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Biochemistry

Coltura cellulare sulle membrane di nitride di silicio e criopreparazione per la fluorescenza a raggi X del sincrotrone Nano-analisi

Published: December 10, 2019 doi: 10.3791/60461
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 2, 1,2
1Inserm, UA7, Synchrotron Radiation for Biomedicine (STROBE), Université Grenoble Alpes, 2ID16A Beamline, ESRF, The European Synchrotron

Summary

Presentato qui è un protocollo per la coltura cellulare sulle membrane di nitrato di silicio e il congelamento del tuffo prima dell'imaging a fluorescenza a raggi X con una nanosonda a raggi X criogenica sincrotrone. Quando viene fornita solo una nano-analisi a temperatura ambiente, i campioni congelati possono essere ulteriormente liofilizzati. Questi sono i passaggi critici per ottenere informazioni sulla composizione elementale intracellulare.

Abstract

Si sa molto poco sulla distribuzione di ioni metallici a livello subcellulare. Tuttavia, tali elementi chimici hanno funzioni normative essenziali e la loro omeostasi disturbata è coinvolta in varie malattie. Le nanosonda a fluorescenza a raggi X del sincrotrone all'avanguardia forniscono la sensibilità e la risoluzione spaziale necessarie per chiarire la distribuzione e la concentrazione bidimensionale (2D) e tridimensionali (3D) di metalli all'interno di intere cellule livello di organello. Questo apre nuovi interessanti campi scientifici di indagine sul ruolo dei metalli nella fisiopatologia della cellula. La preparazione cellulare è una procedura chiave e spesso complessa, in particolare per l'analisi di base. Sebbene le tecniche di fluorescenza a raggi X siano ormai diffuse e siano stati utilizzati vari metodi di preparazione, pochissimi studi hanno studiato la conservazione del contenuto elementare delle cellule nella migliore delle due opzioni e nessun protocollo dettagliato graduale per la criopreparazione finora sono state rilasciate cellule aderenti alle nanosonda a fluorescenza a raggi X. Questa è una descrizione di un protocollo che fornisce la preparazione cellulare graduale per la criofissia rapida per consentire la nanoanalisi della fluorescenza a raggi X del sincrotrone delle cellule in uno stato idratato congelato quando è disponibile un ambiente criogenico e un trasferimento. Nel caso in cui la nanoanalisi debba essere eseguita a temperatura ambiente, viene fornita una procedura aggiuntiva per l'essiccazione congelata della preparazione cellulare dell'aderente criofissa. I protocolli proposti sono stati utilizzati con successo in lavori precedenti, più recentemente nello studio della distribuzione intracellulare 2D e 3D di un composto organometallico nelle cellule del cancro al seno.

Introduction

Le nanosonda a raggi X a raggi X (SR-XRF) di nuova progettazione consentono la visualizzazione della distribuzione subcellulare degli elementi in modo completamente quantitativo. Ad esempio, questa capacità analitica consente di esaminare l'assorbimento di nanoparticelle1 o molecole organometallici come i complessi a base di osmio2,fornendo informazioni sull'assorbimento intracellulare di molecole a base metallica con potenti proprietà anticancro. Come tecnica multielemento, SR-XRF3 con una nanosonda fornisce un modo per quantificare e localizzare simultaneamente elementi intracellulari più biologicamente importanti, tra cui fosforo, zolfo, potassio, calcio, ferro, rame e zinco. Infatti, l'uso di raggi X duri fornisce una grande profondità di penetrazione per l'immagine di intere cellule idratate congelate in modo privo di etichette. Inoltre, fornendo l'accesso al bordo K della maggior parte degli elementi di interesse, la fluorescenza a raggi X è eccitata in modo più efficiente. L'uso di approcci criogenici consente la riduzione dei danni da radiazioni e l'ottimizzazione della conservazione della struttura cellulare e della distribuzione elementale.

La maggior parte delle tecniche analitiche a risoluzione spaziale disponibili per studiare i metalli nelle cellule sono tecniche di superficie che richiedono sezioni di cellule molto sottili e piatte da produrre. Ciò comprende principalmente la microscopia elettronica a trasmissione a scansione con analisi a raggi X dispersiva di energia (STEM-EDX), la microscopia elettronica a trasmissione filtrata dall'energia (EF-TEM) e la spettrometria di massa iografica secondaria su nanoscala (nanoSIMS). Quest'ultimo non può essere eseguito su sezioni cellulari congelate e idratate, mentre la crio-analisi può essere fatta con microscopia elettronica con risoluzione spaziale insuperabile ma scarsa sensibilità elementare. L'emissione di raggi X indotta dalle particelle (PIXE) ha permesso lo studio delle distribuzioni elementali in celle intere. Ha il vantaggio di essere completamente quantitativo con una giusta sensibilità elementale su scala micron e anche con risoluzione submicron4, ma soffre di danni da radiazioni e mancanza di capacità criogeniche per studiare le cellule idratate congelate. Tutte queste tecniche analitiche si completano a vicenda nell'imaging elementare delle cellule, ma per tutte le tecniche la procedura di preparazione del campione è un passo cruciale. Per ottenere risultati significativi, è consigliabile limitare la possibile contaminazione e la ridistribuzione elementare e/o le perdite. Come dimostrato nella microscopia elettronica, un flusso di lavoro criogenico, compreso crio-immobilizzazione della cellula e criotrasferimento a una fase di crioscansione, consente una conservazione elementare ottimale a livelli subcellulari il più vicino possibile allo stato nativo5,6,7,8,9,10. Questa comprensione è stata implementata con successo nello sviluppo della microscopia a raggi X crio-morbida del synchrotron (ad esempio, microscopi a campo completo e microscopi a scansione) per produrre immagini ultrastrutturali di intere cellule idratate congelate in 2D o 3D. Vari flussi di lavoro criogenici sono stati sviluppati11 per microscopi a raggi X morbidi a Beamline 2.1 (XM-2) dell'Advanced Light Source presso il Lawrence Berkeley National Laboratory12, beamline U41-XM presso l'anello di stoccaggio degli elettroni BESSY II (Germania)13, fascio MISTRAL della sorgente luminosa ALBA (Spagna)14, e a Beamline B24 della fonte di luce15. Un flusso di lavoro simile è stato recentemente dimostrato di essere il metodo di preparazione e conservazione più affidabile per l'analisi elementale intracellulare utilizzando microsonde a raggi X16,17.

Anche se le tecniche di nanosonda a raggi X stanno iniziando ad essere ampiamente utilizzate per l'analisi degli elementali cellulari, in particolare con l'avvento delle capacità criogeniche SR-XRF, nessun protocollo graduale è stato diffuso finora alla comunità di ricerca. Qui viene fornita una procedura dettagliata per preparare cellule aderenti criofisse coltivate come monostrati su membrane di nitrato di silicio da analizzare in condizioni criogeniche. Viene fornita anche una fase di congelamento dell'essiccazione dopo il protocollo nel caso in cui l'analisi a raggi X debba essere eseguita a temperatura ambiente. Mentre il protocollo proposto è stato utilizzato con successo con le cellule di cancro al seno umano MD-MB-2312 e l'essiccazione congelato è stata dimostrata tra gli altri su neuroni del topo18,20,21, può essere facilmente esteso a vari tipi di cellule umane o animali.

Protocol

Le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato per la cura degli animali della Divisione Scienze della vita del CEA (CETEA, A14-006). Essi sono stati condotti in conformità con la legislazione francese e la direttiva del Consiglio della Comunità europea del 24 novembre 1986 (86/609/CEE).

1. Preparazione del supporto a membrana di nitrato di silicio (Si3N4)

NOTA: Poiché la membrana è fragile e delicata, il suo supporto (telaio in silicio spesso 200 m) deve essere maneggiato delicatamente, idealmente con una sottile pinzetta in carbonio o pinzette Dumont #5, punte fini di chiusura automatica dritte. Questo protocollo utilizzava membrane di nitrato di silicio con un telaio di 5 mm x 5 mm e una dimensione della membrana di 1,5 mm x 1,5 mm. La membrana deve essere preparata approssimativamente 12 h prima di iniziare l'esperimento (ad esempio, semina cellulare). Le membrane possono essere preparate alla fine della giornata e lasciate asciugare durante la notte sotto un cappuccio laminare di classe II in modo che siano pronti per l'uso la mattina successiva. Uno spessore del telaio in silicio di 200 m è standard per la maggior parte delle aziende che vendono finestre di nitrato di silicio. Se il prodotto utilizzato in questo protocollo non è disponibile, è possibile utilizzare una dimensione della membrana compresa nell'intervallo di 0,5,1,5 mm con una dimensione di fotogramma standard di 5 mm x 5 mm. La dimensione della membrana più grande è preferibile quando verrà utilizzata la tomografia a raggi X. Possono essere utilizzate anche finestre di nitrato di silicio di tipo griglia TEM con una dimensione della membrana di 0,5 mm e uno spessore di 50 nm.

  1. Aprire la capsula contenente il supporto della membrana Si3N4 (Figura 1). Spremere delicatamente la capsula per allentare leggermente il supporto.
  2. Tenere uno degli angoli del telaio in silicio utilizzando le pinzette sottili. Fare attenzione a non toccare la membrana Si3N4 al centro. La membrana spessa 200 o 500 nm può essere facilmente danneggiata.
  3. Utilizzando le pinzette sottili, posizionare delicatamente il supporto della membrana Si3N4 in una parabola Petri in vetro sterile, superficie piatta della finestra di nitrato di silicio rivolta verso l'alto (cioè la cavità rivolta verso il fondo del piatto).
  4. Togliere il coperchio della parabola Petri e lasciare le membrane sotto la luce UV per 25-30 min sotto l'armadio di flusso laminare.
    NOTA: La luce UVC (254 nm) è in genere impostata su 200 w/cm2.
  5. Mettere 10 l di poli-L-lisina sulla membrana. La goccia dovrebbe coprire bene la membrana Si3N4 e può diffondersi un po 'sul telaio in silicio. Lasciarlo a 37 gradi centigradi per 25 min nell'incubatrice di coltura tissutale standard al 100% di umidità relativa e 95% aria, 5% CO2.
    NOTA: In questo caso è stato utilizzato un rivestimento poli-L-lisina per le cellule del cancro al seno MDA-MB-231. A seconda del tipo di linea cellulare, vari rivestimenti possono essere utilizzati, e questo passaggio dovrebbe essere ottimizzato di conseguenza.
  6. In una piastra sterile di 48 pozze, riempire diversi pozzi con 200-250 litri di acqua ultrapura e ultra-traccia filtrata attraverso un filtro sterile da 0,22 m. Tipicamente, ogni pozzo può essere utilizzato per risciacquare fino a 2/3 membrane. Utilizzando una pinzetta fine, raccogliere il supporto della membrana in un angolo del suo telaio in silicio. Sciacquare delicatamente la membrana immergendola verticalmente di 10 s in tre pozzi successivi.
    NOTA: I supporti a membrana vengono prelevati dall'incubatrice e possono essere lavorati a temperatura ambiente, con la temperatura e l'umidità definite da un cappuccio a flusso laminare di classe II.
  7. Mettere il supporto della membrana verticalmente in un pozzo vuoto di una piastra sterile 96 bene, coprirlo, e lasciare asciugare durante la notte sotto un cappuccio laminare di classe II.

2. Semina delle cellule

  1. In una piastra sterile 4 bene, posizionare le membrane con il loro lato piatto rivolto versol'alto .
  2. Le cellule MDA-MB-231 sono mantenute in una coltura monostrato in DMEM con fenolo rosso/Glutamax I, completate con 10% siero di vitello fetale e 1% penicillina e streptomicina a 37 gradi centigradi in un'incubatrice d'aria umidizzata di COdel 5%.
  3. Quando le cellule raggiungono il 60-70% di confluenza, rimuove il supporto dal piatto o dal pallone.
  4. Lavare 1x con 10 ml di fosfato gassato di Dulbecco senza Ca2 o Mg2.
  5. Aggiungere una soluzione di prova/EDTA da 3 mL/T75 dello 0,05% e assicurarsi che l'intero strato di monostrato sia coperto dalla soluzione trypsin.
  6. Incubaperate per 3/5 min a 37 gradi centigradi fino a quando le cellule iniziano a staccarsi. Occorre prestare attenzione a non proibire eccessivamente le cellule e non forzare il distacco prematuro delle cellule.
  7. Aggiungere 8 ml di DMEM integrato con 10% siero di vitello fetale e 1% penicillina e streptomicina o supporti completi e raccogliere le cellule da pipeting. Il siero nei media neutralizzerà la prova.
  8. Girare verso il basso a 250 x g per 3 min a temperatura ambiente. Aspirare il super-attuoso.
  9. Aggiungere 8 ml di supporti completi freschi al tubo da 15 ml contenente il pellet cellulare e convogliare le cellule su e giù fino a quando le cellule non vengono disperse in una singola sospensione cellulare.
  10. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e diluire ad una concentrazione di 5 x 106 cellule per mL in supporti completi (DMEM con Phenol Red/1% di un 200 mM L-alanyl-L-glutamine soluzione integrata con 10% siero di vitello fetale e 1% penicillina e streptomica).
  11. Prendere 10 l della sospensione cellulare MDA-MB-231 e depositarlo sulla membrana. Ciò corrisponde a 50.000 celle/10 -L per MDA-MB-231. La goccia dovrebbe coprire bene la membrana Si3N4 e può diffondersi un po 'sul telaio in silicio. Occorre prestare attenzione a non toccare la membrana Si3N4 con la punta della micropipetta.
    NOTA: A seconda del tipo di linea cellulare e degli esperimenti o delle misurazioni, la densità delle cellule può variare e deve essere testata di conseguenza. Qui, la densità cellulare proposta per la semina della membrana Si3N4 è risultata ottimale per le condizioni sperimentali e un'ulteriore nano-analisi SR-XRF delle cellule MDA-MB-2312.
  12. Per i neuroni ippocampali (HN), rimuovere il tessuto cerebrale dell'ippocampo dai topi del giorno embrionale 18,5 e digerirlo in 0,25% di provapina in Hepes-HBSS (5,3 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 137,9 mM NaCl, 0,34 mM NaH2PO4, 5,56 mM di glucosio) a 37 mM per 15 min18,19.
  13. Utilizzando una pipetta P1000 con una punta P1000 e una punta P200, eseguire la dissociazione meccanica disegnando e rilasciando il contenuto di cono con la pipetta più volte. Durante questo passaggio, fare attenzione a non creare bolle d'aria nel mezzo, perché le bolle d'aria sono tossiche per i neuroni.
  14. Attendere alcuni minuti fino a quando l'aggregato si deposita sul fondo del tubo.
  15. Trasferire il supernatante contenente le cellule disperse in un tubo Eppendorf sterile. Lasciare 25 dollari di mezzo di coltura contenente l'aggregato.
  16. Contare le cellule dissociate usando un emocitometro. I neuroni HN isolati sono placcati ad una concentrazione di 7 x 104 cellule cm-2 su poli-L-lysine (1 mg/mL poly-L-lysine)-rivestito membrana di nitrato di silicio.
  17. Solo per le membrane con HN, incubare i neuroni nel primo DMEM integrato con 10% siero bovino fetale. One h dopo la placcatura HN in DMEM, il mezzo viene cambiato in supporti di placcatura neurobasale (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide in 0.85% NaCl soluzione, e B27 supplemento d - 1/50 diluito in Neurobasal)18,19.
  18. Per le cellule MDA-MB-231, mettere i supporti della membrana a 37 gradi centigradi nell'incubatrice (100% di umidità relativa, 95% aria e 5% CO2)per 25 min. Questo permette alle cellule di stabilirsi e iniziare ad attaccarsi al substrato. Questo può essere adattato a seconda della linea cellulare utilizzata.
  19. Aggiungere 1 mL del mezzo di coltura completo richiesto (DMEM con Phenol Red/1% di un dipeptide L-alanyl-L-glutamine da 200 mM in soluzione 0.85% NaCl integrata con 10% cal fetale siero di femo e 1% penicillina e streptomicina) in ogni pozzo delle cellule MDA-MB-231 mettendo la punta pipetta contro la parete del pozzo di plastica e rilasciando il mezzo molto lentamente mentre copre la membrana.
  20. Mettere la membrana verticale contro la parete della piastra 4 bene al fine di togliere eventuali bolle d'aria intrappolate nella cavità del pozzo della membrana Si3N4 (Figura 2). Per farlo, usa le pinzette sottili e allontana la bolla molto delicatamente, muovendosi parallelamente al telaio posteriore Si3N4 per evitare di toccare e danneggiare la membrana.
  21. Rimettere la membrana orizzontalmente nella parte inferiore del pozzo e lasciare la piastra 4 pozzo nell'incubatrice per il tempo richiesto a seconda del tasso di crescita della linea cellulare utilizzata. Le cellule MDA-MB-231 sono state incubate durante la notte.

3. Trattamento o cambiamento medio

  1. Rimuovere il mezzo dalla piastra 4 del pozzo.
  2. Risciacquare una volta con 1 mL di soluzione PBS a 37 gradi centigradi. Scartare il PBS e aggiungere 1 mL di mezzo fresco caldo completo in presenza o in assenza (controlli) del trattamento desiderato utilizzando una punta di pipetta da 1 mL, rilasciando il liquido molto lentamente contro la parete della piastra del pozzo. La membrana Si3N4 deve essere lentamente sommersa senza disturbi per evitare il movimento o il sollevamento della membrana.

4. Crio-immobilizzazione della preparazione cellulare con congelamento

NOTA: Alla fine del tempo di incubazione richiesto, in presenza o assenza di trattamento, le cellule devono essere accuratamente sciacquate e criofissa. Circa 30 minuti prima di iniziare a sciacquare e oscurare la preparazione cellulare prima del congelamento a tuffo, prima impostare e raffreddare la macchina automatica congelatore a tuffo. Quando manipoli i criogeni, è necessario l'uso di guanti criogenici appropriati, occhiali di sicurezza, scarpe chiuse e un rivestimento da laboratorio. L'azoto liquido deve essere trasportato in Dewars appropriati e il luogo di lavoro deve essere sufficientemente ventilato con la presenza di un monitor dell'ossigeno. Idealmente, un basso livello di igronia del 20-30% aiuta a limitare la contaminazione da ghiaccio dei materiali, Dewars e criogeni, che è dannosa per la vetrificazione dei campioni (cioè uno strato di ghiaccio amorfo). Idealmente, a seconda del livello di esperienza del ricercatore, è possibile preparare fino a 10-12 campioni per una singola sessione utilizzando la stessa tazza secondaria di etano liquido criogeno per la vetrificazione. Tra una sessione e l'altra, il congelatore automatico a tuffo richiede una procedura di forno automatico di 1 h. Idealmente, i campioni devono essere trattati con condizioni di incubazione identiche. Tuttavia, i controlli possono essere elaborati per primi, seguiti dai campioni con una particolare condizione di trattamento.

NOTA: per il congelamento delle immersioni, la procedura seguente si applica sia alle celle MDA-MB-231 che a quella HN.

  1. Impostare il criostan per la criofissazione rapida delle cellule.
    1. Accendere il congelatore automatico a tuffo.
    2. Inserire i parametri (ad esempio, temperatura, umidità percentuale, tempo di gonfiore se viene utilizzato il gonfiore automatico, e la posizione per sollevare il campione sulla superficie del criogeno per facilitare il trasferimento in un contenitore criogenico) direttamente dalla console e parametri dal menu delle impostazioni. Nel caso di specie, i parametri della camera di umidità sono stati fissati a 37 gradi centigradi e all'80% dell'umidità.
      NOTA: sono stati ottenuti migliori risultati di vitrificazione per questo protocollo e l'imaging a raggi X con un taglio manuale rapido e attento. Pertanto, il protocollo non utilizza un programma di sequenza di blotting automatico.
    3. Fissare la camera umidificatrice e per preservare l'umidità prima riempirla utilizzando una siringa con 60 mL di acqua a doppia distillazione, quindi 20 mL come richiesto sulla console del congelatore automatico.
      NOTA: Evitare l'uso di acqua ultrapura perché potrebbe danneggiare il sistema vaporizzatore. Chiudere la valvola e lasciare il tubo attaccato sul retro dell'umidificatore.
    4. Installare la tazza di etano nero nel suo supporto e coprirla con i tappi di plastica.
    5. Riempire la Dewar della camera fredda con LN2, portandolo al livello della griglia all'interno dell'area di lavoro.
    6. Mettere un crio-box dedicato per riporre le membrane dopo la criofissia nel contenitore di trasferimento tenuto nella posizione dedicata nell'area di lavoro EM-GP e vicino al supporto della coppa etano.
      NOTA: Il crio-box dedicato è uno sviluppo interno presso la nanosonda beamline ID16A della radiazione europea di sincrotrone a Grenoble. I disegni con specifiche sono disponibili su richiesta (Figura 3). Possono essere conservati quattro alla volta in un tubo conico da 50 mL per lo stoccaggio a lungo termine in un LN2 Dewar. Una possibilità alternativa consiste nell'utilizzare un piccolo tubo a parete sottile PCR regolare da 0,2 mL con tappi a cupola per memorizzare un singolo supporto a membrana Si3N4. Avrete bisogno di praticare un foro di 2 mm nella parte superiore del tubo a parete utilizzando un ago di siringa riscaldato al fine di consentireAL2 per riempire il tubo.
    7. Riempire il contenitore di trasferimento con LN2 e coprirlo con il coperchio di alluminio dedicato. Continuare a riempire la camera fredda con LN2 (in genere è necessario 2 L) mantenendo al 100% il display del monitor di livello LN2 sulla console. Attendere fino a quando non viene raggiunta la temperatura finale richiesta.
    8. Rimuovere il tappo di plastica e coprire la tazza di etano con il liquetro collegato alla bottiglia di etano. Attendere che la temperatura della coppa di etano equilibrates al setpoint temperatura. Una volta raggiunto, iniziare a utilizzare il criogeno secondario (cioè l'etano liqueficato).
      NOTA: Il setpoint utilizzato è stato -180 gradi centigradi, leggermente al di sopra del punto di fusione dell'etano (-182,8 gradi centigradi). Non è necessario preraffreddare il liquef etano perché può essere una fonte di formazione del gelo e contaminazione della coppa di etano.
    9. Aprire la valvola principale della bottiglia di etano ad alta purezza e aprire molto lentamente il regolatore di pressione fino ad ottenere una lenta nebbia di etano. Mantenere questo flusso molto basso fino a quando non si accumula etano liquido. Riempire la tazza fino al suo bordo superiore. Chiudere il regolatore di pressione e la valvola principale della bottiglia di etano. Rimuovere il liquetro Leica con attenzione e lasciarlo da parte su un piccolo supporto in polistirolo sotto il cofano fumato. Mantenere l'area di lavoro liberamente coperta con il tappo in polistirolo nero fornito con la macchina per evitare la contaminazione da gelo dell'area di lavoro e del contenitore di etano.
    10. Poco prima dell'attracco manuale del campione, rimuovere il tappo in polistirolo nero e dal menu della console premere "Camera inferiore", che porta la camera ambientale a contatto con l'area di lavoro criogenica.
  2. Preparare la spalancate del campione.
    1. Preparare il buffer adeguato per rimuovere le tracce di sali dal mezzo di coltura. Per questo protocollo è stato utilizzato il buffer in acetato di ammonio per il risciacquo delle cellule MDA-MB-231.
      NOTA: il buffer di acetato di ammonio è adatto per la maggior parte dei tipi di cellule e non si aggiunge al segnale di fluorescenza a raggi X (considerando gli elementi con il segno di s > 9). Alcune linee cellulari particolari come le cellule neuronali possono richiedere l'uso di un buffer dedicato. Ad esempio, per i neuroni corticali primari, è possibile utilizzare15una soluzione salina composta da volume di 0,5 M Na2HPO4 e volume 1,9 di 0,5 M NaH2PO4. D'altra parte, il fosforo o il cloro contenuto nel buffer contribuirà allo spettro XRF. Questa limitazione delle linee di emissione di raggi X spurie deve essere tenuta a mente a seconda degli elementi di interesse da rilevare.
    2. Preparare una soluzione di acetato di acetato di ammonio da 150 mm di soluzione ultrapura di acetato di ammonio e verificare la presenza di pH (7,0–7,3) e osmolarità (270-300 mOsm/kg)
      NOTA: L'osmolarità di cui sopra è equivalente alla salina buffer di fosfato di Dulbecco (D-PBS) senza calcio e magnesio e può essere controllata utilizzando un micro-osmometro.
    3. Riempire il numero richiesto di pozze da una piastra di plastica 12 bene con il tampone di acetato di ammonio.
    4. Tagliare un quarto di carta filtrata per l'accovè, sia a partire dal numero 1 filtrare la carta con un foro di taglio, sia dalla carta filtrata perforata manualmente di un diametro di 55 mm con un foro centrale di 15 mm.
    5. Estrarre il campione richiesto conservato nell'incubatrice a 37 gradi centigradi all'ultimo momento prima di risciacquare e congelare la membrana.
    6. Sbloccare le pinzette utilizzando l'anello di morsetto nero delle pinze a rilascio rapido (in genere un anello di bloccaggio Dumont pinzette mediche ad alta precisione) e afferrare il supporto di membrana Si3N4 dalla coltura bene.
      NOTA: Afferrare il centro del telaio in silicio, mantenendo la punta delle pinzette vicino alla membrana. Spostare l'anello di morsetto nero verso il basso per le prime strisce per bloccare le pinzette.
    7. Immergere il supporto della membrana Si3N4 in verticale nella soluzione cuscinetto per il tampone di acetato di ammonio mantenuta a 37 gradi centigradi per 5 s.
      NOTA: il supporto deve rimanere verticale nel buffer. Si noti che la soluzione buffer in ogni pozzo della piastra può essere utilizzata per un massimo di tre membrane per le stesse condizioni di incubazione.
    8. Blot manualmente con carta da filtro per drenare il buffer in eccesso dalla soluzione di risciacquo della membrana (Figura 4) al fine di lasciare uno strato sottile e omogeneo di soluzione accaria di acetato di ammonio che copre le cellule.
      NOTA: Per farlo, premere prima il retro della finestra sulla carta da filtro per rimuovere quasi tutto il buffer acquoso rimanente nel pozzo e nella parte posteriore della membrana. In secondo luogo, macchiare il lato anteriore, a partire da entrambi i lati della pinzetta, quindi ogni lato del telaio (Figura 4). Non toccare mai la membrana. L'eccesso di tampone drenato può essere monitorato con l'aureole formata sulla carta da filtro.
    9. Aprire la porta della camera ambientale e montare rapidamente le pinzette, facendola scorrere nell'interblocco pinze, e chiudere la porta (Figura 5).
    10. Premere "Blot/A plunge". Le pinzette che tengono la membrana Si3N4 saranno rapidamente immerse nel criogeno.
    11. Rimuovere il coperchio del contenitore di trasferimento con pinze preraffreddate.
    12. Premere "Trasferisci". La membrana Si3N4 sarà leggermente spostata sopra il criogeno.
    13. In un unico movimento rapido, scollegare le pinzette facendole scorrere fuori dall'interblocco pinze e inclinare leggermente fuori dall'interblocco per portare direttamente in uno slot vuoto della crio-box nel contenitore di trasferimento riempito con LN2. Rilasciare l'anello di morsetto nero per liberare la membrana (Figura 5).
      NOTA: Il contenitore di trasferimento deve essere sempre coperto con LN2. Quando è necessaria una ricarica, coprire la tazza di etano con il coperchio di plastica fornito con la macchina per evitare la miscelazione LN2 ed etano.
    14. Coprire il contenitore di trasferimento con un coperchio e utilizzare una piccola tazza di polistirolo bianco riempita con LN2 per trasferirla in una scatola di polistirolo riempita con LN2.
      NOTA: Il crio-box o il tubo contenente le membrane possono quindi essere conservati in tubi conici da 50 mL riempiti con LN2 e trasferiti in un deposito a lungo termine LN2 Dewar. Prima di iniziare a immergersi congelare il campione successivo, riscaldare tutte le pinzette fredde e smerigliate con un asciugacapelli o un essiccatore a piastra calda / criotools (45 gradi centigradi) per evitare la contaminazione con cristalli di ghiaccio.

5. Asciugatura a liofiling delle cellule congelate a tuffo coltivate su membrane di nitrato di silicio

NOTA: per il congelamento, i passaggi seguenti si applicano alle celle MDA-MB-231 e HN. Per raffreddare l'asciugatrice congelata, è necessario attendere circa 40 min a 1 h.

  1. Impostare l'asciugatrice congelata
    1. Accendere l'accensione con l'interruttore rocker situato sul pannello posteriore dello strumento.
    2. Iniziare a inserire i parametri seguendo il menu LCD: Segmento 1 : 2 h a -120 gradi centigradi; La rampa da 2 h da -120 gradi a -80 gradi centigradi; Segmento 3 : 2 h a -80 gradi centigradi; La rampa da 4 a 2 h da -80 a 50 gradi centigradi; Segmento 5 : 2 h a -50 gradi centigradi; Rampa da -50 a 30 gradi centigradi.
    3. Alla fine del set-up del parametro, salvare le impostazioni, chiudere il coperchio della camera e premere "START".
    4. L'unità pompa verso il basso a 1,10-5 mbar. Quando viene raggiunta questa pressione, la riga di comando del display mostrerà "Start Cooling Now, START to continue".
    5. Riempire regolarmente l'azoto liquido Dewar per raffreddare lo stadio al di sotto dell'impostazione a tre punti di temperatura.
      NOTA: La temperatura del triplo punto dello stadio è impostata su -140 . Prima di caricare il campione per questo protocollo, è meglio aspettare circa 1 h e una fase di temperatura di -160 gradi centigradi.
    6. Il display mostrerà "Press ENTER" quando è pronto a "Caricare l'esempio".
    7. Raffreddare fino a temperatura liquida dell'azoto all'interno di un Dewar in polistirolo riempito LN2, il supporto di trasferimento del campione fornito dal fornitore, e i due ulteriori porta membrana cilindrica Si3N4 in ottone.
    8. Montare il supporto in ottone a membrana Si3N4 sopra il supporto di trasferimento del campione fornito dal fornitore nel polistirolo Dewar (Figura 6A). Mantenere il livello di LN2 a circa 1/2 mm sotto il bordo superiore del primo pezzo in ottone.
    9. Raccogliere un supporto di campione di membrana Si3N4 dal crio-box o dal tubo PCR utilizzando pinzette autochiusure preraffreddate in inox o rivestito in teflon.
    10. Depositare la membrana con il lato del campione di cellule rivolto verso l'alto nella cavità numerata del supporto in ottone.
    11. Coprire l'assieme con il secondo pezzo di ottone come coperchio (Figura 6C).
      NOTA: Abbiamo progettato due dischi in ottone ciascuno con uno spessore di 5 mm, un diametro di 50 mm e un foro centrale di 11 mm di diametro. Il primo disco in ottone ha 14 posizioni rettangolari (8 mm x 6 mm) per ospitare supporti (5 mm x 5 mm). Ogni fessura ha un pozzo piatto e lucido con una profondità di 2 mm. Il secondo disco in ottone è piatto per coprire il supporto in ottone a membrana Si3N4 e funge da recinto a trappola fredda.
    12. Preraffreddare l'asta di trasferimento nella scatola di schiuma di polistirolo riempita LN2 e utilizzarla per bloccare l'intero assemblaggio (Figura 6D,E).
    13. Premere "ENTER" sul pannello anteriore dell'asciugatrice congelata.
    14. Le pompe turbo e rotanti si fermeranno e la camera si spurga con gas di azoto secco per consentire l'apertura del coperchio della camera.
    15. Trasferire immediatamente l'assieme di trasferimento del campione con l'asta di trasferimento caricata a molla nella camera di congelamento dell'essiccatore e agganciarlo sul rame LN2 stadio freddo.
      NOTA: Lasciare l'assemblaggio completo con l'asta di trasferimento nella camera.
    16. Chiudere immediatamente il coperchio della camera dell'essiccatore di congelamento e premere "START" per continuare con il ciclo di essiccazione congelante.
    17. Riempire manualmente il serbatoio LN2 dell'asciugatrice congelare ogni 2 h.
      NOTA: un sistema di riempimento automatico LN2 può essere collegato a questo serbatoio.
    18. Alla fine del ciclo di congelamento, premere "STOP" per sfogare la camera e rimuovere l'intero assemblaggio per accedere ai campioni liofilizzati.

Representative Results

Una tipica vista al microscopio video ottico delle cellule MDA-MB-231 congelate idratate che sono state sub-coltivate su un supporto a membrana Si3N4 rivestito in poli-L è mostrato nella Figura 7A. La vista ottica del campione nella camera a vuoto è stata ottenuta in modalità di riflessione utilizzando il microscopio video online dedicato della trave ID16A dell'ESRF22. Mentre la microscopia a raggi X o a raggi X morbida richiede che lo strato di ghiaccio che incorpora la cellula sia il più sottile possibile (tipicamente <0,5 m), i raggi X duri (>10 keV) hanno il vantaggio di una profondità di penetrazione molto più elevata e di una deposizione della dose più bassa. Lo spessore del ghiaccio può quindi essere maggiore, in genere <10 m compresa la cella, in modo che il ghiaccio che incorpora la cella sia di pochi metri di spessore. Questo può essere stimato attraverso l'intensità dei raggi X misurata nella trasmissione rispetto all'intensità senza il campione, tenendo conto dell'assorbimento della membrana Si3N4 spessa 500 nm. Questo spessore di ghiaccio può essere raggiunto attraverso il gonfiore manuale come descritto nel presente protocollo. Nella regione degli anelli di Newton, lo spessore del ghiaccio può essere ancora più sottile (non misurato).

La mappatura elementare a fluorescenza a raggi X della cellula idratata congelata è illustrata nella Figura 7B con le distribuzioni rappresentative di elementi fisiologici come il potassio (K), lo zolfo (S) e lo zinco. Queste mappe rappresentano la massa elementare elementare dell'atale (cioè la massa proiettata elementale). Anche se non vengono eseguite nel caso di specie, tali mappe possono essere normalizzate attraverso l'imaging a contrasto di fase basato sulla propagazione dei raggi X che fornisce la stima della massa proiettata del campione23. Come riportato da molti studi, il ione K altamente diffusibile nelle cellule conservate nel loro stato quasi nativo è stato supposto per essere distribuito omogeneamente in tutta l'intera cella23,24,16. Come mostrato nelle immagini elementali della fluorescenza a raggi X 2D nella Figura 7B, l'elemento strettamente legato S è stato distribuito uniformemente all'interno della cella, in modo simile a K, e rappresenta una buona stima del profilo di massa cellulare. La distribuzione di Nn aveva un segnale più alto nel nucleo che nel citosol e delineava chiaramente il nucleo. Si può notare che le piccole regioni arricchite con n possono essere rilevate alla risoluzione spaziale (50 nm) nella regione nucleare.

Le nanosonda a raggi X esistenti o quelle da costruire non sono necessariamente in grado di contenere capacità criogeniche. In questo caso, la migliore alternativa per ottenere immagini a fluorescenza a raggi X di cellule a risoluzioni spaziali di sotto i 100 nm consiste nell'eseguire una procedura di essiccazione con gelo descritta in questo protocollo dopo il congelamento della cellula. Figura 8A mostra una tipica visione microscopia a campo luminoso dei neuroni ippocampali del topo primario liofilizzati risultanti direttamente coltivati sulla membrana Si3N4. In questo caso, se conservati in una camera pulita, i campioni possono essere preparati con 1/2 settimane di anticipo ed essere osservati con un normale microscopio ottico verticale per la registrazione delle regioni di interesse. Occorre prestare attenzione a prevenire l'esposizione all'umidità ambiente in quanto può essere catturata dal campione liofilizzato e causare danni sotto il nanofascio a raggi X. Questa procedura è stata applicata con successo alle cellule molto sensibili (cioè le cellule neuronali) e sono stati ottenuti risultati ancora migliori con altri tipi più robusti di cellule, come le cellule tumorali. Per quanto riguarda le cellule congelate a tuffo, le immagini a fluorescenza a raggi X di K, S e n sull'intero display a celle liofillate sono simili a quelle sopra descritte. Essi sono rappresentativi delle distribuzioni elementali che si trovano in vari tipi di cellule liofiliate a risoluzione spaziale di 50-100 nm. Mentre l'essiccazione a freddo intere cellule è un'alternativa per preservare l'integrità elementare, è a scapito di una perfetta conservazione della morfologia cellulare16, in particolare le membrane cellulari.

Figure 1
Figura 1: supporto tipico del campione per la nanoanalisi della fluorescenza a raggi X. Un supporto a membrana Si3N4 nella sua capsula protettiva. Questo tipo di substrato può essere utilizzato sia per l'analisi della temperatura ambiente (preparazione cellulare con congelamento del tuffo seguita da bassa temperatura e basso processo di congelamento sottovuoto) sia per l'analisi criogenica della fluorescenza a raggi X. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Vista schematica delle finestre di nitrato di silicio dopo la semina delle cellule. Le cellule vengono coltivate direttamente sulla superficie piatta rivestita poli-L-lisina del supporto della membrana Si3N4. A volte le bolle d'aria possono essere intrappolate nella cavità posteriore del supporto della membrana Si3N4 e devono essere rimosse come descritto nel protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Crio-box stampato in 3D sviluppato internamente per la conservazione a lungo termine di immersione congelati Si3N4 supporti a membrana in azoto liquido Dewar. (A) Cryo-box smontato con il contenitore e i tappi (parte inferiore) e (B) la crio-box assemblata con tappi bloccati. I tappi possono essere manipolati con le pinzette, aprendo o bloccando per rotazione. Un piano dettagliato per la stampa 3D è disponibile su richiesta da ESRF ID16A. Il design è stato realizzato per ospitare griglie TEM a nitrato di silicio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Gonfiore delle cellule coltivate su Si3N4. Prima di congelare il mostrato cellulare coltivato su una membrana Si3N4 deve essere sciacquato in soluzione di acetato di ammonio (A) e accuratamente cancellata con carta da filtro (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Macchina EM-GP con congelamento automatico delle tuffi. (A) Il congelatore automatico a tuffo. (B) Camera ambientale con le pinzette rinchiuse. (C) La tazza di etano coperta dal liquef Leica collegata a una bottiglia di etano. (D) Il recinto con gelido che mostra la tazza nera piena di etano liqueficato e il crio-box per un ulteriore stoccaggio in LN2 delle membrane Si3N4 vetrificate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Esempio di assemblaggio criotrasferimento per la procedura di congelamento. (A) Il primo recipiente in ottone per le membrane Si3N4 è montato sopra il supporto di trasferimento del campione fornito dal fornitore dell'essiccatore di congelamento. (B) e (C) mostrano che il secondo disco in ottone piatto viene utilizzato come copertura e funge da involucro di trappola a freddo da inserire nell'involucro sottovuoto dell'asciugatrice congelante. (D) L'assemblaggio completo con l'asta di trasferimento caricata a molla. (E) Il supporto del campione che trasporta la preparazione cellulare vetrificata coltivata sulla membrana Si3N4 deve essere ulteriormente inserito nell'essiccatore congelo raffreddato LN2. Tutti i passaggi per il montaggio dell'assieme vengono eseguiti in LN2 in una scatola di polistirolo. Per chiarezza, tutte le immagini sono state prodotte in assenza di LN2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Immagini a fluorescenza a raggi EX crio-X di una cellula idratata congelata utilizzando la nanosonda a raggi X. (A) Visione online tipica in modalità riflessione utilizzando il microscopio video ottico dedicato della linea del fascio ESRF ID16A. Dopo l'umidità manuale, è stato raggiunto uno spessore totale del ghiaccio di circa 5,10 m che consente una visione chiara delle cellule idratate congelate. Una regione con l'anello di Newton è indicativa anche di molto ghiaccio più sottile è evidente. (B) Rappresentante crio-X fluorescenza fluorescenza distribuzioni cellulari di elementi fisiologici potassio (K), zolfo (S), e zinco . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Immagini a fluorescenza a raggi X di una cellula neuronale liofilizzata utilizzando la nanosonda a raggi X dura. (A) Visione tipica della microscopia a campo luminoso delle cellule neuronali corticali primarie congelato risultanti direttamente coltivate sulla membrana Si3N4. Barra della scala - 200 m (B) Immagini a fluorescenza a raggi X rappresentative della temperatura ambiente di un singolo neurone ippocampale liofilizzato che mostra la distribuzione di elementi fisiologici di potassio (K), zolfo (S) e zinco. Barra di scala : 2 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

La microscopia crioelettronica (crio-EM) ha vinto il Premio Nobel per la chimica 2017 e come tale lo sviluppo di J. Dubochet sulla vetrificazione del materiale biologico per la determinazione della struttura ad alta risoluzione delle biomolecole nella soluzione25. Come riportato da Dubochet nella sua lezione di Nobel "Sapere come vinificare una goccia d'acqua è una cosa, preparare un campione biologico per l'osservazione biologica è un altro"25. I passaggi di criopreparazione sono ora considerati la tecnica standard per mitigare i danni alla dose di radiazioni e studiare le cellule vicine al loro stato nativo. La preparazione rimane però noiosa. Questo perché la microscopia elettronica, a causa della sua risoluzione spaziale insuperabile, è sensibile a qualsiasi artefatto ultrastrutturale che si verifica durante la preparazione del campione. Le crionde di sincrotrone si stanno ora avvicinando a difficoltà simili che si stanno abgiusto per raggiungere risoluzioni spaziali a partire da 13 nm nell'intervallo a raggi X ad alta energia26. La microscopia a raggi X duro è in grado di analizzare intere cellule, mentre la microscopia elettronica soffre della scarsa profondità di penetrazione degli elettroni, consentendo di osservare solo fette cellulari molto sottili.

I monostrati delle cellule sono abbastanza sottili da raggiungere il congelamento dei mmeriti nell'etano liquido. In teoria, sono possibili velocità di raffreddamento fino a 108 K/s utilizzando il congelamento ad alta pressione27 che consente la vetrificazione di campioni troppo spessi per il congelamento dei mmeriti. Una velocità di raffreddamento di 105 K/s, necessaria per consentire la vetrificazione completa del campione a pressione ambientale28, viene raggiunta riproducibilmente utilizzando la macchina di congelamento automatica del tuffo e i parametri qui presentati. Ciò consente a un ricercatore di vinificare campioni biologici sottili (<10 m) come un monostrato di cellule12,13,14,15,29,30 mediante il congelamento dei guasti liquidi in etano liquido.

Una sfida importante con questo protocollo è anche quello di preservare il più possibile l'integrità chimica del contenuto intracellulare per fornire distribuzioni elementali affidabili all'interno della cellula in 2D o 3D. Come pubblicato altrove2,16,17,31, nel caso dell'imaging elementare a livello subcellulare, l'analisi delle cellule idratate congelate dovrebbe essere considerata. In caso contrario, la combinazione di congelamento del guasto e congelamento delle cellule può essere utilizzata per l'analisi della temperatura ambiente. Per quest'ultimo, il ghiaccio amorfo viene rimosso attraverso il processo di sublimazione, mentre le molecole d'acqua rilegate vengono rimosse attraverso il processo di desorpazione. Questo processo può essere tutt'altro che ideale rispetto ai campioni idratati congelati a causa della possibile alterazione delle membrane cellulari e della morfologia di alcune strutture subcellulari32. Inoltre, per gli studi di speciazione, l'estrazione dell'acqua può portare a manufatti di speciazione metallici. Tuttavia, ha avuto successo e la migliore alternativa ai campioni idratati congelati per l'imaging elementare a sotto-100 nm livelli2,16 ,17,18,20,33,34,35,36.

Come è stato riportato37, la qualità dei preparati cellulari crioconservati può essere valutata attraverso il rapporto potassio-sodio K/Na. Purtroppo, non è ancora possibile determinare con la nanosonda a raggi X dura utilizzata qui, a causa del taglio a bassa energia del rilevatore di deriva di silicio utilizzato per rilevare i fotoni a fluorescenza a raggi X degli elementi (E - 1,3 keV magnesio). Infatti, un alto rapporto K/Na (>10) che può essere misurato utilizzando TOF-SIMS, EPMA, o microprobe nucleare PIXE16,37 è indicativo dell'integrità chimica conservata della cellula rispetto al K/Na previsto di 25 in una cellula vivente37. Questo può essere supportato da un concomitante basso rapporto Cl/K38. Tuttavia, la vetrificazione imperfetta, in particolare se la velocità di raffreddamento del campione è troppo bassa, può portare alla formazione di grandi cristalli di ghiaccio che possono danneggiare le membrane cellulari e gli organelli, alterando di conseguenza la distribuzione di elementi chimici. Anche se non esiste una procedura di routine per monitorare questo potenziale danno e impatto sulla distribuzione intracellulare, i rapporti elementali di cui sopra e la possibilità di immagine della cellula ad alta risoluzione utilizzando il contrasto di fase a raggi X o la microscopia a raggi X crio-morbida possono essere i migliori approcci per supportare una buona conservazione dei compartimenti intracellulari con la conservazione concomitante dell'integrità elementare. La combinazione di queste tecniche e l'uso di microscopi ottici a fluorescenza criofrontelita di recente sviluppo aiuteranno a valutare in che misura si verifica questo danno e colpisce la distribuzione elementale intracellulare.

Nel complesso, viene presentato un protocollo dettagliato e completo per preparare campioni cellulari per la nanoanalisi della fluorescenza a raggi X del sincrotrone. È un buon punto di partenza per la comunità di ricerca, aiutando a risolvere il difficile problema di come preparare campioni cellulari appropriati per l'imaging elementare 2D e 3D a (crio) nanoprobe a raggi X duri. Questi approcci possono essere uniti a fluorescenza ottica e capacità di microscopia elettronica per l'imaging chimico e strutturale correlatoale approfondito delle cellule.

Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Acknowledgments

Gli esperimenti sulla nano-imaging trave ID16A sono stati eseguiti nel quadro delle proposte ESRF LS2430, LS2303 e LS2765.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O SIGMA 09691-250mL One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.
B27 supplement, 50x Life Technologies, Invitrogen 17504-044 for hippocampal neuron culture
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2) GIBCO 14190-094 cell culture
DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification) GIBCO 21885025 cell culture
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Life Technologies, Invitrogen 31966-02 for hippocampal neuron culture
Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology World Precision Instrument 501202
Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer Quorum Technology EK3147
Ethane N45 Air Liquid p0505s05r0a001 C2H6 > 99,995 %
Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin GIBCO A31604-02 cell culture
HBSS 10x Life Technologies, Invitrogen 14185-052 for hippocampal neuron culture
Leica GP quick-release forceps Leica 16706435
MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell ATCC ATCC HTB-26 cell culture
Neurobasal medium Life Technologies, Invitrogen 21103-049 for hippocampal neuron culture
Nunc 4-Well Plate Thermo Fisher 176740 cell culture
Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer Advanced Instruments Osmo1 Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO® Vapor Pressure Osmometer)
Penicillin-Streptomycin SIGMA P4333 cell culture
poly-L-lysine SIGMA P4707 Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).
Plunge freezing robot Leica EM GP main unit Leica 16706401 Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.
Silicon nitride membrane (Si3N4) Silson Ltd. SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...
Trypan blue solution 0.4% GIBCO 15250061 cell culture
Trypsin-EDTA, 0.05% GIBCO 25300-054 cell culture
Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water Fisher Chemicals W9-1 MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.
Whatman No. 1 filter paper with precut hole Leica 16706440 Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.

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Coltura cellulare sulle membrane di nitride di silicio e criopreparazione per la fluorescenza a raggi X del sincrotrone Nano-analisi
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Bissardon, C., Reymond, S., Salomé, M., André, L., Bayat, S., Cloetens, P., Bohic, S. Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis. J. Vis. Exp. (154), e60461, doi:10.3791/60461 (2019).

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