Summary
Aanwezig is een gedetailleerd protocol voor het gebruik van zebravis embryo's Tg (vtg1: mCherry) voor de detectie van oestrogene effecten. Het protocol heeft betrekking op de voortplanting van de vis en de behandeling van embryo's, en benadrukt de detectie, documentatie en de evaluatie van fluorescerende signalen veroorzaakt door hormoonontregelende verbindingen (EDC).
Abstract
Er zijn veel hormoonontregelende verbindingen (EDC) in het milieu, vooral oestrogene stoffen. De opsporing van deze stoffen is moeilijk vanwege hun chemische diversiteit; daarom worden steeds meer effectdetectiemethoden gebruikt, zoals oestrogene effectgevoelige biomonitor/bio-indicatororganismen. Deze biomonitoringorganismen omvatten verschillende vismodellen. Dit protocol heeft betrekking op het gebruik van zebravis Tg(vtg1: mCherry) transgene lijn als biomonitoringorganisme, met inbegrip van de voortplanting van vis en de behandeling van embryo's, met de nadruk op de detectie, documentatie en evaluatie van fluorescerende signalen veroorzaakt door EDC. Het doel van het werk is de demonstratie van het gebruik van de Tg(vtg1: mCherry) transgene lijnembryo's om oestrogene effecten op te sporen. Dit werk documenteert het gebruik van transgene zebravisembryo's Tg(vtg1: mCherry) voor de detectie van oestrogene effecten door het testen van twee oestrogene stoffen, α- en β-zearalenol. Het beschreven protocol is slechts een basis voor het ontwerpen van tests; de testmethode kan worden gevarieerd op basis van de testeindpunten en de monsters. Bovendien kan het worden gecombineerd met andere testmethoden, waardoor het toekomstige gebruik van de transgene lijn wordt vergemakkelijkt.
Introduction
Er is een aanzienlijk aantal hormoonontregelende verbindingen (EDC) die tot de gevaarlijkste stoffen in ons milieu behoren. Dit zijn voornamelijk oestrogene verbindingen die water uit natuurlijke hulpbronnen vervuilen. De chemische diversiteit van de stoffen die tot de groep behoren, maakt het testen op hun aanwezigheid moeilijk, aangezien verschillende analysemethoden nodig zijn voor de detectie ervan. Op basis van hun chemische structuur is het zeer moeilijk om te bepalen of een stof daadwerkelijk in staat is om op te treden als een oestrogeen. Bovendien zijn deze stoffen nooit in zuivere vorm in het milieu aanwezig, dus de effecten ervan kunnen ook door andere verbindingen worden beïnvloed1. Dit probleem kan worden opgelost door effectdetectiemethoden, zoals het gebruik van biomonitor/bio-indicatororganismen die oestrogene effecten vertonen2,3,4,5.
Onlangs is een verscheidenheid van cellijn6 en gist-gebaseerde testsystemen2,3 ontwikkeld om oestrogene effecten te detecteren. Deze zijn echter over het algemeen alleen in staat om de binding van de stof aan de oestrogeenreceptor2,3op te sporen . Bovendien zijn ze niet in staat om complexe fysiologische processen in het organisme te modelleren, of om hormoongevoelige fasen van levensfasen op te sporen; ze leiden dus vaak tot valse resultaten.
Het is bekend dat bepaalde genen gevoelig reageren op oestrogeen in levende organismen7. De detectie van genproducten door moleculaire biologie methoden is ook mogelijk op het eiwit of mRNA niveau8,9, maar meestal gaat het om dierenoffers. De wetgeving inzake dierenbescherming is strenger geworden en er is een groeiende vraag naar alternatieve testsystemen die het aantal en het lijden van dieren die bij experimenten worden gebruikt of de vervanging van het diermodel door een ander modelsysteem10minimaliseren. Met de ontdekking van fluorescerende eiwitten en de creatie van biomarkerlijnen bieden transgene technologieën een goed alternatief11. Met deze lijnen kan de activering van een oestrogeengevoelig gen in vivo worden getest.
Onder gewervelde dieren is het potentieel van vissen bij de milieurisicobeoordeling uitstekend. Ze bieden veel voordelen ten opzichte van zoogdiermodellen: als aquatische organismen zijn ze in staat om verontreinigende stoffen door hun hele lichaam te absorberen, een groot aantal nakomelingen te produceren, en sommige van hun soorten worden gekenmerkt door korte generatietijd. Hun endocriene systeem en fysiologische processen vertonen grote gelijkenissen met andere gewervelde dieren en zelfs met zoogdieren, waaronder mensen12.
Verschillende genen voor de detectie van oestrogene effecten bij vissen zijn ook bekend. De belangrijkste zijn de oestrogeenreceptoren aromatase-b, choriogenin-H, en vitellogenine (vtg)7,13. Onlangs zijn er ook verschillende oestrogeenproducerende biosensorlijnen gemaakt van vismodellen die in het laboratorium worden gebruikt, zoals van zebravissen (Danio rerio)4,5,14,15,16,17. Het belangrijkste voordeel van zebravissen bij het maken van biosensorlijnen is het transparante lichaam van de embryo's en larven, omdat het fluorescerende reportersignaal vervolgens gemakkelijk in vivo kan worden bestudeerd zonder het dier op te offeren10. Naast de bescherming van dieren, het is ook een waardevol kenmerk als het mogelijk maakt voor het bestuderen van de reactie van hetzelfde individu op verschillende tijdstippen van de behandeling18.
Deze experimenten maken gebruik van een vitellogenin reporter transgene zebravis lijn15. De transgene constructie die wordt gebruikt voor de ontwikkeling van Tg(vtg1:mCherry) heeft een lange (3,4 kbp) natuurlijke vitellogenin-1 promotor. De oestrogeenreceptor (ER) is een enhancer eiwit geactiveerd door liganden dat is een vertegenwoordiger van de steroïde / nucleaire receptor superfamilie. ER bindt aan specifieke DNA-sequenties genaamd oestrogeen respons elementen (EREs) met hoge affiniteit en transactiveert genexpressie in reactie op estradiol en andere oestrogene stoffen, dus hoe meer ERE in de promotor veroorzaakt een sterkere respons19. Er zijn 17 ERE-sites in het promotorgebied van de Transgene-bouwer Tg(vtg1:mCherry) en van hen wordt verwacht dat ze de expressie van het inheemse vtg-gen15nabootsen. Er is een continue expressie van het fluorescerende signaal bij seksueel gerijpte vrouwen. Bij mannen en embryo's is de expressie in de lever echter alleen zichtbaar bij behandeling met oestrogene stoffen (figuur 1).
Figuur 1: Rood fluorescerend signaal in de lever van vtg1:mCherry transgene volwassen zebravis en 5 dpf embryo's, na 17-ß-estradiol (E2) inductie. Bij vrouwen en bij mannen die met E2 worden behandeld (25 μg/L blootstellingstijd:48 uur) is sterke fluorescentie van de lever zelfs zichtbaar via de gepigmenteerde huid. Er is geen fluorescerend signaal zichtbaar bij onbehandelde mannen(A). Na E2-inductie (50 μg/L-blootstellingstijd: 0-120 pk) kan ook een rood fluorescerend signaal in de lever van 5 dpf-embryo's worden waargenomen, wat niet zichtbaar is bij controleembryo's (B). Terwijl het fluorescerende signaal continu aanwezig is bij volwassen vrouwtjes, zijn voornamelijk mannetjes en embryo's van de lijn geschikt voor het detecteren van oestrogene effecten. (BF: helder veld, mCherry: rode fluorescerende filterweergave, enkele effen beelden, schaalbalk A: 5mm, schaalbalk B: 250 μm) Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Net als bij de endogene vitellogenine, wordt de mCherry-verslaggever alleen uitgedrukt in de lever. Omdat vitellogenine alleen wordt geproduceerd in aanwezigheid van oestrogeen, is er geen fluorescerend signaal in de controles. Omdat de uitdrukking alleen in de lever zit, is de evaluatie van de resultaten veel gemakkelijker15.
De gevoeligheid en bruikbaarheid van de embryo's van deze lijn zijn onderzocht op verschillende oestrogene samengestelde mengsels en ook op milieumonsters15,20, en in de meeste gevallen werden dosisresponsrelaties gedocumenteerd ( figuur2). In het geval van zeer toxische, voornamelijk hepatoxische stoffen (bijvoorbeeld zearalenon) kan echter slechts een zeer zwak fluorescerend signaal zichtbaar zijn in de lever van behandelde embryo's en kan het veroorzaakte maximale fluorescerende signaal worden bereikt binnen een zeer klein concentratiebereik, waardoor het moeilijk is om dosis-effectrelaties vast te stellen20.
Figuur 2: Dosisresponsdiagram (A) en fluorescerende beelden (mCherry) van de lever (B) blootgesteld aan 17-α-ethynilestradiol (EE2), in 5 dpf vtg1:mCherry larven. De resultaten worden uitgedrukt als geïntegreerde dichtheid gegenereerd uit de signaalsterkte en de grootte van het getroffen gebied (±SEM, n = 60). 100% verwijst naar het waargenomen maximum. Fluorescerende signaalintensiteit nam geleidelijk toe met concentratie. Schaalbalk = 250 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Er zijn verschillende oestrogene stoffen aanwezig in het milieu, zoals 17-β-estradiol (milieuconcentratie: 0,1–5,1 ng/L)21, 17-α-ethynylestradiol (milieuconcentratie: 0,16–0,2 μg/L L)22, zearalenon (milieuconcentratie: 0,095–0,22 μg/L)23, bisfenol-A (milieuconcentratie: 0,45–17,2 mg/L)24. Bij het testen van deze stoffen in zuiver actieve vorm met behulp van mCherry transgene embryo's waren de laagste waargenomen effectconcentraties (LOEC) voor fluorescerende tekendetectie 100 ng/L voor 17-ß-estradiol, 1 ng/L voor 17-α-ethynilestradiol, 100 ng/L voor zearalenon en 1 mg/L voor bisfenol-A (96-120 hpf behandeling), die zeer dicht bij of binnen het bereik van milieuconcentraties van de stoffen15ligt. De transgene lijn Tg(vtg1:mCherry) kan helpen bij het detecteren van oestrogeen in afvalwatermonsters na directe blootstelling. De lijn is zo gevoelig als de veelgebruikte gist oestrogeen test, de bioluminiscente gist oestrogeen (BLYES) test15. Met behulp van deze lijn, de beschermende effecten van bèta-cyclodextrins tegen zearalenon-geïnduceerde toxiciteit is bevestigd met behulp van chemische mengsels20.
In een recent rapport werd het in vivo gebruik van de transgene lijn aangetoond met behulp van twee oestrogene zearalenon (ZEA) metabolieten, α- en β-zearalenol (α-ZOL en β-ZOL)25. De baseline van het protocol is geschikt om de oestrogene effecten van verschillende verbindingen of milieumonsters op Tg(vtg1:mCherry) embryo's te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het dierprotocol werd goedgekeurd op grond van de Hongaarse wet op het welzijn van dieren en alle studies werden voltooid voordat de behandelde personen het vrije voederstadium zouden hebben bereikt.
1. Embryooogst en -behandeling
- Houd Tg(vtg1:mCherry) zebravissen op 25,5 ± 0,5 °C, pH = 7 ± 0,2, geleidbaarheid tussen 525 ± 50 μS/m, zuurstofgehalte ≥80% verzadiging en 14 h licht en 10 h donkere cyclus.
- Vul de parentanks met systeemwater en zet de vis voor de paring de middag voor het oogsten van eieren.
- Plaats de mannelijke en vrouwelijke vissen in de tank en scheid ze met behulp van een scheidingswand.
- Verwijder de scheidingswand uit de tanks als het licht de volgende ochtend aan gaat. Controleer de paringstanks op eieren om de 15-20 minuten.
- Oogst alle embryo's met behulp van een theezeef of dicht geweven fijn gaas en combineer ze tot één grote petrischaal met E3-buffer (5 mM natriumchloride, 0,17 mM kaliumchloride, 0,33 mM calciumchloride, 0,33 mM magnesiumsulfaat) of helder systeemwater.
- Plaats de embryo's in de couveuse ingesteld op 25,5 ± 0,5 °C.
- Na 1-1,5 uur, verwijderen en weggooien onbevruchte of onvoldoende verdelen eieren met een plastic overdracht pipet onder een ontleden microscoop.
OPMERKING: Onbevruchte eieren zijn ondoorzichtig; bevruchte eieren zijn transparant. Om de behandeling in een later stadium van ontwikkeling te starten, aandacht besteden aan de normale ontwikkeling van de personen die worden behandeld. - Plaats de geselecteerde embryo's in de behandelingsvaten (bijvoorbeeld in petrischaaltjes of weefselkweekplaten) die al zijn gelabeld en gevuld met verschillende concentraties van de teststof.
- De embryo's tot het einde van het experiment incubeer maken bij 25,5 ± 0,5 °C.
OPMERKING: Embryo's kunnen reageren met een significante individuele gevoeligheid voor verschillende oestrogene verbindingen, dus het wordt aanbevolen om ten minste 15 embryo's te gebruiken in ten minste drie herhaalde behandelingen om het experiment goed te evalueren. Houd er bij de keuze van de container rekening mee dat voor de ontwikkeling van een embryo ten minste 200 μL water26vereist. In dit experiment werden de embryo's geïncubeerd tot 120 pkf bij 25,5 ± 0,5 °C. - Vernieuw de testoplossing als deze nodig is om de behandelingsconcentratie te behouden. Wees voorzichtig bij het veranderen van de testoplossing om beschadiging van de embryo's te voorkomen.
OPMERKING: Het is ook mogelijk om sterfte of subletale symptomen te onderzoeken tijdens het experiment. De gebruikte concentraties moeten zo stabiel mogelijk blijven om betrouwbare resultaten te verkrijgen. Dit kan eenvoudig worden bereikt door de testoplossingen te vernieuwen. De frequentie van het verversen kan variëren afhankelijk van de teststof. Daarom is het raadzaam om de concentratie van de teststof te controleren door middel van analytische metingen om de frequentie van de oplossingsupdates te bepalen.
2. Larven voorbereiding voor fotografie
- Bereid vooraf 4% methylcellulose met MS-222 (tricaine-methaan-sulfonaat) voor.
- Voeg hiervoor 4 mg/mL MS-222 tot 100 mL dubbel gedestilleerd water toe aan een uiteindelijke concentratie van 0,168 mg/mL en breng de oplossing op 4 °C. Voeg vervolgens 4 g methylcellulose toe. Roer het met een magnetische roerder en laat het 's nachts in 4 °C.
- Roer het de volgende dag opnieuw en de oplossing moet klaar zijn voor gebruik. Als de methylcellulose niet volledig is opgelost, zet deze dan terug op 4 °C en wacht nog een paar uur.
- Plaats 5 dagen oude larven in een petrischaaltje van 5 cm per behandelgroep met een Pasteur pipet.
- Verwijder de behandelingsoplossing uit de larven met een plastic pipet en vul de petrischaal met 2 mL van 0,02% MS-222 verdovingsoplossing.
OPMERKING: Anesthesie is meestal effectief in minder dan een minuut. De larven worden verdoofd als ze niet wegzwemmen in reactie op aanraking. Een overdosis MS-222 kan de larven doden. - Vul elk vierkant van een speciaal ontworpen petrischaal van 10 cm met 4% methylcellulose met MS-222 (figuur 3).
OPMERKING: Lijm twee vierkante oppervlakten van 1,5 x 1,5 cm aan de onderkant van de petrischaal met plastic platen (1 mm hoogte, 5 mm breed). Twintig larven kunnen naast elkaar op een vierkant worden geplaatst. In plaats van een speciaal ontworpen petrischaal, kan een andere lage rand container worden gebruikt om de positie van de embryo's vast te stellen.
Figuur 3: Een petrischaal van 10 cm met gelijmde 1,5 x 1,5 cm breed, 1 mm dikke plastic plaatvierkanten voor larven die zich voorbereiden op fotografie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
- Breng de verdoofde larven over op methylcellulose met een beetje water in een van de twee vierkanten. Vanaf het eerste vierkant brengen de larven naar het tweede vierkant.
OPMERKING: Met behulp van deze overdracht wordt de 4% methylcellulose die voor fotografie wordt gebruikt niet verdund en draaien de larven niet tijdens de beeldvorming. - Draai en oriënteer larven aan de linkerkant en druk ze voorzichtig naar de bodem van de cellulose met een microloader pipetpunt tot 2 cm.
OPMERKING: Gebruik geen andere pipettips omdat ze letsel aan de larven veroorzaken.
3. Microscopie
LET OP: Fotografie doodt de dieren niet. Dieren kunnen worden gewekt door ze uit de methylcellulose te verwijderen en ze in zoet systeemwater of behandelingsoplossing te plaatsen, zodat dezelfde persoon meerdere keren kan worden onderzocht tijdens de behandeling.
- Om het signaal van de uitgedrukte verslaggever te evalueren, beeld de embryo's met dezelfde weergave en instellingen.
LET OP: Zie stap 2.6 voor een optimale embryopositionering. De foto's in het manuscript zijn genomen onder de beschreven voorwaarden. Helder veld: 60x vergroting, 6 ms expositie, Iris 100%, Gain:1.1, fluorescentie foto's: 60x vergroting, 300 ms expositie, Iris: 100%, Gain:1, mCherry filter, fluorescerende lichtbron: kwik metaal halide lamp. Voor het nemen van een fluorescerende stereomicroscoop werden speciale camera en software voor microscoop gebruikt. - Plaats de petrischaal op het podium van de microscoop.
- Focus op de lever van het embryo en leg een helder veldbeeld vast met behulp van de bijbehorende software.
- Schakel de microscoop om de mCherry filter en neem een fluorescerend beeld van de lever onder tl-licht met behulp van de bijbehorende software.
OPMERKING: Voer alle fluorescentiestappen uit in het donker. Verander de vergroting, de focus of de positie van het embryo niet tussen het vastleggen van het heldere veld en de fluorescerende beelden, omdat dit zal helpen bij de analyse van de beelden. - Herhaal stap 3.3 en 3.4 totdat alle embryo's in het experiment in beeld zijn gebracht.
4. Vaststelling van de geïntegreerde dichtheid
OPMERKING: Een van de beste indicatoren voor het vergelijken van fluorescerende signaalsterkte is de geïntegreerde dichtheidswaarde (d.w.z. het product van het gebied en de gemiddelde grijze waarde). Een van de gemakkelijkste manieren om de geïntegreerde dichtheid te bepalen is het gebruik van het ImageJ-programma27. Het programma is beschikbaar op het internet en kan worden geïnstalleerd op de computer.
- Open ImageJ en upload vervolgens de fluorescerende afbeelding die moet worden geanalyseerd door de afbeelding te slepen en te laten vallen of op Bestand te klikken| Open.
- Klik op Afbeelding| Kleur| Gesplitste kanalen om de afbeelding te splitsen die door het tl-filter wordt gemaakt volgens de RGB-kleurendiagram.
- Werk met het rode kanaalbeeldspectrum, sluit de andere kanalen.
- Wijs een elliptisch gebied van vergelijkbare grootte in het beeld aan, zodat valse signalen de evaluatie niet verstoren. Met behulp van de Oval tools, teken een ellips over de gemarkeerde lever gebied zo nauwkeurig mogelijk.
- Als het signaal zwak is, gebruik dan lichte microscopiebeelden (d.w.z. het heldere veldpaar van het tl-beeld) om de locatie van de lever te bepalen.
- Klik op Analyseren| Meet om de signaalsterkte en de grootte van het getroffen gebied te bepalen. De geïntegreerde dichtheidswaarde wordt automatisch berekend door de software (IntDen-kolom in de grafiek).
- Zet de analyse voort door stap 4.1–4.6 te herhalen totdat alle fluorescerende beelden van alle embryo's in de behandelingsgroep worden geanalyseerd.
- Sla de gegevens op en analyseer vervolgens de geïntegreerde dichtheidswaarden.
OPMERKING: Selecteer tijdens de analyse altijd dezelfde gebiedsgrootte in de afbeeldingen. De grootte van het te analyseren gebied is afhankelijk van de vergroting, beeldresolutie, andere instellingen voor het fotograferen, enz. De analyse kan worden versneld of nauwkeuriger worden gemaakt door persoonlijke macro's te gebruiken voor analyse. Macro's kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om ervoor te zorgen dat het geselecteerde gebied altijd hetzelfde is in de onderzochte afbeeldingen. Gedetailleerde beschrijvingen voor het maken van macro's die de beste beeldanalyse volgens bepaalde foto-instellingen mogelijk maken, zijn te vinden op de ImageJ-website.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In het experiment in dit manuscript werden de effecten van twee oestrogene stoffen getest bij vijf concentraties die vijf dagen lang bij bevruchting begonnen op Tg(vtg1:mCherry) zebravisembryo's. We onderzochten of er fluorescerende signalen in de lever van vissen verschenen tegen het einde van de blootstellingstijd vanwege de stoffen en of er verschillen waren in de oestrogeenheid van de twee stoffen. De resultaten werden geëvalueerd op basis van de fluorescerende beelden en geïntegreerde dichtheidswaarden. In het algemeen hebben beide stoffen de omzetting aan het einde van de blootstellingstijd geïnduceerd bij de testconcentraties waar individuen het overleefden. In het geval van onbehandelde controlevissen was er geen fluorescerend signaal zichtbaar.
In het geval van α-ZOL stierven bij de hoogste testconcentratie (8 μM) alle personen, zodat in dit geval het fluorescerende signaal niet kon worden onderzocht. Bij lagere concentraties (0,5 μM–4 μM) werd een sterk tl-signaal waargenomen in de lever van de embryo's (figuur 4A). Er werd geen significant verschil waargenomen in de fluorescentieintensiteit en de grootte van de fluorescerende gebieden (p < 0,05). De α-ZOL geïntegreerde dichtheidswaarden (figuur 4C), tonen aan dat de stof het verschijnen van een fluorescerend signaal veroorzaakte. Er werd geen significant verschil gevonden tussen de geïntegreerde dichtheidswaarden en tussen behandelingen (p < 0,05). De gemiddelde geïntegreerde dichtheid varieerde tussen 31,26 ± 13,95 (0,5 μM) en 34,25 ± 15,36 (4 μM).
Tijdens de behandeling met β-ZOL werd geen mortaliteit gedocumenteerd en de stof die transgene activiteit veroorzaakte bij alle behandelingsconcentraties. De fluorescentieintensiteit en de grootte van het tl-gebied namen toe naarmate de concentratie toenam, zoals te zien is in de fluorescerende beelden(figuur 4B). Door de fluorescerende beelden van α- en β-ZOL visueel te vergelijken, waren zowel de signaalsterkte als de grootte van het tl-gebied zichtbaar zwakker voor β-ZOL bij dezelfde behandelingsconcentraties van de twee stoffen. Door de geïntegreerde waarden van β-ZOL (figuur 4D)te bestuderen, verdubbelde de gemiddelde geïntegreerde dichtheidswaarde bijna tussen de laagste en de hoogste behandelingsconcentraties. In het geval van β-ZOL was er echter geen significant verschil tussen de geïntegreerde dichtheidswaarden van de individuele concentraties (p < 0,05). De gemiddelde geïntegreerde dichtheid varieerde tussen 15,86 ± 4,08 (0,5 μM) en 21,73 ± 5,94 (8 μM).
Figuur 4: Presentatie van geïntegreerde dichtheidswaarden die zijn afgeleid van de intensiteit van fluorescerende signalen in de lever en van de grootte van het getroffen gebied veroorzaakt door α- en β-zearalenolbehandeling op 5 dagen oude Tg(vtg1:mCherry) transgene zebravisembryo's. In het experiment werden oestrogeengevoelige embryo's van de biomarker zebravislijn (20 larven per groep in drie repliceert in elke behandelingsconcentratie) behandeld met 0,5 μM–8 μM concentraties van α- en β-ZOL vanaf bevruchting gedurende 5 dagen. Beelden van de vislevers voor α-ZOL(A)en β-ZOL(B)tonen duidelijk aan dat de stoffen het verschijnen van het fluorescerende signaal veroorzaakten. Geïntegreerde dichtheidsgegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD = foutbalk). De gegevens werden geanalyseerd met iteratieve Grubbs voor identificerende uitschieters, die werden uitgesloten. De gegevens werden gecontroleerd op normaliteit met de Shapiro-Wilk normaliteitstest en de naleving van de vereisten van parametrische methoden werd vastgesteld. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van een eenrichtings-ANOVA volgde op een Dunnett-test. Bij het bestuderen van de geïntegreerde dichtheidswaarden werd geen significant verschil gevonden tussen de behandelingen in het geval van α-ZOL(C)en β-ZOL(D)(p < 0,05). Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Door de geïntegreerde dichtheidswaarden te onderzoeken die zijn verkregen uit dezelfde behandelingsconcentraties van de twee stoffen (figuur 5), presenteerde α-ZOL in elk geval hogere geïntegreerde dichtheidsgemiddelden ten opzichte van β-ZOL, wat overeenkomt met de verschillen tussen de signaalsterkten die in de fluorescerende beelden worden waargenomen. In alle behandelingsconcentraties werden significante verschillen (0,5 μM, p = 0,0011; 1 μM, p = 0,0003; 2 μM, p = 0,0329; en 4 μM, p = 0,0325) gevonden.
Figuur 5: Vergelijking van α- en β-zearalenol geïntegreerde dichtheidswaarden. Geïntegreerde dichtheidsgegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie SD = foutbalk. De gegevens werden geanalyseerd met iteratieve Grubbs om uitschieters te identificeren, die werden uitgesloten. De gegevens werden gecontroleerd op normaliteit met de Shapiro-Wilk normaliteitstest en de naleving van de vereisten van parametrische methoden werd vastgesteld. Voor elke concentratie (0,5 μM, p = 0,0003) werden significante verschillen geverifieerd met een niet-gepaarde t-test tussen α-ZOL en β-ZOL. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gebruik van biomonitoren/bio-indicatoren voor oestrogene effecten is verspreid in toxicologische studies. In vivo modellen spelen een uitstekende rol, omdat ze in tegenstelling tot in vitro tests niet alleen informatie geven over de respons van een cel of een receptor, maar ook het onderzoek van complexe processen in het organisme mogelijk maken. Verschillende transgene lijnen voor het bestuderen van oestrogene effecten zijn geproduceerd uit zebravissen, waarvan Tg(vtg1:mCherry) werd gebruikt voor deze studies. De hier beschreven methode illustreert een protocol voor het testen van embryo's van deze lijn om oestrogeenactiviteit in vivo in zuivere, actieve ingrediënten op te sporen.
Mannetjes en embryo's van de lijn zijn ook geschikt voor het detecteren van oestrogene effecten, maar embryo's hebben verschillende voordelen die hun bruikbaarheid bevorderen. In het bijzonder is het lichaam transparant, zodat het fluorescerende signaal in de lever gemakkelijk kan worden waargenomen. De zebravis lever begint te ontwikkelen 6 uur na de bevruchting (6 hpf) en begint te werken na 50 uur (50 pk). Eerst wordt de linkerkwab van de lever gevormd, en na 96 uur (96 pk) verschijnt ook de rechterkwab van de lever. De uiteindelijke vorm van de lever is ontwikkeld door rond dag 5 (120 pk)28,29. De lever is in staat om endogene vitellogenine te produceren vanaf de leeftijd van 2-3 dagen van een embryo14, wat samenvalt met het verschijnen van het fluorescerende signaal in de Tg(vtg1:mCherry) lijn15. Daarom moet bij het ontwerpen van experimenten rekening worden gehouden met het feit dat een fluorescerend signaal alleen kan worden verwacht in de embryolever van vanaf die tijd. De lever van de 5 dagen oude embryo's is al goed gedefinieerd in een relatief groot gebied, waar het fluorescerende signaal gemakkelijk kan worden gedetecteerd onder een stereomicroscoop. Dit maakt de ontwikkeling van testprotocollen die niet onderworpen zijn aan de wetgeving inzake dierenbescherming mogelijk. Vitellogenin, en ook het fluorescerende eiwit, wordt geproduceerd door de linkerkwab van de lever van de embryo's15. Daarom is de ruimtelijke oriëntatie van de embryo's belangrijk voor de detectie van het sterkste signaal bij het onderzoeken van het fluorescerende signaal of het maken van foto's. Daarom werden embryo's in het protocol links gelegd. Zoals blijkt uit de representatieve resultaten, wordt het oestrogene effect van een testmonster duidelijk aangegeven door het fluorescerende signaal in de lever, zodat de resultaten ook visueel kunnen worden geëvalueerd. Als de kwantificering van de resultaten nodig is, is de geïntegreerde dichtheidswaarde gedefinieerd door het ImageJ-programma geschikt. Voor een goede evaluatie is het echter onontbeerlijk dat tijdens het experiment met dezelfde instellingen wordt beelden worden gemaakt en dat de grootte van de gemarkeerde tl-gebieden in elke afbeelding hetzelfde is. Samen met de precieze positionering van de embryo's zijn dit de meest kritische stappen in het protocol. Het is belangrijk te vermelden dat in het geval van embryo's de expressie van het transgene, vergelijkbaar met de productie van endogene vitellogenine, een grote spreiding en verschillen in individuele gevoeligheid vertoont. In sommige gevallen kan dit leiden tot grote variaties in de resultaten, waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van de experimenten.
Een belangrijk aspect bij het bepalen van de behandelingsconcentraties is dat de cellen van de embryo's, en dus de levercellen, kunnen worden beschadigd door hoge concentraties van zeer giftige stoffen, wat kan leiden tot een afname van vitellogenine-inductie. Daarom moeten tests worden uitgevoerd bij concentraties onder LC1015.
Het vergelijken van de gevoeligheid van oestrogeengevoelige vislijnen met elkaar is een moeilijke taak, omdat de tot nu toe beschreven lijnen zijn getest volgens verschillende protocollen5,14,15,16. De lijn getest in dit protocol is in staat om te detecteren dosis-effect relaties in gevallen van zuivere actieve ingrediënten, mixen, en milieumonsters, en de verkregen resultaten gecorreleerd goed met de resultaten met BLYES tests en HeLa cellen15,20.
Het nut van de embryo's van de lijn om te testen agenten is bewezen, met inbegrip van zearalenone15. In dit werk werden twee metabolieten van het toxine, α- en β-zearalenol, getest. Volgens literatuurgegevens is α-ZOL giftiger dan β-ZOL30 en is de oestrogeenheid ook hoger31. Deze resultaten worden bevestigd door onze studies. Zo zijn studies naar de embryo's van de lijn ook geschikt om de oestrogene effecten van andere oestrogene stoffen te vergelijken.
Mycotoxinebesmetting in de voedselketen is een wereldwijd probleem, dus verschillende procedures zijn verbeterd om het mycotoxinegehalte in diervoeders en menselijke voeding te verminderen25,32. Een van de meest veelbelovende oplossingen is mycotoxine biologische afbraak door micro-organismen of door hun enzymen. Het kan een essentiële postoogstmethode zijn om mycotoxinedecontaminatie te verminderen of te elimineren. De ZEA vernederende vermogen van tal van bacteriële stammen is getest in de literatuur tot nu toe, echter, recente onderzoeksresultaten die blijken hoge afbraak van het toxine zelden specificeren het nadelige effect van metabolieten33. Omdat de embryo's van deze lijn theoretisch geschikt zijn om de oestrogene effecten van monsters met het gehalte aan organische stof15te testen, kan een behandelingsprotocol worden ontwikkeld dat kan helpen bij het testen van de biologische afbraakproducten van ZEA en de kwalificatie van de vernederende stammen.
Dit protocol kan op vele manieren worden gewijzigd op basis van de geplande testeindpunten (bijvoorbeeld blootstellingsbezeting en lengte) en de monsters (bijvoorbeeld mengsels of milieumonsters) die getest gaan worden en kunnen worden voltooid met andere testmethoden (bijvoorbeeld moleculaire methoden). Zo hopen we dat het gebruik van de Tg(vtg1:mCherry) lijn een model zal worden van estrogeniciteitstests en voor standaard testmethoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het National Research, Development and Innovation Office (NKFIH) van het Nationaal Fonds voor Onderzoek, Ontwikkeling en Innovatie (NKFIA); Subsidieovereenkomst: NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 project medegefinancierd door de Europese Unie, en het thematische excellenceprogramma NKFIH-831-10/2019 van de Szent István University, toegekend door het Ministerie van Innovatie en Technologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jet Biofil | TCP011024 | |
| Calcium-chloride (CaCl2) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 16383-0-27-39 | |
| GraphPad Prism 6.01 software | GraphPad Software Inc. | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health, USA | Public access software, downloadable from: http://imagej.nih.gov/ | |
| Leica Application Suite X calibrated software | Leica Microsystems GmbH. | We used the softver described in the experiments, but any photographic software complies with the tests | |
| Leica M205 FA stereomicroscope, Leica DFC 7000T camera | Leica Microsystems GmbH. | We used the equipments described in the experiments, but any fluorescent stereomicroscope is suitable for the tests | |
| Magnesium-sulphate (MgSO4) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 20342-0-27-38 | |
| mCherry filter | Leica Microsystems GmbH. | ||
| Mehyl-cellulose | Sigma Aldrich Ltd. | 274429 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf GmbH. | 5242956003 | |
| Pasteur pipette | VWR International LLC. | 612-1684 | |
| Petri-dish | Jet Biofil | TCD000060 | |
| Potassium-chloride (KCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 18050-0-01-33 | |
| Sodium-chloride (NaCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 24640-0-01-38 | |
| Tricane-methanesulfonate (MS-222) | Sigma Aldrich Ltd. | E10521 |
References
- Sumpter, J. P. Endocrine Disrupters in the Aquatic Environment : An Overview. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica. 33 (1), 9-16 (2005).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environmental Toxicology and Chemistry. 15 (3), 241-248 (1996).
- Sanseverino, J., et al. Use of Saccharomyces cerevisiae BLYES Expressing Bacterial Bioluminescence for Rapid, Sensitive Detection of Estrogenic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 71 (8), 4455-4460 (2008).
- Fetter, E., et al. Effect-directed analysis for estrogenic compounds in a fluvial sediment sample using transgenic cyp19a1b-GFP zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 154, 221-229 (2014).
- Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of estrogen receptor transcriptional activation in zebrafish. Endocrinology. 152 (7), 2690-2703 (2011).
- Rider, C. V., Hartig, P. C., Cardon, M. C., Wilson, V. S. Development of a competitive binding assay system with recombinant estrogen receptors from multiple species. Toxicology Letters. 184 (2), 85-89 (2009).
- Gunnarsson, L., Kristiansson, E., Förlin, L., Nerman, O., Larsson, J. Sensitive and robust gene expression changes in fish exposed to estrogen - a microarray approach. BMC Genomics. 8 (149), 1-9 (2007).
- Vander Ven, L. T. M., et al. Vitellogenin expression in zebrafish Danio rerio evaluation by histochemistry, immunohistochemistry, and in situ mRNA hybridisation. Aquatic Toxicology. 65 (1), 1-11 (2003).
- Bakos, K., et al. Developmental toxicity and estrogenic potency of zearalenone in zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 136-137, 13-21 (2013).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments - A commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Tsang, M. Zebrafish : A Tool for Chemical Screens. Birth Defects Research, Part C. 90 (3), 185-192 (2010).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Lee, C., Na, J. G., Lee, K., Park, K. Choriogenin mRNA induction in male medaka, Oryzias latipes as a biomarker of endocrine disruption. Aquatic Toxicology. 61 (3-4), 233-241 (2002).
- Chen, H., et al. Generation of a fluorescent transgenic zebrafish for detection of environmental estrogens. Aquatic Toxicology. 96 (1), 53-61 (2010).
- Bakos, K., et al. Estrogen sensitive liver transgenic zebrafish (Danio rerio) line (Tg(vtg1:mCherry)) suitable for the direct detection of estrogenicity in environmental samples. Aquatic Toxicology. 208, 157-167 (2019).
- Abdelmoneim, A., Clark, C., Mukai, M. Fluorescent reporter zebrafish line for estrogenic compound screening generated using a CRISPR/Cas9-mediated knock-in system. Toxicological Sciences. 173 (2), 336-346 (2019).
- Tong, S. K., et al. A cyp19a1b-GFP (aromatase B) transgenic zebrafish line that expresses GFP in radial glial cells. Genesis. 47 (2), 67-73 (2009).
- Segner, H. Zebrafish (Danio rerio) as a model organism for investigating endocrine disruption. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C: Toxicology and Pharmacology. 149 (2), 187-195 (2009).
- Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Res. 29 (14), 2905-2919 (2001).
- Faisal, Z., et al. Protective effects of beta-cyclodextrins vs. zearalenone-induced toxicity in HeLa cells and Tg(vtg1:mCherry) zebrafish embryos. Chemosphere. 240, 1-11 (2020).
- Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in U.S. streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environmental Science and Technology. 36 (6), 1202-1211 (2002).
- Kuch, H. M., Ballschmiter, K. Determination of endocrine-disrupting phenolic compounds and estrogens in surface and drinking water by HRGC-(NCI)-MS in the picogram per liter range. Environmental Science and Technology. 35 (15), 3201-3206 (2001).
- Lundgren, M. S., Novak, P. J. Quantification of phytoestrogens in industrial waste streams. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (11), 2318-2323 (2009).
- Masoner, J. R., Kolpin, D. W., Furlong, E. T., Cozzarelli, I. M., Gray, J. L. Landfill leachate as a mirror of today’s disposable society: Pharmaceuticals and other contaminants of emerging concern in final leachate from landfills in the conterminous United States. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (4), 906-918 (2016).
- Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDA). EFSA Statement on the establishment of guidelines for the assessment of additives from the functional group ‘substances for reduction of the contamination of feed by mycotoxins' 1 EFSA. EFSA Journal. 8 (7), 1-8 (2010).
- Braunbeck, T., et al. Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: the fish embryo toxicity test goes multi-species - an update. Altex. 22 (50), 87-102 (2005).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ober, E. A., Field, H. A., Stainier, D. Y. R. From endoderm formation to liver and pancreas development in zebrafish. Mechanisms of Development. 120 (1), 5-18 (2003).
- Tao, T., Peng, J. Liver development in zebrafish (Danio rerio). Journal of Genetics and Genomics. 36 (6), 325-334 (2009).
- Shier, W. T., Shier, A. C., Xie, W., Mirocha, C. J. Structure-activity relationships for human estrogenic activity in zearalenone mycotoxins. Toxicon. 39 (9), 1435-1438 (2001).
- Panel, E., Chain, F. Appropriateness to set a group health-based guidance value for zearalenone and its modified forms EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). EFSA Journal. 14, 4425 (2016).
- Binder, E. M. Managing the risk of mycotoxins in modern feed production. Animal Feed Science and Technology. 133 (1-2), 149-166 (2007).
- Risa, A., Krifaton, C., Kukolya, J., Kriszt, B., Cserháti, M., Táncsics, A. Aflatoxin B1 and Zearalenone-Detoxifying Profile of Rhodococcus Type Strains. Current Microbiology. 75 (7), 907-917 (2018).
