Summary
Til stede her er en detaljert protokoll for bruk av sebrafisk embryoer Tg (vtg1: mCherry) for påvisning av estrogenic effekter. Protokollen dekker forplantning av fisk og behandling av embryoer, og understreker deteksjon, dokumentasjon og evaluering av fluorescerende signaler indusert av endokrine forstyrreforbindelser (EDC).
Abstract
Det er mange endokrine forstyrreforbindelser (EDC) i miljøet, spesielt estrogenic stoffer. Påvisning av disse stoffene er vanskelig på grunn av deres kjemiske mangfold; Derfor brukes stadig mer effektoppdagende metoder, for eksempel estrogenic effektfølsomme biomonitor / bioindicator organismer. Disse biomonitoring organismer inkluderer flere fiskemodeller. Denne protokollen dekker bruk av sebrafisk Tg(vtg1: mCherry) transgene linje som en biomonitoring organisme, inkludert forplantning av fisk og behandling av embryoer, med vekt på påvisning, dokumentasjon, og evaluering av fluorescerende signaler indusert av EDC. Målet med arbeidet er demonstrasjon av bruk av Tg(vtg1: mCherry) transgene linje embryoer for å oppdage estrogenic effekter. Dette arbeidet dokumenterer bruk av transgene sebrafisk embryoer Tg (vtg1: mCherry) for påvisning av estrogenic effekter ved å teste to estrogenic stoffer, α- og β-zearalenol. Den beskrevne protokollen er bare et grunnlag for å designe analyser; testmetoden kan varieres i henhold til testendepunktene og prøvene. Videre kan den kombineres med andre analysemetoder, og dermed lette fremtidig bruk av den transgene linjen.
Introduction
Det er et betydelig antall endokrine forstyrrende forbindelser (EDC) som er blant de farligste stoffene i vårt miljø. Dette er hovedsakelig estrogenic forbindelser som forurenser vann fra naturressurser. Det kjemiske mangfoldet av stoffene som tilhører gruppen gjør testing for deres tilstedeværelse vanskelig, da forskjellige analytiske metoder er nødvendig for deres deteksjon. Basert på deres kjemiske struktur er det svært vanskelig å avgjøre om et stoff faktisk er i stand til å fungere som et østrogen. I tillegg er disse stoffene aldri tilstede i ren form i miljøet, så deres effekter kan påvirkes av andre forbindelser, for1. Dette problemet kan løses ved effektdetekterende metoder, for eksempel bruk av biomonitor / bioindicator organismer som viser estrogenic effekter2,3,4,5.
Nylig, en rekke celle linje6 og gjær-baserte testsystemer2,3 har blitt utviklet for å oppdage estrogenic effekter. Disse er imidlertid vanligvis bare i stand til å oppdage bindingen av stoffet til østrogenreseptoren2,3. I tillegg er de ikke i stand til å modellere komplekse fysiologiske prosesser i organismen, eller for å oppdage hormonfølsomme faser av livsstadier; dermed fører de ofte til falske resultater.
Det er kjent at visse gener reagerer følsomt på østrogen i levende organismer7. Påvisning av genprodukter ved molekylærbiologi metoder er også mulig på protein eller mRNA nivå8,9, men vanligvis innebærer dyr offer. Dyrevernslover har blitt strengere, og det er en økende etterspørsel etter alternative testsystemer som minimerer antall og lidelser av dyr som brukes i eksperimenter eller utskifting av dyremodellen med et annet modellsystem10. Med oppdagelsen av fluorescerende proteiner og etableringen av biomarkørlinjer, gir transgene teknologier et godt alternativ11. Med disse linjene kan aktiveringen av et østrogenfølsomt gen testes in vivo.
Blant virveldyr er potensialet for fisk i miljørisikovurdering enestående. De tilbyr mange fordeler fremfor pattedyrmodeller: å være vannlevende organismer, de er i stand til å absorbere forurensende stoffer gjennom hele kroppen, produsere et stort antall avkom, og noen av deres arter er preget av kort generasjonstid. Deres endokrine system og fysiologiske prosesser viser store likheter med andre virveldyr og selv med pattedyr, inkludert mennesker12.
Flere gener for påvisning av estrogenic effekter i fisk er også kjent. Det viktigste er østrogen reseptorer aromatase-b, choriogenin-H, og vitellogenin (vtg)7,13. Nylig har flere østrogenproduserende biosensorlinjer også blitt opprettet fra fiskemodeller som brukes i laboratoriet, for eksempel fra sebrafisk (Danio rerio)4,5,14,15,16,17. Den største fordelen med sebrafisk i å skape biosensorlinjer er den gjennomsiktige kroppen til embryoer og larver, fordi det fluorescerende reportersignalet deretter lett kan studeres in vivo uten å ofre dyret10. I tillegg til dyrevern er det også en verdifull funksjon som det gjør det mulig å studere reaksjonen til samme person på forskjellige tider av behandlingen18.
Disse eksperimentene bruker en vitellogenin reporter transgen sebrafisk linje15. Transgene konstruksjonen som brukes til utvikling av Tg(vtg1:mCherry) har en lang (3,4 kbp) naturlig vitellogenin-1 arrangør. Østrogen reseptor (ER) er en enhancer protein aktivert av ligander som er en representant for steroid/kjernefysisk reseptor superfamilie. ER binder seg til spesifikke DNA-sekvenser kalt østrogenresponselementer (ERE) med høy affinitet og transaktiverer genuttrykk som svar på østradiol og andre estrogenic stoffer, slik at jo mer ERE i arrangøren forårsaker en sterkere respons19. Det er 17 ERE nettsteder i arrangørregionen av Tg (vtg1:mCherry) transgene konstruere og de forventes å etterligne uttrykket av den innfødte vtg genet15. Det er et kontinuerlig uttrykk for det fluorescerende signalet hos seksuelt modnede kvinner. Men hos menn og embryo er uttrykket i leveren bare synlig ved behandling med estrogenic stoffer (figur 1).
Figur 1: Rødt fluorescerende signal i leveren av vtg1:mCherry transgene voksne sebrafisk og 5 dpf embryoer, etter 17-ß-østradiol (E2) induksjon. Hos kvinner og hos hann behandlet med E2 (25 μg/l eksponeringstid:48 timer) er sterk fluorescens i leveren synlig selv gjennom den pigmenterte huden. Ingen fluorescerende signal er synlig hos ubehandlet mann (A). Etter E2 induksjon (50 μg/l eksponeringstid: 0-120 hkf), kan et rødt fluorescerende signal i leveren på 5 dpf embryoer også observeres, noe som ikke er synlig i kontrollembryoer (B). Mens fluorescerende signalet er kontinuerlig til stede hos voksne kvinner, er primært menn og embryoer i linjen egnet for å oppdage estrogenic effekter. (BF: bright field, mCherry: rød fluorescerende filtervisning, enkle slettebilder, Skala bar A: 5mm, skala bar B: 250 μm) Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
I likhet med den endogene vitellogenin, er mCherry reporter bare uttrykt i leveren. Fordi vitellogenin bare produseres i nærvær av østrogen, er det ingen fluorescerende signal i kontrollene. Fordi uttrykket er bare i leveren, er evalueringen av resultatene mye enklere15.
Følsomheten og brukervennligheten til denne linjens embryoer har blitt undersøkt på ulike estrogenic sammensatte blandinger og også på miljøprøver15,,20, og i de fleste tilfeller dose-respons relasjoner ble dokumentert (Figur 2). Men i tilfelle av svært giftig, hovedsakelig hepatotoksisk, stoffer (f.eks zearalenone), bare et svært svakt fluorescerende signal kan være synlig i leveren av behandlede embryoer og maksimal intensitet fluorescerende signal forårsaket kan nås innenfor et svært lite konsentrasjonsområde, noe som gjør det vanskelig å etablere dose-effekt relasjoner20.
Figur 2: Doseresponsdiagram (A) og fluorescerende bilder (mCherry) i leveren (B) eksponert for 17-α-ethynilestradiol (EE2), i 5 dpf vtg1:mCherry larver. Resultatene uttrykkes som integrert tetthet generert fra signalstyrken og størrelsen på det berørte området (±SEM, n = 60). 100 % refererer til det observerte maksimumet. Fluorescerende signalintensitet økte gradvis med konsentrasjon. Skala bar = 250 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Det er flere estrogenic stoffer tilstede i miljøet, som 17-β-østradiol (miljøkonsentrasjon: 0,1–5,1 ng/l)21,17-α-ethynylestradiol (miljøkonsentrasjon: 0,16–0,2 μg/L)22, zearalenone (miljøkonsentrasjon: 0.095–0.22 μg/L)23, bisfenol-A (miljøkonsentrasjon: 0.45–17.2 mg/L)24. Ved testing av disse stoffene i ren aktiv form ved hjelp av mCherry transgene embryoer var de laveste observerte effektkonsentrasjonene (LOEC) for fluorescerende tegndeteksjon 100 ng/l for 17-ß-østradiol, 1 ng/l for 17-α-ethynilestradiol, 100 ng/l for zearalenon, og 1 mg/l for bisfenol-A (96–120 hpf behandling), som er svært nær eller innenfor rekkevidden av miljøkonsentrasjoner av stoffene15. Tg(vtg1:mCherry) transgene linjen kan bidra til å oppdage estrogenicity i avløpsvannprøver etter direkte eksponering. Linjen er like følsom som den vanlige gjær østrogen test, bioluminiscent gjær østrogen (BLYES) analyse15. Ved hjelp av denne linjen har de beskyttende effektene av beta-cyklodekstrin mot zearalenon-indusert toksisitet blitt bekreftet ved hjelp av kjemiske blandinger20.
I en fersk rapport ble in vivo bruk av den transgene linjen demonstrert ved hjelp av to estrogenic zearalenone (ZEA) metabolitter, α- og β-zearalenol (α-ZOL og β-ZOL)25. Protokollen baseline er hensiktsmessig å studere estrogenic effekten av flere forbindelser eller miljøprøver på Tg (vtg1:mCherry) embryoer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreprotokollen ble godkjent i henhold til den ungarske dyrevelferdsloven, og alle studiene ble fullført før de behandlede personene ville ha nådd det frie fôringsstadiet.
1. Embryo høsting og behandling
- Vedlikehold Tg(vtg1:mCherry) sebrafisk ved 25,5 ± 0,5 °C, pH = 7 ± 0,2, konduktivitet mellom 525 ± 50 μS/m, oksygennivå ≥ 80 % av metning og 14 h lys og 10 h mørk syklus.
- Fyll parringstantene med systemvann og sett opp fisken for parring ettermiddagen før du høster egg.
- Plasser den mannlige og kvinnelige fisken i tanken og skill dem ved hjelp av en skillevegg.
- Fjern skilleveggen fra tankene når lyset slås på neste morgen. Kontroller parringstantene for egg hver 15.–20 min.
- Høst alle embryoer ved hjelp av en tesil eller tett vevd fint nett og kombiner dem i en stor petriskål med E3-buffer (5 mM natriumklorid, 0,17 mM kaliumklorid, 0,33 mM kalsiumklorid, 0,33 mM magnesiumsulfat) eller klart systemvann.
- Plasser embryoene i inkubatoren satt til 25,5 ± 0,5 °C.
- Etter 1–1,5 timer fjerner og kast unfertilized eller utilstrekkelig dele egg med en plastoverføringspipet under et disseksjonsmikroskop.
MERK: Unfertilized egg er ugjennomsiktige; befruktede egg er gjennomsiktige. For å starte behandlingen i et senere utviklingsstadium, vær oppmerksom på den normale utviklingen av individene som behandles. - Plasser de valgte embryoene i behandlingsfartøyene (f.eks. i petriskåler eller vevskulturplater) som allerede er merket og fylt med forskjellige konsentrasjoner av teststoffet.
- Inkuber embryoene ved 25,5 ± 0,5 °C til slutten av forsøket.
MERK: Embryoer kan reagere med betydelig individuell følsomhet for ulike estrogenic forbindelser, så det anbefales å bruke minst 15 embryoer i minst tre gjentatte behandlinger for å evaluere eksperimentet riktig. Når du velger beholderen, må du huske på at utviklingen av et embryo krever minst 200 μL vann26. I dette eksperimentet ble embryoene inkubert til 120 hkf ved 25,5 ± 0,5 °C. - Oppdater testløsningen hvis det er nødvendig å opprettholde behandlingskonsentrasjonen. Vær forsiktig når du endrer testløsningen for å unngå å skade embryoene.
MERK: Det er også mulig å undersøke dødelighet eller fordypne symptomer under forsøket. Konsentrasjonene som brukes bør forbli så stabile som mulig for å oppnå pålitelige resultater. Dette kan enkelt oppnås ved å oppdatere testløsningene. Hyppigheten av forfriskende kan variere avhengig av teststoffet. Derfor er det tilrådelig å kontrollere konsentrasjonen av teststoffet ved analytiske målinger for å bestemme hyppigheten av løsningsoppdateringene.
2. Larver forberedelse til fotografering
- Forbered 4% metylcellulose med MS-222 (trikain-metansulfonat) på forhånd.
- For å gjøre dette, tilsett 4 mg/ml MS-222 til 100 ml dobbelt destillert vann til en endelig konsentrasjon på 0,168 mg/ml, og ta løsningen til 4 °C. Tilsett deretter 4 g metylcellulose. Rør den med en magnetisk rører, og la den stå i 4 °C over natten.
- Neste dag, rør den igjen og løsningen skal være klar til bruk. Hvis metylcellulosen ikke er helt oppløst, sett den tilbake ved 4 °C og vent noen timer til.
- Plasser 5 dager gamle larver i en 5 cm Petriskål per behandlingsgruppe med en Pasteur pipette.
- Fjern behandlingsløsningen fra larver med en plastpipette, og fyll deretter petriskålen med 2 ml 0,02% MS-222 bedøvelsesløsning.
MERK: Anestesi er vanligvis effektiv på mindre enn et minutt. Larvene er bedøvet hvis de ikke svømmer bort som svar på berøring. En overdose av MS-222 kan drepe larver. - Fyll hver firkant av en spesialdesignet 10 cm petriskål med 4% metylcellulose med MS-222 (Figur 3).
MERK: Lim to 1,5 x 1,5 cm kvadratiske områder nederst på petriskålen ved hjelp av plastplater (1 mm høyde, 5 mm bred). Tjue larver kan plasseres ved siden av hverandre på en firkant. I stedet for en spesialdesignet petriskål, kan en annen lavkantbeholder brukes til å fikse embryoenes posisjon.
Figur 3: En 10 cm petriskål med limt 1,5 x 1,5 cm bred, 1 mm tykke plastark firkanter for larver forberedelse til fotografering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Overfør de bedøvede larver til metylcellulose med litt vann i en av de to rutene. Fra den første firkanten overføre larver til den andre firkanten.
MERK: Ved hjelp av denne overføringen vil 4% metylcellulose som brukes til fotografering ikke fortynnes, og larvene vil ikke rotere under bildebehandling. - På den andre firkanten roterer og orienterer larver til venstre side og trykk dem forsiktig ned til bunnen av cellulosen med en mikrolaster pipettespiss kuttet opp til 2 cm.
MERK: Ikke bruk andre pipettespisser fordi de forårsaker skade på larver.
3. Mikroskopi
MERK: Fotografering dreper ikke dyrene. Dyr kan vekkes ved å fjerne dem fra metylcellulosen og plassere dem i ferskvannsvann eller behandlingsløsning, slik at samme person kan undersøkes flere ganger under behandlingen.
- For å evaluere signalet fra den uttrykte reporteren, bilde embryoene med samme visning og innstillinger.
MERK: Se trinn 2.6 for optimal plassering av embryo. Bildene i manuskriptet ble tatt under de forholdene som er beskrevet. Lysfelt: 60x forstørrelse, 6 ms utstilling, Iris 100%, Gain:1.1, fluorescens bilder: 60x forstørrelse, 300 ms utstilling, Iris: 100%, Gain:1, mCherry filter, fluorescerende lyskilde: kvikksølv metallhalogen pære. For foto tar et fluorescerende stereomikroskop, dedikert kamera og programvare for mikroskop ble brukt. - Plasser petriskålen på mikroskopets stadium.
- Fokuser på embryoets lever og ta et lyst feltbilde ved hjelp av den tilknyttede programvaren.
- Bytt mikroskopet til mCherry-filteret og ta et fluorescerende bilde av leveren under fluorescerende lys ved hjelp av den tilknyttede programvaren.
MERK: Utfør alle fluorescenstrinnene i mørket. Ikke endre forstørrelsen, fokuset eller plasseringen av embryoet mellom å fange det lyse feltet og de fluorescerende bildene, da dette vil hjelpe til med analysen av bildene. - Gjenta trinn 3.3 og 3.4 til alle embryoene i eksperimentet er avbildet.
4. Fastsettelse av integrert tetthet
MERK: En av de beste indikatorene for å sammenligne fluorescerende signalstyrke er den integrerte tetthetsverdien (dvs. produktet av området og gjennomsnittlig grå verdi). En av de enkleste måtene å bestemme integrert tetthet er å bruke ImageJ-programmet27. Programmet er tilgjengelig på internett og kan installeres på datamaskinen.
- Åpne ImageJ og last deretter opp det fluorescerende bildet som skal analyseres ved å dra og slippe bildet eller klikke på Fil| Åpne.
- Klikk på Bilde| Farge| Split kanaler for å dele bildet laget av fluorescerende filter i henhold til RGB fargediagram.
- Arbeid med det røde kanalbildespekteret, lukk de andre kanalene.
- Angi et tilsvarende elliptisk område i bildet slik at falske signaler ikke forstyrrer evalueringen. Ved hjelp av ovale verktøy, tegn en ellipse over det uthevede leverområdet så nøyaktig som mulig.
- Hvis signalet er svakt, bruk lysmikroskopibilder (dvs. det lyse feltparet av det fluorescerende bildet) for å bestemme leverens plassering.
- Klikk på Analyser| Mål for å bestemme signalstyrken og størrelsen på det berørte området. Den integrerte tetthetsverdien beregnes automatisk av programvaren (IntDen-kolonnen i diagrammet).
- Fortsett analysen ved å gjenta trinn 4.1-4.6 til alle fluorescerende bilder av alle embryoer i behandlingsgruppen analyseres.
- Lagre dataene, og analyser deretter de integrerte tetthetsverdiene.
MERK: Velg alltid samme områdestørrelse i bildene under analysen. Størrelsen på området som skal analyseres, avhenger av forstørrelse, bildeoppløsning, andre innstillinger for opptak, etc. Analysen kan akselereres eller gjøres mer nøyaktig ved hjelp av personlige makroer for analyse. Makroer kan for eksempel brukes til å sikre at det valgte området alltid er det samme i de undersøkte bildene. Detaljerte beskrivelser for å lage makroer som tillater den beste bildeanalysen i henhold til bestemte bildeinnstillinger, finnes på ImageJ-nettstedet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I forsøket presentert i dette manuskriptet ble effekten av to estrogenic stoffer testet ved fem konsentrasjoner som starter ved befruktning i 5 dager på Tg (vtg1:mCherry) sebrafisk embryoer. Vi undersøkte om fluorescerende signaler dukket opp i leveren av fisk ved slutten av eksponeringstiden på grunn av stoffene og om det var forskjeller i estrogenicity av de to stoffene. Resultatene ble evaluert på grunnlag av fluorescerende bilder og integrerte tetthetsverdier. Generelt induserte begge stoffene uttrykket av transgenen ved slutten av eksponeringstiden ved de testkonsentrasjonene der individer overlevde. I tilfelle av ubehandlet kontrollfisk var det ikke synlige noe fluorescerende signal.
I tilfelle av α-ZOL, ved den høyeste testkonsentrasjonen (8 μM) døde alle individer, så i dette tilfellet kunne fluorescerende signalet ikke undersøkes. Ved lavere konsentrasjoner (0,5 μM–4 μM ble det observert et sterkt fluorescerende signal i embryoets lever (figur 4A). Ingen signifikant forskjell ble observert i fluorescensintensiteten og størrelsen på fluorescerende områder (p < 0,05). Α-ZOL integrerte tetthetsverdier (figur 4C), viser at stoffet induserte utseendet på et fluorescerende signal. Det ble ikke funnet signifikant forskjell mellom de integrerte tetthetsverdiene og mellom behandlinger (p < 0,05). Gjennomsnittlig integrert tetthet varierte mellom 31,26 ± 13,95 (0,5 μM) og 34,25 ± 15,36 (4 μM).
Ingen dødelighet ble dokumentert under behandlingen med β-ZOL, og stoffet indusert transgeneaktivitet ved alle behandlingskonsentrasjoner. Fluorescensintensiteten og størrelsen på fluorescerende området økte etter hvert som konsentrasjonen økte, som vist i de fluorescerende bildene (figur 4B). Sammenligning av fluorescerende bilder av α- og β-ZOL visuelt, både signalstyrken og størrelsen på fluorescerende området var synlig svakere for β-ZOL ved samme behandlingskonsentrasjoner av de to stoffene. Ved å studere de integrerte verdiene til β-ZOL (figur 4D),ble den gjennomsnittlige integrerte tetthetsverdien nesten doblet mellom de laveste og de høyeste behandlingskonsentrasjonene. I tilfelle β-ZOL var det imidlertid ingen signifikant forskjell mellom de integrerte tetthetsverdiene til de enkelte konsentrasjonene (p < 0,05). Gjennomsnittlig integrert tetthet varierte mellom 15,86 ± 4,08 (0,5 μM) og 21,73 ± 5,94 (8 μM).
Figur 4: Presentasjon av integrerte tetthetsverdier avledet fra intensiteten av fluorescerende signaler i leveren og fra størrelsen på det berørte området forårsaket av α- og β-zearalenolbehandling på 5 dagers gamle Tg (vtg1:mCherry) transgene sebrafiskembryoer. I forsøket ble østrogensensitive embryoer av biomarkør sebrafisklinjen (20 larver per grupper i tre replikere i hver behandlingskonsentrasjon) behandlet med 0,5 μM–8 μM konsentrasjoner av α- og β-ZOL fra befruktning og utover i 5 dager. Bilder av fiskelevene for α-ZOL (A) og β-ZOL (B) viser tydelig at stoffene induserte utseendet på fluorescerende signal. Integrerte tetthetsdata presenteres som gjennomsnitt ± standardavvik (SD = feillinje). Data ble analysert med iterative Grubbs' for å identifisere outliers, som ble utelukket. Data ble sjekket for normalitet med Shapiro-Wilk normalitetstest og overholdelse av kravene til parametriske metoder ble etablert. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av en enveis ANOVA fulgte en Dunnetts test. Ved å studere de integrerte tetthetsverdiene ble det ikke funnet signifikant forskjell mellom behandlingene i tilfellene av α-ZOL (C) og β-ZOL (D) (p < 0,05). Skala bar = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ved å undersøke de integrerte tetthetsverdiene hentet fra de samme behandlingskonsentrasjonene av de to stoffene (figur 5), presenterte α-ZOL høyere integrerte tetthetsgjennomsnitt i hvert tilfelle i forhold til β-ZOL, som er i samsvar med forskjellene mellom signalstyrker observert i de fluorescerende bildene. I tilfellene av alle behandlingskonsentrasjoner ble det funnet signifikante forskjeller (0,5 μM, p = 0,0011; 1 μM, p = 0,0003; 2 μM, p = 0,0329; og 4 μM, p = 0,0325).
Figur 5: Sammenligning av α- og β-zearalenol integrerte tetthetsverdier. Integrerte tetthetsdata presenteres som gjennomsnitt ± standardavvik SD = feillinje. Data ble analysert med iterative Grubbs ' for å identifisere outliers, som ble utelukket. Data ble sjekket for normalitet med Shapiro-Wilk normalitetstest og overholdelse av kravene til parametriske metoder ble etablert. Signifikante forskjeller ble verifisert med unpaired t-test mellom α-ZOL og β-ZOL i tilfelle av hver konsentrasjon (0,5 μM, p = 0,0011; 1 μM, p = 0,0003; 2 μM, p = 0,0329; og 4 μM, p = 0,0325). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruken av biomonitorer/bioindicatorer for estrogenic effekter har blitt spredt i toksikologiske studier. In vivo-modeller spiller en enestående rolle, fordi i motsetning til in vitro-tester, gir de ikke bare informasjon om responsen fra en celle eller en reseptor, men tillater også undersøkelse av komplekse prosesser i organismen. Flere transgene linjer for å studere estrogenic effekter har blitt produsert fra sebrafisk, hvorav Tg (vtg1:mCherry) ble brukt til disse studiene. Metoden som er beskrevet her illustrerer en protokoll for testing av embryoer av denne linjen for å oppdage østrogenaktivitet in vivo i rene, aktive ingredienser.
Menn og embryoer i linjen er også egnet for å oppdage estrogenic effekter, men embryoer har flere fordeler som fremmer deres brukervennlighet. Spesielt er kroppen gjennomsiktig, slik at det fluorescerende signalet i leveren lett kan observeres. Sebrafiskleveren begynner å utvikle seg 6 timer etter befruktning (6 hkf) og begynner å jobbe etter 50 timer (50 hkf). Først dannes venstre av leveren, og ved 96 timer (96 hkf) vises også den høyre i leveren. Den endelige formen på leveren er utviklet med rundt dag 5 (120 hpf)28,29. Leveren er i stand til å produsere endogene vitellogenin fra en alder av 2-3 dager av et embryo14, som sammenfaller med utseendet på fluorescerende signal i Tg (vtg1:mCherry) linje15. Derfor, når du utformer eksperimenter, bør det tas hensyn til at et fluorescerende signal bare kan forventes i embryoleveren fra den tiden. Leveren av de 5 dagers gamle embryoene er allerede godt definert i et relativt stort område, hvor det fluorescerende signalet lett kan oppdages under et stereomikroskop. Dette gjør utviklingen av testprotokoller som ikke er underlagt dyrevernslover mulig. Vitellogenin, og på samme måte fluorescerende protein, produseres av venstre lobe av embryoenes lever15. Derfor er embryoenes romlige orientering viktig for påvisning av det sterkeste signalet ved undersøkelse av fluorescerende signal eller ta bilder. Dette er grunnen til at embryoer ble lagt til venstre i protokollen. Som det fremgår av de representative resultatene, er estrogenic effekten av en testprøve tydelig indikert av fluorescerende signalet i leveren, slik at resultatene kan evalueres visuelt også. Hvis kvantifiseringen av resultatene er nødvendig, er den integrerte tetthetsverdien som er definert av ImageJ-programmet, passende. For riktig evaluering er det imidlertid uunnværlig at bilder tas med de samme innstillingene under eksperimentet, og at størrelsen på de uthevede fluorescerende områdene er den samme i hvert bilde. Sammen med nøyaktig posisjonering av embryoene, er dette de mest kritiske trinnene i protokollen. Det er viktig å nevne at i tilfelle av embryoer uttrykk for transgenen, på samme måte som produksjonen av endogene vitellogenin, viser en stor spredning og forskjeller i individuell følsomhet. I noen tilfeller kan dette føre til store variasjoner i resultatene, som bør tas i betraktning når du utformer eksperimentene.
Et viktig aspekt ved å bestemme behandlingskonsentrasjoner er at cellene i embryoene, og dermed levercellene, kan bli skadet av høye konsentrasjoner av svært giftige stoffer, noe som kan føre til en nedgang i vitellogeninininduksjon. Tester bør derfor utføres ved konsentrasjoner under LC1015.
Sammenligning av følsomheten til østrogenfølsomme fiskelinjer med hverandre er en vanskelig oppgave, fordi linjene som er beskrevet så langt, har blitt testet i henhold til forskjellige protokoller5,14,15,16. Linjen som er testet i denne protokollen er i stand til å oppdage doseeffektrelasjoner i tilfeller av rene aktive ingredienser, blandinger og miljøprøver, og de oppnådde resultatene korrelerte godt med resultater med BLYES-tester og HeLa-celler15,20.
Nytten av embryoene i linjen for å teste midler har blitt bevist, inkludert zearalenone15. I dette arbeidet ble to metabolitter av toksinet, α- og β-zearalenol, testet. Ifølge litteraturdata er α-ZOL mer giftig enn β-ZOL30 og østrogeniteten er også høyere31. Disse resultatene bekreftes av våre studier. Dermed er studier på embryoer i linjen også egnet for å sammenligne estrogenic effekten av andre estrogenic stoffer.
Mykotoksinforurensning i næringskjeden er et globalt problem, så flere prosedyrer er forbedret for å redusere mykotoksinnivåer i dyrefôr og menneskelig mat25,32. En av de mest lovende løsningene er mykotoksinbionedbrytning av mikroorganismer eller av deres enzymer. Det kan være en viktig postharvest metode for å redusere eller eliminere mycotoxin dekontaminering. ZEA nedverdigende evne til mange bakterielle stammer har blitt testet i litteraturen så langt, men nyere forskningsfunn som viser høy nedbrytning av toksinet sjelden spesifisere den negative effekten av metabolitter33. Fordi embryoene i denne linjen er teoretisk egnet til å teste estrogenic effekten av prøver med organisk materiale innhold15, en behandlingsprotokoll kan utvikles som kan bidra til å teste bionedbrytningsprodukter av ZEA og kvalifikasjonen av de nedverdigende stammer.
Denne protokollen kan endres på mange måter i henhold til de planlagte testendepunktene (f.eks. eksponeringsinnsett og lengde) og til prøvene (f.eks. blandinger eller miljøprøver) som skal testes og kan fullføres med andre testmetoder (f.eks. molekylære metoder). Dermed håper vi at bruken av Tg (vtg1:mCherry) linjen vil bli en modell av estrogenicity tester og for standard testing metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Research, Development and Innovation Office (NKFIH) fra National Research, Development and Innovation Fund (NKFIA); Grant Agreement: NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 prosjekt co-finansiert av EU, og Thematic Excellence Program NKFIH-831-10/2019 av Szent István University, tildelt av Ministry for Innovation and Technology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jet Biofil | TCP011024 | |
| Calcium-chloride (CaCl2) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 16383-0-27-39 | |
| GraphPad Prism 6.01 software | GraphPad Software Inc. | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health, USA | Public access software, downloadable from: http://imagej.nih.gov/ | |
| Leica Application Suite X calibrated software | Leica Microsystems GmbH. | We used the softver described in the experiments, but any photographic software complies with the tests | |
| Leica M205 FA stereomicroscope, Leica DFC 7000T camera | Leica Microsystems GmbH. | We used the equipments described in the experiments, but any fluorescent stereomicroscope is suitable for the tests | |
| Magnesium-sulphate (MgSO4) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 20342-0-27-38 | |
| mCherry filter | Leica Microsystems GmbH. | ||
| Mehyl-cellulose | Sigma Aldrich Ltd. | 274429 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf GmbH. | 5242956003 | |
| Pasteur pipette | VWR International LLC. | 612-1684 | |
| Petri-dish | Jet Biofil | TCD000060 | |
| Potassium-chloride (KCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 18050-0-01-33 | |
| Sodium-chloride (NaCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 24640-0-01-38 | |
| Tricane-methanesulfonate (MS-222) | Sigma Aldrich Ltd. | E10521 |
References
- Sumpter, J. P. Endocrine Disrupters in the Aquatic Environment : An Overview. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica. 33 (1), 9-16 (2005).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environmental Toxicology and Chemistry. 15 (3), 241-248 (1996).
- Sanseverino, J., et al. Use of Saccharomyces cerevisiae BLYES Expressing Bacterial Bioluminescence for Rapid, Sensitive Detection of Estrogenic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 71 (8), 4455-4460 (2008).
- Fetter, E., et al. Effect-directed analysis for estrogenic compounds in a fluvial sediment sample using transgenic cyp19a1b-GFP zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 154, 221-229 (2014).
- Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of estrogen receptor transcriptional activation in zebrafish. Endocrinology. 152 (7), 2690-2703 (2011).
- Rider, C. V., Hartig, P. C., Cardon, M. C., Wilson, V. S. Development of a competitive binding assay system with recombinant estrogen receptors from multiple species. Toxicology Letters. 184 (2), 85-89 (2009).
- Gunnarsson, L., Kristiansson, E., Förlin, L., Nerman, O., Larsson, J. Sensitive and robust gene expression changes in fish exposed to estrogen - a microarray approach. BMC Genomics. 8 (149), 1-9 (2007).
- Vander Ven, L. T. M., et al. Vitellogenin expression in zebrafish Danio rerio evaluation by histochemistry, immunohistochemistry, and in situ mRNA hybridisation. Aquatic Toxicology. 65 (1), 1-11 (2003).
- Bakos, K., et al. Developmental toxicity and estrogenic potency of zearalenone in zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 136-137, 13-21 (2013).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments - A commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Tsang, M. Zebrafish : A Tool for Chemical Screens. Birth Defects Research, Part C. 90 (3), 185-192 (2010).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Lee, C., Na, J. G., Lee, K., Park, K. Choriogenin mRNA induction in male medaka, Oryzias latipes as a biomarker of endocrine disruption. Aquatic Toxicology. 61 (3-4), 233-241 (2002).
- Chen, H., et al. Generation of a fluorescent transgenic zebrafish for detection of environmental estrogens. Aquatic Toxicology. 96 (1), 53-61 (2010).
- Bakos, K., et al. Estrogen sensitive liver transgenic zebrafish (Danio rerio) line (Tg(vtg1:mCherry)) suitable for the direct detection of estrogenicity in environmental samples. Aquatic Toxicology. 208, 157-167 (2019).
- Abdelmoneim, A., Clark, C., Mukai, M. Fluorescent reporter zebrafish line for estrogenic compound screening generated using a CRISPR/Cas9-mediated knock-in system. Toxicological Sciences. 173 (2), 336-346 (2019).
- Tong, S. K., et al. A cyp19a1b-GFP (aromatase B) transgenic zebrafish line that expresses GFP in radial glial cells. Genesis. 47 (2), 67-73 (2009).
- Segner, H. Zebrafish (Danio rerio) as a model organism for investigating endocrine disruption. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C: Toxicology and Pharmacology. 149 (2), 187-195 (2009).
- Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Res. 29 (14), 2905-2919 (2001).
- Faisal, Z., et al. Protective effects of beta-cyclodextrins vs. zearalenone-induced toxicity in HeLa cells and Tg(vtg1:mCherry) zebrafish embryos. Chemosphere. 240, 1-11 (2020).
- Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in U.S. streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environmental Science and Technology. 36 (6), 1202-1211 (2002).
- Kuch, H. M., Ballschmiter, K. Determination of endocrine-disrupting phenolic compounds and estrogens in surface and drinking water by HRGC-(NCI)-MS in the picogram per liter range. Environmental Science and Technology. 35 (15), 3201-3206 (2001).
- Lundgren, M. S., Novak, P. J. Quantification of phytoestrogens in industrial waste streams. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (11), 2318-2323 (2009).
- Masoner, J. R., Kolpin, D. W., Furlong, E. T., Cozzarelli, I. M., Gray, J. L. Landfill leachate as a mirror of today’s disposable society: Pharmaceuticals and other contaminants of emerging concern in final leachate from landfills in the conterminous United States. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (4), 906-918 (2016).
- Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDA). EFSA Statement on the establishment of guidelines for the assessment of additives from the functional group ‘substances for reduction of the contamination of feed by mycotoxins' 1 EFSA. EFSA Journal. 8 (7), 1-8 (2010).
- Braunbeck, T., et al. Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: the fish embryo toxicity test goes multi-species - an update. Altex. 22 (50), 87-102 (2005).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ober, E. A., Field, H. A., Stainier, D. Y. R. From endoderm formation to liver and pancreas development in zebrafish. Mechanisms of Development. 120 (1), 5-18 (2003).
- Tao, T., Peng, J. Liver development in zebrafish (Danio rerio). Journal of Genetics and Genomics. 36 (6), 325-334 (2009).
- Shier, W. T., Shier, A. C., Xie, W., Mirocha, C. J. Structure-activity relationships for human estrogenic activity in zearalenone mycotoxins. Toxicon. 39 (9), 1435-1438 (2001).
- Panel, E., Chain, F. Appropriateness to set a group health-based guidance value for zearalenone and its modified forms EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). EFSA Journal. 14, 4425 (2016).
- Binder, E. M. Managing the risk of mycotoxins in modern feed production. Animal Feed Science and Technology. 133 (1-2), 149-166 (2007).
- Risa, A., Krifaton, C., Kukolya, J., Kriszt, B., Cserháti, M., Táncsics, A. Aflatoxin B1 and Zearalenone-Detoxifying Profile of Rhodococcus Type Strains. Current Microbiology. 75 (7), 907-917 (2018).
