Summary
目前这里是使用斑马鱼胚胎Tg（vtg1：mCherry）来检测雌激素效应的详细协议。该协议涵盖鱼类的繁殖和胚胎的治疗，并强调内分泌干扰化合物（EDC）引起的荧光信号的检测、文献和评估。
Abstract
环境中有许多内分泌干扰化合物（EDC），尤其是雌激素物质。由于这些物质的化学多样性，很难发现这些物质;因此，越来越多地使用效果检测方法，如雌激素效应敏感生物监测器/生物致病生物。这些生物监测生物体包括几种鱼类模型。该协议涵盖使用斑马鱼Tg（vtg1：mCherry）转基因线作为生物监测生物体，包括鱼类的繁殖和胚胎的治疗，重点是检测、记录和评估EDC诱导的荧光信号。这项工作的目标是演示使用Tg（vtg1：mCherry）转基因线胚胎来检测雌激素效应。这项工作记录了使用转基因斑马鱼胚胎Tg（vtg1：mCherry）通过测试两种雌激素物质α-泽拉不醇来检测雌激素效应。所述协议只是设计测定的基础;测试方法可根据测试端点和样本而变化。此外，它可以与其他测定方法相结合，从而促进转基因线的未来使用。
Introduction
在我们的环境中，有大量内分泌干扰化合物（EDC）是我们环境中最危险的物质之一。这些主要是从自然资源中污染水的雌激素化合物。属于该组的物质的化学多样性使得测试其存在变得困难，因为检测这些物质需要不同的分析方法。根据它们的化学结构，很难确定一种物质是否真的能够充当雌激素。此外，这些物质永远不会以纯形式存在于环境中，因此它们的影响可能受其他化合物的影响，太1。这个问题可以通过效果检测方法解决，例如使用生物监测器/生物致病生物，显示雌激素效应2，3，4，5。3,4,52
最近，各种细胞系6和酵母为基础的测试系统22，33已经开发出来检测雌激素效应。然而，这些通常只能检测物质与雌激素受体2，3,的结合。此外，它们无法模拟生物体中复杂的生理过程，或检测生命阶段的激素敏感阶段;因此，它们往往导致错误的结果。
众所周知，某些基因对生物体中的雌激素反应敏感。通过分子生物学方法检测基因产品也可以在蛋白质或mRNA级别8，9，9但通常涉及动物牺牲。8动物保护法已经变得更加严格，对替代性测试系统的需求也日益增长，这种试验系统可以最大限度地减少实验中使用的动物的数量和痛苦，或者用另一个模型系统10取代动物模型。随着荧光蛋白的发现和生物标志物线的产生，转基因技术提供了很好的替代方案。有了这些线，雌激素敏感基因的激活可以在体内测试。
在脊椎动物中，鱼类在环境风险评估中的潜力是突出的。与哺乳动物模型相比，它们有许多优点：作为水生生物，它们能够通过整个身体吸收污染物，产生大量的后代，而且它们的一些物种的特点是生成时间短。它们的内分泌系统和生理过程与其他脊椎动物，甚至哺乳动物，包括人类12有很大的相似之处。
几种用于检测鱼类雌激素效应的基因也已知。最重要的是雌激素受体芳香酶-b，胆碱-H，和维泰洛宁（vtg）7，13。7,13最近，一些产生雌激素的生物传感器线也创造了从鱼模型在实验室使用，如从斑马鱼（达尼奥雷里奥）4，5，14，15，16，17。4,5,14,15,16,17斑马鱼在创建生物传感器线的主要优点是胚胎和幼虫的透明体，因为荧光报告器信号可以在体内轻松研究，而不会牺牲动物10。除了动物保护，它也是一个有价值的功能，因为它允许研究同一个人的反应在治疗的不同时间18。
这些实验使用维泰洛根因记者转基因斑马鱼线15。用于开发Tg（vtg1：mCherry）的转基因结构具有长（3.4 kbp）天然维泰洛根-1启动子。雌激素受体（ER）是由配体激活的增强蛋白，是类固醇/核受体超级家庭的代表。ER结合到特定的DNA序列称为雌激素反应元素（EREs），具有高亲和力和转活性基因表达对雌二醇和其他雌激素物质的反应，所以在启动子中更多的ERE导致更强的反应19。在Tg（vtg1：mCherry）的启动区域有17个ERE位点，它们有望模仿原生vtg基因15的表达。在性成熟的女性中，荧光信号有连续的表达。然而，在雄性和胚胎中，肝脏中的表达只有在雌激素治疗时才能看到（图1）。
图1：vtg1：mCherry转基因成年斑马鱼和5dpf胚胎肝脏的红色荧光信号，17-β-雌二醇（E2）诱导后。在女性和男性治疗E2（25μg/L暴露时间：48小时）肝脏强荧光是可见的，即使通过色素的皮肤。未经治疗的雄性（A）看不到荧光信号。E2 诱导（50 μg/L 暴露时间：0-120 hpf）后，还可以观察到 5 dpf 胚胎肝脏中的红色荧光信号，这在控制胚胎（B） 中不可见。虽然荧光信号持续存在于成年女性体内，但主要为男性和胚胎，适合检测雌激素效应。（BF：亮场，mCherry：红色荧光滤光片视图，单纯图像，比例杆 A：5mm，比例杆B：250μm）请单击此处查看此图的较大版本。
与内源性维泰洛源类似，mCherry 记者只在肝脏中表达。由于维泰洛根宁只在雌激素存在的情况下产生，因此控制装置中没有荧光信号。因为表达只在肝脏，评估结果要容易得多15。
该线的胚胎的敏感性和可用性已研究的各种雌激素化合物混合物，以及环境样本15，20，在大多数情况下剂量反应15,20关系被记录（图2）。然而，在剧毒，主要是肝毒性，物质（如泽拉酮），只有非常弱的荧光信号可能可见于治疗胚胎的肝脏，最大强度荧光信号可以达到一个非常小的浓度范围内，这使得很难建立剂量效应关系20。
图2：肝脏的剂量反应图（A）和荧光图像（mCherry），在5dpf vtg1：mCherry幼虫中，暴露于17-β-乙二醇二醇（EE2）。结果表示为从信号强度和受影响区域大小（+SEM，n = 60）生成的集成密度。100% 是指观测到的最大值。荧光信号强度随着浓度的逐渐增加。比例线 = 250 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
环境中存在几种雌激素物质， 如17-μ-雌二醇（环境浓度：0.1±5.1纳克/升）21，17-β-乙酰二醇（环境浓度：0.16~0.2μg/L）22，泽拉酮 （环境浓度： 0.095~0.22 μg/L）23， 双酚-A （环境浓度： 0.45~17.2毫克/升）24.当在转基因胚胎的帮助下以纯活性形式测试这些物质时，用于荧光标志检测的最低观测效果浓度（LOEC）为17-β--雌二醇的100纳克/升， 1 ng/L 代表 17-α-乙酰二醇，100 ng/L 代表泽拉酮，1 mg/L 代表双酚-A（96-120 hpf 处理），非常接近或非常接近15.的环境浓度范围。Tg（vtg1：mCherry）转基因线有助于在直接接触后检测废水样品中的雌激素。线是敏感作为常用酵母雌激素测试，生物卢米尼森酵母雌激素（BLYES）测定15。在这条线的帮助下，使用化学混合物20证实了β-环糊精对泽拉酮诱导毒性的保护作用。
在最近的一份报告中，在两种雌激素泽拉酮（ZEA）代谢物的帮助下，在体内使用转基因线，α-泽拉醇（+-ZOL和+-ZOL）25。协议基线适合研究几种化合物或环境样本对Tg（vtg1：mCherry）胚胎的雌激素效应。
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Protocol
《动物议定书》根据《匈牙利动物福利法》获得批准，所有研究都是在治疗者达到免费喂养阶段之前完成的。
1. 胚胎收获和治疗
- 保持Tg（vtg1：mCherry）斑马鱼在25.5±0.5 °C，pH = 7 = 0.2，电导率在525×50μS/m之间，氧位=80%饱和度，14小时光和10小时暗循环。
- 在收获鸡蛋之前，将交配罐装满系统水，并在下午将鱼设置为交配。
- 将雄性鱼和雌性鱼放入鱼缸中，并在分压器的帮助下将它们分开。
- 当第二天早上灯打开时，从储罐上拆下分压器。每 15~20 分钟检查一次煎蛋罐。
- 使用茶过滤器或密布编织的细网收获所有胚胎，并将它们与 E3 缓冲液（5 mM 氯化钠、0.17 mM 氯化钾、0.33 mM 氯化钙、0.33 m 硫酸镁）或透明系统水混合成一个大型培养皿。
- 将胚胎放在培养箱中设置为 25.5 ± 0.5 °C。
- 1~1.5小时后，在解剖显微镜下用塑料转移移液器取出并丢弃未受精或分不充分的鸡蛋。
注：未受精的卵子是不透明的;受精卵是透明的。在后期开发阶段开始治疗，注意被治疗个体的正常发展。 - 将选定的胚胎放在已经标记并填充不同浓度的测试物质的治疗容器中（例如，在培养皿或组织培养板中）。
- 在25.5±0.5 °C下孵育胚胎，直到实验结束。
注：胚胎可以对各种雌激素化合物具有显著的个体敏感性，因此建议在至少三次重复治疗中至少使用15个胚胎，以便正确评估实验。在选择容器时，请记住，胚胎的发育至少需要200μL的水26。在这个实验中，胚胎在25.5~0.5°C时孵育至120马力。 - 如果保持治疗浓度是必要的，请刷新测试溶液。更换测试溶液时要小心，以免损坏胚胎。
注：在实验期间，也可以调查死亡率或亚致命症状。使用的浓度应尽可能保持稳定，以获得可靠的结果。通过刷新测试解决方案，可以轻松实现这一点。清爽的频率可能因测试物质而异。因此，建议通过分析测量来检查测试物质的浓度，以确定溶液更新的频率。
2. 幼虫摄影准备
- 事先使用MS-222（三甲烷-硫酸盐）准备4%甲基纤维素。
- 为此，将4mg/mL MS-222至100 mL双蒸馏水加入至0.168毫克/mL的最终浓度，并将溶液溶液溶液达到4°C。然后加入4克甲基纤维素。用磁力搅拌器搅拌，然后将搅拌器在4°C中过夜。
- 第二天，再次搅拌，解决方案应随时使用。如果甲基纤维素没有完全溶解，请把它放回4°C，再等几个小时。
- 将5天大的幼虫放入每组5厘米的培养皿中，配以巴斯德移液器。
- 用塑料移液器从幼虫中去除处理溶液，然后用 2 mL 的 0.02% MS-222 麻醉液填充培养皿。
注：麻醉通常在不到一分钟内有效。幼虫被麻醉，如果他们不游泳离开的反应触摸。过量的MS-222可以杀死幼虫。 - 用 MS-222 填充 10 厘米培养皿的每个方块（图3）。
注：使用塑料板（1 毫米高，5 毫米宽）在 Petri 盘底部粘合两个 1.5 x 1.5 厘米方形区域。二十只幼虫可以放在一个正方形中。而不是专门设计的培养皿，另一个低边容器可以用来固定胚胎的位置。
图3：10厘米培养皿，粘附1.5 x 1.5厘米宽，1毫米厚的塑料板方，用于幼虫的摄影准备。请单击此处查看此图的较大版本。
- 将麻醉幼虫转移到甲基纤维素中，在两个方块之一中用一点水。从第一个方块将幼虫转移到第二个方块。
注：借助此转移，用于摄影的4%甲基纤维素不会稀释，幼虫在成像过程中不会旋转。 - 在第二个正方形中，旋转并定向幼虫到其左侧，然后轻轻按到纤维素的底部，用微加载器移液器尖端切割至 2 厘米。
注意：不要使用其他移液器尖端，因为它们会导致幼虫受伤。
3. 显微镜
注：摄影不会杀死动物。动物可以通过从甲基纤维素中去除并放入新鲜的系统水或处理溶液中来唤醒它们，因此在治疗过程中可以多次检查同一个体。
- 为了评估表示者的信号，用相同的视图和设置对胚胎进行图像图像。
注：有关最佳胚胎定位，请参阅步骤 2.6。手稿中的照片是在所述条件下拍摄的。明亮场：60 倍放大倍率、6 ms 曝光、虹膜 100%、增益：1.1、荧光照片：60 倍放大倍率、300 ms 放大率、虹膜：100%、增益：1、mCherry 滤光片、荧光光源：汞金属卤化物灯泡。对于拍摄荧光立体显微镜的照片，使用了专用相机和显微镜软件。 - 将培养皿放在显微镜的舞台上。
- 聚焦胚胎的肝脏，并使用相关软件捕捉明亮的场图像。
- 将显微镜切换到 mCherry 过滤器，并使用相关软件在荧光灯下拍摄肝脏的荧光图像。
注：在黑暗中执行所有荧光步骤。不要更改捕获明亮场和荧光图像之间的放大倍率、焦点或胚胎位置，因为这将有助于图像分析。 - 重复步骤3.3和3.4，直到实验中的所有胚胎都成像。
4. 确定集成密度
注：比较荧光信号强度的最佳指标之一是集成密度值（即面积和平均灰色值的产品和）。确定集成密度的最简单方法之一是使用 ImageJ 程序27。该程序在互联网上可用，可以安装在计算机上。
- 打开 ImageJ 然后通过拖放图像或单击 File+ 上传荧光图像进行分析。打开。
- 点击图片|点击图片|点击图片|点击图片|点击图片颜色|颜色|颜色|颜色|拆分通道，根据 RGB 颜色图拆分荧光滤镜制作的图像。
- 使用红色通道图像频谱，关闭其他通道。
- 在图像中指定一个大小类似的椭圆区域，这样假信号不会干扰评估。使用椭圆形工具，尽可能准确地在高亮的肝脏区域上绘制椭圆。
- 如果信号较弱，请使用光显微镜图像（即荧光图像的明亮场对）来确定肝脏的位置。
- 点击分析|测量以确定信号强度和受影响区域的大小。集成密度值由软件自动计算（图表中的 IntDen 列）。
- 通过重复步骤 4.1~4.6 继续分析，直到分析治疗组中所有胚胎的所有荧光图像。
- 保存数据，然后分析集成密度值。
注：在分析过程中，始终在图像中选择相同的区域大小。要分析的区域的大小取决于放大倍率、图像分辨率、其他拍摄设置等。通过使用个人宏进行分析，可以加速或使分析更准确。例如，宏可用于确保所选区域在检查的图像中始终相同。在 ImageJ 网站上找到用于创建宏的详细说明，以便根据特定照片设置进行最佳图像分析。
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Representative Results
在本文介绍的实验中，对两种雌激素物质的影响进行了5次检测，从受精开始，对Tg（vtg1：mCherry）斑马鱼胚胎进行了5天的受精。我们调查了荧光信号是否出现在鱼的肝脏在接触时间结束时，因为物质，以及是否有差异的雌激素的两种物质。根据荧光图像和综合密度值对结果进行了评价。一般来说，这两种物质在暴露时间结束时诱导了转基因的表达，这些物质的暴露浓度在个体存活的这些浓度下。在未经处理的对照鱼中，看不到荧光信号。
在 +-ZOL 的情况下，在最高测试浓度 （8 μM） 所有个体死亡，因此在这种情况下，荧光信号无法检查。在较低的浓度（0.5 μM+4 μM）下，在胚胎的肝脏中观察到强烈的荧光信号（图4A）。荧光强度和荧光区大小无显著差异（p < 0.05）。+-ZOL集成密度值（图4C）显示该物质诱导荧光信号的出现。综合密度值与治疗（p < 0.05）之间没有显著差异。平均集成密度在 31.26 × 13.95 （0.5 μM） 和 34.25 × 15.36 （4 μM） 之间变化。
在使用β-ZOL治疗期间没有记录死亡率，并且所有治疗浓度均含有诱导转基因活性的物质。荧光强度和荧光区域的大小随着浓度的增加而增加，如荧光图像所示（图4B）。在视觉上比较β-和β-ZOL的荧光图像，在两种物质的相同处理浓度下，α-ZOL的信号强度和荧光区域的大小明显较弱。研究+-ZOL的集成值（图4D），平均综合密度值几乎翻了一番之间的最低和最高的治疗浓度。但是，在 +-ZOL 的情况下，单个浓度的综合密度值（p < 0.05）之间没有显著差异。平均集成密度介于 15.86 × 4.08 （0.5 μM） 和 21.73 × 5.94 （8 μM） 之间。
图4：从肝脏荧光信号的强度和5天大的Tg（vtg1：mCherry）转基因斑马鱼胚胎的β-泽拉醇治疗引起的受影响区域的大小得出的综合密度值的呈现。在实验中，生物标志物斑马鱼系的雌激素敏感胚胎（每次治疗浓度三个复制中每组20个幼虫）从受精开始，以0.5μM~8μM浓度的β-和μ-ZOL治疗5天。α-ZOL（A） 和+-ZOL（B） 的鱼肝图像清楚地显示，这些物质诱导了荧光信号的出现。集成密度数据以平均 + 标准差 （SD = 误差条） 表示。使用迭代 Grubbs 分析数据，以确定排除的异常值。数据与夏皮罗-威尔克法常测试的异常性进行了检测，并确定了符合参数化方法要求的情况。统计分析是在Dunnett的测试之后使用单向的SNOVA进行的。研究综合密度值时，在+-ZOL （C） 和+-ZOL （D） （p < 0.05） 的治疗方法之间没有显著差异。比例线 = 200 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
通过检查从两种物质的相同处理浓度中获得的集成密度值（图5），+-ZOL提出了相对于+-ZOL的每种情况下更高的集成密度平均值，这与荧光图像中观察到的信号强度之间的差异是一致的。Figure 5在所有治疗浓度的情况下，发现显著差异（0.5 μM，p = 0.0011;1 μM，p = 0.0003;2 μM，p = 0.0329;和4μM，p = 0.0325）。
图5：α-泽拉醇集成密度值的比较。集成密度数据以平均 + 标准差 SD + 误差条表示。使用迭代 Grubbs 分析数据，以识别排除的异常值。数据与夏皮罗-威尔克法常测试的异常性进行了检测，并确定了符合参数化方法要求的情况。在每种浓度（0.5 μM，p = 0.0011;1 μM，p = 0.0003;2 μM，p = 0.0329;和4μM，p = 0.0325）的情况下，用未配对的t检验验证了显著差异。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在毒理学研究中，生物监测器/生物杀病剂对雌激素效应的使用一直在蔓延。体内模型发挥着突出的作用，因为与体外测试不同，它们不仅提供有关细胞或受体反应的信息，还允许对生物体内复杂过程进行调查。研究雌激素效应的几条转基因线已经产生于斑马鱼，其中一条用于这些研究。此处描述的方法说明了用于测试此线胚胎的协议，以便检测纯活性成分体内的雌激素活性。
线的雄性胚胎也适合检测雌激素效应，但胚胎有几个优点，可以促进其可用性。特别是，身体是透明的，所以肝脏中的荧光信号很容易被观察到。斑马鱼肝脏在受精后6小时开始发育（6马力），50小时后开始工作（50马力）。首先，肝脏的左叶形成，在96小时（96马力）时，肝脏的右叶也出现。肝脏的最终形状是由第5天（120马力）28，29,左右发育的。肝脏能够产生内源性维泰洛源从2-3天的胚胎14，这与荧光信号的外观在Tg（vtg1：mCherry）线15。因此，在设计实验时，应考虑到荧光信号只能从那个时候的胚胎肝脏中得到预期。5天大胚胎的肝脏在相对较大的区域已经定义得很好，在立体显微镜下很容易检测到荧光信号。这使得不受动物保护法管辖的测试协议的开发成为可能。维泰洛根素，以及类似的荧光蛋白，是由胚胎肝脏15的左叶产生的。因此，在检查荧光信号或拍照时，胚胎的空间方向对于检测最强信号非常重要。这就是为什么胚胎在协议中被放在左边的原因。从代表性结果中可以看出，试验样品的雌激素效应由肝脏中的荧光信号清晰地指示，因此也可以直观地评估结果。如果需要量化结果，则由 ImageJ 程序定义的集成密度值是适当的。但是，为了进行适当的评估，在实验过程中必须使用相同的设置拍摄图像，并且每个图像中高亮的荧光区域的大小是相同的。加上胚胎的精确定位，这些是协议中最关键的步骤。必须指出，在胚胎的情况下，转基因的表达，类似于产生内源性维泰原素，表现出较大的分散和个体敏感性的差异。在某些情况下，这可能会导致结果发生很大变化，在设计实验时应考虑这些差异。
确定治疗浓度的一个重要方面是，胚胎的细胞，因此肝细胞，可能会因高浓度的剧毒物质而受损，这可能导致葡萄激素诱导下降。因此，测试的浓度应低于LC1015。
比较雌激素敏感鱼线彼此的敏感性是一项艰巨的任务，因为到目前为止描述的鱼线已经根据不同的协议,5，14，15，1614,15进行了测试。5该协议中测试的生产线能够检测纯活性成分、混合物和环境样品的剂量效应关系，所得结果与BLYES试验和 HeLa细胞15、20,结果密切相关。
该线的胚胎对测试剂的效用已经证明，包括泽拉酮15。在这项工作中，测试了毒素的两种代谢物，β-和β-泽拉连醇。根据文献资料，+-ZOL比+-ZOL30毒性强，其30雌性也高31。这些结果得到了我们的研究证实。因此，对线胚胎的研究也适合比较其他雌激素物质的雌激素效应。
食物链中的霉菌毒素污染是一个全球性的问题，因此已经改进了几个程序，以减少动物饲料和人类食物中的霉菌毒素水平25，32。3225最有希望的解决方案之一是微生物或其酶的霉菌毒素生物降解。它可以是减少或消除霉菌毒素去污染的一种重要的后处理方法。迄今为止，文献中已经测试了许多细菌菌株的ZEA降解能力，然而，最近的研究结果证明毒素的高降解很少能说明代谢物33的不利影响。由于该线的胚胎理论上适合测试有机质含量为15的样品的雌激素效应，因此可以开发出一种治疗方案，帮助测试ZEA的生物降解产品和降解菌株的资格。
根据计划的测试终点（如接触开始和长度）和要测试的样品（如混合物或环境样品），可以采用多种方式更改此协议，并可以使用其他测试方法（如分子方法）完成。因此，我们希望使用Tg（vtg1：mCherry）线将成为雌激素试验和标准测试方法的模型。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家研究、发展和创新基金国家研究、发展和创新办公室的支持;赠款协议：NVKP_16-1-2016-0003，EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-0008项目由欧盟共同资助，以及由创新和技术部授予的Szent István大学主题卓越项目NKFIH-831-10/2019。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jet Biofil | TCP011024 | |
| Calcium-chloride (CaCl2) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 16383-0-27-39 | |
| GraphPad Prism 6.01 software | GraphPad Software Inc. | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health, USA | Public access software, downloadable from: http://imagej.nih.gov/ | |
| Leica Application Suite X calibrated software | Leica Microsystems GmbH. | We used the softver described in the experiments, but any photographic software complies with the tests | |
| Leica M205 FA stereomicroscope, Leica DFC 7000T camera | Leica Microsystems GmbH. | We used the equipments described in the experiments, but any fluorescent stereomicroscope is suitable for the tests | |
| Magnesium-sulphate (MgSO4) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 20342-0-27-38 | |
| mCherry filter | Leica Microsystems GmbH. | ||
| Mehyl-cellulose | Sigma Aldrich Ltd. | 274429 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf GmbH. | 5242956003 | |
| Pasteur pipette | VWR International LLC. | 612-1684 | |
| Petri-dish | Jet Biofil | TCD000060 | |
| Potassium-chloride (KCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 18050-0-01-33 | |
| Sodium-chloride (NaCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 24640-0-01-38 | |
| Tricane-methanesulfonate (MS-222) | Sigma Aldrich Ltd. | E10521 |
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