doppen. De doppen kunnen worden gemanipuleerd met de pincet, openen of vergrendelen door rotatie. Een gedetailleerd plan voor 3D-printen is beschikbaar op aanvraag van ESRF ID16A. Het ontwerp is gemaakt voor siliciumnitride TEM roosters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: blotting van cellen gekweekt op si3N4. Voorafgaand aan het invriezen van de cel monolaag gekweekt op een si3N4 membraan moet worden gespoeld in ammoniumacetaat oplossing (a) en zorgvuldig handmatig geblokt met behulp van filtreerpapier (B). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: automatisch invriezing em-GP machine. A) de automatische Dompel vriezer. B) de milieu kamer met de pincet opgesloten.C) de ethaan-beker bedekt met de Leica lifier die is aangesloten op een ethaan fles. D) de Dompel kast met de zwarte beker vol vloeibaar ethaan en de Cryo-box voor verdere opslag in LN2 van de verglaasd si3N4 membranen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: monster cryotransfer assemblage voor vriesdroog procedure. A) de eerste messing ontvanger voor si3N4 membranen wordt bovenop de houder van de monster overdracht gemonteerd die door de leverancier van de vriesdroger wordt geleverd. B) enC) tonen aan dat de tweede platte messing schijf als afdekking wordt gebruikt en fungeert als een koelval behuizing die in de vacuüm behuizing van de vriesdroger moet worden geplaatst. D) de volledige montage met de veer stang met veerbelaste overbrenging. E) de monsterhouder die de verglaasd cellulaire bereiding op het si3N4 -membraan draagt, moet verder worden ingebracht in de LN2-gekoelde vriesdroger. Alle stappen voor het monteren van de assemblage worden gedaan in LN2 in een piepschuim doos. Voor de duidelijkheid, alle beelden werden geproduceerd in de afwezigheid van LN2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 7
Afbeelding 7: Cryo-X-Ray fluorescentie beelden van een bevroren gehydrateerde cel met behulp van harde X-Ray nanoprobe. (A) typische online weergave in reflectie modus met behulp van de speciale optische video-Microscoop van de ESRF ID16A beamline. Na handmatige blotting werd een totale ijsdikte van ongeveer 5 − 10 μm bereikt die een duidelijk beeld van de bevroren gehydrateerde cellen mogelijk maakt. Een regio met Newton ringen die indicatief zijn voor nog veel dunner ijs is merkbaar. B) representatieve Cryo-X-Ray fluorescentie cellulaire distributies van fysiologische elementen kalium (K), zwavel (S) en zink (Zn). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: röntgenfluorescentie beelden van een gevriesdroogde neuronale cel met behulp van harde X-Ray nanoprobe. A) typisch helderveld microscopie van resulterende gevriesdroogde primaire corticale neuronale cellen direct gekweekt op de si3N4 membraan. Schaalbalk = 200 μm (B) representatieve kamertemperatuur X-Ray fluorescentie beelden van een enkelvoudig gevriesdroogd hippocampal neuron dat de distributies van fysiologische elementen kalium (K), zwavel (S) en zink (Zn) weergeeft. Schaalbalk = 2 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Cryo-electron microscopie (Cryo-em) won de 2017 Nobel prijs voor de Scheikunde en als zodanig de ontwikkeling gemaakt door J. dubochet op vitrificatie van biologisch materiaal voor de hoge-resolutie structuurbepaling van biomoleculen in oplossing25. Zoals gerapporteerd door Dubochet in zijn Nobel College "weten hoe een druppel water te verwateren, is één ding, het voorbereiden van een biologisch monster voor biologische observatie is een andere"25. Cryopreparation stappen worden nu beschouwd als de standaardtechniek om stralingsdosis schade te verminderen en studie cellen dicht bij hun geboortestaat. De voorbereiding blijft echter vervelend. Dit komt omdat elektronenmicroscopie, vanwege zijn onovertroffen ruimtelijke resolutie, gevoelig is voor een ultrastructureel artefact dat optreedt tijdens de monstervoorbereiding. De Synchrotron cryonanoprobes naderen nu soortgelijke moeilijkheden naar beneden naar ruimtelijke resoluties zo laag als 13 nm in de hoge energie X-Ray bereik26. Harde X-Ray microscopie kan hele cellen analyseren terwijl elektronenmicroscopie lijdt aan de slechte penetratie diepte van elektronen waardoor alleen zeer dunne celsegmenten kunnen worden waargenomen.

Monolagen van cellen zijn dun genoeg, zodat door het invriezen van vloeibaar ethaan, de vereiste koelsnelheden voor water verglagering worden bereikt. In theorie zijn koelsnelheden zo hoog als 108 K/s mogelijk met behulp van hogedruk bevriezing27 , waardoor vitrificatie van specimens te dik voor het plungevriezen. Een koelsnelheid van 105 K/s, vereist om volledige verglavering van het monster bij omgevingsdruk28mogelijk te maken, wordt met behulp van de automatische plungevries machine en de hier gepresenteerde parameters reproducbaar bereikt. Dit stelt een onderzoeker in staat om dunne biologische specimens (< 10 μm), zoals een monolaag van cellen12,13,14,15,29,30 , te verglazen door in vloeibaar ethaan te invriezen.

Een belangrijke uitdaging met dit protocol is ook de chemische integriteit van het intracellulaire gehalte zo veel mogelijk te behouden om betrouwbare elementaire distributies binnen de cel in 2D of 3D te leveren. Zoals elders gepubliceerd2,16,17,31, in het geval van elementair beeldvorming op subcellulair niveau, moet de analyse van bevroren gehydrateerde cellen worden overwogen. Anders kan de combinatie van Dompel-Vries-en vriesdrogen van cellen worden gebruikt voor kamertemperatuur analyse. Voor deze laatste wordt het amorfe ijs verwijderd door het proces van sublimatie, terwijl de gebonden watermoleculen worden verwijderd door het proces van desorptie. Dit proces kan verre van ideaal zijn in vergelijking met bevroren gehydrateerde monsters als gevolg van de mogelijke verandering van de cellulaire membranen en de morfologie van sommige subcellulaire structuren32. Ook, voor soortvorming studies, de waterwinning kan leiden tot metalen soortvorming artefacten. Toch is het succesvol geweest en het beste alternatief voor diepgevroren gehydrateerde monsters voor elementaire beeldvorming op sub-100 nm niveaus2,16,17,18,20,33,34,35,36.

Zoals gemeld37, de kwaliteit van cryopreserved cellulaire preparaten kan worden geëvalueerd door middel van de kalium-naar-natrium K/na ratio. Helaas, het kan nog niet worden bepaald met de harde X-Ray nanoprobe hier gebruikt, als gevolg van de lage energie-cut-off van de silicium drift detector gebruikt voor het detecteren van de röntgenfluorescentie fotonen van de elementen (E ≥ 1,3 keV magnesium). Inderdaad, een hoge K/na ratio (> 10) die kan worden gemeten met behulp van tof-Sims, EPMA, of Nuclear microprobe PIXE16,37 is een indicatie van de bewaarde chemische integriteit van de cel in vergelijking met de verwachte k/na van 25 in een levende cel37. Dit kan worden ondersteund door een gelijktijdige lage cl/K ratio38. Toch kan onvolmaakte verglaking, vooral als de snelheid van monster koeling te laag is, leiden tot de vorming van grote ijskristallen die celmembranen en organellen kunnen beschadigen, waardoor de verdeling van chemische elementen verandert. Hoewel er geen routineprocedure is om deze potentiële schade en impact op de intracellulaire verdeling te bewaken, kunnen de bovenstaande elementen verhoudingen en de mogelijkheid om de cel met een hoge resolutie te beeld met behulp van X-Ray fase contrast of Cryo-Soft X-Ray microscopie de beste benaderingen zijn om goed behoud van intracellulaire compartimenten te ondersteunen met gelijktijdig behoud van de elementaire integriteit. De combinatie van deze technieken en het gebruik van nieuw ontwikkelde cryocorrelatieve fluorescentie optische microscopen zullen helpen beoordelen in hoeverre deze schade optreedt en beïnvloedt de intracellulaire elementale verdeling.

Over het algemeen wordt een gedetailleerd en uitgebreid protocol voor het voorbereiden van cellulaire monsters voor Synchrotron X-Ray fluorescentie nano-analyse gepresenteerd. Het is een goed uitgangspunt voor de onderzoeksgemeenschap en helpt bij het oplossen van het lastige probleem van het voorbereiden van de juiste cellulaire samples voor 2D en 3D Elemental Imaging op (Cryo) harde X-Ray nanoprobes. Deze benaderingen kunnen worden samengevoegd met optische fluorescentie en elektronenmicroscopie mogelijkheden voor diepgaande correlatieve chemische en structurele beeldvorming van cellen.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Acknowledgments

De experimenten op de nano-Imaging beamline ID16A werden uitgevoerd in het kader van ESRF-voorstellen LS2430, LS2303 en LS2765.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O SIGMA 09691-250mL One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.
B27 supplement, 50x Life Technologies, Invitrogen 17504-044 for hippocampal neuron culture
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2) GIBCO 14190-094 cell culture
DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification) GIBCO 21885025 cell culture
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Life Technologies, Invitrogen 31966-02 for hippocampal neuron culture
Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology World Precision Instrument 501202
Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer Quorum Technology EK3147
Ethane N45 Air Liquid p0505s05r0a001 C2H6 > 99,995 %
Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin GIBCO A31604-02 cell culture
HBSS 10x Life Technologies, Invitrogen 14185-052 for hippocampal neuron culture
Leica GP quick-release forceps Leica 16706435
MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell ATCC ATCC HTB-26 cell culture
Neurobasal medium Life Technologies, Invitrogen 21103-049 for hippocampal neuron culture
Nunc 4-Well Plate Thermo Fisher 176740 cell culture
Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer Advanced Instruments Osmo1 Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO® Vapor Pressure Osmometer)
Penicillin-Streptomycin SIGMA P4333 cell culture
poly-L-lysine SIGMA P4707 Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).
Plunge freezing robot Leica EM GP main unit Leica 16706401 Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.
Silicon nitride membrane (Si3N4) Silson Ltd. SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...
Trypan blue solution 0.4% GIBCO 15250061 cell culture
Trypsin-EDTA, 0.05% GIBCO 25300-054 cell culture
Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water Fisher Chemicals W9-1 MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.
Whatman No. 1 filter paper with precut hole Leica 16706440 Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewis, D. J., et al. Intracellular synchrotron nanoimaging and DNA damage/genotoxicity screening of novel lanthanide-coated nanovectors. Nanomedicine. 5 (10), 1547-1557 (2010).
  2. Fus, F., et al. The intracellular localization of osmocenyl-tamoxifen derivatives in hormone-independent breast cancer cells revealed by 2D and 3D nano X-ray fluorescence imaging. Angwendte Chemie. , (2019).
  3. Janssens, K., Adams, F., Rindby, A. Microscopic X-Ray Fluorescence Analysis. , Wiley. Chichester, UK. (2000).
  4. Carmona, A., et al. Uranium exposure of human dopaminergic cells results in low cytotoxicity, accumulation within sub-cytoplasmic regions, and down regulation of MAO-B. Neurotoxicology. 68, 177-188 (2018).
  5. Leapman, R. D., Hunt, J. A., Buchanan, R. A., Andrews, S. B. Measurement of low calcium concentrations in cryosectioned cells by parallel-EELS mapping. Ultramicroscopy. 49 (1-4), 225-234 (1993).
  6. Saubermann, A. J., Echlin, P., Peters, P. D., Beeuwkes, R. Application of scanning electron microscopy to X-ray analysis of frozen hydrated sections. I. Specimen handling techniques. Journal of Cell Biology. 88 (2), 257-267 (1981).
  7. Saubermann, A. J., Heyman, R. V. Quantitative digital X-ray imaging using frozen hydrated and frozen dried tissue sections. Journal of Microscopy. 146, Pt2 169-182 (1987).
  8. Wroblewski, J., Roomans, G. M. X-ray microanalysis of single and cultured cells. Scanning Electron Microscopy. , Pt 4 1875-1882 (1984).
  9. Wroblewski, J., Müller, R. M., Wroblewski, R., Roomans, G. M. Quantitative X-ray microanalysis of semi-thick cryosections. Histochemistry. 77 (4), 447-463 (1983).
  10. Zierold, K. Cryopreparation of mammalian tissue for X-ray microanalysis in STEM. Journal of Microscopy. 125, Pt2 149-156 (1982).
  11. Harkiolaki, M., et al. Cryo-soft X-ray tomography: Using soft X-rays to explore the ultrastructure of whole cells. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 81-92 (2018).
  12. McDermott, G., Le Gros, M. A., Knoechel, C. G., Uchida, M., Larabell, C. A. Soft X-ray tomography and cryogenic light microscopy: the cool combination in cellular imaging. Trends in Cell Biology. 19 (11), 587-595 (2009).
  13. Schneider, G., et al. Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy. Nature Methods. 7 (12), 985-987 (2010).
  14. Sorrentino, A., et al. MISTRAL: a transmission soft X-ray microscopy beamline for cryo nano-tomography of biological samples and magnetic domains imaging. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (4), 1112-1117 (2015).
  15. Carzaniga, R., Domart, M. C., Duke, E., Collinson, L. M. Correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray tomography of adherent cells at European synchrotrons. Methods in Cell Biology. 124, Academic Press. 151-175 (2014).
  16. Perrin, L., Carmona, A., Roudeau, S., Ortega, R. Evaluation of sample preparation methods for single cell quantitative elemental imaging using proton or synchrotron radiation focused beams. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30 (12), 2525-2532 (2015).
  17. Jin, Q., et al. Preserving elemental content in adherent mammalian cells for analysis by synchrotron-based x-ray fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 265 (1), 81-93 (2017).
  18. Daoust, A., et al. Impact of manganese on primary hippocampal neurons from rodents. Hippocampus. 24 (5), 598-610 (2014).
  19. Daoust, A., et al. Manganese Cytotoxicity Assay on Hippocampal Neuronal Cell Culture. Bio-protocol. 5 (1), 1368 (2015).
  20. Gibon, J., et al. The over-expression of TRPC6 channels in HEK-293 cells favours the intracellular accumulation of zinc. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1808 (12), 2807-2818 (2011).
  21. Hasna, J., Bohic, S., Lemoine, S., Blugeon, C., Bouron, A. Zinc Uptake and Storage During the Formation of the Cerebral Cortex in Mice. Molecular Neurobiology. , 1-13 (2019).
  22. Villar, F., et al. Nanopositioning for the ESRF ID16A Nano-Imaging Beamline. Synchrotron Radiation News. 31 (5), 9-14 (2018).
  23. Kosior, E., et al. Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for subcellular metal quantification. Journal of Structural Biology. 177 (2), 239-247 (2012).
  24. Bohic, S., et al. Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells. Applied Physics Letters. 78, 3544-3546 (2001).
  25. Dubochet, J. On the Development of Electron Cryo-Microscopy (Nobel Lecture). Angwendte Chemie. 57 (34), 10842-10846 (2018).
  26. Da Silva, J. C., et al. Efficient concentration of high-energy X-rays for diffraction-limited imaging resolution. Optica. 4 (5), 492-495 (2017).
  27. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high-pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
  28. Moor, H. Theory and pratice of high pressure freezing. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer. 175-191 (1987).
  29. Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Journal of Electron Microscopy Techniques. 3 (2), 177-210 (1986).
  30. Ferreira, J. L., Matthews-Palmer, T. R., Beeby, M. Electron Cryo-Tomography. Cellular Imaging. , Springer, Cham. 61-94 (2018).
  31. Colvin, R. A., Jin, Q., Lai, B., Kiedrowski, L. Visualizing metal content and intracellular distribution in primary hippocampal neurons with synchrotron X-ray fluorescence. PLoS One. 11 (7), 0159582 (2016).
  32. Vavpetič, P., et al. Elemental distribution and sample integrity comparison of freeze-dried and frozen-hydrated biological tissue samples with nuclear microprobe. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 348, 147-151 (2015).
  33. Guerquin-Kern, J. L., Bordat, C. Cryo-preparation procedures for elemental imaging by sims and eftem. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. , CRC Press. 499-536 (2008).
  34. Gramaccioni, C., et al. Nanoscale quantification of intracellular element concentration by X-ray fluorescence microscopy combined with X-ray phase contrast nanotomography. Applied Physics Letters. 112 (5), 053701 (2018).
  35. Perrin, L., et al. Zinc and Copper Effects on Stability of Tubulin and Actin Networks in Dendrites and Spines of Hippocampal Neurons. ACS Chemical Neurosciences. 8 (7), 1490-1499 (2017).
  36. Ortega, R., et al. α-synuclein over-expression induces increased iron accumulation and redistribution in iron-exposed neurons. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1925-1934 (2016).
  37. Fartmann, M., et al. Quantitative imaging of atomic and molecular species in cancer cultures with TOF-SIMS and Laser-SNMS. Applied Surface Sciences. 231 (2), 428-431 (2004).
  38. Pålsgård, E., Lindh, U., Roomans, G. M. Comparative study of freeze-substitution techniques for X-ray microanalysis of biological tissue. Microscopy Research and Techniques. 28 (3), 254-258 (1994).

Tags

Biochemie uitgave 154 kankercellen sporenelement synchrotronstraling X-Ray fluorescentiemicroscopie Cryofixatie vriesdrogen nanoprobe
Celkweek op siliciumnitride membranen en Cryopreparation voor Synchrotron X-Ray fluorescentie nano-analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bissardon, C., Reymond, S.,… More

Bissardon, C., Reymond, S., Salomé, M., André, L., Bayat, S., Cloetens, P., Bohic, S. Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis. J. Vis. Exp. (154), e60461, doi:10.3791/60461 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter