Summary
هنا هو بروتوكول مفصل لاستخدام أجنة حمار وحشي Tg (vtg1: mCherry) للكشف عن الآثار الإستروجين. ويغطي البروتوكول انتشار الأسماك وعلاج الأجنة، ويؤكد على الكشف عن الإشارات الفلورية المستحثة عن طريق مركبات اختلال الغدد الصماء وتوثيقها وتقييمها.
Abstract
هناك العديد من المركبات المسببة لاضطرابات الغدد الصماء (EDC) في البيئة ، وخاصة المواد الإستروجين. ومن الصعب اكتشاف هذه المواد بسبب تنوعها الكيميائي؛ ولذلك، تستخدم أساليب اكتشاف التأثيرات بشكل متزايد، مثل الكائنات الحية الحساسة للتأثيرات/الكائنات الحية المسببة للاستروجين. وتشمل هذه الكائنات الحية التي تقوم بصيد الأسماك عدة نماذج من الأسماك. يغطي هذا البروتوكول استخدام خط الحمار الوحشي Tg(vtg1: mCherry) المحور وراثياً ككائن حيوي، بما في ذلك انتشار الأسماك ومعالجة الأجنة، مع التركيز على الكشف عن الإشارات الفلورية التي تسببها EDC وتوثيقها وتقييمها. والهدف من العمل هو عرض لاستخدام Tg (vtg1: mCherry) الأجنة خط المعدلة وراثيا للكشف عن الآثار الإستروجين. يوثق هذا العمل استخدام أجنة حمار وحشي معدلة وراثيا Tg(vtg1: mCherry) للكشف عن آثار إستروجين عن طريق اختبار اثنين من المواد الاستروجينية، α- و β زيارالينول. البروتوكول الموصوف هو فقط أساس لتصميم عمليات الفحص؛ يمكن أن تختلف طريقة الاختبار وفقا لنقاط نهاية الاختبار والعينات. وعلاوة على ذلك، يمكن الجمع بين ذلك مع أساليب أخرى للتشايس، وبالتالي تسهيل استخدام خط المعدل وراثيا في المستقبل.
Introduction
هناك عدد كبير من المركبات المعطلة للغدد الصماء (EDC) التي هي من بين المواد الأكثر خطورة في بيئتنا. هذه هي أساسا مركبات إستروجين التي تلوث المياه من الموارد الطبيعية. إن التنوع الكيميائي للمواد التي تنتمي إلى المجموعة يجعل من الصعب إجراء الاختبارات اللازمة لوجودها، حيث أن هناك حاجة إلى طرق تحليلية مختلفة للكشف عنها. استناداً إلى التركيب الكيميائي من الصعب جداً تحديد ما إذا كانت مادة ما قادرة فعلاً على العمل كهرمون الاستروجين. بالإضافة إلى ذلك ، هذه المواد لا تكون موجودة أبدا في شكل نقي في البيئة ، لذلك قد تتأثر آثارها بالمركبات الأخرى ، أيضا1. ويمكن حل هذه المشكلة عن طريق أساليب الكشف عن الأثر، مثل استخدام الكائنات الحية مراقب الحيوي / bioindicator التي تظهر آثاراستروجين 2،3،4،5.
في الآونة الأخيرة، مجموعة متنوعة من خط الخلية6 والخميرة القائمة على أنظمة الاختبار2،,وقد تم تطوير3 للكشف عن الآثار إستروجين. ومع ذلك، هذه عموما قادرة فقط على الكشف عن ربط المادة لمستقبلات هرمون الاستروجين2،3. وبالإضافة إلى ذلك، فإنها غير قادرة على نموذج العمليات الفسيولوجية المعقدة في الكائن الحي، أو للكشف عن مراحل حساسة للهرمونات من مراحل الحياة؛ وبالتالي، فإنها تؤدي في كثير من الأحيان إلى نتائج خاطئة.
ومن المعروف أن بعض الجينات تتفاعل بحساسية للاستروجين في الكائنات الحية7. الكشف عن المنتجات الجينية عن طريق طرق البيولوجيا الجزيئية هو أيضا ممكن على مستوى البروتين أو مرنا8،9، ولكن عادة ما ينطوي على التضحية الحيوانية. قوانين حماية الحيوان أصبحت أكثر صرامة، وهناك طلب متزايد على أنظمة اختبار بديلة تقلل من عدد ومعاناة الحيوانات المستخدمة في التجارب أو استبدال نموذج الحيوان بنظام نموذجي آخر10. مع اكتشاف البروتينات الفلورسنت وإنشاء خطوط المؤشرات الحيوية، والتكنولوجيات المعدلة وراثيا توفير بديل جيد11. مع هذه الخطوط، يمكن اختبار تنشيط جين حساس للاستروجين في الجسم الحي.
ومن بين الفقاريات، لا تزال إمكانات الأسماك في تقييم المخاطر البيئية غير مُجدّة. وهي توفر العديد من المزايا على نماذج الثدييات: كونها كائنات مائية ، فهي قادرة على امتصاص الملوثات من خلال كامل جسمها ، وإنتاج عدد كبير من النسل ، وتتميز بعض أنواعها بوقت جيل قصير. نظام الغدد الصماء والعمليات الفسيولوجية تظهر أوجه تشابه كبيرة مع الفقاريات الأخرى وحتى مع الثدييات، بما في ذلك البشر12.
ومن المعروف أيضا العديد من الجينات للكشف عن الآثار الإستروجين في الأسماك. أهمها هي مستقبلات هرمون الاستروجين aromatase-B, choriogenin-H, و vitellogenin (vtg)7,13. مؤخرا، كما تم إنشاء العديد من خطوط هرمون الاستروجين المنتجة للحساسية البيولوجية من نماذج الأسماك المستخدمة في المختبر، مثل من حمار وحشي (Danio rerio)4،5،14،15،16،17.5 والميزة الرئيسية للحمار الوحشي في خلق خطوط biosensor هو هيئة شفافة من الأجنة واليرقات، لأن إشارة مراسل الفلورسنت يمكن بعد ذلك أن تدرس بسهولة في الجسم الحي دون التضحية الحيوان10. بالإضافة إلى حماية الحيوان، بل هو أيضا ميزة قيمة لأنها تسمح لدراسة رد فعل نفس الفرد في أوقات مختلفة من العلاج18.
هذه التجارب استخدام vitellogenin مراسل محورة وراثيا خط حمار وحشي15. بناء transgene المستخدمة في تطوير Tg (vtg1:mCherry) لديه طويلة (3.4 كيلو بايت) الطبيعية vitellogenin-1 المروج. مستقبلات الإستروجين (ER) هو بروتين محسن تنشيطها ligands الذي هو ممثل من الستيرويد / مستقبلات نووية superfamily. ER يربط إلى تسلسلات الحمض النووي محددة تسمى عناصر استجابة الإستروجين (EREs) مع تقارب عالية وtransactivates التعبير الجيني استجابة لاستراديول وغيرها من المواد الاستروجينية، لذلك فإن أكثر ERE في المروج يسبب استجابة أقوى19. هناك 17 مواقع ERE في المنطقة المروج من Tg (vtg1:mCherry) بناء transgene ومن المتوقع أن تحاكي التعبير عن الجين vtg الأصلي15. هناك تعبير مستمر عن إشارة الفلورسنت في الإناث نضجت جنسيا. ومع ذلك، في الذكور والجنين التعبير في الكبد هو فقط مرئية على العلاج مع المواد إستروجين (الشكل 1).
الشكل 1: إشارة فلورية حمراء في الكبد من vtg1:mCherry الحمار الوحشي الكبار المعدلة وراثيا و 5 أجنة dpf، بعد 17-ß-استراديول (E2) التعريفي. في الإناث والذكور في تعامل مع E2 (25 ميكروغرام / لتر وقت التعرض: 48hrs) الفلوري قوية من الكبد مرئية حتى من خلال الجلد المصطبغ. لا توجد إشارة فلورية مرئية في الذكور غير المعالجين (A). بعد E2 التعريفي (50 ميكروغرام / لتر وقت التعرض: 0-120 حصانا)، إشارة الفلورسنت الحمراء في الكبد من 5 أجنة dpf يمكن أيضا أن يلاحظ، والتي ليست مرئية في الأجنة التحكم (B). في حين أن إشارة الفلورسنت موجودة باستمرار في الإناث البالغات ، فإن الذكور وأجنة الخط مناسبة للكشف عن آثار الإستروجين. (BF: حقل مشرق، mCherry: عرض مرشح الفلورسنت الأحمر، صور عادية واحدة، شريط مقياس A: 5mm، شريط مقياس B: 250 ميكرومتر) الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
على غرار الـ"فيتيلوجينين" الداخلي، يتم التعبير عن مراسل mCherry فقط في الكبد. لأن يتم إنتاج فيتيلوجينين فقط في وجود هرمون الاستروجين، لا توجد إشارة الفلورسنت في الضوابط. لأن التعبير هو فقط في الكبد، وتقييم النتائج هو أسهل بكثير15.
وقد تم التحقيق حساسية وسهولة الاستخدام من أجنة هذا الخط على مختلف خليط مركب استروجين وأيضا على العينات البيئية15,20, وفي معظم الحالات تم توثيق العلاقة الجرعة والاستجابة ( الشكل2). ومع ذلك، في حالة المواد السمية للغاية، السمية الكبدية أساسا (مثل zearalenone)، فقط إشارة الفلورسنت ضعيفة جدا قد تكون مرئية في كبد الأجنة المعالجة ويمكن الوصول إلى إشارة الفلورسنت كثافة قصوى تسبب ضمن نطاق تركيز صغير جدا، مما يجعل من الصعب إقامة علاقة الجرعة تأثير20.
الشكل 2: الرسم التخطيطي للجرعات والاستجابة (A) والصور الفلورية (mCherry) للكبد (B) المعرضة لـ 17-α-ethynilestradiol (EE2)، في 5 dpf vtg1:mCherry اليرقات. ويعبر عن النتائج على أنها كثافة متكاملة تولد من قوة الإشارة وحجم المنطقة المتأثرة (±SEM، n = 60). 100% يشير إلى الحد الأقصى الملاحظ. زادت كثافة الإشارة الفلورسنت تدريجيا مع التركيز. شريط مقياس = 250 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
هناك العديد من المواد الإستروجين موجودة في البيئة، مثل 17-β-استراديول (التركيز البيئي: 0.1-5.1 نانوغرام/لتر)21، 17-α-ethynylestradiol (التركيز البيئي: 0.16-0.2 ميكروغرام/لتر22, zearalenone (التركيز البيئي: 0.095-0.22 ميكروغرام /لتر)23, بيسفينول-A (التركيز البيئي: 0.45-17.2 ملغم/لتر)24. عند اختبار هذه المواد في شكل نشط نقي بمساعدة الأجنة المتحولة وراثيا mCherry، كانت أقل تركيزات تأثير ملحوظ (LOEC) للكشف عن علامة الفلورسنت 100 نانوغرام / لتر ل17-ß-استراديول، 1 نانوغرام/لتر ل17-α-ethynilestradiol, 100 ng/L للزيارالينون, و 1 ملغ/لتر للبيسفينول-A (96-120 حصانا) علاج, وهو قريب جدا أو ضمن نطاق تركيزات بيئية للمواد15. يمكن أن يساعد خط Tg(vtg1:mCherry) المعدل وراثياً في اكتشاف إستروجين في عينات مياه الصرف الصحي بعد التعرض المباشر. خط حساس مثل اختبار الاستروجين الخميرة المستخدمة عادة، و bioluminiscent الخميرة الاستروجين (BLYES) مقايسة15. بمساعدة هذا الخط، تم تأكيد الآثار الوقائية من بيتا-cyclodextrins ضد السمية الناجمة عن الزيارالينون باستخدام الخلائط الكيميائية20.
في تقرير صدر مؤخرا، وقد ثبت في استخدام في الجسم الحي من خط المعدلة وراثيا مع مساعدة من اثنين من استروجين zearalenone (ZEA) الأيض، α- و β-zearalenol (α-ZOL و β-ZOL)25. خط الأساس البروتوكول مناسب لدراسة الآثار الإستروجين من عدة مركبات أو عينات بيئية على Tg (vtg1:mCherry) الأجنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتمت الموافقة على البروتوكول المتعلق بالحيوان بموجب قانون رعاية الحيوان الهنغاري، وأُنجزت جميع الدراسات قبل أن يصل الأفراد الذين عولجوا إلى مرحلة التغذية المجانية.
1- حصاد الأجنة وعلاجها
- الحفاظ على Tg (vtg1:mCherry) حمار وحشي في 25.5 ± 0.5 درجة مئوية، ودرجة الحرارة = 7 ± 0.2، التوصيلية بين 525 ± 50 μS / م، ومستوى الأكسجين ≥ 80٪ من التشبع، و 14 ساعة ضوء و 10 ساعة دورة داكنة.
- ملء خزانات التزاوج مع المياه النظام وإعداد الأسماك للتزاوج بعد الظهر قبل حصاد البيض.
- وضع الأسماك الذكور والإناث في الخزان وفصلها بمساعدة من مقسم.
- إزالة المقسم من الدبابات كما يتحول الضوء في صباح اليوم التالي. تحقق من خزانات التزاوج للبيض كل 15-20 دقيقة.
- حصاد جميع الأجنة باستخدام مصفاة الشاي أو شبكة غرامة المنسوجة بكثافة والجمع بينها وبين طبق بيتري كبير واحد مع E3 العازلة (5 mM كلوريد الصوديوم، 0.17 mM كلوريد البوتاسيوم، 0.33 mM كلوريد الكالسيوم، 0.33 mM سلفات المغنيسيوم) أو المياه نظام واضح.
- ضع الأجنة في الحاضنة التي تم تعيينها إلى 25.5 ± 0.5 درجة مئوية.
- بعد 1-1.5 ساعة، وإزالة وتجاهل البيض غير المخصب أو تقسيم غير كاف مع أنبوب نقل البلاستيك تحت مجهر تشريح.
ملاحظة: البيض غير المخصبة غير شفاف; البيض المخصب شفاف. لبدء العلاج في مرحلة لاحقة من التطور ، انتبه إلى التطور الطبيعي للأفراد الذين يتم علاجهم. - ضع الأجنة المختارة في أوعية العلاج (على سبيل المثال، في أطباق بيتري أو لوحات زراعة الأنسجة) التي تم تصنيفها بالفعل وملئها بتركيزات مختلفة من مادة الاختبار.
- احتضان الأجنة في 25.5 ± 0.5 درجة مئوية حتى نهاية التجربة.
ملاحظة: يمكن أن تتفاعل الأجنة مع حساسية فردية كبيرة لمختلف مركبات استروجين، لذلك فمن المستحسن استخدام ما لا يقل عن 15 جنينا في ما لا يقل عن ثلاثة علاجات تكرار من أجل تقييم التجربة بشكل صحيح. عند اختيار الحاوية، نضع في اعتبارنا أن تطوير الجنين يتطلب ما لا يقل عن 200 ميكرولتر من الماء26. في هذه التجربة تم احتضان الأجنة حتى 120 حصان في 25.5 ± 0.5 درجة مئوية. - تحديث حل الاختبار إذا كان هو neccesary للحفاظ على تركيز العلاج. كن حذرا عند تغيير حل الاختبار من أجل تجنب إتلاف الأجنة.
ملاحظة: من الممكن أيضًا التحقق من الوفيات أو الأعراض شبه الهتكية أثناء التجربة. وينبغي أن تظل التركيزات المستخدمة مستقرة قدر الإمكان للحصول على نتائج موثوقة. يمكن تحقيق هذا بسهولة عن طريق تحديث حلول الاختبار. قد تختلف وتيرة منعش اعتمادا على مادة الاختبار. ولذلك، فمن المستحسن للتحقق من تركيز المادة اختبار من خلال القياسات التحليلية لتحديد تواتر التحديثات الحل.
2. إعداد اليرقات للتصوير الفوتوغرافي
- إعداد 4٪ ميثيلسيللوز مع MS-222 (الترايكايين والميثان- سلفونات) مسبقا.
- للقيام بذلك، إضافة 4 ملغ/مل MS-222 إلى 100 مل مزدوجة الماء المقطر إلى تركيز النهائي من 0.168 ملغ / مل، وتقديم الحل إلى 4 درجة مئوية. ثم يضاف 4 غرام من ميثيل سيلولوز. اثارة مع مُحرك مغناطيسي، ثم اتركه في 4 °C بين عشية وضحاها.
- اليوم التالي، وتحريك مرة أخرى، والحل ينبغي أن تكون جاهزة للاستخدام. إذا لم يتم حل الميثيلسيللوز تماما وضعه مرة أخرى في 4 درجة مئوية وانتظر بضع ساعات أخرى.
- ضع يرقات قديمة لمدة 5 أيام في طبق بيتري 5 سم لكل مجموعة معالجة مع ماصة باستور.
- إزالة محلول العلاج من اليرقات مع ماصة بلاستيكية، ثم ملء طبق بيتري مع 2 مل من 0.02٪ MS-222 محلول مخدر.
ملاحظة: التخدير عادة ما يكون فعالا في أقل من دقيقة. يتم تخدير اليرقات إذا لم تسبح بعيدًا استجابة للمس. جرعة زائدة من MS-222 يمكن أن تقتل اليرقات. - ملء كل مربع من 10 سم مصممة خصيصا طبق بيتري مع 4٪ ميثيلسيلولوز مع MS-222 (الشكل 3).
ملاحظة: الغراء اثنين 1.5 × 1.5 سم مربع المناطق في الجزء السفلي من طبق بيتري باستخدام الأغطية البلاستيكية (1 مم ارتفاع, 5 مم واسعة). يمكن وضع عشرين يرقة بجانب بعضها البعض في مربع. بدلا من طبق بيتري مصممة خصيصا، يمكن استخدام حاوية أخرى حافة منخفضة لإصلاح موقف الأجنة.
الشكل 3: طبق بيتري 10 سم مع لصقها 1.5 × 1.5 سم، 1 مم سميكة مربعات ورقة بلاستيكية لإعداد اليرقات للتصوير الفوتوغرافي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- نقل اليرقات المُهدَّدَة إلى ميثيل سيلولوز مع القليل من الماء في أحد المربعين. من المربع الأول نقل اليرقات إلى المربع الثاني.
ملاحظة: بمساعدة هذا النقل، لن يتم تخفيف الميثيل سيللوز بنسبة 4٪ المستخدم في التصوير ولن يتم تدوير اليرقات أثناء التصوير. - في المربع الثاني، قم بتدوير وتوجيه اليرقات إلى جانبها الأيسر واضغط عليها بلطف إلى أسفل السليلوز مع طرف ماصات microloader مقطعة حتى 2 سم.
ملاحظة: لا تستخدم نصائح الماصات الأخرى لأنها تسبب إصابة اليرقات.
3. المجهر
ملاحظة: التصوير الفوتوغرافي لا يقتل الحيوانات. يمكن إيقاظ الحيوانات عن طريق إزالتها من ميثيسيلولوز ووضعها في المياه العذبة أو محلول المعالجة ، لذلك يمكن فحص نفس الشخص عدة مرات أثناء العلاج.
- من أجل تقييم إشارة المراسل المعبر عنها، تصور الأجنة بنفس المنظر والإعدادات.
ملاحظة: راجع الخطوة 2.6 للحصول على الموضع الجنين الأمثل. تم التقاط الصور الواردة في المخطوطة في ظل الظروف الموصوفة. حقل مشرق: 60x التكبير، 6 مللي ثانية المعرض، إيريس 100٪، كسب: 1.1، صور الفلوريسين: 60x التكبير، 300 مللي ثانية المعرض، إيريس: 100٪، كسب: 1، مرشح mCherry، مصدر الضوء الفلوري: الزئبق المعادن لمبة هاليد. لالتقاط الصور تم استخدام منظار مجسم الفلوري، وكاميرا مخصصة، وبرامج للمجهر. - ضع طبق بيتري على خشبة المجهر.
- التركيز على الكبد الجنين والتقاط صورة حقل مشرق باستخدام البرامج المرتبطة بها.
- قم بتبديل المجهر إلى مرشح mCherry وأخذ صورة فلورية للكبد تحت ضوء الفلورسنت باستخدام البرامج المرتبطة به.
ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات الفلورية في الظلام. لا تغير التكبير أو التركيز أو موضع الجنين بين التقاط الحقل الساطع والصور الفلورية ، لأن هذا سيساعد في تحليل الصور. - كرر الخطوتين 3.3 و3.4 حتى يتم تصوير جميع الأجنة في التجربة.
4- تحديد الكثافة المتكاملة
ملاحظة: أحد أفضل المؤشرات لمقارنة قوة الإشارة الفلورية هو قيمة الكثافة المتكاملة (أي، ناتج المنطقة ومتوسط القيمة الرمادية). واحدة من أسهل الطرق لتحديد الكثافة المتكاملة هو استخدام برنامج ImageJ27. البرنامج متاح على شبكة الانترنت ويمكن تثبيته على الكمبيوتر.
- افتح ImageJ ثم قم بتحميل صورة الفلورسنت ليتم تحليلها إما بسحب الصورة وإسقاطها أو النقر على ملف| مفتوح.
- انقر على صورة | اللون| تقسيم القنوات لتقسيم الصورة التي أدلى بها مرشح الفلورسنت وفقا ل RGB لون الرسم البياني.
- العمل مع طيف صورة القناة الحمراء، وإغلاق القنوات الأخرى.
- تعيين منطقة بيضاوية الحجم مماثلة الحجم في الصورة حتى إشارات خاطئة لا تتداخل مع التقييم. باستخدام الأدوات البيضاوية، رسم القطع الناقص على منطقة الكبد أبرز بأكبر قدر ممكن من الدقة.
- إذا كانت الإشارة ضعيفة استخدام الصور المجهرية الخفيفة (أي، زوج حقل مشرق من صورة الفلورسنت) لتحديد موقع الكبد.
- انقر على تحليل| قياس لتحديد قوة الإشارة وحجم المنطقة المتضررة. يتم حساب قيمة الكثافة المتكاملة تلقائيًا بواسطة البرنامج (عمود IntDen في المخطط).
- مواصلة التحليل من خلال تكرار الخطوات 4.1-4.6 حتى يتم تحليل جميع الصور الفلورية لجميع الأجنة في مجموعة العلاج.
- حفظ البيانات ثم قم بتحليل قيم الكثافة المتكاملة.
ملاحظة: دوماً تحديد نفس المساحة في الصور أثناء التحليل. يعتمد حجم المنطقة التي سيتم تحليلها على التكبير، دقة الصورة، الإعدادات الأخرى للتصوير، إلخ. يمكن تسريع التحليل أو جعله أكثر دقة باستخدام وحدات الماكرو الشخصية للتحليل. على سبيل المثال، يمكن استخدام وحدات الماكرو للتأكد من أن المساحة المحددة هي نفسها دائماً في الصور التي تم فحصها. تم العثور على أوصاف مفصلة لإنشاء وحدات ماكرو تسمح بأفضل تحليل للصور وفقًا لإعدادات صور معينة على موقع ImageJ على الويب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في التجربة المعروضة في هذه المخطوطة، تم اختبار آثار اثنين من المواد الإستروجينية في خمسة تركيزات بدءا من الإخصاب لمدة 5 أيام على Tg(vtg1:mCherry) أجنة حمار وحشي. لقد قمنا بالتحقيق فيما إذا كانت الإشارات الفلورية قد ظهرت في كبد الأسماك بحلول نهاية وقت التعرض بسبب المواد وما إذا كانت هناك اختلافات في إستروجين المواد. وقد تم تقييم النتائج على أساس الصور الفلورية وقيم الكثافة المتكاملة. وبصفة عامة، فإن كلا من المواد المستحثة التعبير عن transgene بنهاية وقت التعرض في تلك التركيزات الاختبارية التي نجا فيها الأفراد. وفي حالات الأسماك غير المعالجة، لم تكن هناك إشارة فلورية مرئية.
في حالة α-ZOL، في أعلى تركيز اختبار (8 ميكرومتر) مات جميع الأفراد، لذلك في هذه الحالة لا يمكن فحص إشارة الفلورسنت. في تركيزات أقل (0.5 ميكرومتر - 4 ميكرومتر)، لوحظت إشارة فلورية قوية في كبد الأجنة(الشكل 4A). ولم يلاحظ أي فرق كبير في شدة الفلورسنت وحجم المناطق الفلورية (p < 0.05). قيم الكثافة المتكاملة α-ZOL(الشكل 4C)،تبين أن المادة تسبب ظهور إشارة فلورية. لم يتم العثور على فرق كبير بين قيم الكثافة المتكاملة وبين العلاجات (p < 0.05). وتراوح متوسط الكثافة المتكاملة بين 31.26 ± 13.95 (0.5 ميكرومتر) و34.25 ± 15.36 (4 ميكرومتر).
لم يتم توثيق أي وفيات أثناء العلاج مع β-ZOL، و المادة الناجمة عن نشاط transgene في جميع تركيزات العلاج. وقد زادت شدة الفلوريسنس وحجم منطقة الفلورسنت مع زيادة التركيز، كما هو اُرى في الصور الفلورية(الشكل 4B). وبمقارنة الصور الفلورية لـ α و β-زول بصريا، كانت قوة الإشارة وحجم منطقة الفلورسنت أضعف بشكل واضح بالنسبة لـ β-ZOL في نفس تركيزات المعالجة للمادتين. دراسة القيم المتكاملة لل β-ZOL(الشكل 4D)،متوسط قيمة الكثافة المتكاملة تضاعفت تقريبا بين أدنى وأعلى تركيزات العلاج. ومع ذلك، في حالة β-ZOL لم يكن هناك فرق كبير بين قيم الكثافة المتكاملة للتركيزات الفردية (p < 0.05). وتراوح متوسط الكثافة المتكاملة بين 15.86 ± 4.08 (0.5 ميكرومتر) و21.73 ± 5.94 (8 ميكرومتر).
الشكل 4: عرض قيم الكثافة المتكاملة المستمدة من شدة الإشارات الفلورية في الكبد ومن حجم المنطقة المصابة الناجمة عن علاج ألفا و بيتا زيارالينول على 5 أيام Tg (vtg1:mCherry) أجنة حمار وحشي متحولة وراثيا. في التجربة، تم التعامل مع الأجنة الحساسة للاستروجين من خط الحمار الوحشي العلامة الحيوية (20 يرقة لكل مجموعات في ثلاث نسخ متماثلة في كل تركيز العلاج) مع تركيزات 0.5 μM-8 μM من α- و β-ZOL من الإخصاب فصاعدا لمدة 5 أيام. صور من كبد السمك لα-ZOL (A)،وβ-ZOL (B) تظهر بوضوح أن المواد التي تسبب ظهور إشارة الفلورسنت. يتم عرض بيانات الكثافة المتكاملة على أنها متوسط ± الانحراف المعياري (SD = شريط خطأ). تم تحليل البيانات مع Grubbs تكراري لتحديد القيم المتطرفة ، والتي تم استبعادها. وتم التحقق من البيانات لمعرفة مدى اتّضحها في الوضع الطبيعي مع اختبار "شابيرو - ويلك" للأوضاع الطبيعية، وتمّ وضع الامتثال لمتطلبات الطرائق البارامترية. وأجريت التحليلات الإحصائية باستخدام ANOVA في اتجاه واحد يتبع اختبار دونيت. دراسة قيم الكثافة المتكاملة، لم يتم العثور على فرق كبير بين العلاجات في حالات α-ZOL (C) و β-ZOL (D) (p < 0.05). شريط مقياس = 200 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
من خلال فحص قيم الكثافة المتكاملة التي تم الحصول عليها من نفس تركيزات المعالجة للمادتين(الشكل 5)، قدمت α-ZOL متوسطات كثافة متكاملة أعلى في كل حالة بالنسبة لـ β-ZOL ، وهو ما يتسق مع الاختلافات بين نقاط قوة الإشارة الملاحظة في الصور الفلورية. وفي حالات جميع تركيزات العلاج، وجدت فروق كبيرة (0.5 ميكرومتر، p = 0.0011؛ 1 ميكرومتر، p = 0.0003؛ 2 ميكرومتر، p = 0.0329؛ و4 ميكرومتر، p = 0.0325).
الشكل 5: مقارنة قيم الكثافة المتكاملة α و β-zearalenol. يتم عرض بيانات الكثافة المتكاملة على أنها متوسط ± الانحراف المعياري SD = شريط الأخطاء. تم تحليل البيانات مع Grubbs تكرارية لتحديد القيم المتطرفة ، والتي تم استبعادها. وتم التحقق من البيانات لمعرفة مدى اتّضحها في الوضع الطبيعي مع اختبار "شابيرو - ويلك" للأوضاع الطبيعية، وتمّ وضع الامتثال لمتطلبات الطرائق البارامترية. تم التحقق من الفروق الكبيرة مع اختبار t-m غير مُزوج بين α-ZOL و β-ZOL في حالة كل تركيز (0.5 ميكرومتر، p = 0.0011؛ 1 ميكرومتر، p = 0.0003؛ 2 ميكرومتر، p = 0.0329؛ و 4 ميكرومتر، p = 0.0325). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد انتشر استخدام العوامل الحيوية/التحلل الحيوي لآثار الإستروجين في الدراسات السمية. في نماذج الجسم الحي تلعب دورا بارزا، لأنه على عكس الاختبارات في المختبر، فإنها لا توفر فقط معلومات حول استجابة خلية أو مستقبلات، ولكن أيضا السماح للتحقيق في العمليات المعقدة في الكائن الحي. وقد تم إنتاج عدة خطوط معدلة وراثيا لدراسة الآثار الإستروجين من حمار وحشي، واحدة منها Tg (vtg1:mCherry) استخدمت لهذه الدراسات. الطريقة المذكورة هنا يوضح بروتوكول لاختبار أجنة هذا الخط من أجل الكشف عن نشاط هرمون الاستروجين في الجسم الحي في نقية، والمكونات النشطة.
الذكور والأجنة من الخط هي أيضا مناسبة للكشف عن آثار استروجين، ولكن الأجنة لديها العديد من المزايا التي تعزز من استخدامها. على وجه الخصوص، الجسم شفاف، لذلك يمكن بسهولة أن تكون لاحظت إشارة الفلورسنت في الكبد. يبدأ كبد سمك الحمار الوحشي في التطور بعد 6 ساعات من الإخصاب (6 حصان) ويبدأ العمل بعد 50 ساعة (50 حصان). أولاً، يتم تشكيل الفص الأيسر للكبد، وفي 96 ساعة (96 حصان) يظهر الفص الأيمن للكبد أيضاً. يتم تطوير الشكل النهائي للكبد من قبل حوالي اليوم 5 (120 حصان)28,29. الكبد قادر على إنتاج فيتيلوجينين الذاتية من سن 2-3 أيام من الجنين14, الذي يتزامن مع ظهور إشارة الفلورسنت في Tg(vtg1:mCherry) خط15. لذلك، عند تصميم التجارب، ينبغي أن يؤخذ في الاعتبار أن إشارة الفلورسنت لا يمكن إلا أن يتوقع في كبد الجنين من ذلك الوقت. إن كبد الأجنة القديمة التي تبلغ مدتها 5 أيام محدد بالفعل في منطقة كبيرة نسبياً، حيث يمكن اكتشاف إشارة الفلورسنت بسهولة تحت منظار مجسم. وهذا يجعل وضع بروتوكولات الاختبار التي لا تخضع لقوانين حماية الحيوان ممكنا. يتم إنتاج فيتيلوجينين ، وبالمثل البروتين الفلورسنت ، من قبل الفص الأيسر من كبد الأجنة15. لذلك، فإن التوجه المكاني للأجنة مهم للكشف عن أقوى إشارة عند فحص الإشارة الفلورية أو التقاط الصور. هذا هو السبب في وضع الأجنة على اليسار في البروتوكول. كما يمكن أن نرى من النتائج التمثيلية، يشار بوضوح إلى تأثير إستروجين عينة اختبار من قبل إشارة الفلورسنت في الكبد، لذلك يمكن تقييم النتائج بصريا جدا. إذا كان هناك حاجة إلى تحديد كمي للنتائج، فإن قيمة الكثافة المتكاملة التي يحددها برنامج ImageJ مناسبة. ومع ذلك، من أجل التقييم السليم، لا بد من التقاط الصور بنفس الإعدادات أثناء التجربة، وأن يكون حجم المناطق الفلورية البارزة هو نفسه في كل صورة. جنبا إلى جنب مع تحديد المواقع الدقيقة للأجنة، وهذه هي الخطوات الأكثر أهمية في البروتوكول. من المهم أن نذكر أنه في حالة الأجنة التعبير عن transgene ، على غرار إنتاج فيتيلوجينين الذاتية ، يظهر تشتت كبير واختلافات في الحساسية الفردية. في بعض الحالات، يمكن أن يسبب هذا اختلافات كبيرة في النتائج، والتي ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند تصميم التجارب.
جانب مهم في تحديد تركيزات العلاج هو أن خلايا الأجنة، وبالتالي خلايا الكبد، يمكن أن تتضرر من تركيزات عالية من المواد شديدة السمية، والتي يمكن أن تؤدي إلى انخفاض في تحريض فيتيلوجينين. ولذلك، ينبغي إجراء الاختبارات بتركيزات أقل منLC 15 10.15
مقارنة حساسية من خطوط الأسماك الحساسة للاستروجين لبعضها البعض مهمة صعبة، لأن الخطوط الموصوفة حتى الآن قد تم اختبار وفقا لبروتوكولات مختلفة5،14،15،16. خط اختبارها في هذا البروتوكول قادر على الكشف عن العلاقة الجرعة تأثير في حالات المكونات النشطة النقية، يمزج، والعينات البيئية، والنتائج التي تم الحصول عليها ترتبط بشكل جيد مع النتائج مع اختبارات BLYES وخلايا هيلا15،20.
وقد ثبت فائدة أجنة الخط لاختبار وكلاء، بما في ذلك zearalenone15. في هذا العمل، تم اختبار اثنين من الأيض من السم، α- وβ-zearalenol. وفقا لبيانات الأدب، α-ZOL هو أكثر سمية من β-زول30 وهرمون الاستروجين أيضا أعلى31. هذه النتائج تؤكدها دراساتنا. وهكذا، والدراسات على أجنة الخط هي أيضا مناسبة لمقارنة الآثار الإستروجين من المواد الاستروجينية الأخرى.
Mycotoxin التلوث في السلسلة الغذائية مشكلة عالمية ، لذلك تم تحسين العديد من الإجراءات للحد من مستويات السموم الفطرية في الأعلاف الحيوانية والغذاء البشري25،32. واحدة من أكثر الحلول الواعدة هو التحلل البيولوجي mycotoxin عن طريق الكائنات الحية الدقيقة أو عن طريق الإنزيمات الخاصة بهم. قد يكون طريقة ما بعد هارفست أساسية لتقليل أو القضاء على إزالة التلوث من مادة السموم الفطرية. وقد تم اختبار القدرة ZEA المهينة من العديد من السلالات البكتيرية في الأدب حتى الآن، ومع ذلك، نتائج البحوث الحديثة التي تثبت ارتفاع تدهور السم نادرا ما تحدد التأثير السلبيللاستقلابات 33. لأن أجنة هذا الخط هي مناسبة نظريا لاختبار الآثار إستروجين من العينات مع محتوى المواد العضوية15، يمكن تطوير بروتوكول العلاج التي يمكن أن تساعد في اختبار منتجات التحلل الحيوي من ZEA وتأهيل السلالات المهينة.
ويمكن تغيير هذا البروتوكول بطرق عديدة وفقاً لنقاط نهاية الاختبار المخطط لها (مثل التعرض للتعرض للتعرض وطوله) وللعيّنات (مثل الخلائط أو العينات البيئية) التي سيتم اختبارها ويمكن استكمالها بأساليب اختبار أخرى (مثل الأساليب الجزيئية). وهكذا، نأمل أن استخدام خط Tg(vtg1:mCherry) سوف تصبح نموذجا لاختبارات استروجين وأساليب الاختبار القياسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل المكتب الوطني للبحث والتطوير والابتكار التابع للصندوق الوطني للبحث والتطوير والابتكار؛ اتفاقية المنحة: NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 مشروع مشترك من قبل الاتحاد الأوروبي، وبرنامج التميز المواضيعي NKFIH-831-10/2019 من جامعة Szent István، الذي منحته وزارة الابتكار والتكنولوجيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jet Biofil | TCP011024 | |
| Calcium-chloride (CaCl2) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 16383-0-27-39 | |
| GraphPad Prism 6.01 software | GraphPad Software Inc. | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health, USA | Public access software, downloadable from: http://imagej.nih.gov/ | |
| Leica Application Suite X calibrated software | Leica Microsystems GmbH. | We used the softver described in the experiments, but any photographic software complies with the tests | |
| Leica M205 FA stereomicroscope, Leica DFC 7000T camera | Leica Microsystems GmbH. | We used the equipments described in the experiments, but any fluorescent stereomicroscope is suitable for the tests | |
| Magnesium-sulphate (MgSO4) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 20342-0-27-38 | |
| mCherry filter | Leica Microsystems GmbH. | ||
| Mehyl-cellulose | Sigma Aldrich Ltd. | 274429 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf GmbH. | 5242956003 | |
| Pasteur pipette | VWR International LLC. | 612-1684 | |
| Petri-dish | Jet Biofil | TCD000060 | |
| Potassium-chloride (KCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 18050-0-01-33 | |
| Sodium-chloride (NaCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 24640-0-01-38 | |
| Tricane-methanesulfonate (MS-222) | Sigma Aldrich Ltd. | E10521 |
References
- Sumpter, J. P. Endocrine Disrupters in the Aquatic Environment : An Overview. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica. 33 (1), 9-16 (2005).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environmental Toxicology and Chemistry. 15 (3), 241-248 (1996).
- Sanseverino, J., et al. Use of Saccharomyces cerevisiae BLYES Expressing Bacterial Bioluminescence for Rapid, Sensitive Detection of Estrogenic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 71 (8), 4455-4460 (2008).
- Fetter, E., et al. Effect-directed analysis for estrogenic compounds in a fluvial sediment sample using transgenic cyp19a1b-GFP zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 154, 221-229 (2014).
- Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of estrogen receptor transcriptional activation in zebrafish. Endocrinology. 152 (7), 2690-2703 (2011).
- Rider, C. V., Hartig, P. C., Cardon, M. C., Wilson, V. S. Development of a competitive binding assay system with recombinant estrogen receptors from multiple species. Toxicology Letters. 184 (2), 85-89 (2009).
- Gunnarsson, L., Kristiansson, E., Förlin, L., Nerman, O., Larsson, J. Sensitive and robust gene expression changes in fish exposed to estrogen - a microarray approach. BMC Genomics. 8 (149), 1-9 (2007).
- Vander Ven, L. T. M., et al. Vitellogenin expression in zebrafish Danio rerio evaluation by histochemistry, immunohistochemistry, and in situ mRNA hybridisation. Aquatic Toxicology. 65 (1), 1-11 (2003).
- Bakos, K., et al. Developmental toxicity and estrogenic potency of zearalenone in zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 136-137, 13-21 (2013).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments - A commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Tsang, M. Zebrafish : A Tool for Chemical Screens. Birth Defects Research, Part C. 90 (3), 185-192 (2010).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Lee, C., Na, J. G., Lee, K., Park, K. Choriogenin mRNA induction in male medaka, Oryzias latipes as a biomarker of endocrine disruption. Aquatic Toxicology. 61 (3-4), 233-241 (2002).
- Chen, H., et al. Generation of a fluorescent transgenic zebrafish for detection of environmental estrogens. Aquatic Toxicology. 96 (1), 53-61 (2010).
- Bakos, K., et al. Estrogen sensitive liver transgenic zebrafish (Danio rerio) line (Tg(vtg1:mCherry)) suitable for the direct detection of estrogenicity in environmental samples. Aquatic Toxicology. 208, 157-167 (2019).
- Abdelmoneim, A., Clark, C., Mukai, M. Fluorescent reporter zebrafish line for estrogenic compound screening generated using a CRISPR/Cas9-mediated knock-in system. Toxicological Sciences. 173 (2), 336-346 (2019).
- Tong, S. K., et al. A cyp19a1b-GFP (aromatase B) transgenic zebrafish line that expresses GFP in radial glial cells. Genesis. 47 (2), 67-73 (2009).
- Segner, H. Zebrafish (Danio rerio) as a model organism for investigating endocrine disruption. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C: Toxicology and Pharmacology. 149 (2), 187-195 (2009).
- Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Res. 29 (14), 2905-2919 (2001).
- Faisal, Z., et al. Protective effects of beta-cyclodextrins vs. zearalenone-induced toxicity in HeLa cells and Tg(vtg1:mCherry) zebrafish embryos. Chemosphere. 240, 1-11 (2020).
- Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in U.S. streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environmental Science and Technology. 36 (6), 1202-1211 (2002).
- Kuch, H. M., Ballschmiter, K. Determination of endocrine-disrupting phenolic compounds and estrogens in surface and drinking water by HRGC-(NCI)-MS in the picogram per liter range. Environmental Science and Technology. 35 (15), 3201-3206 (2001).
- Lundgren, M. S., Novak, P. J. Quantification of phytoestrogens in industrial waste streams. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (11), 2318-2323 (2009).
- Masoner, J. R., Kolpin, D. W., Furlong, E. T., Cozzarelli, I. M., Gray, J. L. Landfill leachate as a mirror of today’s disposable society: Pharmaceuticals and other contaminants of emerging concern in final leachate from landfills in the conterminous United States. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (4), 906-918 (2016).
- Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDA). EFSA Statement on the establishment of guidelines for the assessment of additives from the functional group ‘substances for reduction of the contamination of feed by mycotoxins' 1 EFSA. EFSA Journal. 8 (7), 1-8 (2010).
- Braunbeck, T., et al. Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: the fish embryo toxicity test goes multi-species - an update. Altex. 22 (50), 87-102 (2005).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ober, E. A., Field, H. A., Stainier, D. Y. R. From endoderm formation to liver and pancreas development in zebrafish. Mechanisms of Development. 120 (1), 5-18 (2003).
- Tao, T., Peng, J. Liver development in zebrafish (Danio rerio). Journal of Genetics and Genomics. 36 (6), 325-334 (2009).
- Shier, W. T., Shier, A. C., Xie, W., Mirocha, C. J. Structure-activity relationships for human estrogenic activity in zearalenone mycotoxins. Toxicon. 39 (9), 1435-1438 (2001).
- Panel, E., Chain, F. Appropriateness to set a group health-based guidance value for zearalenone and its modified forms EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). EFSA Journal. 14, 4425 (2016).
- Binder, E. M. Managing the risk of mycotoxins in modern feed production. Animal Feed Science and Technology. 133 (1-2), 149-166 (2007).
- Risa, A., Krifaton, C., Kukolya, J., Kriszt, B., Cserháti, M., Táncsics, A. Aflatoxin B1 and Zearalenone-Detoxifying Profile of Rhodococcus Type Strains. Current Microbiology. 75 (7), 907-917 (2018).
