Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Cellekultur på silicium nitrid membraner og Cryopreparation for Synchrotron røntgen fluorescens Nano-analyse

Published: December 10, 2019 doi: 10.3791/60461
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 2, 1,2
1Inserm, UA7, Synchrotron Radiation for Biomedicine (STROBE), Université Grenoble Alpes, 2ID16A Beamline, ESRF, The European Synchrotron

Summary

Præsenteret her er en protokol for cellekultur på silicium nitrid membraner og springet-frysning forud for røntgenstråler fluorescens Imaging med en Synchrotron kryogen X-ray nanoprobe. Når kun rumtemperatur Nano-analyse er forudsat, de frosne prøver kan yderligere frysetørret. Disse er kritiske skridt til at indhente oplysninger om den intracellulære elementært sammensætning.

Abstract

Meget lidt vides om fordelingen af metalioner på subcellulært niveau. Disse kemiske elementer har imidlertid væsentlige reguleringsfunktioner, og deres forstyrrede homøostase er involveret i forskellige sygdomme. State-of-the-art Synchrotron X-ray fluorescens nanopkåber giver den nødvendige følsomhed og rumlig opløsning til at belyse den todimensionelle (2D) og tredimensionale (3D) fordeling og koncentration af metaller inde i hele celler ved organelle niveau. Dette åbner nye spændende videnskabelige områder af undersøgelsen om rollen af metaller i fysiopatologi af cellen. Den cellulære forberedelse er en nøgle og ofte kompleks procedure, især for grundlæggende analyse. Selv om røntgen-fluorescens teknikker nu er udbredte, og der er anvendt forskellige tilberedningsmetoder, har meget få undersøgelser undersøgt bevarelsen af det elementære indhold af celler i bedste fald, og ingen trinvis detaljeret protokol til kryopreparation af overholder celler til røntgen fluorescens nanopkåber er blevet frigivet indtil videre. Dette er en beskrivelse af en protokol, der giver den trinvise cellulære forberedelse til hurtig kryofikse ring for at muliggøre Synchrotron røntgen fluorescens Nano-analyse af celler i en frosset hydreret tilstand, når et kryogen miljø og overførsel er til rådighed. I tilfælde af Nano-analyse skal udføres ved stuetemperatur, en yderligere procedure for fryse-tørring af cryofixed klædning cellulære præparat er tilvejebragt. De foreslåede protokoller er blevet anvendt med succes i tidligere værker, senest i studiet af 2D og 3D intracellulær fordeling af en Organometallisk forbindelse i brystkræft celler.

Introduction

Nydesignet Synchrotron røntgen fluorescens (SR-XRF) nanopkåber tillader visualisering af den subcellulære fordeling af elementer i en fuldt kvantitativ måde. Som et eksempel, denne analytiske kapacitet tillader undersøgelse af optagelsen af nanopartikler1 eller organometalliske molekyler såsom osmium-baserede komplekser2, giver indsigt i den intracellulære optagelse af metal-baserede molekyler med potente anticancer egenskaber. Som en multielement teknik, SR-XRF3 med en nanoprobe giver en måde at samtidig kvantificere og lokalisere intracellulært mest biologisk vigtige elementer, herunder fosfor, svovl, kalium, calcium, jern, kobber, og zink. Faktisk, brugen af hårde røntgenstråler giver stor penetration dybde til billede hele frosne-hydrerede celler i en etiket-fri mode. Desuden, giver adgang til K-kanten af de fleste elementer af interesse, røntgenstråler Fluorescens er spændt mest effektivt. Brugen af kryogene tilgange tillader reduktion af strålingsskader og optimering af bevarelsen af cellestrukturen og elementær distribution.

De fleste tilgængelige rumligt løste analytiske teknikker til at studere metaller i celler er overflade teknikker, der kræver meget tynde og flade sektioner af celler, der skal produceres. Dette omfatter primært scanning transmission elektronmikroskopi med energi-dispersive røntgen analyse (Stem-EDX), energi-filtreret transmission elektronmikroskopi (EF-tem), og nanoskala sekundær ion massespektrometri (nanosims). Sidstnævnte kan ikke udføres på frosne, hydrerede celle sektioner, mens Cryo-analyse kan gøres med elektronmikroskopi med uovertruffen rumlig opløsning, men dårlig elementær følsomhed. Partikel induceret røntgen emission (PIXE) har gjort det muligt at studere elementær distributioner i hele celler. Det har fordelen af at være fuldt kvantitativ med en rimelig elementær følsomhed på micron skalaen og selv ved submikron resolution4, men lider af strålingsskader og mangel på kryogene kapaciteter til at studere frosne-hydrerede celler. Alle disse analytiske teknikker supplerer hinanden i elementær billeddannelse af celler, men for alle teknikker er prøveforberedelsesproceduren et afgørende skridt. Det bør holdes enkelt at begrænse eventuel kontaminering samt elementær omfordeling og/eller lækage for at opnå meningsfulde resultater. Som påvist i elektronmikroskopi, en kryogen arbejdsgang, herunder Cryo-immobilisering af cellen og kryooverførsel til en kryoscanning fase, tillader en optimal elementær bevaring på subcellulære niveauer så tæt som muligt på den indfødte tilstand5,6,7,8,9,10. Denne forståelse er blevet implementeret med succes i udviklingen af Synchrotron Cryo-Soft røntgen mikroskopi (f. eks. fuld felt mikroskoper og scannings mikroskoper) for at producere ultrastrukturel billeddannelse af hele frosne-hydrerede celler i 2D eller 3D. Der blev udviklet forskellige kryogene arbejdsprocesser11 for bløde røntgen mikroskoper på strålinger 2,1 (Xm-2) af den avancerede lyskilde på Lawrence Berkeley National Laboratory12, strålinger U41-XM på elektron lagrings ringen Bessy II (Tyskland)13, strålinger MISTRAL af Alba Light source (Spanien)14, og på strålinger B24 af diamant lyskilden15, blandt andre. En lignende Workflow blev for nylig vist sig at være den mest pålidelige forberedelse og bevaring metode til intracellulære elementært analyse ved hjælp af X-ray microprobes16,17.

Selv om X-ray nanoprobe teknikker er begyndt at blive udbredt til cellulær elementær analyse, især med fremkomsten af Cryogen SR-XRF kapaciteter, ingen trinvis protokol er blevet formidlet indtil videre til forskersamfundet. Her er der en detaljeret procedure for at forberede kryofaste klæbriste celler, der dyrkes som monolag på silicium nitrid membraner til at blive analyseret under kryogene forhold. Et frysetørret trin, der skal anvendes efter protokollen i tilfælde af røntgen analyse skal udføres ved stuetemperatur er også forudsat. Mens den foreslåede protokol er blevet anvendt med succes med humane brystkræft celler MD-MB-2312 og frysetørring blev demonstreret blandt andre på mus neuroner18,20,21, det kan nemt udvides til forskellige typer af humane eller animalske celler.

Protocol

Eksperimentelle procedurer blev godkendt af Animal Care Komitéen for cea's Life Sciences division (CETEA, A14-006). De blev gennemført i overensstemmelse med den franske lovgivning og det Europæiske Fællesskabs rådsdirektiv af 24 november 1986 (86/609/EØF).

1. silicium nitrid (si3N4) membran støtte forberedelse

Bemærk: da membranen er skrøbelig og delikat, skal dens støtte (200 μm tyk silicium ramme) håndteres forsigtigt, ideelt med en tynd Carbon pincet eller Dumont pincet #5, lige selvlukkende fine tips. Denne protokol anvendte silicium nitrid membraner med en ramme på 5 mm x 5 mm og en membran størrelse på 1,5 mm x 1,5 mm. Membranen skal tilberedes ca. 12 timer før forsøget påbegyndes (dvs. celle såning). Membraner kan tilberedes i slutningen af dagen og venstre tørring natten over under en klasse II laminar flow hætte, så de er klar til at bruge den næste morgen. En silicium rammetykkelse på 200 μm er standard for de fleste virksomheder, der sælger silicium nitrid vinduer. Hvis det produkt, der anvendes i denne protokol, ikke er tilgængeligt, kan en membran størrelse i intervallet 0,5 − 1,5 mm anvendes med en standardramme størrelse på 5 mm x 5 mm. Den større membran størrelse foretrækkes, når røntgen tomografi vil blive anvendt. TEM gitter typen silicium nitrid vinduer med en membran størrelse på 0,5 mm og en tykkelse på 50 nm kan også anvendes.

  1. Åbn kapslen, der indeholder si3N4 membran støtte (figur 1). Klem forsigtigt kapslen for let at løsne støtten.
  2. Hold et af hjørnerne af silicium rammen ved hjælp af tynde pincet. Pas på ikke at røre ved si3N4 membranen i midten. 200 eller 500 nm tyk membran kan nemt beskadiges.
  3. Ved hjælp af de tynde pincet, Placer forsigtigt si3N4 membran støtte i en steril glas Petri skål, flad overflade af silicium nitrid vinduet opad (dvs. hulrummet mod bunden af skålen).
  4. Fjern låget på Petri skålen og lad membranerne være under UV-lys i 25 − 30 minutter under laminar flow kabinettet.
    Bemærk: UVC-lampen (254 nm) er typisk indstillet til 200 μW/cm2.
  5. Sæt 10 μL poly-L-lysin på membranen. Faldet skal dække si3N4 membranen godt og kan sprede sig lidt over silicium rammen. Lad det være ved 37 °C i 25 min i standard vævskultur inkubator ved 100% relativ luftfugtighed og 95% luft, 5% CO2.
    Bemærk: i dette tilfælde en poly-L-lysin belægning blev brugt til MDA-MB-231 brystkræft celler. Afhængigt af typen af cellelinje, forskellige belægninger kan anvendes, og dette trin skal optimeres i overensstemmelse hermed.
  6. I en steril 48 brønd plade fyldes forskellige brønde med 200 − 250 μL ultra-ren og ultra-Trace vand filtreret gennem et 0,22 μm sterilt filter. Typisk kan hver brønd bruges til at skylle op til 2 − 3 membraner. Ved hjælp af fine pincetter, pick-up membran støtte på et hjørne af sin silicium ramme. Skyl membranen forsigtigt ved at nedsænke den lodret 10 s i tre på hinanden følgende brønde.
    Bemærk: membran understøtninger tages ud af inkubator og kan forarbejdes ved stuetemperatur, hvor temperaturen og fugtigheden er defineret af en klasse II laminar flow hætte.
  7. Sæt membranen støtte lodret i en tom brønd af en steril 96 brønd plade, dække det, og lad det tørre natten over under en klasse II laminar flow hætte.

2. celle såning

  1. I en steril 4 brønd plade, Placer membranerne med deres flade side opad.
  2. MDA-MB-231 celler vedligeholdes i en enkeltlags kultur i DMEM med phenol rød/glutamax i, suppleret med 10% føtal kalveserum og 1% penicillin og streptomycin ved 37 °c i en 5% Co2 luft befuret inkubator.
  3. Når cellerne når 60 − 70% konfluency, fjernes mediet fra skålen eller kolben.
  4. Vask 1x med 10 ml Dulbecco's fosfat bufferet saltvand uden ca2 + eller mg2 +.
  5. Tilsæt 3 ml/T75 kolbe 0,05% trypsin/EDTA opløsning og sørg for, at hele enkeltlags er dækket med trypsin-opløsningen.
  6. Inkuber i 3 − 5 minutter ved 37 °C, indtil cellerne begynder at løsne sig. Der skal udvises forsigtighed for ikke at over-trypsinisere cellerne og ikke tvinge cellerne til at løsne sig for tidligt.
  7. Tilsæt 8 ml DMEM suppleret med 10% føtal kalveserum og 1% penicillin og streptomycin eller komplette medier og Indsaml cellerne ved pipettering. Serum i medierne vil neutralisere trypsin.
  8. Spin ned ved 250 x g i 3 minutter ved stuetemperatur. Aspirere supernatanten.
  9. Der tilsættes 8 ml friske komplette medier til 15 ml-røret, som indeholder celle pellet, og pipet cellerne op og ned, indtil cellerne er dispergeret i en enkelt cellesuspension.
  10. Tæl cellerne ved hjælp af et hemocytometer og fortyndes til en koncentration på 5 x 106 celler pr. ml i komplette medier (DMEM med phenol rød/1% af en 200 mm L-alanyl-l-glutamin dipeptid i 0,85% NaCl opløsning suppleret med 10% føtal kalveserum og 1% penicillin og streptomycin).
  11. Tag 10 μL af MDA-MB-231-cellesuspensionen, og Indbetal den på membranen. Dette svarer til 50.000 celler/10 μL for MDA-MB-231. Faldet skal dække si3N4 membranen godt og kan sprede en lille smule på silicium rammen. Der skal udvises forsigtighed for ikke at røre ved si3N4 membranen med spidsen af mikropipetten.
    Bemærk: afhængigt af typen af cellelinje og eksperimenter eller målinger kan celletætheden variere og skal testes i overensstemmelse hermed. Her, den foreslåede celletæthed for såning si3N4 membran blev fundet optimal for de EKSPERIMENTELLE betingelser og yderligere SR-XRF Nano-analyse af mda-MB-231 celler2.
  12. For hippocampus neuroner (HN), fjerne hippocampus hjernevæv fra embryonale dag 18,5 mus og fordøje det i 0,25% trypsin i Hepes-hbss (5,3 mm KCl, 0,44 mm KH2po4, 137,9 mm NaCl, 0,34 mm Nah2po4, 5,56 mm glukose) ved 37 °c i 15 min18,19.
  13. Brug en P1000-pipette med en P1000-spids og et P200-tip til at udføre den mekaniske dissociation ved at trække og slippe kegle indholdet med pipetten flere gange. I dette trin skal du passe på ikke at oprette luftbobler i mediet, fordi luftbobler er giftige for neuroner.
  14. Vent et par minutter, indtil aggregatet er afregnet i bunden af røret.
  15. Supernatanten, der indeholder de dispergerede celler, overføres til et sterilt Eppendorf-rør. Efterlad ~ 25 μl kulturmedium, der indeholder aggregatet.
  16. Tæl de dissocierede celler ved hjælp af et hemocytometer. Isolerede HN neuroner er belagt i en koncentration på 7 x 104 celler cm-2 på poly-l-lysin (1 mg/ml poly-l-lysin)-belagt silicium nitrid membran.
  17. Kun for membraner med HN, Inkubér neuronerne i første DMEM suppleret med 10% føtal bovint serum. En h efter plating HN i DMEM, mediet er ændret til neurobasal plating medier (200 mm L-alanyl-l-glutamin dipeptid i 0,85% NaCl opløsning, og B27 supplement d = 1/50 fortyndet i neurobasal)18,19.
  18. For MDA-MB-231-cellerne sættes membran understøtninger ved 37 °C i inkubator (100% relativ luftfugtighed, 95% luft og 5% CO2) i 25 min. Dette gør det muligt for cellerne at bosætte sig og begynde at vedhæfte til substratet. Dette kan tilpasses afhængigt af den anvendte cellelinje.
  19. Der tilsættes 1 mL af det krævede komplette dyrkningsmedium (DMEM med phenol rød/1% af en 200 mM L-alanyl-L-glutamindipeptid i 0,85% NaCl-opløsning suppleret med 10% føtal kalveserum og 1% penicillin og streptomycin) i hver brønd af MDA-MB-231 celler ved at sætte pipettespidsen mod væggen af plastik godt og frigive mediet meget langsomt, mens det dækker membranen.
  20. Sæt membranen lodret mod væggen af 4 brønd pladen for at fjerne eventuelle luftbobler fanget i brønd hulen af si3N4 membranen (figur 2). For at gøre det skal du bruge fine pincetter og skubbe boblen meget forsigtigt, bevæge sig parallelt med si3N4 bagsiden frame for at undgå at røre og beskadige membranen.
  21. Sæt membranen tilbage vandret i bunden af brønden og Efterlad 4 brønd pladen i inkubator for den ønskede tid afhængigt af vækstraten for den anvendte cellelinje. MDA-MB-231 cellerne blev inkuberet natten over.

3. behandling eller medium ændring

  1. Fjern mediet fra 4-brønd pladen.
  2. Skyl én gang med 1 mL PBS-opløsning ved 37 °C. PBS kasseres, og der tilsættes 1 mL varmet komplet frisk medium i tilstedeværelse eller i fravær (kontrol) af den ønskede behandling ved hjælp af en 1 mL pipettespids, der frigiver væsken meget langsomt mod væggen på brønd pladen. Si3N4 membranen skal langsomt nedsænkes uden forstyrrelser for at undgå membran bevægelse eller løft.

4. Cryo-immobilisering af det cellulære præparat ved springet-frysning

Bemærk: ved afslutningen af den påkrævede inkubationstid, ved tilstedeværelse eller fravær af behandling, skal cellerne omhyggeligt skylles og kryofikseres. Omkring 30 min før du begynder at skylle og blottede den cellulære forberedelse før springet-frysning, første opsætning og køle ned den automatiske springet fryser maskine. Når du manipulerer cryogens, kræves der brug af passende kryogene handsker, sikkerhedsbriller, lukkede sko og en laboratorie frakke. Flydende nitrogen skal transporteres i passende Dewars, og arbejdsstedet skal være tilstrækkeligt ventileret med tilstedeværelsen af en iltmåler. Ideelt set hjælper et lavt hygrometri-niveau på 20 − 30% med at begrænse iskontaminering af materialerne, Dewars og kryogener, hvilket er skadeligt for forvitringen af prøverne (dvs. et amorft islag). Ideelt set kan der afhængigt af forskeres erfaringsniveau fremstilles op til 10 − 12 prøver til en enkelt session ved hjælp af samme sekundære kryogen væske Ethan Cup til forvitrifikation. Mellem sessioner, kræver den automatiske springet fryser en 1 h automatisk bake-out procedure. Ideelt set bør prøverne behandles med identiske inkubations betingelser. Stadig, kontrol kan behandles først, efterfulgt af prøverne med en bestemt behandlingstilstand.

Bemærk: til springet frysning gælder følgende trin både for MDA-MB-231 eller HN-celler.

  1. Indstil cryoplunger til hurtig kryofiksering af celler.
    1. Tænd den automatiske dybfryser.
    2. Indtast parametrene (f. eks. temperatur, procent fugtighed, blotting tid, hvis der anvendes automatisk blotting, og Placer den til at løfte prøven til kryogenens overflade for at lette overførslen til en kryogen beholder) direkte fra konsollen og parametre menuen Indstillinger. I det foreliggende tilfælde blev parametrene for fugtigheds kammeret sat til 37 °C og 80% fugtighed.
      Bemærk: bedre forglasning resultater blev opnået for denne protokol og røntgenbilleder med hurtig og omhyggelig manuel blotting. Således, protokollen ikke bruger en automatisk blotting sekvens program.
    3. Fastgør luftfugter kammeret og for at bevare fugtigheden først fylde den ved hjælp af en sprøjte med 60 mL dobbeltdestilleret vand, og derefter 20 mL som krævet på den automatiske springet fryser konsollen.
      Bemærk: undgå at bruge ultrarent vand, da det kan beskadige vaporizer-systemet. Luk ventilen og lad slangen være fastgjort på bagsiden af luftfugter.
    4. Installer den sorte Ethan Cup i holderen og dæk den med plastikhætter.
    5. Fyld Dewar af det kolde kammer med LN2, hvilket bringer det til niveau af nettet inden for arbejdsområdet.
    6. Sæt en dedikeret Cryo-boks til opbevaring af membraner efter kryofiksering i overførings beholderen, der holdes på det dedikerede sted i EM-GP-arbejdsområdet og tæt på Ethan Cup-holderen.
      Bemærk: den dedikerede Cryo-Box er en in-House udvikling på nanoprobe strålinger ID16A af den europæiske synkrotron stråling i Grenoble. Tegninger med specifikationer er tilgængelige efter anmodning (figur 3). De kan opbevares fire ad gangen i en 50 mL konisk rør til langtidsopbevaring i en LN2 Dewar. En alternativ mulighed består i at bruge en lille 0,2 mL regelmæssig PCR tynd væg tube med Dome caps til at gemme en enkelt si3N4 membran støtte. Du skal bore et ~ 2 mm hul i den øverste del af vægrøret ved hjælp af en opvarmet sprøjte nål for at tillade LN2 at fylde røret.
    7. Fyld overførings beholderen med LN2 og dæk den med det dedikerede aluminiums låg. Fortsæt med at fylde det kolde kammer med LN2 (typisk ~ 2 L er nødvendig) at holde på 100% i LN2 niveau Monitor display på konsollen. Vent, indtil den sidste påkrævede temperatur er nået.
    8. Tag plastikhætten af, og Tildæk Ethan-koppen med den liquefier, som er sluttet til Ethan flasken. Vent, indtil Ethan-Koppens temperatur er i ligevægt med temperatur indstillingspunktet. Når det er nået, begynder at bruge det sekundære kryogen (dvs., flydende Ethan).
      Bemærk: det anvendte indstillingspunkt var-180 °c, lidt over det Ethan smeltepunkt (-182,8 °c). Du behøver ikke at forkøle Ethan liquefier, fordi det kan være en kilde til frost dannelse og kontaminering af Ethan Cup.
    9. Åbn den høje renhed Ethan flaske hoved ventil og meget langsomt åbne trykregulator, indtil du får en langsom tåge af Ethan. Hold dette meget lave flow, indtil væske Ethan hober sig op. Fyld koppen til dens øverste kant. Luk trykregulatoren og den primære ventil i Ethan flasken. Fjern Leica liquefier forsigtigt, og lad den ligge til side på en lille polystyren støtte under røgudemhætten. Hold arbejdsområdet løst dækket med den sorte polystyren hætte forsynet med maskinen for at forhindre frost forurening af arbejdsområdet og Ethan container.
    10. Lige før manuel blotting af prøven, fjerne den sorte polystyren cap og fra menuen på konsollen tryk "nedre kammer", som bringer den miljømæssige kammer i kontakt med den kryogene arbejdsområde.
  2. Forbered dig på at duppes prøven.
    1. Forbered den passende buffer til at fjerne spor af salte fra dyrkningsmediet. Til denne protokol blev ammonium acetatbuffer anvendt til skylning af MDA-MB-231-cellerne.
      Bemærk: ammonium acetatbuffer er egnet til de fleste celletyper, og det tilføjer ikke til røntgen fluorescens signalet (overvejer elementer med Z > 9). Nogle bestemte cellelinjer såsom neuronal celler kan kræve brug af en dedikeret buffer. For eksempel, for primære kortikale neuroner, en saltvandsopløsning bestående af 1,8 volumen 0,5 M na2HPO4 og 1,9 volumen på 0,5 m Nah2po4 kan anvendes15. På den anden side vil fosfor eller klor indeholdt i bufferen bidrage til XRF spektret. Denne begrænsning af falske røntgen emissioner linjer skal holdes i tankerne, afhængigt af de elementer af interesse, der skal påvises.
    2. Forbered en 150 mm ammoniumacetat opløsning fra ammoniumacetat ultrarent opløsning, og kontroller for ph (7,0 – 7.3) og osmolaritet (270 – 300 mosm/kg)
      Bemærk: ovennævnte osmolaritet svarer til Dulbecco's fosfatbuffer saltvand (D-PBS) uden calcium og magnesium og kan kontrolleres ved hjælp af et mikro-osmometer.
    3. Udfyld det påkrævede antal brønde fra en 12-brønd plastik plade med ammonium acetat bufferen.
    4. Skær en fjerdedel af filtrerpapir til blotting, enten fra No. 1 filtrerpapir med et forsnit hul, eller fra manuelt stansede filtrerpapir med en 55 mm diameter med et 15 mm central hul.
    5. Tag den påkrævede prøve opbevaret i inkubator ved 37 °C i sidste øjeblik før skylning og nedfrysning af membranen.
    6. Lås pincet ved hjælp af den sorte klemme ring af Quick-Release pincet (typisk en Dumont spændering høj præcision medicinske pincetter) og Grib si3N4 membran støtte fra kulturen godt.
      Bemærk: Grib midten af silicium rammen, holde spidsen af pincet nær membranen. Flyt den sorte klemme ring ned til de første striber for at låse tweezerne.
    7. Si3N4 membran støtten nedsænkes lodret i ammonium acetatbuffer opløsningen, som opbevares ved 37 °c i ~ 5 s.
      Bemærk: støtten skal forblive lodret i bufferen. Bemærk, at bufferopløsningen i hver brønd af pladen kan anvendes til op til tre membraner til de samme inkubations betingelser.
    8. Blot manuelt med filtrerpapir for at tømme den overskydende buffer ud af membran skylle opløsningen (figur 4) for at efterlade et tyndt og homogent lag ammoniumacetat vandig opløsning, der dækker cellerne.
      Bemærk: for at gøre dette skal du først trykke på bagsiden af vinduet på filter papiret for at fjerne næsten al den vandige buffer, som er tilbage i brønden og bagsiden af membranen. For det andet, skamplet forsiden, startende fra begge sider af pincet, så hver side af rammen (figur 4). Rør aldrig ved membranen. Overskydende buffer drænet kan overvåges med den Aureole dannet på filtrerpapiret.
    9. Åbn den miljømæssige kammer låge, og monter hurtigt tweezerne, Glid den ind i pincet, og luk lågen (figur 5).
    10. Tryk på "blot/A Plunge". Den pincet holder si3N4 membran vil blive hurtigt kastet ind i Cryogen.
    11. Fjern låget på overførings beholderen med forkølede pincet.
    12. Tryk på "Overfør". Si3N4 membranen vil blive lidt flyttet op over Cryogen.
    13. I en enkelt hurtig bevægelse, frakobl pincet ved at skubbe dem ud af pincet interlock og let vippe ud af interlock at bringe direkte ind i en tom slot af Cryo-box i overførings beholderen fyldt med LN2. Frigør den sorte klemme ring for at frigøre membranen (figur 5).
      Bemærk: overførings beholderen skal altid dækkes med LN2. Når en refill er påkrævet, dækkes Ethan-koppen med plastiklåget, der er forsynet med maskinen, for at undgå at blande LN2 og Ethan.
    14. Dæk overførings beholderen med et låg og brug en lille hvid polystyren kop fyldt med LN2 til at overføre det til en polystyren æske fyldt med LN2.
      Bemærk: Cryo-box eller rør, der indeholder membraner kan derefter opbevares i 50 mL koniske rør fyldt med LN2 og overført til en langsigtet opbevaring LN2 Dewar. Før du begynder at kaste fryse den næste prøve, opvarmer alle kolde og matteret pincet med en hårtørrer eller en kogeplade/kryoværktøj tørretumbler (45 °C) for at undgå kontaminering med iskrystaller.

5. frysetørring af dybfrosne celler, som dyrkes på silicium nitrid membraner

Bemærk: til frysetørring gælder følgende trin for både MDA-MB-231-og HN-celler. For at køle ned fryse tørrer, skal du vente omkring 40 min til 1 h.

  1. Opsætning af fryse tørrer
    1. Tænd for strømmen med vippekontakten placeret på instrumentets bagpanel.
    2. Begynd at indtaste parametrene efter LCD-menuen: segment 1 = 2 h ved-120 °C; Segment 2 = 2 h rampe fra-120 °C til-80 °C; Segment 3 = 2 h ved-80 °C; Segment 4 = 2 h rampe fra-80 °C til 50 °C; Segment 5 = 2 h ved-50 °C; Segment 6 = 6 h rampe fra-50 °C til 30 °C.
    3. I slutningen af parameterens Opsætning skal du gemme indstillingerne, lukke kammer låget og trykke på "StarT".
    4. Enheden vil pumpe ned til 1,10-5 mbar. Når dette tryk er nået, vil kommandolinjen i displayet vise "Start afkøling nu, start for at fortsætte".
    5. Fyld flydende kvælstof Dewar regelmæssigt at køle ned scenen under temperaturen tredobbelt punkt indstilling.
      Bemærk: den fase Triple point temperatur er sat til-140 °C. Før du indlæser prøven for denne protokol, er det bedst at vente ca. 1 time og et temperatur stadie på-160 °C.
    6. Displayet viser "Press ENTER", når du er klar til at "indlæse prøve".
    7. Afkøles til flydende nitrogen temperatur i en LN2 fyldt polystyren Dewar, prøven overførsel indehaveren leveres af leverandøren, og de to yderligere messing cylindrisk si3N4 membran holdere.
    8. Monter si3N4 membran messing holderen oven på prøve overførings holderen fra leverandøren i polystyren Dewar (figur 6A). Hold niveauet af LN2 til ca. 1 − 2 mm under den øverste kant af det første messing stykke.
    9. Hent en si3N4 membran prøve støtte fra Cryo-box eller PCR tube ved hjælp af forkølet selvlukkende pincet i Inox eller Teflon-belagt.
    10. Indbetal membranen med cellerne prøve side opad i messing holderen nummererede hulrum.
    11. Dæk samlingen med det andet messing stykke som låg (figur 6C).
      Bemærk: Vi designede to messing skiver hver med en tykkelse på 5 mm, en diameter på 50 mm, og en central 11 mm diameter hul. Den første messing skive har 14 bearbejdet rektangulære (8 mm x 6 mm) placeringer til at rumme understøtter (5 mm x 5 mm). Hvert slot har en flad og poleret godt med en dybde på 2 mm. Den anden messing skive er flad til at dække si3N4 membran messing støtte og fungerer som en kold fælde kabinet.
    12. Forcool Transfer stangen i LN2 fyldt polystyren skum boks og bruge den til at låse i fuld samling (figur 6D, E).
    13. Tryk på "ENTER" på frontpanelet på fryse tørretumbleren.
    14. Turbo og roterende pumper vil stoppe, og kammeret renset med tør nitrogen gas for at åbne låget af kammeret.
    15. Overfør straks prøve overførings samlingen med den fjederbelastede overførings stang ind i fryse tørrekammeret og klip det på kobber LN2 Cold Stage.
      Bemærk: Lad hele samlingen være med overførings stangen ind i kammeret.
    16. Luk straks låget af fryse tørrekammeret og tryk på "StarT" for at fortsætte med frysetørring cyklus.
    17. Fylde LN2 reservoir af fryse tørrer manuelt hver 2 h.
      Bemærk: der kan tilsluttes et automatisk LN2 påfyldningssystem til dette reservoir.
    18. Ved afslutningen af frysetørring cyklus, skal du trykke på "StoP" for at lufte kammeret, og fjerne den fulde samling for at få adgang til frysetørret prøver.

Representative Results

En typisk optisk video mikroskop visning af frosne hydrerede MDA-MB-231 celler, der blev under kultiveret på en poly-L-lysin belagt si3N4 membran støtte er vist i figur 7a. Den optiske visning af prøven i vakuumkammeret blev opnået i refleksions tilstand ved hjælp af det dedikerede online video mikroskop af ID16A strålinger i ESRF22. Mens elektron eller Soft røntgen mikroskopi kræver islaget indlejring af cellen for at være så tynd som muligt (typisk < 0,5 μm), har hårde røntgenstråler (> 10 keV) Fordelen ved en meget højere indtrængningsdybde og lavere dosis deposition. Istykkelsen kan derfor være større, typisk < 10 μm inklusive cellen, således at isen indlejring cellen er et par μm i tykkelse. Dette kan anslås gennem den målte røntgen intensitet i transmissionen sammenlignet med intensiteten uden prøven, under hensyntagen til absorptionen af 500 nm tyk si3N4 membran. Denne istykkelse kan opnås gennem manuel blotting som beskrevet i denne protokol. I Newton Rings regionen kan istykkelsen være endnu tyndere (ikke målt).

X-ray fluorescens elementært kortlægning af den frosne hydrerede celle er vist i figur 7B med repræsentative fordelinger af fysiologiske elementer såsom kalium (K), svovl (S) og zink (Zn). Disse kort repræsenterer den elementale areal masse (dvs. elementær projekteret masse). Selv om det ikke er gjort i det foreliggende tilfælde, kan sådanne kort normaliseres gennem røntgen overførsels baseret fasekontrast Imaging, der giver en vurdering af den forventede masse af prøven23. Som rapporteret af mange undersøgelser, den meget diffusible K ion i celler bevaret i deres Near-Native tilstand blev antaget at være homogent fordelt i hele cellen23,24,16. Som vist i 2D X-ray fluorescens elementale billeder i figur 7B, var det tæt bundne element S jævnt fordelt i cellen, på samme måde som K, og repræsenterer et godt estimat af cellernes masse profil. Zn-distributionen havde et højere signal i kernen end i cytosol og klart skitseret kernen. Det kan konstateres, at små Zn-berigede regioner kan påvises ved den fysiske opløsning (50 nm) i det nukleare område.

De eksisterende X-ray nanopkåber eller dem, der skal bygges ikke nødvendigvis rumme kryogene kapaciteter. I dette tilfælde er det bedste alternativ til at få røntgen fluorescensbilleder af celler ved sub-100 nm rumlige opløsninger at udføre en frysetørring procedure beskrevet i denne protokol efter springet-frysning af cellen. Figur 8a viser en typisk lys felt mikroskopi visning af resulterende frysetørret primær mus hippocampus neuroner direkte dyrket på si3N4 membran. I dette tilfælde kan prøverne, hvis de opbevares i et rent udtørret kammer, forberedes 1 − 2 uger i forvejen og observeres med et almindeligt oprejst optisk mikroskop til registrering af områder af interesse. Der bør udvises forsigtighed for at undgå udsættelse for omgivende luftfugtighed, da det kan blive fanget af frysetørret prøve og føre til beskadigelse under røntgenstråle nanostrålen. Denne procedure blev anvendt med succes til meget følsomme celler (dvs., neuronal celler) og endnu bedre resultater blev opnået med andre mere robuste typer af celler, såsom kræftceller. Som for dybfrosne celler, røntgenstråler fluorescensbilleder af K, S, og Zn på hele frysetørret celle display ligner dem, der er beskrevet ovenfor. De er repræsentative for de elementale fordelinger, der findes i forskellige typer af frysetørret celler ved 50 − 100 nm rumlig opløsning. Mens frysetørring hele celler er et alternativ til at bevare elementær integritet, det er på bekostning af en perfekt bevarelse af cellen morfologi16, især cellemembraner.

Figure 1
Figur 1: typisk prøve støtte til røntgen-fluorescens Nano-analyse. En si3N4 membran støtte i sin beskyttende kapsel. Denne type substrat kan bruges både til rumtemperatur analyse (springet-fryse cellulære præparat efterfulgt af lav temperatur og lav vakuum fryse-tørring proces) eller til kryogen røntgen fluorescens analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Skematisk visning af silicium nitrid vinduerne efter celle såning. Cellerne dyrkes direkte på poly-L-lysin coated flad overflade af si3N4 membran støtte. Sommetider luftbobler kan være fanget i bagsiden hulrum af si3N4 membran støtte og skal fjernes som beskrevet i protokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: in-House udviklet 3D trykt Cryo-Box til langsigtet opbevaring af springet frosne si3N4 membran støtter i flydende kvælstof Dewar. A) Cryo-box demonteres med beholderen og hætter (nedre del) og (B) den samlede kryo-boks med låste hætter. Caps kan manipuleres med pincet, åbning eller låsning ved rotation. En detaljeret plan for 3D-udskrivning er tilgængelig efter anmodning fra ESRF ID16A. Designet er lavet til at rumme silicium nitrid TEM gitre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: blotting af celler kultiveret på si3N4. Før dykfrysning af celle enkeltlags, der dyrkes på en si3N4 membran, skal skylles i ammonium acetat opløsning (a) og omhyggeligt manuelt blottet ved hjælp af filtrerpapir (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: automatisk springet-FRYSNING EM-GP maskine. (A) den automatiske dybfryser. (B) miljøkammer med pincet låst inde.C) Ethan-koppen, som er dækket med Leica liquefier tilsluttet en Ethan-flaske. D) det dybfrysende kabinet, der viser den sorte kop fuld af flydende Ethan og Cryo-boksen til yderligere opbevaring i LN2 af de vitrificerede si3N4 membraner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: prøve kryooverførings samling til frysetørret procedure. A) den første messing modtager til si3N4 membraner monteres oven på prøve overførings holderen, som leveres af fryse tørrer leverandøren. (B) og (C) viser, at den anden flade messing skive anvendes som et dæksel og fungerer som en kold fælde kabinet, der skal indsættes i vakuum kabinettet på fryse tørrer. D) den komplette samling med den fjederbelastede overførings stang. E) prøveholderen, der transporterer det forvilede celle præparat, der dyrkes på si3N4 -membranen, skal indsættes yderligere i den2-kølede fryse tørrer. Alle trin til montering af samlingen er udført i LN2 i en Styrofoam boks. For klarhedens skyld blev alle billederne produceret i fravær af LN2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Cryo-røntgenstråler fluorescensbilleder af en frosset hydreret celle ved hjælp af hård X-ray nanoprobe. (A) typisk online visning i refleksions tilstand ved hjælp af det dedikerede optiske videomikroskop i ESRF ID16A beamline. Efter manuel blotting blev der opnået en samlet istykkelse på ca. 5 − 10 μm, som giver et klart over syn af de frosne hydrerede celler. En region med Newton ringe, der indikerer endnu meget tyndere is, er mærkbar. B) repræsentative Cryo-røntgen-fluorescens cellulære fordelinger af fysiologiske elementer kalium (K), svovl (S) og zink (Zn). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: røntgen fluorescensbilleder af en frysetørret neuronal celle ved hjælp af hård x-ray nanoprobe. (A) typisk lyse felt mikroskopi visning af resulterende frysetørret primær kortikale neuronal celler direkte dyrket på si3N4 membran. Scale bar = 200 μm (B) repræsentativ rumtemperatur røntgen fluorescensbilleder af en enkelt frysetørret hippocampus Neuron, der viser Fordelingerne af fysiologiske elementer kalium (K), svovl (S) og zink (Zn). Scale bar = 2 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Cryo-Electron mikroskopi (Cryo-EM) vandt 2017 Nobelprisen i kemi og som sådan udvikling foretaget af J. dubochet om forvitning af biologisk materiale til højopløsnings struktur bestemmelse af biomolekyler i opløsning25. Som rapporteret af Dubochet i hans nobel forelæsning "at vide, hvordan man vitrify en dråbe vand er én ting, forbereder en biologisk prøve for biologisk observation er en anden"25. Cryopreparation trin er nu betragtes som standard teknik til at afbøde strålingsdosis skader og studere celler tæt på deres oprindelige tilstand. Forberedelsen er dog stadig kedelig. Dette skyldes elektronmikroskopi, på grund af sin uovertruffen rumlig opløsning, er følsom over for enhver ultrastrukturel artefakt, der opstår under prøven forberedelse. Synchrotron cryonanopkåber nærmer sig nu lignende vanskeligheder, der går ned til rumlige opløsninger så lavt som 13 nm i den høje energi X-ray Range26. Hård røntgen mikroskopi kan analysere hele celler, mens elektronmikroskopi lider under den dårlige indtrængningsdybde af elektroner, der kun gør det muligt at iagttage meget tynde celle skiver.

Monolayers af celler er tynde nok, så ved dybfrysning i flydende Ethan opnås de nødvendige afkølingshastigheder for vand vitrifikation. I teorien, køling satser så højt som 108 K/s er muligt ved hjælp af højtryks frysning27 som tillader forglasning af prøver for tyk til springet frysning. En afkølingshastighed på 105 K/s, der kræves for at muliggøre fuld vitrifikation af prøven ved omgivende Tryk28, opnås reproducerbart ved hjælp af den automatiske dybfrysnings maskine og de parametre, som præsenteres her. Dette giver en forsker til at vitrify tynde biologiske prøver (< 10 μm) såsom en enkeltlags af celler12,13,14,15,29,30 ved springet-frysning i flydende Ethan.

En vigtig udfordring med denne protokol er også at bevare så meget som muligt den kemiske integritet af det intracellulære indhold for at give pålidelige elementært distributioner i cellen i 2D eller 3D. Som offentliggjort andetsteds2,16,17,31, i tilfælde af elementær billeddannelse på subcellulært niveau, bør analysen af frosne hydrerede celler overvejes. Ellers kan kombinationen af dykfrysning og frysetørring af celler anvendes til rumtemperatur analyse. For sidstnævnte, den amorfe is fjernes gennem processen med Sublimation, mens de bundne vandmolekyler fjernes gennem processen med desorption. Denne proces kan være langt fra ideel i forhold til frosne hydrerede prøver på grund af den mulige ændring af de cellulære membraner og morfologien af nogle subcellulære strukturer32. Også, for artsbestemmelse undersøgelser, vand udvinding kan føre til metal artsbestemmelse artefakter. Stadig, det har været en succes og det bedste alternativ til frosne hydrerede prøver for elementær billeddannelse på sub-100 nm niveauer2,16,17,18,20,33,34,35,36.

Som det er blevet rapporteret37, kvaliteten af kryopræserverede cellulære præparater kan evalueres gennem kalium-til-natrium K/na ratio. Desværre kan det endnu ikke bestemmes med den hårde røntgen-nanoprobe, der anvendes her, på grund af den lave energi cut-off af Silicon drift detektor anvendes til at detektere røntgenstråler fluorescens fotoner af elementerne (E ≥ 1,3 keV magnesium). Faktisk en høj K/na ratio (> 10), der kan måles ved hjælp af TOF-Sims, EPMA, eller nuklear mikroprobe pixe16,37 er en indikation af den bevarede kemiske integritet af cellen i forhold til den forventede K/na af 25 i en levende celle37. Dette kan understøttes af et samtidigt lavt CL/K-forhold38. Stadig, ufuldkommen forvitrifikation, især hvis hastigheden af prøven afkøling er for lav, kan føre til dannelsen af store iskrystaller, der kan beskadige cellemembraner og organeller, dermed ændre fordelingen af kemiske elementer. Selv om der ikke er nogen rutine procedure for at overvåge denne potentielle skade og indvirkning på den intracellulære fordeling, de ovennævnte elementært nøgletal og muligheden for at billedet cellen ved høj opløsning ved hjælp af røntgen fasekontrast eller Cryo-Soft røntgen mikroskopi kan være de bedste tilgange til at støtte god bevaring af intracellulære rum med samtidig bevarelse af elementært integritet. Kombinationen af disse teknikker og brugen af nyudviklede kryocorrelative fluorescens optiske mikroskoper vil hjælpe med at vurdere, i hvilket omfang denne skade opstår og påvirker den intracellulære elementale fordeling.

Samlet set præsenteres en detaljeret og omfattende protokol til forberedelse af cellulære prøver for Synchrotron røntgen fluorescens Nano-analyse. Det er et godt udgangspunkt for forskersamfundet, der hjælper med at løse det vanskelige spørgsmål om, hvordan man forbereder passende cellulære prøver til 2D og 3D elementært Imaging på (Cryo) hårde X-ray nanopkåber. Disse tilgange kan fusioneres med optisk fluorescens og elektronmikroskopi kapaciteter til dybtgående korrelativ kemisk og strukturel billeddannelse af celler.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forsøgene på nano-Imaging strålinger ID16A blev udført inden for rammerne af ESRF-forslag LS2430, LS2303 og LS2765.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O SIGMA 09691-250mL One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.
B27 supplement, 50x Life Technologies, Invitrogen 17504-044 for hippocampal neuron culture
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2) GIBCO 14190-094 cell culture
DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification) GIBCO 21885025 cell culture
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Life Technologies, Invitrogen 31966-02 for hippocampal neuron culture
Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology World Precision Instrument 501202
Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer Quorum Technology EK3147
Ethane N45 Air Liquid p0505s05r0a001 C2H6 > 99,995 %
Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin GIBCO A31604-02 cell culture
HBSS 10x Life Technologies, Invitrogen 14185-052 for hippocampal neuron culture
Leica GP quick-release forceps Leica 16706435
MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell ATCC ATCC HTB-26 cell culture
Neurobasal medium Life Technologies, Invitrogen 21103-049 for hippocampal neuron culture
Nunc 4-Well Plate Thermo Fisher 176740 cell culture
Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer Advanced Instruments Osmo1 Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO® Vapor Pressure Osmometer)
Penicillin-Streptomycin SIGMA P4333 cell culture
poly-L-lysine SIGMA P4707 Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).
Plunge freezing robot Leica EM GP main unit Leica 16706401 Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.
Silicon nitride membrane (Si3N4) Silson Ltd. SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...
Trypan blue solution 0.4% GIBCO 15250061 cell culture
Trypsin-EDTA, 0.05% GIBCO 25300-054 cell culture
Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water Fisher Chemicals W9-1 MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.
Whatman No. 1 filter paper with precut hole Leica 16706440 Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewis, D. J., et al. Intracellular synchrotron nanoimaging and DNA damage/genotoxicity screening of novel lanthanide-coated nanovectors. Nanomedicine. 5 (10), 1547-1557 (2010).
  2. Fus, F., et al. The intracellular localization of osmocenyl-tamoxifen derivatives in hormone-independent breast cancer cells revealed by 2D and 3D nano X-ray fluorescence imaging. Angwendte Chemie. , (2019).
  3. Janssens, K., Adams, F., Rindby, A. Microscopic X-Ray Fluorescence Analysis. , Wiley. Chichester, UK. (2000).
  4. Carmona, A., et al. Uranium exposure of human dopaminergic cells results in low cytotoxicity, accumulation within sub-cytoplasmic regions, and down regulation of MAO-B. Neurotoxicology. 68, 177-188 (2018).
  5. Leapman, R. D., Hunt, J. A., Buchanan, R. A., Andrews, S. B. Measurement of low calcium concentrations in cryosectioned cells by parallel-EELS mapping. Ultramicroscopy. 49 (1-4), 225-234 (1993).
  6. Saubermann, A. J., Echlin, P., Peters, P. D., Beeuwkes, R. Application of scanning electron microscopy to X-ray analysis of frozen hydrated sections. I. Specimen handling techniques. Journal of Cell Biology. 88 (2), 257-267 (1981).
  7. Saubermann, A. J., Heyman, R. V. Quantitative digital X-ray imaging using frozen hydrated and frozen dried tissue sections. Journal of Microscopy. 146, Pt2 169-182 (1987).
  8. Wroblewski, J., Roomans, G. M. X-ray microanalysis of single and cultured cells. Scanning Electron Microscopy. , Pt 4 1875-1882 (1984).
  9. Wroblewski, J., Müller, R. M., Wroblewski, R., Roomans, G. M. Quantitative X-ray microanalysis of semi-thick cryosections. Histochemistry. 77 (4), 447-463 (1983).
  10. Zierold, K. Cryopreparation of mammalian tissue for X-ray microanalysis in STEM. Journal of Microscopy. 125, Pt2 149-156 (1982).
  11. Harkiolaki, M., et al. Cryo-soft X-ray tomography: Using soft X-rays to explore the ultrastructure of whole cells. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 81-92 (2018).
  12. McDermott, G., Le Gros, M. A., Knoechel, C. G., Uchida, M., Larabell, C. A. Soft X-ray tomography and cryogenic light microscopy: the cool combination in cellular imaging. Trends in Cell Biology. 19 (11), 587-595 (2009).
  13. Schneider, G., et al. Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy. Nature Methods. 7 (12), 985-987 (2010).
  14. Sorrentino, A., et al. MISTRAL: a transmission soft X-ray microscopy beamline for cryo nano-tomography of biological samples and magnetic domains imaging. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (4), 1112-1117 (2015).
  15. Carzaniga, R., Domart, M. C., Duke, E., Collinson, L. M. Correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray tomography of adherent cells at European synchrotrons. Methods in Cell Biology. 124, Academic Press. 151-175 (2014).
  16. Perrin, L., Carmona, A., Roudeau, S., Ortega, R. Evaluation of sample preparation methods for single cell quantitative elemental imaging using proton or synchrotron radiation focused beams. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30 (12), 2525-2532 (2015).
  17. Jin, Q., et al. Preserving elemental content in adherent mammalian cells for analysis by synchrotron-based x-ray fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 265 (1), 81-93 (2017).
  18. Daoust, A., et al. Impact of manganese on primary hippocampal neurons from rodents. Hippocampus. 24 (5), 598-610 (2014).
  19. Daoust, A., et al. Manganese Cytotoxicity Assay on Hippocampal Neuronal Cell Culture. Bio-protocol. 5 (1), 1368 (2015).
  20. Gibon, J., et al. The over-expression of TRPC6 channels in HEK-293 cells favours the intracellular accumulation of zinc. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1808 (12), 2807-2818 (2011).
  21. Hasna, J., Bohic, S., Lemoine, S., Blugeon, C., Bouron, A. Zinc Uptake and Storage During the Formation of the Cerebral Cortex in Mice. Molecular Neurobiology. , 1-13 (2019).
  22. Villar, F., et al. Nanopositioning for the ESRF ID16A Nano-Imaging Beamline. Synchrotron Radiation News. 31 (5), 9-14 (2018).
  23. Kosior, E., et al. Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for subcellular metal quantification. Journal of Structural Biology. 177 (2), 239-247 (2012).
  24. Bohic, S., et al. Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells. Applied Physics Letters. 78, 3544-3546 (2001).
  25. Dubochet, J. On the Development of Electron Cryo-Microscopy (Nobel Lecture). Angwendte Chemie. 57 (34), 10842-10846 (2018).
  26. Da Silva, J. C., et al. Efficient concentration of high-energy X-rays for diffraction-limited imaging resolution. Optica. 4 (5), 492-495 (2017).
  27. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high-pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
  28. Moor, H. Theory and pratice of high pressure freezing. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer. 175-191 (1987).
  29. Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Journal of Electron Microscopy Techniques. 3 (2), 177-210 (1986).
  30. Ferreira, J. L., Matthews-Palmer, T. R., Beeby, M. Electron Cryo-Tomography. Cellular Imaging. , Springer, Cham. 61-94 (2018).
  31. Colvin, R. A., Jin, Q., Lai, B., Kiedrowski, L. Visualizing metal content and intracellular distribution in primary hippocampal neurons with synchrotron X-ray fluorescence. PLoS One. 11 (7), 0159582 (2016).
  32. Vavpetič, P., et al. Elemental distribution and sample integrity comparison of freeze-dried and frozen-hydrated biological tissue samples with nuclear microprobe. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 348, 147-151 (2015).
  33. Guerquin-Kern, J. L., Bordat, C. Cryo-preparation procedures for elemental imaging by sims and eftem. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. , CRC Press. 499-536 (2008).
  34. Gramaccioni, C., et al. Nanoscale quantification of intracellular element concentration by X-ray fluorescence microscopy combined with X-ray phase contrast nanotomography. Applied Physics Letters. 112 (5), 053701 (2018).
  35. Perrin, L., et al. Zinc and Copper Effects on Stability of Tubulin and Actin Networks in Dendrites and Spines of Hippocampal Neurons. ACS Chemical Neurosciences. 8 (7), 1490-1499 (2017).
  36. Ortega, R., et al. α-synuclein over-expression induces increased iron accumulation and redistribution in iron-exposed neurons. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1925-1934 (2016).
  37. Fartmann, M., et al. Quantitative imaging of atomic and molecular species in cancer cultures with TOF-SIMS and Laser-SNMS. Applied Surface Sciences. 231 (2), 428-431 (2004).
  38. Pålsgård, E., Lindh, U., Roomans, G. M. Comparative study of freeze-substitution techniques for X-ray microanalysis of biological tissue. Microscopy Research and Techniques. 28 (3), 254-258 (1994).

Tags

Biokemi kræftceller sporstof synkrotron stråling røntgen Fluorescens mikroskopi kryofiksation frysetørring nanoprobe
Cellekultur på silicium nitrid membraner og Cryopreparation for Synchrotron røntgen fluorescens Nano-analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bissardon, C., Reymond, S.,… More

Bissardon, C., Reymond, S., Salomé, M., André, L., Bayat, S., Cloetens, P., Bohic, S. Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis. J. Vis. Exp. (154), e60461, doi:10.3791/60461 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter