Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Cell kultur på Silicon nitride membraner og Cryopreparation for Synchrotron X-ray fluorescens nano-analyse

Published: December 10, 2019 doi: 10.3791/60461
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 2, 1,2
1Inserm, UA7, Synchrotron Radiation for Biomedicine (STROBE), Université Grenoble Alpes, 2ID16A Beamline, ESRF, The European Synchrotron

Summary

Presentert her er en protokoll for cellekultur på silisium nitride membraner og stupe-frysing før X-ray fluorescens Imaging med en Synchrotron kryogene X-ray hippocampusen. Når bare romtemperatur nano-analysen er gitt, kan de frosne prøvene bli ytterligere fryse-tørket. Dette er avgjørende skritt for å få informasjon om intracellulære Elemental sammensetning.

Abstract

Svært lite er kjent om fordelingen av metall ioner på subcellulære nivå. Men de kjemiske elementene har viktige regulatoriske funksjoner og deres forstyrret homeostase er involvert i ulike sykdommer. State-of-the-art Synchrotron X-ray fluorescens hjemme gi den nødvendige følsomhet og romlig oppløsning for å belyse den todimensjonale (2D) og tredimensjonal (3D) distribusjon og konsentrasjon av metaller i hele celler på organelle nivå. Dette åpner nye spennende vitenskapelige felt av etterforskning på rollen av metaller i physiopathology av cellen. Den cellulære forberedelse er en nøkkel og ofte komplisert prosedyre, spesielt for grunnleggende analyse. Selv om X-ray fluorescens teknikker er nå utbredt og ulike forberedelser metoder har blitt brukt, svært få studier har undersøkt bevaring av Elemental innhold av celler i beste fall, og ingen trinnvis detaljert protokoll for cryopreparation av tilhenger celler for X-ray fluorescens hjemme har blitt sluppet så langt. Dette er en beskrivelse av en protokoll som gir trinnvis cellulær forberedelse for rask cryofixation å muliggjøre Synchrotron X-ray fluorescens nano-analyse av celler i en frossen hydrert tilstand når et kryogene miljø og overføring er tilgjengelig. I tilfelle nano-analyse må utføres ved romtemperatur, en ekstra prosedyre for fryse-tørking cryofixed tilhenger Cellular forberedelse er gitt. De foreslåtte protokollene har blitt brukt i tidligere arbeider, senest i å studere 2D og 3D intracellulære distribusjon av en organometalliske sammensatte i brystkreftceller.

Introduction

Nydesignede Synchrotron X-ray fluorescens (SR-XRF) hjemme tillate visualisering av subcellulære fordeling av elementer i en fullstendig kvantitativ måte. Som et eksempel, denne analytiske evnen tillater gransking av opptaket av nanopartikler1 eller organometalliske molekyler som Osmium-baserte komplekser2, gir innsikt i intracellulære opptak av metall-baserte molekyler med potente anticancer egenskaper. Som en multielement teknikk, SR-XRF3 med en hippocampusen gir en måte å samtidig kvantifisere og lokalisere intracellulært mest biologisk viktige elementer, inkludert fosfor, svovel, kalium, kalsium, jern, kobber og sink. Faktisk gir bruk av harde røntgenstråler stor penetrasjon dybde til bildet hele frosne-hydrert celler i en etikett-fri mote. Videre gir tilgang til K-kanten av de fleste elementer av interesse, er X-ray fluorescens spent mest effektivt. Bruken av kryogene tilnærminger tillater reduksjon av strålings skade og optimalisering av bevaring av cellestrukturen og Elemental fordeling.

De fleste tilgjengelige romlig løst analytiske teknikker for å studere metaller i cellene er overflate teknikker som krever svært tynne og flate deler av celler som skal produseres. Dette omfatter hovedsakelig skanning overføring elektron mikroskopi med energi-dispersive X-ray analyse (STEM-EDX), energi-filtrert overføring elektron mikroskopi (EF-TEM), og nanoskala sekundære ion Mass massespektrometri (nanoSIMS). Sistnevnte kan ikke utføres på frosne, hydrert celle seksjoner mens fryse-analyse kan gjøres med elektron mikroskopi med uovertruffen romlig oppløsning, men dårlig Elemental følsomhet. Partikkel-indusert X-ray-utslipp (PIXE) har tillatt studiet av elementær distribusjoner i hele celler. Det har fordelen av å være fullt kvantitative med en rettferdig Elemental følsomhet på mikron skala og selv på submikron oppløsning4, men lider av stråling skader og mangel på kryogene evner å studere frossen-hydrert celler. Alle disse analytiske teknikker utfyller hverandre i elementær bildebehandling av celler, men for alle teknikker prøven forberedelse prosedyren er et avgjørende skritt. Det bør holdes enkelt å begrense mulig forurensning, samt Elemental omfordeling og/eller lekkasje for å oppnå meningsfulle resultater. Som demonstrert i elektron mikroskopi, en kryogene arbeidsflyt, inkludert immobilisering av cellen og cryotransfer til et cryoscanning Stadium, tillater en optimal element bevaring på subcellulære nivåer så nær som mulig til den innfødte staten5,6,7,8,9,10. Denne forståelsen har blitt implementert i utviklingen av Synchrotron fryse-Soft røntgen mikroskopi (f.eks. full felt mikroskop og skanning mikroskop) for å produsere ultrastructural avbildning av hele frosne-hydrert celler i 2D eller 3D. Ulike kryogene arbeidsflyter ble utviklet11 for Soft X-ray mikroskop på Beamline 2,1 (XM-2) av Advanced Light kilde ved Lawrence Berkeley National Laboratory12, Beamline U41-XM ved ELEKTRON lagring ringen BESSY II (Tyskland)13, Beamline MISTRAL av Alba lyskilde (Spania)14, og på Beamline B24 av Diamond lyskilde15, blant andre. En lignende arbeidsflyt ble nylig vist å være den mest pålitelige Forberedelses-og bevarings metoden for intracellulære elementær analyse ved hjelp av røntgen microprobes16,17.

Selv om X-ray hippocampusen teknikker begynner å bli mye brukt for mobilnettet elementær analyse, særlig med bruk av kryogene SR-XRF evner, ingen trinnvis protokollen har blitt formidlet så langt til forskningsmiljøet. Her er en detaljert prosedyre gitt for å forberede cryofixed tilhenger celler kultivert som monolagere på silisium nitride membraner som skal analyseres under kryogene forhold. En fryse-tørking trinn som skal påføres etter at protokollen i tilfelle X-ray analyse må utføres ved romtemperatur er også gitt. Mens den foreslåtte protokollen har blitt brukt med menneskelige brystkreftceller MD-MB-2312 og fryse-tørking ble demonstrert blant annet på mus neurons18,20,21, det kan lett utvides til ulike typer av menneske-eller dyreceller.

Protocol

Eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av dyr omsorg komiteen av CEA ' s Life Sciences Division (CETEA, A14-006). De ble gjennomført i samsvar med den franske lovgivningen og det europeiske fellesskaps rådsdirektiv 24. november 1986 (86/609/EØF).

1. silisium nitride (si3N4) membran støtte forberedelse

Merk: fordi membranen er skjør og delikat, sin støtte (200 μm tykk silisium ramme) må håndteres forsiktig, ideelt med en tynn karbon pinsett eller Dumont pinsett #5, Straight selv-lukking fine tips. Denne protokollen brukes silisium nitride membraner med en ramme på 5 mm x 5 mm og en membran størrelse på 1,5 mm x 1,5 mm. Membranen bør utarbeides omtrent 12 h før eksperimentet (dvs. celle seeding). Membraner kan tilberedes på slutten av dagen og venstre tørking over natten under en klasse II laminær Flow hette slik at de er klare til bruk neste morgen. En silisium ramme tykkelse på 200 μm er standard for de fleste selskaper som selger silisium nitride Vinduer. Hvis produktet som brukes i denne protokollen ikke er tilgjengelig, kan en membran størrelse i området 0,5 − 1,5 mm brukes med en standard rammestørrelse på 5 mm x 5 mm. Den større membran størrelsen foretrekkes når røntgen tomografi vil bli brukt. TEM Grid type silisium nitride Vinduer med en membran størrelse på 0,5 mm og en tykkelse på 50 NM kan også brukes.

  1. Åpne kapselen som inneholder støtte for si3N4 membran (figur 1). Klem forsiktig på kapselen for å løsne støtten lett.
  2. Hold et av hjørnene av silisium ramme ved hjelp av tynne pinsett. Vær forsiktig så du ikke berører si3N4 membran i midten. Den 200 eller 500 NM tykk membran kan lett skades.
  3. Bruke den tynne pinsett, forsiktig plassere si3N4 membran støtte i en steril glass Petri parabol, flate overflaten av Silicon nitride vinduet vendt opp (dvs. hulrommet mot bunnen av fatet).
  4. Fjern lokket på Petri-fatet og la membranen være under UV-lys i 25 − 30 minutter under laminær strømnings kabinett.
    Merk: UVC-lampen (254 NM) er vanligvis innstilt på 200 μW/cm2.
  5. Sett 10 μL av Poly-L-lysin på membranen. Drop skal dekke si3N4 membran godt og kan spre litt over silisium ramme. La det være ved 37 ° c i 25 min i standard vev kultur inkubator ved 100% relativ luftfuktighet og 95% luft, 5% CO2.
    Merk: i dette tilfellet en Poly-L-lysin belegg ble brukt for MDA-MB-231 brystkreftceller. Avhengig av hvilken type cellelinje, kan ulike belegg brukes, og dette trinnet bør optimaliseres tilsvarende.
  6. I en steril 48 brønn plate fyller du forskjellige brønner med 200 − 250 μL ultra-ren og ultra-Trace vann filtrert gjennom et sterilt 0,22 μm-filter. Vanligvis kan hver brønn brukes til å skylle opp til 2 − 3 membraner. Ved hjelp av fin pinsett, plukke opp membranen støtte på et hjørne av sin silisium ramme. Skyll membranen forsiktig ved å submerging den vertikalt 10 s i tre påfølgende brønner.
    Merk: membranen støtter tas ut av inkubator og kan behandles ved romtemperatur, med temperatur og fuktighet definert av en klasse II laminær Flow hette.
  7. Sett membranen støtte vertikalt i en tom brønn av en steril 96 brønn plate, dekke det, og la det tørke over natten under en klasse II laminær Flow hette.

2. celle seeding

  1. I en steril 4 brønn plate, plassere membraner med sin flate side vendt opp.
  2. MDA-MB-231 celler opprettholdes i en monolag kultur i DMEM med fenol rød/Glutamax jeg, supplert med 10% fosterets kalv serum og 1% penicillin og Streptomycin ved 37 ° c i en 5% CO2 Air fuktet inkubator.
  3. Når cellene nå 60-70% confluency fjerne Media fra parabolen eller kolbe.
  4. Vask 1x med 10 ml Dulbecco ' s fosfat bufret saltvann uten ca2 + eller mg2 +.
  5. Tilsett 3 mL/T75 kolbe på 0,05% Trypsin/EDTA løsning og sikre at hele monolag er dekket med den Trypsin løsningen.
  6. Ruge for 3 − 5 min ved 37 ° c til cellene begynner å løsne. Forsiktighet bør utvises for å ikke trypsinize cellene og ikke tvinge cellene til å løsne for tidlig.
  7. Tilsett 8 ml DMEM supplert med 10% fosterets kalv serum og 1% penicillin og Streptomycin eller komplett Media og samle cellene ved pipettering. Serum i Media vil nøytralisere Trypsin.
  8. Spinn ned ved 250 x g i 3 min ved romtemperatur. Aspirer supernatanten.
  9. Tilsett 8 ml friskt komplett materiale til 15 ml rør som inneholder celle pellet, og Pipet cellene opp og ned til cellene er spredt i en enkelt celle suspensjon.
  10. Tell cellene ved hjelp av en hemocytometer og fortynne til en konsentrasjon på 5 x 106 celler per ml i komplett Media (DMEM med fenol rød/1% av en 200 mm L-alanyl-L-glutamin dipeptidet i 0,85% NaCl løsning supplert med 10% fosterets kalv serum og 1% penicillin og Streptomycin).
  11. Take 10 μL av MDA-MB-231 celle fjæring og sette den på membranen. Dette tilsvarer 50 000 celler/10 μL for MDA-MB-231. Drop skal dekke si3N4 membran godt og kan spre litt på silisium ramme. Forsiktighet bør utvises for ikke å berøre si3N4 membran med tuppen av micropipette.
    Merk: avhengig av type cellelinje og eksperimenter eller målinger, celle tetthet kan variere og bør testes tilsvarende. Her ble den foreslåtte celle tettheten for seeding si3N4 membran funnet optimal for EKSPERIMENTELLE forhold og videre SR-XRF nano-analyse av MDA-MB-231 celler2.
  12. For hippocampus neurons (HN), fjerne hippocampus hjernevev fra embryonale dagen 18,5 mus og fordøye det i 0,25% Trypsin i Hepes-HBSS (5,3 mm KCl, 0,44 mm KH2PO4, 137,9 mm NaCl, 0,34 mm NaH2PO4, 5,56 mm glukose) ved 37 ° c for 15 min18,19.
  13. Bruk en P1000-pipette med en P1000-spiss og en P200-spiss, Utfør den mekaniske dissosiasjon ved å tegne og frigjøre membran innholdet med pipette flere ganger. I løpet av dette trinnet, være forsiktig med å lage luftbobler i mediet, fordi luftbobler er giftig for neurons.
  14. Vent noen minutter til aggregatet går ned i bunnen av røret.
  15. Overfør supernatanten som inneholder de spredte cellene, til et sterilt Eppendorf-rør. La ~ 25 μL av kultur medium inneholder aggregat.
  16. Tell de dissosiert cellene ved hjelp av en hemocytometer. Isolerte HN neurons er belagt med en konsentrasjon på 7 x 104 celler cm-2 på Poly-l-lysin (1 mg/ml Poly-l-lysin)-belagt silisium nitride membran.
  17. Bare for membraner med HN, ruge neurons i første DMEM supplert med 10% fosterets storfe serum. En h etter plating HN i DMEM, mediet er endret til neurobasal plating Media (200 mm L-alanyl-L-glutamin dipeptidet i 0,85% NaCl løsning, og B27 supplement d = 1/50 fortynnet i neurobasal)18,19.
  18. For MDA-MB-231 celler, sette membranen støtter ved 37 ° c i inkubator (100% relativ fuktighet, 95% luft og 5% CO2) i 25 min. Dette gjør at cellene til å bosette og begynne å feste til underlaget. Dette kan tilpasses avhengig av cellelinjen som brukes.
  19. Tilsett 1 mL av det nødvendige komplette kultur mediet (DMEM med fenol rød/1% av en 200 mM L-alanyl-L-glutamin dipeptidet i 0,85% NaCl løsning supplert med 10% fosterets kalv serum og 1% penicillin og Streptomycin) i hver brønn av MDA-MB-231 celler ved å sette pipette spissen mot veggen av plasten godt og slippe mediet svært langsomt mens den dekker membranen.
  20. Sett membranen vertikalt mot veggen av de 4 brønn platen for å ta bort eventuelle luftbobler fanget i brønnen hulrom i si3N4 membran (figur 2). For å gjøre dette, bruk fin pinsett og skyv bort boblen veldig forsiktig, beveger seg parallelt med si3N4 backside Frame å unngå å berøre og skade membranen.
  21. Sett membranen tilbake horisontalt på bunnen av brønnen og la de 4 brønn plate i inkubator for den nødvendige tid avhengig av vekstraten av cellelinjen brukes. Den MDA-MB-231 celler ble inkubert over natten.

3. behandling eller medium endring

  1. Fjern mediet fra de 4 brønn plate.
  2. Skyll en gang med 1 mL PBS-oppløsning ved 37 ° c. Kast PBS og tilsett 1 mL varmet komplett friskt medium i nærvær eller i fravær (kontroller) av ønsket behandling ved hjelp av en 1 mL pipette spissen, slippe væsken svært langsomt mot veggen av brønnen plate. Si3N4 membranen bør være langsomt neddykket uten forstyrrelser for å unngå membran bevegelse eller løfting.

4. immobilisering av mobilnettet forberedelse av stupe-frysing

Merk: på slutten av den nødvendige inkubasjonstid, i nærvær eller fravær av behandling, cellene må skylles nøye og cryofixed. Rundt 30 min før du begynner å skylle og blot den cellulære preparatet før stupe-frysing, første oppsett og kjøle ned automatisk stupe fryser maskin. Som du manipulere cryogens, bruk av egnede kryogene hansker, vernebriller, lukkede sko, og en Laboratoriefrakk er nødvendig. Flytende nitrogen må transporteres i passende Dewars, og arbeidsplassen bør være tilstrekkelig ventilert med tilstedeværelsen av en oksygen Monitor. Ideelt sett bidrar et lavt hygrometry nivå på 20 − 30% til å begrense is forurensning av materialene, Dewars og cryogens, som er skadelig for vitrifikasjon av prøvene (dvs. et amorfe islag). Ideelt sett, avhengig av erfarings nivået til forskeren, kan opptil 10 − 12 prøver for en enkelt sesjon tilberedes med samme sekundære cryogen flytende etan-kopp for vitrifikasjon. Mellom øktene, den automatiske stupe fryseren krever en 1 h automatisk bake ut prosedyren. Ideelt sett bør prøvene behandles med identiske inkubasjons forhold. Likevel, kontroller kan behandles først, etterfulgt av prøvene med en bestemt behandling tilstand.

Merk: for lite frysing gjelder følgende trinn både for MDA-MB-231-eller HN-celler.

  1. Definer cryoplunger for rask cryofixation av celler.
    1. Slå på automatisk stupe fryseboks.
    2. Angi parametrene (f. eks temperatur, prosent fuktighet, blotting tid hvis automatisk blotting brukes, og posisjon for å løfte prøven til overflaten av cryogen for å lette overføringen til en kryogene container) direkte fra konsollen og parametere Innstillinger-menyen. I den foreliggende sak ble parametrene til luft fuktighets kammeret satt til 37 ° c og 80% fuktighet.
      Merk: bedre vitrifikasjon resultater ble innhentet for denne protokollen og røntgenbilder med rask og forsiktig manuell blotting. Således, protokollen bruker ikke en automatisk blotting sekvens program.
    3. Fest Fukteren kammeret og for å bevare fuktigheten først fylle den ved hjelp av en sprøyte med 60 mL dobbel destillert vann, og deretter 20 mL som kalles for på automatisk stupe fryser konsollen.
      Merk: unngå bruk av ultrarent vann fordi det kan skade fordamper systemet. Steng ventilen og la slangen være festet på baksiden av Fukteren.
    4. Monter den sorte etan koppen i holderen og dekk den til med plast dekslene.
    5. Fyll Dewar i det kalde kammeret med LN2, og bringe det til nivået av rutenettet innenfor arbeidsområdet.
    6. Plasser en dedikert fryseboks for å lagre membraner etter cryofixation i overførings beholderen som holdes i den dedikerte plasseringen i arbeidsområdet EM-GP og i nærheten av etan-koppholderen.
      Merk: den dedikerte fryseboksen er en in-House utvikling på hippocampusen beamline ID16A av den europeiske Synchrotron strålingen i Grenoble. Tegninger med spesifikasjoner er tilgjengelige på forespørsel (Figur 3). De kan lagres fire om gangen i et 50 mL konisk rør for langtidslagring i en LN2 Dewar. En alternativ mulighet består i å bruke en liten 0,2 mL vanlig PCR tynn vegg tube med kuppel caps for å lagre en enkelt si3N4 membran støtte. Du må bore et ~ 2 mm hull i den øverste delen av vegg røret ved hjelp av en oppvarmet sprøyte nål for å tillate LN2 å fylle røret.
    7. Fyll overførings beholderen med LN2 og dekk den med det dedikerte aluminiums lokket. Fortsett å fylle det kalde kammeret med LN2 (vanligvis ~ 2 L er nødvendig) holder på 100% av ln2 nivå skjermen på konsollen. Vent til den endelige ønskede temperaturen er nådd.
    8. Fjern plast korken og dekk til etan koppen med liquefier som er koblet til etan flasken. Vent til temperaturen på etan koppen equilibrates til det settpunkt. Når den er nådd, begynner du å bruke den sekundære cryogen (dvs. flytende etan).
      Merk: verdien som ble brukt var-180 ° c, litt over etan Smeltepunkt (-182,8 ° c). Du trenger ikke å forkjøle etan-liquefier fordi det kan være en kilde til frost dannelse og forurensning av etan koppen.
    9. Åpne hov EDS ventilen med høy renhet i etan, og åpne forsiktig trykk regulatoren til du får en langsom tåke av etan. Hold denne svært lave flyten til flytende etan bygger seg opp. Fyll koppen til øverste kant. Lukk trykk regulatoren og den viktigste ventilen til etan flasken. Fjern Leica liquefier forsiktig og la den til side på en liten polystyren støtte under avtrekks panseret. Hold arbeidsområdet løst dekket med den sorte polystyren hetten som følger med maskinen for å hindre frost forurensning av arbeidsområdet og etan container.
    10. Like før manuell blotting av prøven, Fjern den sorte polystyren hetten og fra menyen på konsollen trykk "Lower Chamber", som bringer miljøkammeret i kontakt med kryogene arbeidsområdet.
  2. Forbered deg på å blot prøven.
    1. Klargjør tilstrekkelig buffer for å fjerne spor av salter fra kultur mediet. For denne protokollen, ammonium acetate buffer ble brukt for skylling av MDA-MB-231 celler.
      Merk: ammonium acetate buffer er egnet for de fleste celletyper, og det legger ikke til X-ray fluorescens signal (vurderer elementer med Z > 9). Noen bestemte cellelinjer som neuronal celler kan kreve bruk av en dedikert buffer. For primær kortikale neurons kan for eksempel en saltvannsoppløsning bestående av 1,8 volum på 0,5 M na2HPO4 og 1,9 volum på 0,5 m NaH2PO4 brukes15. På den annen side, fosfor eller klor som finnes i bufferen vil bidra til XRF spekteret. Denne begrensningen av falske X-ray utslipp linjer må holdes i bakhodet avhengig av elementer av interesse å bli oppdaget.
    2. Forbered en 150 mM ammonium acetate løsning fra ammonium acetate ultrarent løsning og sjekk for pH (7.0 – 7.3) og OSMOLARITETSSYSTEM (270 – 300 mOsm/kg)
      Merk: ovennevnte OSMOLARITETSSYSTEM tilsvarer Dulbecco ' s fosfat buffer saltvann (D-PBS) uten kalsium og magnesium og kan kontrolleres ved hjelp av en mikro-osmometer.
    3. Fyll inn det nødvendige antall brønner fra en 12 brønn plast plate med ammonium acetate buffer.
    4. Skjær en fjerdedel av filter papir for blotting, enten fra nr. 1 filter papir med et precut hull, eller fra manuelt stemplet filter papir av en 55 mm diameter med et 15 mm sentralt hull.
    5. Ta ut den nødvendige prøven lagret i inkubator ved 37 ° c i siste øyeblikk før skylling og stupe-frysing membranen.
    6. Lås opp pinsett ved hjelp av den sorte klemmen ringen av Quick-Release tang (vanligvis en Dumont klemme ring høy presisjon medisinsk pinsett) og ta tak i si3N4 membran støtte fra kulturen godt.
      Merk: grip midten av silisium ramme, holde spissen av pinsett nær membranen. Flytt den sorte klemme ringen ned til de første stripene for å låse pinsett.
    7. Senk si3N4 membran støtte vertikalt i ammonium acetate buffer løsning holdt på 37 ° c for ~ 5 s.
      Merk: støtten skal være vertikal i bufferen. Merk at bufferløsningen i hver brønn av platen kan brukes til opptil tre membraner for de samme inkubasjons forholdene.
    8. Blot manuelt med filter papir for å drenere ut overflødig buffer fra membranen skylle løsning (Figur 4) for å forlate en tynn og homogen lag av ammonium acetate vandig løsning som dekker cellene.
      Merk: for å gjøre dette trykker du først på baksiden av vinduet på filter papiret for å fjerne nesten alle de vandige buffer som gjenstår i brønnen og baksiden av membranen. Sekund, blot forsiden, fra begge sider av pinsett, deretter hver side av rammen (Figur 4). Rør aldri membranen. Overflødig buffer drenert kan overvåkes med herlighetens som er dannet på filter papiret.
    9. Åpne miljøkammeret døren og raskt montere pinsett, skyve den inn i pinsett sperre, og lukke døren (figur 5).
    10. Trykk på "blot/A Plunge". Pinsett som holder si3N4 membranen vil raskt bli kastet inn i cryogen.
    11. Fjern lokket på overførings beholderen med forkjøles tang.
    12. Trykk på "Transfer". Si3N4 membranen vil bli litt flyttet opp over cryogen.
    13. I en enkelt rask bevegelse, koble fra pinsett ved å skyve dem ut av pinsett sperre og litt vippe ut av sperren for å bringe direkte inn i en tom plass i fryseboksen i overførings beholderen fylt med LN2. Løsne den sorte klemme ringen for å frigjøre membranen (figur 5).
      Merk: overførings beholderen skal alltid være dekket med LN2. Når det er nødvendig med påfylling, må du dekke etan koppen med plast lokket som følger med maskinen for å unngå å blande LN2 og etan.
    14. Dekk overførings beholderen med et lokk og bruk en liten hvit polystyren kopp fylt med LN2 for å overføre den til en polystyren boks fylt med ln2.
      Merk: fryseboksen eller røret som inneholder membraner, kan deretter oppbevares i 50 mL koniske rør fylt med LN2 og overføres til en langvarig lagring ln2 Dewar. Før du begynner å stupe fryse neste prøve, varme opp alle kalde og frostet pinsett med en hårføner eller en varm plate/cryotools tørketrommel (45 ° c) for å unngå forurensning med iskrystaller.

5. Frys-tørking av stupe-frosne celler kultivert på silisium nitride membraner

Merk: for fryse-tørking, gjelder følgende trinn for både MDA-MB-231 og HN celler. For å kjøle ned fryse tørketrommel, må du vente rundt 40 min til 1 t.

  1. Sett opp fryse tørketrommel
    1. Slå på strømmen med vippebryteren som er plassert på apparatets bakside.
    2. Begynn å angi parametrene etter LCD-menyen: segment 1 = 2 h ved-120 ° c; Segment 2 = 2 h rampe fra-120 ° c til-80 ° c; Segment 3 = 2 h ved-80 ° c; Segment 4 = 2 h rampe fra-80 ° c til 50 ° c; Segment 5 = 2 h ved-50 ° c; Segment 6 = 6 h rampe fra-50 ° c til 30 ° c.
    3. På slutten av parameteroppsettet, lagre innstillingene, Lukk kammer lokket og trykk "StarT".
    4. Enheten vil pumpe ned til 1,10-5 mbar. Når dette trykket er nådd, vil kommandolinjen på skjermen vise "Start Cooling nå, start for å fortsette".
    5. Fyll flytende nitrogen Dewar regelmessig for å kjøle ned scenen under temperaturen trippel punkt innstilling.
      Merk: fase trippel punkt temperaturen er satt til-140 ° c. Før du legger prøven for denne protokollen, er det best å vente omtrent 1 time og et temperatur trinn på-160 ° c.
    6. Displayet vil vise "Trykk ENTER" når klar til å "laste sample".
    7. Kjøl ned til flytende nitrogen temperatur innenfor en LN2 fylt polystyren Dewar, prøven overføre holderen levert av leverandøren, og de to ekstra messing sylindriske si3N4 membran holdere.
    8. Monter si3N4 membran messing holder på toppen av prøven overførings holde ren levert av leverandøren i polystyren Dewar (figur 6A). Hold nivået på LN2 til ca 1 − 2 mm under den øverste kanten av det første messing stykket.
    9. Plukk opp en si3N4 membran prøve støtte fra fryseboksen eller PCR røret ved hjelp av forkjøles selv lukking pinsett i Inox eller Teflon-belagt.
    10. Innskudd membranen med cellene prøven siden vendt opp i messing holderen nummererte hulrom.
    11. Dekk forsamlingen med den andre messing brikken som lokk (figur 6C).
      Merk: vi designet to messingplater hver med en tykkelse på 5 mm, en diameter på 50 mm, og en sentral 11 mm diameter hull. Den første messing platen har 14 bearbeidet rektangulære (8 mm x 6 mm) steder for å imøtekomme støttene (5 mm x 5 mm). Hvert spor har en flat og polert brønn med en dybde på 2 mm. Den andre messing platen er flat for å dekke si3N4 membran messing støtte og fungerer som en kald felle kabinett.
    12. Forkjøle overføring stangen i LN2 fylte polystyren skum boksen og bruke den til å låse i full forsamlingen (figur 6D, E).
    13. Trykk på "ENTER" på frontpanelet på fryse tørketrommelen.
    14. Turbo og roterende pumper vil stoppe og kammeret renset med tørr nitrogen gass å tillate åpning lokket av kammeret.
    15. Umiddelbart overføre prøven overføre forsamlingen med fjær-lastet overførings stangen inn i fryse tørketrommel kammeret og klipp den på kobber LN2 kalde scenen.
      Merk: la hele forsamlingen med overførings stangen inn i kammeret.
    16. Umiddelbart lukke lokket på fryse tørketrommel kammeret og trykk "StarT" for å fortsette med fryse-tørking syklus.
    17. Fyll opp LN2 reservoar av fryse tørketrommel manuelt hver 2 h.
      Merk: et automatisk LN2 -fyllingssystem kan være koblet til dette reservoaret.
    18. På slutten av fryse-tørking syklus, trykk "stoP" for å ventilere kammeret, og fjerne hele forsamlingen å få tilgang til fryse-tørkede prøver.

Representative Results

En typisk optisk video mikroskop visning av frossen hydrert MDA-MB-231 celler som var sub-kultivert på en Poly-L-lysin belagt si3N4 membran støtte er vist i figur 7a. Den optiske visningen av prøven i vakuumkammeret ble innhentet i refleksjon modus ved hjelp av dedikert online video mikroskop av ID16A beamline av ESRF22. Mens elektron eller myk røntgen mikroskopi krever at isen laget embedding cellen å være så tynn som mulig (vanligvis < 0,5 μm), hard røntgen (> 10 keV) har fordelen av en mye høyere gjennomtrenging dybde og lavere dose avsetning. Isen tykkelse kan derfor være større, vanligvis < 10 μm inkludert cellen slik at isen embedding cellen er noen μm i tykkelse. Dette kan anslås gjennom den målte X-ray intensitet i overføring sammenlignet med intensiteten uten prøven, tar hensyn til absorpsjon av 500 NM tykk si3N4 membran. Denne isen tykkelse kan oppnås gjennom manuelle blotting som beskrevet i denne protokollen. I Newton ringene regionen, kan isen tykkelse bli enda tynnere (ikke målt).

Den X-ray fluorescens Elemental kartlegging av den frosne hydrert cellen er vist i figur 7B med representative distribusjoner av fysiologiske elementer som kalium (K), svovel (S) og sink (Zn). Disse kartene representerer elementær areal massen (dvs. elementær projisert masse). Selv om det ikke er gjort i den foreliggende sak, kan slike kart bli normalisert gjennom X-ray forplantning-basert fase kontrast Imaging som gir estimering av prøven projiserte massen23. Som rapportert av mange studier, den svært ekstremt K ion i cellene bevart i nær-native State ble antatt å være homogent fordelt gjennom hele cellen23,24,16. Som vist i 2D X-ray fluorescens Elemental bilder i figur 7B, ble tett bundet element S jevnt fordelt i cellen, på samme måte som K, og representerer et godt anslag over mobilnettet masse profil. Den Zn fordelingen hadde et høyere signal i kjernen enn i stoffer og tydelig skissert kjernen. Det kan bemerkes at små Zn-beriket regioner kan påvises ved romlig oppløsning (50 NM) i den kjernefysiske regionen.

Det eksisterende X-rokke hjemme eller det seg å bli bygget ikke nødvendigvis huse kryogene evnene. I dette tilfellet er det beste alternativet å få X-ray fluorescens bilder av celler ved sub-100 NM romlige oppløsninger er å utføre en fryse-tørking prosedyre beskrevet i denne protokollen etter stuper frysing av cellen. Figur 8a viser en typisk lyse feltet mikroskopi syn på resulterende fryse-tørket primær mus hippocampus neurons direkte kultivert på si3N4 membran. I dette tilfellet, hvis det oppbevares i et rent desiccated kammer, kan prøvene fremstilles 1 − 2 uker på forhånd og observeres med et vanlig oppreist optisk mikroskop for registrering av interesseområder. Det bør utvises forsiktighet for å hindre eksponering for omgivelsesluft fuktighet, da det kan fanges opp av den fryse-tørkede prøven og føre til skade under røntgen nanobeam. Denne prosedyren ble brukt med hell på svært følsomme celler (dvs. neuronal celler) og enda bedre resultater ble innhentet med andre mer robuste typer celler, for eksempel kreftceller. Som for stup frosne celler, X-ray fluorescens bilder av K, S, og Zn på hele fryse-tørket celle displayet ligner på de som er beskrevet ovenfor. De er representative for de grunnleggende distribusjonene som finnes i ulike typer fryse-tørkede celler ved 50 − 100 NM romlig oppløsning. Mens fryse-tørking hele celler er et alternativ til å bevare elementær integritet, er det på bekostning av en perfekt bevaring av cellen morfologi16, spesielt cellemembraner.

Figure 1
Figur 1: typisk eksempel støtte for X-ray-fluorescens nano-analyse. A si3N4 membran støtte i sin beskyttende kapsel. Denne typen substrat kan brukes både for romtemperatur analyse (stupe-fryse Cellular forberedelse etterfulgt av lav temperatur og lav vakuum fryse-tørking prosess) eller for kryogene X-ray fluorescens analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: skjematisk visning av silisium nitride Vinduer etter celle seeding. Cellene er kultivert direkte på Poly-L-lysin belagt flate overflaten av si3N4 membran støtte. Noen ganger luftbobler kan være fanget i baksiden hulrom av si3N4 membran støtte og må fjernes som beskrevet i protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: egenutviklet 3D-trykt fryseboks for langtidsoppbevaring av stupe frosset si3N4 membran støtter i flytende nitrogen Dewar. (A) fryseboks demontert med beholderen og caps (nedre del) og (B) den monterte fryseboksen med låste caps. Caps kan manipuleres med pinsett, åpning eller låsing ved rotasjon. En detaljert plan for 3D-utskrift er tilgjengelig på forespørsel fra ESRF ID16A. Designet har blitt gjort for å imøtekomme silisium nitride TEM-nett. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: blotting av celler kultivert på si3N4. Før stupe-frysing cellen monolag kultivert på en si3N4 membran må skylles i ammonium acetate løsning (a) og forsiktig manuelt blotted ved hjelp av filter papir (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: automatisk stupe-FRYSING EM-GP maskin. (A) automatisk stupe fryseboks. (B) miljøkammer med pinsett låst inn (C) etan-koppen dekket med Leica-liquefier som er koblet til en etan-flaske. (D) det spranget fryse skapet som viser den sorte koppen full av flytende etan og fryseboksen for videre lagring i ln2 av vitrified si3N4 membraner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: sample cryotransfer forsamlingen for fryse-tørking prosedyre. (A) den første messing mottaker for si3N4 membraner er montert på toppen av prøven overførings holde ren levert av fryse tørketrommel leverandøren. (B) og (C) viser at den andre flate messing platen brukes som deksel og fungerer som et kaldt felleskap som skal settes inn i vakuum kabinettet til fryse tørketrommelen. (D) full montering med den fjær fylte overførings stangen. (E) prøve holderen som frakter den vitrified celle blandingen som dyrkes på si3N4 -membranen, må legges ytterligere inn i ln2-avkjølt fryse tørketrommel. Alle trinnene for montering av forsamlingen gjøres i LN2 i en Styrofoam boks. For klarhet, ble alle bildene produsert i fravær av LN2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: fryse-X-ray fluorescens bilder av en frossen hydrert celle ved hjelp av hard X-ray-hippocampusen. (A) typisk online visning i refleksjon modus ved hjelp av dedikert optisk video MIKROSKOP av ESRF ID16A beamline. Etter manuell blotting ble det oppnådd en total is tykkelse på ca 5 − 10 μm som gir klar sikt til de frosne væske cellene. En region med Newton ringer indikasjon på enda mye tynnere isen er merkbar. (B) en representant fryse-X-ray fluorescens cellulære distribusjoner av fysiologiske elementer kalium (K), svovel (S), og sink (Zn). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: X-ray fluorescens bilder av en fryse-tørket neuronal celle ved hjelp av hard X-ray hippocampusen. (A) typisk lyse feltet mikroskopi syn på resulterende fryse-tørket primære kortikale neuronal celler direkte kultivert på si3N4 membran. Scale bar = 200 μm (B) representant romtemperatur X-ray fluorescens bilder av en enkelt fryse-tørket hippocampus Nevron viser distribusjoner av fysiologiske elementer kalium (K), svovel (S), og sink (Zn). Scale bar = 2 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Mikroskopi vant 2017 Nobel prisen i kjemi og som sådan ble utbyggingen gjort av J. Dubochet på vitrifikasjon av biologisk materiale for en høyoppløsnings struktur bestemmelse av biomolekyler i løsning25. Som rapportert av Dubochet i sin Nobel foredrag "å vite hvordan å vitrify en dråpe vann er en ting, forbereder en biologisk prøve for biologisk observasjon er en annen"25. Cryopreparation trinn er nå betraktet som standard teknikk for å dempe stråling dose skade og studere celler nær deres opprinnelige tilstand. Forberedelsene er imidlertid kjedelig. Dette er fordi elektron mikroskopi, på grunn av sin uovertruffen romlig oppløsning, er følsom for alle ultrastructural gjenstand som oppstår under prøven forberedelse. Den Synchrotron cryonanoprobes er nå nærmer lignende vanskeligheter går ned til romlige vedtak så lavt som 13 NM i høy energi X-ray rekkevidde26. Hard X-ray mikroskopi kan analysere hele celler mens elektron mikroskopi lider av de fattige penetrasjon dybden av elektroner slik at bare svært tynne celle skiver som skal overholdes.

Monolagere av celler er tynne nok til at ved å fryse i flytende etan, er de påkrevde kjøle hastighetene for vann vitrifikasjon oppnådd. I teorien, kjøling priser så høyt som 108 K/s er mulig ved hjelp av høytrykks frysing27 som gjør at vitrifikasjon av prøvene for tykk for stuper frysing. En kjøle hastighet på 105 K/s, som kreves for å tillate full vitrifikasjon av prøven ved omgivelsestrykk28, er nådd reproduserbar ved hjelp av automatisk stupe frysing maskin og parametre som presenteres her. Dette gjør det mulig for en forsker å vitrify tynne biologiske prøver (< 10 μm), for eksempel en monolag av cellene12,13,14,15,29,30 ved å fryse i flytende etan.

En viktig utfordring med denne protokollen er å også bevare så mye som mulig den kjemiske integriteten til intracellulære innhold for å gi pålitelige Elemental distribusjoner i cellen i 2D eller 3D. Som publisert andre steder2,16,17,31, i tilfelle av elementær Imaging på subcellulære nivå, bør analysen av frosne hydrert celler vurderes. Ellers kan kombinasjonen av stupe-frysing og fryse-tørking av celler brukes til romtemperatur analyse. For sistnevnte fjernes amorfe isen gjennom prosessen med sublimering, mens de bundne vannmolekylene fjernes gjennom prosessen med desorpsjon. Denne prosessen kan være langt fra ideelt i forhold til frosne hydrert prøver på grunn av mulig endring av cellulære membraner og morfologi av noen subcellulære strukturer32. Også for artsdannelse studier, vann utvinning kan føre til metall artsdannelse gjenstander. Likevel har det vært vellykket og det beste alternativet til frosne hydrert prøver for elementær bildebehandling ved sub-100 NM nivå2,16,17,18,20,33,34,35,36.

Som det har blitt rapportert37, kvaliteten på embryo cellulære preparater kan evalueres gjennom kalium-til-natrium K/na ratio. Beklageligvis, den kan ikke ennå være besluttet med det hard X-rokke hippocampusen anvendt her over, på grunn av det lav energi kutt-av av det Silicon drift merker pleide merker det X-rokke fluorescens fotoner av delene (E ≥ 1,3 keV magnesium). Faktisk, en høy K/na-forhold (> 10) som kan måles ved hjelp av TOF-Sims, EPMA, eller kjernefysiske microprobe PIXE16,37 er en indikasjon på den bevarte kjemiske integriteten til cellen i forhold til den forventede K/na av 25 i en levende celle37. Dette kan støttes av et samtidig lavt CL/K-forhold38. Likevel, ufullkommen vitrifikasjon, spesielt hvis hastigheten på prøven kjøling er for lav, kan føre til dannelse av store iskrystaller som kan skade cellemembraner og organeller, følgelig endre fordelingen av kjemiske elementer. Selv om det ikke er noen rutine prosedyre for å overvåke denne potensielle skaden og innvirkningen på den intracellulære fordelingen, kan de ovennevnte element forholdene og muligheten til å avbilde cellen med høy oppløsning ved hjelp av X-ray fase kontrast eller fryse-Soft røntgen mikroskopi være de beste tilnærmingene for å støtte god bevaring av intracellulære rom med samtidig bevaring av elementær integritet. Kombinasjonen av disse teknikkene og bruken av nyutviklet cryocorrelative fluorescens optiske mikroskop vil bidra til å vurdere i hvilken grad denne skaden oppstår og påvirker intracellulære Elemental fordeling.

Total, en detaljert og allsidig protokollen å forberede Cellular eksemplar for Synchrotron X-rokke fluorescens nano-analyse er forevist. Det er et godt utgangspunkt for forskningen samfunnet, bidrar til å løse den vanskelige spørsmålet om hvordan å forberede passende cellulære prøver for 2D og 3D elementær Imaging på (fryse) hard X-ray hjemme. Disse tilnærmingene kan slås sammen med optiske fluorescens og elektron mikroskopi evner for dyptgående correlative kjemisk og strukturell bildebehandling av celler.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Eksperimentene på nano-Imaging beamline ID16A ble utført i rammen av ESRF forslag LS2430, LS2303, og LS2765.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O SIGMA 09691-250mL One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.
B27 supplement, 50x Life Technologies, Invitrogen 17504-044 for hippocampal neuron culture
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2) GIBCO 14190-094 cell culture
DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification) GIBCO 21885025 cell culture
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Life Technologies, Invitrogen 31966-02 for hippocampal neuron culture
Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology World Precision Instrument 501202
Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer Quorum Technology EK3147
Ethane N45 Air Liquid p0505s05r0a001 C2H6 > 99,995 %
Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin GIBCO A31604-02 cell culture
HBSS 10x Life Technologies, Invitrogen 14185-052 for hippocampal neuron culture
Leica GP quick-release forceps Leica 16706435
MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell ATCC ATCC HTB-26 cell culture
Neurobasal medium Life Technologies, Invitrogen 21103-049 for hippocampal neuron culture
Nunc 4-Well Plate Thermo Fisher 176740 cell culture
Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer Advanced Instruments Osmo1 Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO® Vapor Pressure Osmometer)
Penicillin-Streptomycin SIGMA P4333 cell culture
poly-L-lysine SIGMA P4707 Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).
Plunge freezing robot Leica EM GP main unit Leica 16706401 Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.
Silicon nitride membrane (Si3N4) Silson Ltd. SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...
Trypan blue solution 0.4% GIBCO 15250061 cell culture
Trypsin-EDTA, 0.05% GIBCO 25300-054 cell culture
Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water Fisher Chemicals W9-1 MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.
Whatman No. 1 filter paper with precut hole Leica 16706440 Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewis, D. J., et al. Intracellular synchrotron nanoimaging and DNA damage/genotoxicity screening of novel lanthanide-coated nanovectors. Nanomedicine. 5 (10), 1547-1557 (2010).
  2. Fus, F., et al. The intracellular localization of osmocenyl-tamoxifen derivatives in hormone-independent breast cancer cells revealed by 2D and 3D nano X-ray fluorescence imaging. Angwendte Chemie. , (2019).
  3. Janssens, K., Adams, F., Rindby, A. Microscopic X-Ray Fluorescence Analysis. , Wiley. Chichester, UK. (2000).
  4. Carmona, A., et al. Uranium exposure of human dopaminergic cells results in low cytotoxicity, accumulation within sub-cytoplasmic regions, and down regulation of MAO-B. Neurotoxicology. 68, 177-188 (2018).
  5. Leapman, R. D., Hunt, J. A., Buchanan, R. A., Andrews, S. B. Measurement of low calcium concentrations in cryosectioned cells by parallel-EELS mapping. Ultramicroscopy. 49 (1-4), 225-234 (1993).
  6. Saubermann, A. J., Echlin, P., Peters, P. D., Beeuwkes, R. Application of scanning electron microscopy to X-ray analysis of frozen hydrated sections. I. Specimen handling techniques. Journal of Cell Biology. 88 (2), 257-267 (1981).
  7. Saubermann, A. J., Heyman, R. V. Quantitative digital X-ray imaging using frozen hydrated and frozen dried tissue sections. Journal of Microscopy. 146, Pt2 169-182 (1987).
  8. Wroblewski, J., Roomans, G. M. X-ray microanalysis of single and cultured cells. Scanning Electron Microscopy. , Pt 4 1875-1882 (1984).
  9. Wroblewski, J., Müller, R. M., Wroblewski, R., Roomans, G. M. Quantitative X-ray microanalysis of semi-thick cryosections. Histochemistry. 77 (4), 447-463 (1983).
  10. Zierold, K. Cryopreparation of mammalian tissue for X-ray microanalysis in STEM. Journal of Microscopy. 125, Pt2 149-156 (1982).
  11. Harkiolaki, M., et al. Cryo-soft X-ray tomography: Using soft X-rays to explore the ultrastructure of whole cells. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 81-92 (2018).
  12. McDermott, G., Le Gros, M. A., Knoechel, C. G., Uchida, M., Larabell, C. A. Soft X-ray tomography and cryogenic light microscopy: the cool combination in cellular imaging. Trends in Cell Biology. 19 (11), 587-595 (2009).
  13. Schneider, G., et al. Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy. Nature Methods. 7 (12), 985-987 (2010).
  14. Sorrentino, A., et al. MISTRAL: a transmission soft X-ray microscopy beamline for cryo nano-tomography of biological samples and magnetic domains imaging. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (4), 1112-1117 (2015).
  15. Carzaniga, R., Domart, M. C., Duke, E., Collinson, L. M. Correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray tomography of adherent cells at European synchrotrons. Methods in Cell Biology. 124, Academic Press. 151-175 (2014).
  16. Perrin, L., Carmona, A., Roudeau, S., Ortega, R. Evaluation of sample preparation methods for single cell quantitative elemental imaging using proton or synchrotron radiation focused beams. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30 (12), 2525-2532 (2015).
  17. Jin, Q., et al. Preserving elemental content in adherent mammalian cells for analysis by synchrotron-based x-ray fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 265 (1), 81-93 (2017).
  18. Daoust, A., et al. Impact of manganese on primary hippocampal neurons from rodents. Hippocampus. 24 (5), 598-610 (2014).
  19. Daoust, A., et al. Manganese Cytotoxicity Assay on Hippocampal Neuronal Cell Culture. Bio-protocol. 5 (1), 1368 (2015).
  20. Gibon, J., et al. The over-expression of TRPC6 channels in HEK-293 cells favours the intracellular accumulation of zinc. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1808 (12), 2807-2818 (2011).
  21. Hasna, J., Bohic, S., Lemoine, S., Blugeon, C., Bouron, A. Zinc Uptake and Storage During the Formation of the Cerebral Cortex in Mice. Molecular Neurobiology. , 1-13 (2019).
  22. Villar, F., et al. Nanopositioning for the ESRF ID16A Nano-Imaging Beamline. Synchrotron Radiation News. 31 (5), 9-14 (2018).
  23. Kosior, E., et al. Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for subcellular metal quantification. Journal of Structural Biology. 177 (2), 239-247 (2012).
  24. Bohic, S., et al. Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells. Applied Physics Letters. 78, 3544-3546 (2001).
  25. Dubochet, J. On the Development of Electron Cryo-Microscopy (Nobel Lecture). Angwendte Chemie. 57 (34), 10842-10846 (2018).
  26. Da Silva, J. C., et al. Efficient concentration of high-energy X-rays for diffraction-limited imaging resolution. Optica. 4 (5), 492-495 (2017).
  27. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high-pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
  28. Moor, H. Theory and pratice of high pressure freezing. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer. 175-191 (1987).
  29. Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Journal of Electron Microscopy Techniques. 3 (2), 177-210 (1986).
  30. Ferreira, J. L., Matthews-Palmer, T. R., Beeby, M. Electron Cryo-Tomography. Cellular Imaging. , Springer, Cham. 61-94 (2018).
  31. Colvin, R. A., Jin, Q., Lai, B., Kiedrowski, L. Visualizing metal content and intracellular distribution in primary hippocampal neurons with synchrotron X-ray fluorescence. PLoS One. 11 (7), 0159582 (2016).
  32. Vavpetič, P., et al. Elemental distribution and sample integrity comparison of freeze-dried and frozen-hydrated biological tissue samples with nuclear microprobe. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 348, 147-151 (2015).
  33. Guerquin-Kern, J. L., Bordat, C. Cryo-preparation procedures for elemental imaging by sims and eftem. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. , CRC Press. 499-536 (2008).
  34. Gramaccioni, C., et al. Nanoscale quantification of intracellular element concentration by X-ray fluorescence microscopy combined with X-ray phase contrast nanotomography. Applied Physics Letters. 112 (5), 053701 (2018).
  35. Perrin, L., et al. Zinc and Copper Effects on Stability of Tubulin and Actin Networks in Dendrites and Spines of Hippocampal Neurons. ACS Chemical Neurosciences. 8 (7), 1490-1499 (2017).
  36. Ortega, R., et al. α-synuclein over-expression induces increased iron accumulation and redistribution in iron-exposed neurons. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1925-1934 (2016).
  37. Fartmann, M., et al. Quantitative imaging of atomic and molecular species in cancer cultures with TOF-SIMS and Laser-SNMS. Applied Surface Sciences. 231 (2), 428-431 (2004).
  38. Pålsgård, E., Lindh, U., Roomans, G. M. Comparative study of freeze-substitution techniques for X-ray microanalysis of biological tissue. Microscopy Research and Techniques. 28 (3), 254-258 (1994).

Tags

Biokjemi kreftceller sporstoff Synchrotron stråling røntgen fluorescens mikroskopi cryofixation fryse-tørking hippocampusen
Cell kultur på Silicon nitride membraner og Cryopreparation for Synchrotron X-ray fluorescens nano-analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bissardon, C., Reymond, S.,… More

Bissardon, C., Reymond, S., Salomé, M., André, L., Bayat, S., Cloetens, P., Bohic, S. Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis. J. Vis. Exp. (154), e60461, doi:10.3791/60461 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter