Summary
Hier ist ein detailliertes Protokoll zur Verwendung von Zebrafischembryonen Tg(vtg1: mCherry) zum Nachweis von östrogene Wirkungen. Das Protokoll behandelt die Vermehrung der Fische und die Behandlung von Embryonen und betont den Nachweis, die Dokumentation und die Bewertung von fluoreszierenden Signalen, die durch endokrine Störverbindungen (EDC) induziert werden.
Abstract
Es gibt viele endokrine störende Verbindungen (EDC) in der Umwelt, vor allem östrogene Substanzen. Der Nachweis dieser Stoffe ist aufgrund ihrer chemischen Vielfalt schwierig; daher werden immer mehr wirkungserkennende Methoden wie östrogene effektempfindliche Biomonitor-/Bioindikatororganismen eingesetzt. Diese Biomonitoring-Organismen umfassen mehrere Fischmodelle. Dieses Protokoll betrifft die Verwendung von Zebrafisch Tg(vtg1: mCherry) transgene Linie als Biomonitoring-Organismus, einschließlich der Vermehrung von Fischen und der Behandlung von Embryonen, mit schwerpunkt auf dem Nachweis, der Dokumentation und Bewertung von fluoreszierenden Signalen, die durch EDC induziert werden. Das Ziel der Arbeit ist die Demonstration der Verwendung der transgenen Linienembryonen tg(vtg1: mCherry) zum Nachweis östrogener Wirkungen. Diese Arbeit dokumentiert die Verwendung von transgenen Zebrafischembryonen Tg(vtg1: mCherry) zum Nachweis östrogener Wirkungen durch die Prüfung von zwei östrogenen Substanzen, dem E- und dem Zearalenol. Das beschriebene Protokoll ist nur eine Grundlage für die Gestaltung von Assays; die Prüfmethode kann je nach Testendpunkt und Proben variiert werden. Darüber hinaus kann es mit anderen Assay-Methoden kombiniert werden, wodurch die zukünftige Verwendung der transgenen Linie erleichtert wird.
Introduction
Es gibt eine erhebliche Anzahl von endokrin störenden Verbindungen (EDC), die zu den gefährlichsten Stoffen in unserer Umwelt gehören. Dies sind vor allem östrogene Verbindungen, die Wasser aus natürlichen Ressourcen kontaminieren. Die chemische Vielfalt der zur Gruppe gehörenden Stoffe erschwert die Prüfung auf ihre Anwesenheit, da für ihren Nachweis unterschiedliche Analysemethoden erforderlich sind. Aufgrund ihrer chemischen Struktur ist es sehr schwierig festzustellen, ob ein Stoff tatsächlich in der Lage ist, als Östrogen zu wirken. Darüber hinaus sind diese Stoffe nie in reiner Form in der Umwelt vorhanden, so dass ihre Auswirkungen auch durch andere Verbindungen beeinflusst werden können, auch1. Dieses Problem kann durch wirkungserkennende Methoden gelöst werden, wie die Verwendung von Biomonitor-/Bioindikatororganismen, die östrogene Effekte zeigen2,3,4,5.
Kürzlich wurden eine Vielzahl von Zelllinie6 und Hefe-basierte Testsysteme2,3 entwickelt, um östrogene Effekte zu erkennen. Diese sind jedoch in der Regel nur in der Lage, die Bindung der Substanz an den Östrogenrezeptor2,3zu erkennen. Darüber hinaus sind sie nicht in der Lage, komplexe physiologische Prozesse im Organismus zu modellieren oder hormonempfindliche Phasen von Lebensphasen zu erkennen; daher führen sie oft zu falschen Ergebnissen.
Es ist bekannt, dass bestimmte Gene empfindlich auf Östrogen in lebenden Organismen reagieren7. Der Nachweis von Genprodukten durch molekularbiologische Methoden ist auch auf der Protein- oder mRNA-Ebene8,9möglich, beinhaltet aber in der Regel Tieropfer. Die Tierschutzgesetze sind strenger geworden, und die Nachfrage nach alternativen Testsystemen, die die Anzahl und das Leiden der in Experimenten verwendeten Tiere oder die Ersetzung des Tiermodells durch ein anderes Modellsystem minimieren, ist gestiegen10. Mit der Entdeckung fluoreszierender Proteine und der Schaffung von Biomarker-Linien bieten transgene Technologien eine gute Alternative11. Mit diesen Linien kann die Aktivierung eines Östrogen-sensitiven Gens in vivo getestet werden.
Bei Wirbeltieren ist das Potenzial von Fischen bei der Umweltverträglichkeitsprüfung hervorragend. Sie bieten viele Vorteile gegenüber Säugetiermodellen: Als Wasserorganismen sind sie in der Lage, Schadstoffe durch ihren gesamten Körper zu absorbieren, produzieren eine große Anzahl von Nachkommen, und einige ihrer Arten zeichnen sich durch kurze Erzeugungszeit aus. Ihr endokrines System und physiologische Prozesse zeigen große Ähnlichkeiten mit anderen Wirbeltieren und sogar mit Säugetieren, einschließlich Menschen12.
Mehrere Gene zum Nachweis von östrogene Wirkungen bei Fischen sind ebenfalls bekannt. Die wichtigsten sind die Östrogen-Rezeptoren Aromatase-b, Choriogenin-H, und Vitellogenin (vtg)7,13. Kürzlich wurden mehrere Östrogen-produzierende Biosensorlinien auch aus Fischmodellen erstellt, die im Labor verwendet werden, wie z.B. von Zebrafischen (Danio rerio)4,5,14,15,16,17. Der Hauptvorteil von Zebrafischen bei der Erstellung von Biosensorlinien ist der transparente Körper der Embryonen und Larven, da das fluoreszierende Reportersignal dann einfach in vivo untersucht werden kann, ohne das Tier10zu opfern. Neben dem Tierschutz ist es auch ein wertvolles Merkmal, da es ermöglicht, die Reaktion des gleichen Individuums zu verschiedenen Zeiten der Behandlung zu untersuchen18.
Diese Experimente verwenden einen Vitellogenin Reporter transgene Zebrafischlinie15. Das transgene Konstrukt, das für die Entwicklung von Tg(vtg1:mCherry) verwendet wird, hat einen langen (3,4 kbp) natürlichen Vitellogenin-1-Promotor. Der Östrogen-Rezeptor (ER) ist ein Enhancer-Protein durch Liganden aktiviert, die ein Vertreter der Steroid / Kernrezeptor Superfamilie ist. ER bindet an spezifische DNA-Sequenzen, sogenannte Östrogen-Response-Elemente (EREs) mit hoher Affinität und transaktiviert die Genexpression als Reaktion auf Ösradiol und andere östrogene Substanzen, so dass je mehr ERE im Promotor eine stärkere Reaktion verursacht19. Es gibt 17 ERE-Standorte in der Promotorregion des Tg(vtg1:mCherry) Transgenkonstrukts und es wird erwartet, dass sie die Expression des nativen vtg-Gens15imitieren. Es gibt einen kontinuierlichen Ausdruck des fluoreszierenden Signals bei geschlechtsreifen Weibchen. Bei Männern und Embryonen ist die Expression in der Leber jedoch nur bei der Behandlung mit östrogenen Substanzen sichtbar (Abbildung 1).
Abbildung 1: Rotes Fluoreszenzsignal in der Leber von vtg1:mCherry transgene erwachsene Zebrafische und 5 dpf Embryonen, nach 17-ß-Estradiol (E2) Induktion. Bei Frauen und Männern, die mit E2 (25 g/L Expositionszeit:48 Stunden) behandelt werden, ist eine starke Fluoreszenz der Leber auch durch die pigmentierte Haut sichtbar. Bei unbehandeltem Männchen ist kein fluoreszierendes Signal sichtbar (A). Nach der E2-Induktion (50 g/L-Expositionszeit: 0-120 hpf) kann auch ein rotes fluoreszierendes Signal in der Leber von 5 dpf-Embryonen beobachtet werden, das in Kontrollembryonen nicht sichtbar ist (B). Während das fluoreszierende Signal kontinuierlich bei erwachsenen Weibchen vorhanden ist, eignen sich vor allem Männchen und Embryonen der Linie zum Nachweis östrogener Wirkungen. (BF: helles Feld, mCherry: rote fluoreszierende Filteransicht, einzelne einfache Bilder, Skalenleiste A: 5mm, Skalenbalken B: 250 m) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ähnlich wie das endogene Vitellogenin wird der mCherry-Reporter nur in der Leber ausgedrückt. Da Vitellogenin nur in Gegenwart von Östrogen produziert wird, gibt es kein fluoreszierendes Signal in den Kontrollen. Da die Expression nur in der Leber ist, ist die Auswertung der Ergebnisse viel einfacher15.
Die Empfindlichkeit und Verwendbarkeit der Embryonen dieser Linie wurde an verschiedenen östrogenen Mischungen und auch an Umweltproben15,20, und in den meisten Fällen Dosis-Wirkungs-Beziehungen dokumentiert (Abbildung 2). Bei hochgiftigen, hauptsächlich hepatotoxischen Substanzen (z.B. Zearalenon) kann jedoch nur ein sehr schwaches fluoreszierendes Signal in der Leber behandelter Embryonen sichtbar sein und das verursachte maximale Fluoreszenzsignal kann innerhalb eines sehr kleinen Konzentrationsbereichs erreicht werden, was es schwierig macht, Dosis-Wirkungs-Beziehungen zu etablieren20.
Abbildung 2: Dosis-Wirkungs-Diagramm (A) und fluoreszierende Bilder (mCherry) der Leber (B), die 17-A-Ethynilestradiol (EE2) ausgesetzt sind, in 5 dpf vtg1:mCherry Larven. Die Ergebnisse werden als integrierte Dichte ausgedrückt, die aus der Signalstärke und der Größe des betroffenen Bereichs erzeugt wird (SEM, n = 60). 100% bezieht sich auf das beobachtete Maximum. Die fluoreszierende Signalintensität nahm mit der Konzentration allmählich zu. Maßstabsleiste = 250 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Es gibt mehrere östrogene Substanzen in der Umwelt, wie z. B. 17-'-Estradiol (Umweltkonzentration: 0,1–5,1 ng/L)21, 17-A-Ethynylestradiol (Umweltkonzentration: 0,16–0,2 g/L))22, Zearalenon (Umweltkonzentration: 0,095–0,22 g/L)23, Bisphenol-A (Umweltkonzentration: 0,45–17,2 mg/L)24. Bei der Prüfung dieser Stoffe in rein aktiver Form mit Hilfe von mCherry transgenen Embryonen die niedrigsten beobachteten Wirkungskonzentrationen (LOEC) für den Fluoreszenzzeichennachweis waren 100 ng/L für 17-ß-Estradiol, 1 ng/L für 17-A-Ethynilestradiol, 100 ng/L für Zearalenon und 1 mg/L für Bisphenol-A (96–120 h-Behandlung), die sehr nahe oder innerhalb des Bereichs der Umweltkonzentrationen der Stoffe15liegt. Die transgene Tg(vtg1:mCherry) kann helfen, Östrogeneität in Abwasserproben nach direkter Exposition zu erkennen. Die Linie ist so empfindlich wie der häufig verwendete Hefe-Östrogen-Test, der bioluminiscent Hefe-Östrogen (BLYES) Assay15. Mit Hilfe dieser Linie wurde die schützende Wirkung von Beta-Cyclodextrinen gegen zearalenon-induzierte Toxizität mit chemischen Gemischen bestätigt20.
In einem kürzlich veröffentlichten Bericht wurde die In-vivo-Verwendung der transgenen Linie mit Hilfe von zwei östrogenenen Zearalenon (ZEA)-Metaboliten, den Metaboliten , und -zearalenol (-ZOL und -ZOL)25, nachgewiesen. Die Protokollbasis ist geeignet, die östrogene Wirkung mehrerer Verbindungen oder Umweltproben auf Tg(vtg1:mCherry)-Embryonen zu untersuchen.
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Protocol
Das Tierprotokoll wurde nach dem ungarischen Tierschutzgesetz genehmigt, und alle Studien wurden abgeschlossen, bevor die behandelten Personen die freie Fütterungsphase erreicht hätten.
1. Embryo-Ernte und -Behandlung
- Halten Sie Tg(vtg1:mCherry) Zebrafische bei 25,5 x 0,5 °C, pH = 7 x 0,2, Leitfähigkeit zwischen 525 x 50 s/m, Sauerstoffgehalt bei 80 % der Sättigung und 14 h Licht und 10 h dunkel.
- Füllen Sie die Paarungstanks mit Systemwasser und stellen Sie die Fische für die Paarung am Nachmittag vor der Ernte Eier.
- Legen Sie die männlichen und weiblichen Fische in den Tank und trennen Sie sie mit Hilfe eines Teilers.
- Entfernen Sie den Teiler aus den Tanks, wenn sich das Licht am nächsten Morgen einschaltet. Überprüfen Sie die Paarungstanks alle 15–20 min auf Eier.
- Ernten Sie alle Embryonen mit einem Teesieb oder dicht gewebtem Feingewebe und kombinieren Sie sie zu einer großen Petrischale mit E3-Puffer (5 mM Natriumchlorid, 0,17 mM Kaliumchlorid, 0,33 mM Calciumchlorid, 0,33 mM Magnesiumsulfat) oder klarem Systemwasser.
- Legen Sie die Embryonen in den Inkubator eingestellt auf 25,5 x 0,5 °C.
- Nach 1–1,5 h unbefruchtete oder unzureichend emittierende Eier mit einer Kunststofftransferpipette unter einem Sezierendes Mikroskop entfernen und entsorgen.
HINWEIS: Unbefruchtete Eier sind undurchsichtig; befruchtete Eier sind transparent. Um die Behandlung in einem späteren Entwicklungsstadium zu beginnen, achten Sie auf die normale Entwicklung der behandelten Personen. - Legen Sie die ausgewählten Embryonen in die Behandlungsgefäße (z. B. in Petrischalen oder Gewebekulturplatten), die bereits gekennzeichnet und mit unterschiedlichen Konzentrationen der Prüfsubstanz gefüllt wurden.
- Inkubieren Sie die Embryonen bis zum Ende des Experiments bei 25,5 °C bei 0,5 °C.
HINWEIS: Embryonen können mit signifikanter individueller Empfindlichkeit auf verschiedene östrogene Verbindungen reagieren, daher wird empfohlen, mindestens 15 Embryonen in mindestens drei Wiederholungsbehandlungen zu verwenden, um das Experiment richtig zu bewerten. Beachten Sie bei der Auswahl des Behälters, dass die Entwicklung eines Embryos mindestens 200 l Wasser26erfordert. In diesem Experiment wurden die Embryonen bis 120 hpf bei 25,5 x 0,5 °C inkubiert. - Erfrischen Sie die Testlösung, wenn es notwendig ist, die Behandlungskonzentration aufrechtzuerhalten. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Testlösung ändern, um eine Beschädigung der Embryonen zu vermeiden.
HINWEIS: Es ist auch möglich, Die Sterblichkeit oder subletle Symptome während des Experiments zu untersuchen. Die verwendeten Konzentrationen sollten so stabil wie möglich bleiben, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Dies kann leicht durch Eine Aktualisierung der Testlösungen erreicht werden. Die Häufigkeit der Erfrischung kann je nach Prüfsubstanz variieren. Daher ist es ratsam, die Konzentration der Prüfsubstanz durch analytische Messungen zu überprüfen, um die Häufigkeit der Lösungsaktualisierungen zu bestimmen.
2. Larven Vorbereitung für die Fotografie
- 4% Methylcellulose mit MS-222 (Tricain-Methan-Sulfonat) vorab vorbereiten.
- Dazu 4 mg/ml MS-222 bis 100 ml doppeldestilliertes Wasser auf eine Endkonzentration von 0,168 mg/ml geben und die Lösung auf 4 °C bringen. Dann 4 g Methylcellulose hinzufügen. Mit einem Magnetrührer umrühren und über Nacht bei 4 °C lassen.
- Am nächsten Tag, rühren Sie es wieder und die Lösung sollte einsatzbereit sein. Wenn die Methylcellulose nicht vollständig aufgelöst ist, legen Sie sie wieder auf 4 °C und warten Sie noch ein paar Stunden.
- 5 Tage alte Larven in eine 5 cm Petrischale pro Behandlungsgruppe mit einer Pasteurpipette geben.
- Entfernen Sie die Behandlungslösung aus den Larven mit einer Kunststoffpipette, dann füllen Sie die Petrischale mit 2 ml 0,02% MS-222 Anästhetika.
HINWEIS: Anästhesie ist in der Regel in weniger als einer Minute wirksam. Die Larven werden beästhetisiert, wenn sie nicht als Reaktion auf Berührung wegschwimmen. Eine Überdosierung von MS-222 kann die Larven töten. - Füllen Sie jedes Quadrat einer speziell gestalteten 10 cm Petrischale mit 4% Methylcellulose mit MS-222 (Abbildung 3).
HINWEIS: Kleben Sie zwei 1,5 x 1,5 cm quadratische Flächen an der Unterseite der Petrischale mit Kunststoffplatten (1 mm Höhe, 5 mm breit). Zwanzig Larven können nebeneinander auf einem Quadrat platziert werden. Anstelle einer speziell entwickelten Petrischale kann ein weiterer Low-Edge-Behälter verwendet werden, um die Position der Embryonen zu fixieren.
Abbildung 3: Eine 10 cm Petrischale mit verklebten 1,5 x 1,5 cm breiten, 1 mm dicken Kunststoffblechquadraten zur Larvenvorbereitung für die Fotografie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Die anästhesierten Larven mit etwas Wasser in einem der beiden Quadrate auf Methylcellulose übertragen. Vom ersten Quadrat übertragen die Larven in das zweite Quadrat.
HINWEIS: Mit Hilfe dieser Übertragung wird die 4% Methylcellulose, die für die Fotografie verwendet wird, nicht verdünnt und die Larven drehen sich während der Bildgebung nicht. - Im zweiten Quadrat die Larven nach links drehen und orientieren und vorsichtig auf den Boden der Zellulose drücken, wobei eine Bissener-Pipettespitze mit mikroloader Pipette bis zu 2 cm geschnitten ist.
HINWEIS: Verwenden Sie keine anderen Pipettenspitzen, da sie Verletzungen der Larven verursachen.
3. Mikroskopie
HINWEIS: Fotografie tötet die Tiere nicht. Tiere können geweckt werden, indem sie aus der Methylcellulose entfernt und in frisches Systemwasser oder Behandlungslösung gebracht werden, so dass dieselbe Person während der Behandlung mehrmals untersucht werden kann.
- Um das Signal des ausgedrückten Reporters auszuwerten, bilde die Embryonen mit der gleichen Ansicht und Einstellung.
HINWEIS: Siehe Schritt 2.6 für eine optimale Embryopositionierung. Die Fotos im Manuskript wurden unter den beschriebenen Bedingungen aufgenommen. Helles Feld: 60x Vergrößerung, 6 ms Exposition, Iris 100%, Gain:1.1, Fluoreszenzfotos: 60x Vergrößerung, 300 ms Exposition, Iris: 100%, Gain:1, mCherry filter, fluoreszierende Lichtquelle: Quecksilbermetallhalogenidlampe. Für die Aufnahme eines fluoreszierenden Stereomikroskops wurden eine spezielle Kamera und Software für das Mikroskop verwendet. - Legen Sie die Petrischale auf die Bühne des Mikroskops.
- Konzentrieren Sie sich auf die Leber des Embryos und erfassen Sie ein helles Feldbild mit der zugehörigen Software.
- Schalten Sie das Mikroskop auf den mCherry-Filter um und nehmen Sie mit der zugehörigen Software ein fluoreszierendes Bild der Leber unter Fluoreszenzlicht auf.
HINWEIS: Führen Sie alle Fluoreszenzschritte im Dunkeln aus. Ändern Sie nicht die Vergrößerung, den Fokus oder die Position des Embryos zwischen der Erfassung des hellen Feldes und den fluoreszierenden Bildern, da dies bei der Analyse der Bilder hilfreich ist. - Wiederholen Sie die Schritte 3.3 und 3.4, bis alle Embryonen im Experiment abgebildet sind.
4. Bestimmung der integrierten Dichte
HINWEIS: Einer der besten Indikatoren für den Vergleich der fluoreszierenden Signalstärke ist der integrierte Dichtewert (d. h. das Produkt der Fläche und der mittlere Grauwert). Eine der einfachsten Möglichkeiten, die integrierte Dichte zu bestimmen, ist die Verwendung des ImageJ-Programms27. Das Programm ist im Internet verfügbar und kann auf dem Computer installiert werden.
- Öffnen Sie ImageJ und laden Sie dann das zu analysierende fluoreszierende Bild hoch, indem Sie das Bild ziehen und ablegen oder auf Datei klicken| Öffnen.
- Klicken Sie auf Bild| Farbe | Teilen Sie Kanäle, um das bilddurchschlossene Bild gemäß der RGB-Farbkarte zu teilen.
- Arbeiten Sie mit dem roten Kanal Bildspektrum, schließen Sie die anderen Kanäle.
- Legen Sie einen elliptischen Bereich in ähnlicher Größe im Bild fest, damit falsche Signale die Auswertung nicht stören. Zeichnen Sie mit den Oval-Werkzeugen eine Ellipse so genau wie möglich über den hervorgehobenen Leberbereich.
- Wenn das Signal schwach ist, verwenden Sie Lichtmikroskopiebilder (d. h. das helle Feldpaar des fluoreszierenden Bildes), um die Position der Leber zu bestimmen.
- Klicken Sie auf Analysieren| Messen Sie, um die Signalstärke und die Größe des betroffenen Bereichs zu bestimmen. Der integrierte Dichtewert wird automatisch von der Software berechnet (IntDen-Spalte im Diagramm).
- Setzen Sie die Analyse fort, indem Sie die Schritte 4.1–4.6 wiederholen, bis alle fluoreszierenden Bilder aller Embryonen in der Behandlungsgruppe analysiert werden.
- Speichern Sie die Daten, und analysieren Sie dann die integrierten Dichtewerte.
HINWEIS: Wählen Sie während der Analyse immer die gleiche Flächengröße in den Bildern aus. Die Größe des zu analysierenden Bereichs hängt von der Vergrößerung, der Bildauflösung, anderen Einstellungen für die Aufnahme usw. ab. Die Analyse kann beschleunigt oder genauer gemacht werden, indem persönliche Makros für die Analyse verwendet werden. Makros können beispielsweise verwendet werden, um sicherzustellen, dass der ausgewählte Bereich in den untersuchten Bildern immer gleich ist. Detaillierte Beschreibungen zum Erstellen von Makros, die die beste Bildanalyse gemäß bestimmten Fotoeinstellungen ermöglichen, finden Sie auf der ImageJ-Website.
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Representative Results
In dem in diesem Manuskript vorgestellten Experiment wurden die Wirkungen von zwei östrogenen Substanzen in fünf Konzentrationen getestet, beginnend mit der Befruchtung für 5 Tage an Tg(vtg1:mCherry) Zebrafischembryonen. Wir untersuchten, ob fluoreszierende Signale in der Leber von Fischen am Ende der Expositionszeit aufgrund der Substanzen auftraten und ob es Unterschiede in der Östrogenität der beiden Substanzen gab. Die Ergebnisse wurden anhand der fluoreszierenden Bilder und integrierten Dichtewerte ausgewertet. Im Allgemeinen induzierten beide Substanzen die Expression des Transgens bis zum Ende der Expositionszeit bei jenen Testkonzentrationen, bei denen Individuen überlebten. Bei unbehandelten Kontrollfischen war kein fluoreszierendes Signal sichtbar.
Bei der höchsten Testkonzentration (8 m) starben alle Personen, so dass in diesem Fall das fluoreszierende Signal nicht untersucht werden konnte. Bei niedrigeren Konzentrationen (0,5 –M–4 M) wurde ein starkes fluoreszierendes Signal in der Leber der Embryonen beobachtet (Abbildung 4A). Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Fluoreszenzintensität und der Größe der fluoreszierenden Bereiche (p < 0,05) beobachtet. Die integrierten Dichtewerte von ZOL (Abbildung 4C) zeigen, dass die Substanz das Auftreten eines fluoreszierenden Signals induzierte. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den integrierten Dichtewerten und zwischen den Behandlungen (p < 0,05) festgestellt. Die durchschnittliche integrierte Dichte schwankte zwischen 31,26 x 13,95 (0,5 m) und 34,25 bis 15,36 (4 m).
Während der Behandlung mit der "-ZOL" wurde keine Mortalität dokumentiert, und die Substanz induzierte Transgenaktivität bei allen Behandlungskonzentrationen. Die Fluoreszenzintensität und die Größe der Fluoreszenzfläche nahmen mit zunehmender Konzentration zu, wie in den Fluoreszenzbildern zu sehen ist (Abbildung 4B). Vergleicht man die fluoreszierenden Bilder von '- und '-ZOL visuell, waren sowohl die Signalstärke als auch die Größe des fluoreszierenden Bereichs bei den gleichen Behandlungskonzentrationen der beiden Stoffe für die ,-ZOL" sichtbar schwächer. Untersucht man die integrierten Werte von '-ZOL (Abbildung 4D), hat sich der durchschnittliche integrierte Dichtewert zwischen den niedrigsten und höchsten Behandlungskonzentrationen fast verdoppelt. Bei den bei der ,,ZOL" gab es jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen den integrierten Dichtewerten der einzelnen Konzentrationen (p < 0,05). Die durchschnittliche integrierte Dichte schwankte zwischen 15,86 x 4,08 (0,5 m) und 21,73 bis 5,94 (8 ,M).
Abbildung 4: Darstellung der integrierten Dichtewerte, die sich aus der Intensität der fluoreszierenden Signale in der Leber und der Größe des betroffenen Bereichs ergeben, die durch die Behandlung von 5 Tage alten Tg(vtg1:mCherry) transgenen Zebrafischembryonen verursacht werden. Im Experiment wurden Östrogen-empfindliche Embryonen der Biomarker-Zebrafischlinie (20 Larven pro Gruppe in drei Replikationen in jeder Behandlungskonzentration) ab der Befruchtung 5 Tage lang mit 0,5 -M–8-M-Konzentrationen von .- und -ZOL behandelt. Bilder der Fischleber für die Fischlebern für die Fische (A) und die B-zeigen deutlich, dass die Stoffe das Auftreten des fluoreszierenden Signals induzierten. Integrierte Dichtedaten werden als Mittelwert dargestellt , Standardabweichung (SD = Fehlerbalken). Die Daten wurden mit den iterativen Grubbs' analysiert, um Ausreißer zu identifizieren, die ausgeschlossen wurden. Die Daten wurden mit dem Shapiro-Wilk Normalitätstest auf Normalität überprüft und die Einhaltung der Anforderungen parametrischer Methoden festgelegt. Statistische Analysen wurden mit einer einseitigen ANOVA durchgeführt, die einem Dunnett-Test folgte. Bei der Untersuchung der integrierten Dichtewerte wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den Behandlungen in den Fällen von '-ZOL (C) und '-ZOL (D) (p < 0.05) festgestellt. Maßstabsleiste = 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Durch die Untersuchung der integrierten Dichtewerte, die aus den gleichen Behandlungskonzentrationen der beiden Stoffe(Abbildung 5)gewonnen wurden, stellte die ZOL jeweils höhere integrierte Dichtedurchschnitte relativ zu der --ZOL dar, was mit den unterschieden den in den Fluoreszenzbildern beobachteten Signalstärken übereinstimmt. Bei allen Behandlungskonzentrationen wurden signifikante Unterschiede (0,5 ,M, p = 0,0011; 1 m, p = 0,0003; 2 m, p = 0,0329; und 4 'M, p = 0,0325) festgestellt.
Abbildung 5: Vergleich der integrierten Dichtewerte von S- und Zearalenol. Integrierte Dichtedaten werden als Mittelwert dargestellt, Standardabweichung SD = Fehlerbalken. Die Daten wurden mit iterativen Grubbs' analysiert, um Ausreißer zu identifizieren, die ausgeschlossen wurden. Die Daten wurden mit dem Shapiro-Wilk Normalitätstest auf Normalität überprüft und die Einhaltung der Anforderungen parametrischer Methoden festgelegt. Bei jeder Konzentration wurden signifikante Unterschiede bei ungepaarten t-Tests zwischen den C-ZOL und der -ZOL -Konzentration (0,5 ,M, p = 0,0011; 1 m, p = 0,0003; 2 M, p = 0,0329; und 4 ,M, p = 0,0325) festgestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Verwendung von Biomonitoren/Bioindikatoren für östrogene Wirkungen hat sich in toxikologischen Studien ausgebreitet. In-vivo-Modelle spielen eine herausragende Rolle, denn im Gegensatz zu In-vitro-Tests liefern sie nicht nur Informationen über das Ansprechen einer Zelle oder eines Rezeptors, sondern ermöglichen auch die Untersuchung komplexer Prozesse im Organismus. Mehrere transgene Linien zur Untersuchung östrogener Wirkungen wurden aus Zebrafischen hergestellt, von denen eine Tg(vtg1:mCherry) für diese Studien verwendet wurde. Die hier beschriebene Methode veranschaulicht ein Protokoll zur Prüfung von Embryonen dieser Linie, um östrogenaktivität in vivo in reinen Wirkstoffen zu erkennen.
Männchen und Embryonen der Linie sind auch für den Nachweis östrogene Effekte geeignet, aber Embryonen haben mehrere Vorteile, die ihre Benutzerfreundlichkeit fördern. Insbesondere ist der Körper transparent, so dass das fluoreszierende Signal in der Leber leicht beobachtet werden kann. Die Zebrafischleber beginnt sich 6 Stunden nach der Befruchtung (6 hpf) zu entwickeln und beginnt nach 50 Stunden (50 hpf) zu arbeiten. Zuerst bildet sich der linke Leberlappen, und bei 96 Stunden (96 hpf) erscheint auch der rechte Leberlappen. Die endgültige Form der Leber wird um tag 5 (120 hpf)28,29entwickelt. Die Leber ist in der Lage, endogenes Vitellogenim ab dem Alter von 2-3 Tagen eines Embryos14zu produzieren, was mit dem Auftreten des fluoreszierenden Signals in der Tg(vtg1:mCherry) Linie15zusammenfällt. Daher sollte bei der Planung von Experimenten berücksichtigt werden, dass ein fluoreszierendes Signal nur in der Embryoleber von damals zu erwarten ist. Die Leber der 5 Tage alten Embryonen ist bereits in einem relativ großen Bereich gut definiert, wo das fluoreszierende Signal unter einem Stereomikroskop leicht zu erkennen ist. Dies ermöglicht die Entwicklung von Testprotokollen, die nicht den Tierschutzgesetzen unterliegen. Vitellogenin, und ähnlich das fluoreszierende Protein, werden durch den linken Lappen der Leber der Embryonen15produziert. Daher ist die räumliche Ausrichtung der Embryonen wichtig für den Nachweis des stärksten Signals bei der Untersuchung des Fluoreszenzsignals oder beim Fotografieren. Aus diesem Grund wurden Embryonen im Protokoll auf die linke Seite gelegt. Wie aus den repräsentativen Ergebnissen hervorgeht, wird die östrogene Wirkung einer Testprobe durch das fluoreszierende Signal in der Leber deutlich angezeigt, so dass die Ergebnisse auch visuell ausgewertet werden können. Wenn die Quantifizierung der Ergebnisse erforderlich ist, ist der integrierte Dichtewert, der vom ImageJ-Programm definiert wird, angemessen. Für eine ordnungsgemäße Auswertung ist es jedoch unerlässlich, dass während des Experiments Bilder mit den gleichen Einstellungen aufgenommen werden und dass die Größe der hervorgehobenen Fluoreszenzbereiche in jedem Bild gleich ist. Zusammen mit der präzisen Positionierung der Embryonen sind dies die wichtigsten Schritte im Protokoll. Es ist wichtig zu erwähnen, dass bei Embryonen die Expression des Transgens, ähnlich wie bei der Produktion von endogenem Vitellogenin, eine große Dispersion und Unterschiede in der individuellen Empfindlichkeit aufweist. In einigen Fällen kann dies zu großen Abweichungen in den Ergebnissen führen, die bei der Gestaltung der Experimente berücksichtigt werden sollten.
Ein wichtiger Aspekt bei der Bestimmung der Behandlungskonzentrationen ist, dass die Zellen der Embryonen und damit die Leberzellen durch hohe Konzentrationen hochgiftiger Substanzen geschädigt werden können, was zu einem Rückgang der Vitellogenin-Induktion führen kann. Daher sollten Tests in Konzentrationen unter LC1015durchgeführt werden.
Der Vergleich der Empfindlichkeit von Östrogen-empfindlichen Fischlinien zueinander ist eine schwierige Aufgabe, da die bisher beschriebenen Linien nach verschiedenen Protokollen5,14,15,16getestet wurden. Die in diesem Protokoll getestete Linie ist in der Lage, Dosis-Wirkungs-Beziehungen in Fällen von reinen Wirkstoffen, Mischungen und Umweltproben zu erkennen, und die erhaltenen Ergebnisse korrelierten gut mit den Ergebnissen mit BLYES-Tests und HeLa-Zellen15,20.
Der Nutzen der Embryonen der Linie für Testmittel ist erwiesen, einschließlich Zearalenon15. In dieser Arbeit wurden zwei Metaboliten des Toxins, das A- und das Zearalenol, getestet. Nach Literaturdaten ist die '-ZOL toxischer als die '-ZOL30 und ihre Östrogenität ist ebenfalls höher31. Diese Ergebnisse werden durch unsere Studien bestätigt. So eignen sich Studien an den Embryonen der Linie auch zum Vergleich der östrogenen Wirkung anderer östrogene Substanzen.
Die Mykotoxinkontamination in der Nahrungskette ist ein globales Problem, so dass mehrere Verfahren verbessert wurden, um den Mykotoxingehalt in Futtermitteln und menschlichen Lebensmitteln zu senken25,32. Eine der vielversprechendsten Lösungen ist der Bioabbau von Mykotoxinen durch Mikroorganismen oder deren Enzyme. Es kann eine wesentliche Methode nach der Ernte sein, um die Mykotoxin-Dekontamination zu verringern oder zu beseitigen. Die ZEA-Erniedrigende Fähigkeit von zahlreichen Bakterienstämmen wurde bisher in der Literatur getestet, jedoch deuten jüngste Forschungsergebnisse, die einen hohen Abbau des Toxins belegen, selten die nachteilige Wirkung von Metaboliten33an. Da die Embryonen dieser Linie theoretisch geeignet sind, die östrogene Wirkung von Proben mit organischem Substanzgehalt15zu testen, kann ein Behandlungsprotokoll entwickelt werden, das helfen kann, die biologischen Abbauprodukte von ZEA und die Qualifizierung der abbauenden Stämme zu testen.
Dieses Protokoll kann in vielerlei Hinsicht entsprechend den geplanten Testendpunkten (z. B. Expositionsbeginn und -länge) und den Proben (z. B. Mischungen oder Umweltproben) geändert werden, die getestet werden sollen und mit anderen Prüfmethoden (z. B. molekularen Methoden) ergänzt werden können. Daher hoffen wir, dass die Verwendung der Tg(vtg1:mCherry) Linie zu einem Modell für Östrogenitätstests und für Standard-Testmethoden wird.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Ess-, Entwicklungs- und Innovationsamt (NKFIH) des Nationalen Fonds für Forschung, Entwicklung und Innovation (NKFIA) unterstützt. Zuschussvereinbarung: NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 Projekt, das von der Europäischen Union kofinanziert wird, und das thematische Exzellenzprogramm NKFIH-831-10/2019 der Szent Istvén Universität, das vom Ministerium für Innovation und Technologie ausgezeichnet wurde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jet Biofil | TCP011024 | |
| Calcium-chloride (CaCl2) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 16383-0-27-39 | |
| GraphPad Prism 6.01 software | GraphPad Software Inc. | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health, USA | Public access software, downloadable from: http://imagej.nih.gov/ | |
| Leica Application Suite X calibrated software | Leica Microsystems GmbH. | We used the softver described in the experiments, but any photographic software complies with the tests | |
| Leica M205 FA stereomicroscope, Leica DFC 7000T camera | Leica Microsystems GmbH. | We used the equipments described in the experiments, but any fluorescent stereomicroscope is suitable for the tests | |
| Magnesium-sulphate (MgSO4) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 20342-0-27-38 | |
| mCherry filter | Leica Microsystems GmbH. | ||
| Mehyl-cellulose | Sigma Aldrich Ltd. | 274429 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf GmbH. | 5242956003 | |
| Pasteur pipette | VWR International LLC. | 612-1684 | |
| Petri-dish | Jet Biofil | TCD000060 | |
| Potassium-chloride (KCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 18050-0-01-33 | |
| Sodium-chloride (NaCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 24640-0-01-38 | |
| Tricane-methanesulfonate (MS-222) | Sigma Aldrich Ltd. | E10521 |
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