Summary
הנוכחי הוא פרוטוקול מפורט עבור השימוש של עוברי הדגים Tg (vtg1: mCherry) לאיתור אפקטים אסטרוגניים. הפרוטוקול מכסה את התפשטות הדג והטיפול של עוברים, ומדגיש את האיתור, תיעוד, והערכה של אותות פלורסנט הנגרמת על ידי תרכובות משבשים האנדוקרינית (EDC).
Abstract
יש הרבה תרכובות הפרעה אנדוקרינית (EDC) בסביבה, במיוחד החומרים אסטרוגניים. הגילוי של חומרים אלה קשה בשל הגיוון הכימי שלהם; לכן, יותר ויותר השפעה-זיהוי שיטות משמשות, כגון האסטרוגניים רגיש ביואוטור/אורגניזמים bioindicator. האורגניזמים הללו כוללים מספר דגמי דגים. פרוטוקול זה מכסה את השימוש של הצינור הטרנסגניים Tg (vtg1: mCherry) בתור אורגניזם ביוטרי, כולל הפצת הדגים והטיפול בעוברים, עם דגש על איתור, תיעוד, והערכה של אותות פלורסנט הנגרמת על ידי edc. מטרת העבודה היא הדגמה של השימוש בעוברים קו Tg (vtg1: mCherry) כדי לזהות אפקטים אסטרוגניים. העבודה הזאת מתעד את השימוש בעוברים הטרנסגניים (vtg1: mCherry) לאיתור אפקטים אסטרוגניים על ידי בדיקת שני חומרים אסטרוגניים, α-ו β-zearאלנבי. הפרוטוקול המתואר הוא רק בסיס לעיצוב מוסר; שיטת הבדיקה יכולה להיות מגוונת בהתאם לנקודות הקצה של הבדיקה ולדגימות. כמו-כן, ניתן לשלב אותה בשיטות שיטה אחרות, ובכך להקל על השימוש העתידי בקווים הטרנסגניים.
Introduction
יש מספר משמעותי של תרכובות משבשי אנדוקריניות (EDC) הינם בין החומרים המסוכנים ביותר בסביבה שלנו. אלו תרכובות אסטרוגניים בעיקר לזהם מים ממשאבי הטבע. המגוון הכימי של החומרים השייכים לקבוצה גורם בדיקה לנוכחותם קשה, כמו שיטות אנליטיות שונות נדרשות לגילוי שלהם. מבוסס על המבנה הכימי שלהם קשה מאוד לקבוע אם החומר הוא בעצם מסוגל לפעול כמו אסטרוגן. בנוסף, חומרים אלה אינם נוכחים אף פעם בצורה טהורה בסביבה, כך שההשפעות שלהם עשויות להיות מושפעות מתרכובות אחרות,1מדי. בעיה זו ניתן לפתור על ידי אפקט-זיהוי שיטות, כגון השימוש של ביואוטור/bioindicator אורגניזמים הרואים אפקטים אסטרוגניים2,3,4,5.
לאחרונה, מגוון של קו תא6 ו שמרים מבוססי מערכות מבחן2,3 פותחו כדי לזהות אפקטים אסטרוגניים. עם זאת, אלה הם בדרך כלל רק מסוגלים לזהות את הכריכה של החומר לקולטן אסטרוגן2,3. בנוסף, הם אינם יכולים לדגמן תהליכים פיזיולוגיים מורכבים באורגניזם, או כדי לזהות שלבים רגישים להורמונים של שלבי החיים; לפיכך, הם מובילים לעתים קרובות לתוצאות כוזבות.
ידוע כי גנים מסוימים להגיב ברגישות לאסטרוגן חיים אורגניזמים7. זיהוי של מוצרי הגן על ידי שיטות ביולוגיה מולקולרית אפשרי גם על חלבון או mrna רמה8,9, אבל בדרך כלל כרוך הקרבת בעלי חיים. חוקי הגנת בעלי חיים הפכו להיות חמורים יותר, ויש ביקוש הולך וגובר למערכות בדיקה חלופיות הממזער את מספר והסבל של בעלי חיים המשמשים בניסויים או בהחלפת המודל החי עם מערכת מודל אחרת10. עם גילוי של חלבונים פלורסנט ויצירת קווי סמנים, הטכנולוגיות הטרנסגניים לספק חלופה טובה11. עם הקווים האלה, ההפעלה של הגן רגיש לאסטרוגן ניתן לבחון ב vivo.
בין החוליות, הפוטנציאל של דגים בהערכת הסיכון הסביבתי הוא יוצא מן ההכלל. הם מציעים יתרונות רבים על פני דגמי היונקים: להיות אורגניזמים מימיים, הם מסוגלים לקלוט מזהמים בכל גופם, לייצר מספר רב של צאצאים, וחלק מהמין שלהם מאופיין בזמן הדור הקצר. המערכת האנדוקרינית והתהליכים הפיזיולוגיים שלהם מראים דמיון רב עם בעלי חוליות אחרים ואפילו עם יונקים, כולל בני אדם12.
כמה גנים לגילוי של תופעות אסטרוגניים דגים ידועים גם. החשובים ביותר הם קולטני אסטרוגן ארומטאז-b, כוראוגנב-H, ו vitellogenin (vtg)7,13. לאחרונה, מספר שורות אסטרוגן המייצרים ביוסנסור יש גם נוצר מדגמי דגים המשמשים במעבדה, כגון מן דג זברה (danio rerio)4,5,14,15,16,17. היתרון העיקרי של דג דג זברה ביצירת קווי ביוסנסור הוא הגוף השקוף של העוברים והזחלים, כי אות הכתב הפלורסנט יכול להיות בקלות למדו בvivo מבלי להקריב את החיה10. בנוסף להגנה על בעלי חיים, היא גם תכונה רבת ערך כפי שהיא מאפשרת ללמוד את התגובה של אותו אדם בתקופות שונות של הטיפול18.
הניסויים האלה משתמשים. בכתב מהונדס לכתבת קו15 המבנה הטרנסגנטי המשמש לפיתוח של Tg (vtg1: mCherry) יש ארוך (3.4 kbp) מקדם טבעי vitellogenin-1. קולטן אסטרוגן (ER) הוא חלבון משפר מופעל על ידי ליגנדס כי הוא נציג של סטרואידים/משפחה קולטן גרעינית. ER נקשר רצפי DNA ספציפיים הנקראים אלמנטים אסטרוגן תגובה (סרס) עם זיקה גבוהה וביטוי גנטי transactivates פעיל בתגובה אסטרדיול וחומרים אסטרוגניים אחרים, כך הרבה יותר ב-היזם גורם תגובה חזקה יותר19. ישנם 17 אתרי ERE באזור המקדם של המבנה הטרנזגני Tg (vtg1: mCherry) והם צפויים לחקות את הביטוי של ה-vtg הגן היליד15. יש ביטוי מתמשך של אות פלורסנט בנשים מובחלות מינית. עם זאת, אצל זכרים והעובר הביטוי בכבד ניתן לראות רק על הטיפול בחומרים אסטרוגניים (איור 1).
איור 1: אות פלורסנט אדום בכבד של vtg1: mCherry הטרנסגניים בוגרים ו 5 העוברים dpf, בעקבות 17-אני-estradiol (E2) אינדוקציה. אצל נקבה ואצל גבר שטופלו E2 (25 μg/L חשיפה זמן: 48 שעות) זריחה חזקה של הכבד הוא גלוי אפילו דרך העור פיגמנט. אין אות פלורסנט נראה בלתי מטופל זכר (א). בעקבות E2 אינדוקציה (50 μg/L חשיפה זמן: 0-120 hpf), אות פלורסנט אדום בכבד של 5 עוברים dpf יכול להיות גם נצפתה, אשר אינו גלוי בעוברי שליטה (ב). בעוד האות פלורסנט הוא ברציפות להציג נשים למבוגרים, בעיקר זכרים ועוברים של הקו מתאימים לגילוי אפקטים אסטרוגניים. (BF: שדה בהיר, mCherry: תצוגת פלורסנט אדום התצוגה, תמונות רגיל יחיד, סרגל קנה מידה A: 5mm, סרגל בקנה מידה B: 250 μm) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
העיתונאי מטעם הדובדבן. מתבטא רק בכבד בגלל vitellogenin מיוצר רק בנוכחות של אסטרוגן, אין אות פלורסנט בפקדים. בגלל הביטוי הוא רק בכבד, הערכת התוצאות היא הרבה יותר קל15.
הרגישות והשימושיות של העוברים קו זה נחקרו על תערובות מורכבות אסטרוגניים שונים גם על דגימות סביבתיות15,20, וברוב המקרים יחסים במינון-תגובה תועדו (איור 2). עם זאת, במקרה של רעיל מאוד, בעיקר hepatotoxic, חומרים (למשל, zearאלנבי), רק אות ניאון חלשה מאוד עשוי להיות גלוי בכבד של עוברים מטופלים ואת האות פלורסנט בעוצמה מקסימלית שנגרמו ניתן להגיע בתוך טווח ריכוז קטן מאוד, מה שמקשה להקים מינון-אפקט יחסים20.
איור 2: דיאגרמת מינון-תגובה (A) ותמונות פלורסנט (mCherry) של הכבד (ב) חשוף ל -17-α-ethynilestradiol (EE2), ב 5 dpf vtg1: הזחלים של שרי. התוצאות מבוטאות כדחיסות משולבת שנוצרת מעוצמת האות ומגודל האזור המושפע (± SEM, n = 60). 100% מתייחס למקסימום שנצפה. עוצמת אות פלורסנט גדלה בהדרגה עם ריכוז. סרגל בקנה מידה = 250 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
ישנם כמה חומרים אסטרוגניים הנמצאים בסביבה, כגון 17-β-estradiol (ריכוז סביבתי: 0.1 – 5.1 ng/L)21, 17-α-אתנוליסטרנול (ריכוז סביבתי: 0.16 – 0.2/l)22, zearאלנבי (ריכוז סביבתי: 0.095 – 0.22 μg/l)23, ביספינול-A (ריכוז סביבתי: 0.45 – 17.2 mg/l)24. בעת בדיקת חומרים אלה בטופס פעיל טהור בעזרת עוברי הטרנסגניים mCherry, ריכוזי האפקט הנצפה הנמוך ביותר (LOEC) עבור זיהוי הסימנים פלורסנט היו 100 ng/L עבור 17-אני-estradiol, 1 ng/L עבור 17-α-ethynol, 100 ng/L עבור zearalenone, ו 1 מ"ג/L עבור ביייננול-A (96 – 120 hpf טיפול), אשר קרוב מאוד או בתוך מגוון של ריכוזי הסביבה של החומרים15. הקו הטרנסגניים Tg (vtg1: mCherry) יכול לסייע בזיהוי אסטרוגניות בדגימות שפכים לאחר חשיפה ישירה. הקו רגיש כמו בדיקת אסטרוגן שמרים נפוץ, מבחן אסטרוגן שמרים (BLYES) בחינה15. בעזרת קו זה, השפעות ההגנה של ביתא-ציקלודטרינים נגד רעילות הנגרמת על-ידי כימיקלים אושרה באמצעות תערובות כימיות20.
בדו ח האחרונות, השימוש vivo של הקו הטרנסגניים הוכח בעזרתו של שני אסטרוגניים zearאלנבי (ZEA) מטבוליטים, α-ו β-zearאלנבי (α-ZOL ו β-ZOL)25. בסיס הפרוטוקול מתאים ללמוד את ההשפעות אסטרוגניים של מספר תרכובות או דגימות סביבתיות על Tg (vtg1: mCherry) עוברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול בעלי החיים אושר תחת חוק רווחה בעלי חיים הונגרית וכל המחקרים הושלמו לפני האנשים שטופלו היה להגיע לשלב האכלה חינם.
1. הקציר וטיפול העובר
- שמור Tg (vtg1: mcherry) דג זברה ב 25.5 ± 0.5 ° c, pH = 7 ± 0.2, מוליכות בין 525 ± 50 μs/m, רמת החמצן ≥ 80% של הרוויה, ו 14 h אור ו 10 h מחזור כהה.
- ממלאים את מיכלי ההזדווגות עם מים המערכת ולהקים את הדג להזדווגות אחר הצהריים לפני קצירת ביצים.
- מניחים את הדגים זכר ונקבה לתוך הטנק ולהפריד אותם בעזרת מחיצה.
- הסר את המפריד מהמיכלים כאשר מתגי האור בבוקר הבא. בדוק את מיכלי ההזדווגות עבור ביצים כל 15 – 20 דקות.
- לקצור את כל העוברים באמצעות מסננת תה או רשת בסדר בצפיפות ארוגים ולשלב אותם לתוך צלחת פטרי אחת גדולה עם E3 מאגר (5 מ"מ נתרן כלוריד, 0.17 מ"מ אשלגן כלוריד, 0.33 מ"מ סידן כלוריד, 0.33 מ"מ מגנזיום גופרתי) או מים מערכת ברורה.
- מניחים את העוברים בחממה שנקבעו ל 25.5 ± 0.5 ° c.
- אחרי 1 – 1.5 h, להסיר ולהשליך ללא הופרות או חלוקה כראוי חלוקת ביצים עם העברת פלסטיק pipet תחת מיקרוסקופ מבתר.
הערה: ביצים בלתי מופרות הן אטומות; ביצים מופרות הן שקופות. כדי להתחיל את הטיפול בשלב מאוחר יותר של פיתוח, שים לב להתפתחות הנורמלית של האנשים שטופלו. - מניחים את העוברים הנבחרים בכלי הטיפול (לדוגמה, בצלחות פטרי או בלוחות של תרבית רקמה) שכבר סומנו והתמלאו בריכוזים שונים של חומר הניסוי.
- הדגירה של העוברים ב 25.5 ± 0.5 ° צ' עד סוף הניסוי.
הערה: עוברים יכולים להגיב עם רגישות אישית משמעותית לתרכובות אסטרוגניים שונות, לכן מומלץ להשתמש לפחות 15 עוברים בשלושה טיפולים חוזרים לפחות כדי להעריך את הניסוי כראוי. בעת בחירת הגורם המכיל, זכור כי ההתפתחות של העובר דורש לפחות 200 μL של מים26. בניסוי זה העוברים הודערו עד 120 hpf ב 25.5 ± 0.5 ° c. - רענן את פתרון הבדיקה אם הוא מקבל כדי לשמור על ריכוז הטיפול. היזהר בעת שינוי פתרון הבדיקה כדי למנוע פגיעה בעוברים.
הערה: ניתן גם לחקור את התמותה או סימפטומים תת-קטלניים במהלך הניסוי. הריכוזים המשמשים צריך להישאר יציב ככל האפשר כדי לקבל תוצאות אמינות. ניתן להשיג זאת בקלות על-ידי רענון פתרונות הבדיקה. תדירות הרענון עשויה להשתנות בהתאם לחומר המבחן. לכן, מומלץ לבדוק את הריכוז של חומר המבחן באמצעות מדידות אנליטיות כדי לקבוע את תדירות עדכוני הפתרון.
2. הרימות הכנה לצילום
- הכינו 4% מתילצלולוזה עם MS-222 (tricaine-מתאן-סולולאט) מראש.
- כדי לעשות זאת, להוסיף 4 מ"ג/mL MS-222 כדי 100 mL מים מזוקקים כפולים לריכוז הסופי של 0.168 mg/mL, ולהביא את הפתרון 4 ° c. ואז להוסיף 4 גרם של מתילצלולוזה. מערבבים את זה עם מערבב מגנטי, ואז משאירים אותו ב 4 ° c בלילה.
- למחרת, מערבבים את זה שוב והפתרון צריך להיות מוכן לשימוש. אם מתילתאית לא לגמרי התפרקה לשים אותו בחזרה 4 ° c ולחכות עוד כמה שעות.
- במקום 5 הזחלים בני היום לתוך 5 ס מ צלחת פטרי לכל קבוצה טיפול עם פיפטה פסטר.
- הסר את פתרון הטיפול מהזחלים עם פיפטה פלסטי, ולאחר מכן מלא את צלחת פטרי עם 2 מ ל של 0.02% MS-222 הרדמה פתרון.
הערה: ההרדמה יעילה בדרך כלל בתוך פחות מדקה. הזחלים מורדם אם הם לא. שוחים מרחק בתגובה למגע מנת יתר של MS-222 יכולה להרוג את הזחלים. - ממלאים כל ריבוע של צלחת פטרי במיוחד 10 ס"מ עם 4% מתילצלולוזה עם MS-222 (איור 3).
הערה: הדבק 2 1.5 x 1.5 שטחים רבועים בתחתית צלחת פטרי באמצעות יריעות פלסטיק (גובה 1 מ"מ, 5 מ"מ רוחב). 20 זחלים ניתן להציב אחד ליד השני בריבוע. במקום צלחת פטרי שתוכננה במיוחד, ניתן להשתמש במיכל קצה נמוך נוסף כדי לתקן את מיקום העוברים.
איור 3: צלחת פטרי בגודל 10 ס מ עם מודבק 1.5 x 1.5 ס"מ רחב, 1 מ"מ גיליון פלסטיק עבה משבצות עבור הזחלים הכנה לצילום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
- . עם מעט מים באחד משני הריבועים מהכיכר הראשונה העבירו את הזחלים למשבצת השנייה.
הערה: בעזרת העברה זו, 4% מתילתאית המשמש לצילום לא יהיה מדולל והזחלים לא יסתובב במהלך הדמיה. - בכיכר השנייה, לסובב הזחלים האוריינט בצד שמאל שלהם בעדינות ללחוץ אותם למטה לתחתית התאית עם טיפ מיקרוטוען מיקרו לחתוך עד 2 ס מ.
הערה: אין להשתמש בטיפים אחרים בצנרת משום שהם גורמים לפגיעה בזחלים.
3. מיקרוסקופיה
הערה: הצילום אינו הורג את החיות. בעלי חיים יכולים להיות מתעורר על ידי הסרתם ממתילתאית והצבת אותם במים מערכת טריים או פתרון הטיפול, כך הפרט אותו ניתן לבחון מספר פעמים במהלך הטיפול.
- על מנת להעריך את האות של הכתב המבוטא, התמונה העוברים עם אותה השקפה והגדרות.
הערה: ראה שלב 2.6 למיקום מיטבי של העובר. התמונות בכתב היד נלקחו תחת התנאים שתוארו. שדה בהיר: הגדלה של 60x, 6 ms התערוכה, איריס 100%, לצבור: 1.1, תמונות פלורסנט: הגדלת 60x, 300 ms התערוכה, איריס: 100%, לצבור: 1, מסנן mCherry, מקור אור פלורסנט: מרקורי מתכת הליד הנורה. עבור צילום לקיחת פלורסנט stereomicroscope, מצלמה ייעודית, ואת התוכנה עבור מיקרוסקופ שימשו. - מניחים את צלחת פטרי על הבמה של המיקרוסקופ.
- להתמקד בכבד של העובר וללכוד תמונת שדה בהיר באמצעות התוכנה המשויכת.
- העבר את המיקרוסקופ למסנן mCherry ולקח תמונת פלורסנט של הכבד תחת אור פלורסנט באמצעות התוכנה המשויכת.
הערה: בצע את כל השלבים הפלואורסצנטית בחושך. אין לשנות את ההגדלה, ההתמקדות או מיקום העובר בין לכידת השדה הבהיר לבין תמונות הפלורסנט, מאחר שפעולה זו תסייע בניתוח התמונות. - חזור על שלבים 3.3 ו-3.4 עד שכל העוברים בניסוי בתמונה.
4. קביעת צפיפות משולבת
הערה: אחד האינדיקטורים הטובים ביותר להשוואת עוצמת אות פלורסנט הוא ערך הצפיפות המשולב (כלומר, התוצר של האזור וערך אפור). אחת הדרכים הקלות ביותר לקביעת דחיסות משולבת היא להשתמש בתוכנית ImageJ27. התוכנית זמינה באינטרנט וניתן להתקינה במחשב.
- הפקודה Open j לאחר מכן להעלות את תמונת הפלורסנט כדי להיות מנותח על ידי גרירה והדרופינג התמונה או לחיצה על הקובץ | . פתח אתזה
- לחצו על התמונה | צבע | פצל ערוצים כדי לפצל את התמונה שנעשתה על-ידי מסנן הפלורסנט בהתאם לתרשים הצבע RGB.
- עבוד עם הספקטרום של תמונת הערוץ האדום, סגור את הערוצים האחרים.
- הגדר אזור אליפטי בגודל דומה בתמונה כך שאותות שווא לא יפריעו להערכה. בעזרת כלי האליפסה , ציירו אליפסה מעל אזור הכבד המסומן במדויק ככל האפשר.
- אם האות חלשה להשתמש בתמונות מיקרוסקופ אור (כלומר, זוג השדה הבהיר של תמונת פלורסנט) כדי לקבוע את מיקום הכבד.
- לחץ על לנתח | מדידה כדי לקבוע את עוצמת האות ואת גודל האזור המושפע. ערך הדחיסות המשולבת מחושב באופן אוטומטי על-ידי התוכנה (עמודת IntDen בתרשים).
- המשך בניתוח על-ידי שלבים חוזרים 4.1 – 4.6 עד לניתוח כל תמונות הפלורסנט של כל העוברים בקבוצת הטיפול.
- שמור את הנתונים ולאחר מכן נתח את ערכי הדחיסות המשולבות.
הערה: בחר תמיד את גודל האזור בתמונות במהלך הניתוח. גודל השטח שיש לנתח תלוי בהגדלה, רזולוציית התמונה, הגדרות אחרות לירי וכו '. ניתן להאיץ או לעשות את הניתוח באופן מדויק יותר על-ידי שימוש בפקודות מאקרו אישיות לצורך ניתוח. לדוגמה, ניתן להשתמש בפקודות מאקרו כדי להבטיח שהאזור שנבחר יהיה תמיד זהה בתמונות הנבדקות. תיאורים מפורטים ליצירת פקודות מאקרו המאפשרות ניתוח תמונה מיטבי בהתאם להגדרות התמונה הספציפיות, מצויים באתר האינטרנט של ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בניסוי המוצג בכתב יד זה, ההשפעות של שני חומרים אסטרוגניים נבדקו בחמישה ריכוזים החל הפריה 5 ימים על Tg (vtg1: mCherry) עוברי דג. חקרנו אם אותות פלורסנט הופיעו בכבד של דגים עד סוף זמן החשיפה בגלל החומרים והאם היו הבדלים באסטרוגניות של שני החומרים. תוצאות הוערכו על בסיס של תמונות פלורסנט וערכי צפיפות משולבת. באופן כללי, שני החומרים המושרה ביטוי של הטרנסגנים עד סוף זמן החשיפה בריכוזי המבחנים שבהם אנשים שרדו. במקרים של דגי בקרה לא מטופל, לא היה אות פלורסנט גלוי.
במקרה של α-ZOL, בריכוז הבדיקה הגבוהה ביותר (8 μM) כל האנשים מתו, ולכן במקרה זה לא ניתן היה לבחון את אות הפלורסנט. בריכוזים נמוכים (0.5 μM – 4 μM), אות פלורסנט חזק נצפתה בכבד של העוברים (איור 4A). אין הבדל משמעותי נצפתה בעוצמת הקרינה ובגודל של אזורי פלורסנט (p < 0.05). ערכי צפיפות משולבים α-ZOL (איור 4C), להראות כי החומר המושרה את המראה של אות פלורסנט. לא נמצא הבדל משמעותי בין ערכי הדחיסות המשולבת ובין הטיפולים (p < 0.05). הצפיפות המשולבת הממוצעת מגוונת בין 31.26 ± 13.95 (0.5 μM) ו34.25 ± 15.36 (4 μM).
התמותה לא תועדה במהלך הטיפול עם β-ZOL, והחומר המושרה הפעילות הטרנסגנטית בכל ריכוזי הטיפול. עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית ואת גודל אזור הפלורסנט גדל כמו הריכוז גדל, כפי שנראה בתמונות פלורסנט (איור 4B). השוואת תמונות פלורסנט של α-ו-β-ZOL חזותית, הן חוזק האות בגודל של אזור הפלורסנט היו חלשים בעליל עבור β-ZOL בריכוזים טיפול זהה של שני החומרים. לימוד הערכים המשולבים של β-ZOL (איור 4D), ערך הדחיסות המשולב הממוצע כמעט כפול בין ריכוזי הטיפול הנמוכים ביותר. עם זאת, במקרה של β-ZOL לא היה הבדל משמעותי בין ערכי צפיפות משולבת של ריכוזי בודדים (p < 0.05). הצפיפות המשולבת הממוצעת מגוונת בין 15.86 ± 4.08 (0.5 μM) ו21.73 ± 5.94 (8 μM).
איור 4: הצגת ערכי צפיפות משולבים שמקורם בעוצמת אותות פלורסנט בכבד ומגודל האזור המושפע הנגרם על ידי α-ו-β-zearאלנבי טיפול על 5 יום הישן Tg (vtg1: mCherry) עוברים הטרנסגניים. בניסוי, עוברי אסטרוגן רגיש של קו ביוארקר דג זברה (20 הזחלים לקבוצות בשלושה משכפל בכל ריכוז הטיפול) טופלו עם 0.5 μm – 8 μm ריכוזי של α-ו β-zol מן הפריה ואילך עבור 5 ימים. תמונות של כבדי הדגים עבור α-ZOL (א), ו β-Zol (ב) מראים בבירור כי החומרים המושרה את המראה של האות פלורסנט. נתוני צפיפות משולבים מוצגים כממוצע ממוצע ± סטנדרטי (SD = שגיאה בר). הנתונים נותחו בעזרת הגרובס האיטרטיבי לזיהוי מיירס, שלא נכללו באתר. הנתונים נבדקו לנורמליות עם מבחן שפירו-וילק נורמליות וציות לדרישות השיטות הפרמטרית שנקבעו. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות ANOVA חד כיוון בעקבות מבחן של דנטו. לימוד ערכי צפיפות משולבים, לא נמצא הבדל משמעותי בין הטיפולים במקרים של α-ZOL (C) ו-β-Zol (D) (p < 0.05). סרגל בקנה מידה = 200 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
על ידי בחינת ערכי צפיפות משולבת שהתקבלו מריכוזי טיפול זהה של שני החומרים (איור 5), α-zol הציג גבוה יותר ממוצעים צפיפות משולבת בכל מקרה ביחס β-zol, אשר עקבית עם ההבדלים בין עוצמות האות נצפתה בתמונות פלורסנט. במקרים של כל ריכוזי הטיפול, הבדלים משמעותיים (0.5 μM, p = 0.0011; 1 μM, p = 0.0003; 2 μM, p = 0.0329; ו-4 μM, p = 0.0325) נמצאו.
איור 5: השוואה בין α לבין ערכי צפיפות משולבים β-zearאלנבי. נתוני צפיפות משולבים מוצגים כמשמעות ± סטיית התקן SD = בשורת השגיאה. הנתונים נותחו באמצעות מעבד איטראטיבי ' כדי לזהות מיירס, שלא נכללו. הנתונים נבדקו לנורמליות עם מבחן שפירו-וילק נורמליות וציות לדרישות השיטות הפרמטרית שנקבעו. הבדלים משמעותיים אומתו עם מבחן t מזווג בין α-ZOL ו-β-ZOL במקרה של כל ריכוז (0.5 μM, p = 0.0011; 1 μM, p = 0.0003; 2 μM, p = 0.0329; ו-4 μM, p = 0.0325). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השימוש biomonitors/bioindicators לתופעות אסטרוגניים התפשט במחקרים הרעילות. במודלים vivo לשחק תפקיד מצטיין, כי בניגוד בדיקות חוץ גופית, הם לא רק לספק מידע על התגובה של תא או קולטן, אלא גם לאפשר את החקירה של תהליכים מורכבים באורגניזם. מספר קווים טרנסגניים לחקר השפעות אסטרוגניים הופקו מ-zebrafish, אחד מהם Tg (vtg1: mCherry) שימש למחקרים אלה. השיטה המתוארת כאן ממחישה פרוטוקול לבדיקות העוברים בקו זה כדי לאתר את פעילות האסטרוגן בvivo מרכיבים טהורים ופעילים.
זכרים ועוברי השורה מתאימים גם לגילוי השפעות אסטרוגניים, אך לעוברים יש מספר יתרונות המקדמים את השימושיות שלהם. בפרט, הגוף הוא שקוף, כך האות פלורסנט בכבד ניתן לצפות בקלות. הכבד דג זברה מתחיל לפתח 6 שעות לאחר ההפריה (6 hpf) ומתחיל לעבוד לאחר 50 שעות (50 hpf). ראשית, האונה השמאלית של הכבד נוצרת, ו ב 96 שעות (96 hpf) האונה הימנית של הכבד מופיע גם. הצורה הסופית של הכבד מפותח על ידי בסביבות יום 5 (120 hpf)28,29. הכבד הוא מסוגל לייצר vitellogenin מגיל 2 – 3 ימים של עובר14, אשר בקנה אחד עם המראה של האות פלורסנט ב Tg (Vtg1: mcherry) קו15. לכן, בעת עיצוב ניסויים, יש לקחת בחשבון כי אות פלורסנט ניתן לצפות רק בכבד העובר מאותו זמן. הכבד של העוברים בן 5 ימים כבר מוגדר היטב באזור גדול יחסית, שבו האות פלורסנט ניתן לזהות בקלות תחת stereomicroscope. זה הופך את הפיתוח של פרוטוקולי הבדיקה שאינם כפופים חוקי הגנת בעלי חיים אפשרי. Vitellogenin, ובדומה חלבון פלורסנט, מיוצרים על ידי האונה השמאלית של בכבד של העוברים15. לכן, האוריינטציה המרחבית של העוברים חשובה לגילוי האות החזק ביותר בעת בחינת אות הפלורסנט או צילום. זו הסיבה שעוברים הונחו. משמאל בפרוטוקול כפי שניתן לראות מן התוצאות הנציג, את ההשפעה אסטרוגניים של דגימת מבחן מצוין בבירור על ידי האות פלורסנט בכבד, כך התוצאות ניתן להעריך ויזואלית מדי. אם יש צורך בכמת של התוצאות, ערך הדחיסות המשולב שהוגדר על-ידי התוכנית ImageJ מתאים. עם זאת, עבור הערכה נאותה, הכרחי שהתמונות יילקחו עם אותן הגדרות במהלך הניסוי, ושהגודל של אזורי הפלורסנט המסומנים זהה בכל תמונה. יחד עם המיקום המדויק של העוברים, אלה הם השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול. חשוב לציין כי במקרה של עוברים את הביטוי של הטרנסגנים, בדומה לייצור vitellogenin, מראה פיזור גדול והבדלים ברגישות אישית. במקרים מסוימים, הדבר עלול לגרום לווריאציות גדולות בתוצאות, שיש לקחת בחשבון בעת עיצוב הניסויים.
היבט חשוב בקביעת ריכוזי הטיפול הוא כי התאים של העוברים, ומכאן תאי הכבד, יכול להינזק על ידי ריכוזים גבוהים של חומרים רעילים מאוד, אשר יכול להוביל לירידה ב האינדוקציה vitellogenin. לכן, בדיקות יש לבצע בריכוזים מתחת LC1015.
השוואת הרגישות של קווי דגים רגישים אסטרוגן אחד לשני היא משימה קשה, כי הקווים שתוארו עד כה נבדקו על פי פרוטוקולים שונים5,14,15,16. הקו נבדק בפרוטוקול זה מסוגל לזהות קשרי מינון-אפקט במקרים של מרכיבים פעילים טהורים, תערובות, ודגימות סביבתיות, ואת התוצאות שהתקבלו בקורלציה היטב עם תוצאות בדיקות blyes ובתאי הלה15,20.
שירות העוברים לסוכני הבדיקה הוכח, כולל זאלאלנבי15. בעבודה זו, שני מטבוליטים של הרעלן, α-ו β-zearאלנבי, נבדקו. על פי נתוני הספרות, α-ZOL רעיל יותר מ-β-ZOL30 ו אסטרוג'ניטי שלה הוא גם גבוה יותר31. תוצאות אלו אושרו על ידי הלימודים שלנו. כך, מחקרים על העוברים של הקו מתאימים גם להשוואת ההשפעות אסטרוגניים של חומרים אסטרוגניים אחרים.
זיהום פטרת בשרשרת המזון הוא בעיה גלובלית, אז כמה הליכים שופרו כדי להפחית את רמות של פטרת בעלי חיים הזנה ומזון אנושי25,32. אחד הפתרונות המבטיחים ביותר הוא השפלה יופילם על ידי מיקרואורגניזמים או על ידי אנזימים שלהם. זו עשויה להיות שיטת תוצרת חקלאית חיונית כדי להקטין או לחסל את טיהור הרעלים. ZEA יכולת משפילה של זנים חיידקיים רבים נבדקו בספרות עד כה, עם זאת, ממצאים מחקר האחרונות להוכיח השפלה גבוהה של הרעלן לעתים נדירות לציין את ההשפעה השליליות של מטבוליטים33. בגלל העוברים של קו זה מתאימים תיאורטית כדי לבדוק את ההשפעות אסטרוגניים של דגימות עם תוכן אורגני החומר15, פרוטוקול טיפול ניתן לפתח כי יכול לעזור לבדוק את המוצרים הביושפלה של zea ואת ההסמכה של זנים משפילים.
פרוטוקול זה ניתן לשינוי בדרכים רבות על פי נקודות קצה הבדיקה המתוכננת (למשל, התפרצות חשיפה ואורך) ולדגימות (למשל, תערובות או דגימות סביבתיות) אשר הולכים להיבדק וניתן להשלים עם שיטות בדיקה אחרות (למשל, שיטות מולקולריות). כך, אנו מקווים כי השימוש של קו Tg (vtg1: mCherry) יהיה מודל של בדיקות אסטרוגניות ועבור שיטות בדיקה סטנדרטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי המשרד הלאומי למחקר, פיתוח וחדשנות (NKFIH) מקרן המחקר, הפיתוח והחדשנות של המדינה (NKFIA); הסכם גרנט: NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-וקופ-16-2017-00008 פרויקט ממומן על ידי האיחוד האירופי, ואת תוכנית מצוינות נושאית NKFIH-831-10/2019 של אוניברסיטת Szent István, הוענק על ידי המשרד לחדשנות וטכנולוגיה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jet Biofil | TCP011024 | |
| Calcium-chloride (CaCl2) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 16383-0-27-39 | |
| GraphPad Prism 6.01 software | GraphPad Software Inc. | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health, USA | Public access software, downloadable from: http://imagej.nih.gov/ | |
| Leica Application Suite X calibrated software | Leica Microsystems GmbH. | We used the softver described in the experiments, but any photographic software complies with the tests | |
| Leica M205 FA stereomicroscope, Leica DFC 7000T camera | Leica Microsystems GmbH. | We used the equipments described in the experiments, but any fluorescent stereomicroscope is suitable for the tests | |
| Magnesium-sulphate (MgSO4) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 20342-0-27-38 | |
| mCherry filter | Leica Microsystems GmbH. | ||
| Mehyl-cellulose | Sigma Aldrich Ltd. | 274429 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf GmbH. | 5242956003 | |
| Pasteur pipette | VWR International LLC. | 612-1684 | |
| Petri-dish | Jet Biofil | TCD000060 | |
| Potassium-chloride (KCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 18050-0-01-33 | |
| Sodium-chloride (NaCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 24640-0-01-38 | |
| Tricane-methanesulfonate (MS-222) | Sigma Aldrich Ltd. | E10521 |
References
- Sumpter, J. P. Endocrine Disrupters in the Aquatic Environment : An Overview. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica. 33 (1), 9-16 (2005).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environmental Toxicology and Chemistry. 15 (3), 241-248 (1996).
- Sanseverino, J., et al. Use of Saccharomyces cerevisiae BLYES Expressing Bacterial Bioluminescence for Rapid, Sensitive Detection of Estrogenic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 71 (8), 4455-4460 (2008).
- Fetter, E., et al. Effect-directed analysis for estrogenic compounds in a fluvial sediment sample using transgenic cyp19a1b-GFP zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 154, 221-229 (2014).
- Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of estrogen receptor transcriptional activation in zebrafish. Endocrinology. 152 (7), 2690-2703 (2011).
- Rider, C. V., Hartig, P. C., Cardon, M. C., Wilson, V. S. Development of a competitive binding assay system with recombinant estrogen receptors from multiple species. Toxicology Letters. 184 (2), 85-89 (2009).
- Gunnarsson, L., Kristiansson, E., Förlin, L., Nerman, O., Larsson, J. Sensitive and robust gene expression changes in fish exposed to estrogen - a microarray approach. BMC Genomics. 8 (149), 1-9 (2007).
- Vander Ven, L. T. M., et al. Vitellogenin expression in zebrafish Danio rerio evaluation by histochemistry, immunohistochemistry, and in situ mRNA hybridisation. Aquatic Toxicology. 65 (1), 1-11 (2003).
- Bakos, K., et al. Developmental toxicity and estrogenic potency of zearalenone in zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 136-137, 13-21 (2013).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments - A commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Tsang, M. Zebrafish : A Tool for Chemical Screens. Birth Defects Research, Part C. 90 (3), 185-192 (2010).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Lee, C., Na, J. G., Lee, K., Park, K. Choriogenin mRNA induction in male medaka, Oryzias latipes as a biomarker of endocrine disruption. Aquatic Toxicology. 61 (3-4), 233-241 (2002).
- Chen, H., et al. Generation of a fluorescent transgenic zebrafish for detection of environmental estrogens. Aquatic Toxicology. 96 (1), 53-61 (2010).
- Bakos, K., et al. Estrogen sensitive liver transgenic zebrafish (Danio rerio) line (Tg(vtg1:mCherry)) suitable for the direct detection of estrogenicity in environmental samples. Aquatic Toxicology. 208, 157-167 (2019).
- Abdelmoneim, A., Clark, C., Mukai, M. Fluorescent reporter zebrafish line for estrogenic compound screening generated using a CRISPR/Cas9-mediated knock-in system. Toxicological Sciences. 173 (2), 336-346 (2019).
- Tong, S. K., et al. A cyp19a1b-GFP (aromatase B) transgenic zebrafish line that expresses GFP in radial glial cells. Genesis. 47 (2), 67-73 (2009).
- Segner, H. Zebrafish (Danio rerio) as a model organism for investigating endocrine disruption. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C: Toxicology and Pharmacology. 149 (2), 187-195 (2009).
- Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Res. 29 (14), 2905-2919 (2001).
- Faisal, Z., et al. Protective effects of beta-cyclodextrins vs. zearalenone-induced toxicity in HeLa cells and Tg(vtg1:mCherry) zebrafish embryos. Chemosphere. 240, 1-11 (2020).
- Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in U.S. streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environmental Science and Technology. 36 (6), 1202-1211 (2002).
- Kuch, H. M., Ballschmiter, K. Determination of endocrine-disrupting phenolic compounds and estrogens in surface and drinking water by HRGC-(NCI)-MS in the picogram per liter range. Environmental Science and Technology. 35 (15), 3201-3206 (2001).
- Lundgren, M. S., Novak, P. J. Quantification of phytoestrogens in industrial waste streams. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (11), 2318-2323 (2009).
- Masoner, J. R., Kolpin, D. W., Furlong, E. T., Cozzarelli, I. M., Gray, J. L. Landfill leachate as a mirror of today’s disposable society: Pharmaceuticals and other contaminants of emerging concern in final leachate from landfills in the conterminous United States. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (4), 906-918 (2016).
- Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDA). EFSA Statement on the establishment of guidelines for the assessment of additives from the functional group ‘substances for reduction of the contamination of feed by mycotoxins' 1 EFSA. EFSA Journal. 8 (7), 1-8 (2010).
- Braunbeck, T., et al. Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: the fish embryo toxicity test goes multi-species - an update. Altex. 22 (50), 87-102 (2005).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ober, E. A., Field, H. A., Stainier, D. Y. R. From endoderm formation to liver and pancreas development in zebrafish. Mechanisms of Development. 120 (1), 5-18 (2003).
- Tao, T., Peng, J. Liver development in zebrafish (Danio rerio). Journal of Genetics and Genomics. 36 (6), 325-334 (2009).
- Shier, W. T., Shier, A. C., Xie, W., Mirocha, C. J. Structure-activity relationships for human estrogenic activity in zearalenone mycotoxins. Toxicon. 39 (9), 1435-1438 (2001).
- Panel, E., Chain, F. Appropriateness to set a group health-based guidance value for zearalenone and its modified forms EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). EFSA Journal. 14, 4425 (2016).
- Binder, E. M. Managing the risk of mycotoxins in modern feed production. Animal Feed Science and Technology. 133 (1-2), 149-166 (2007).
- Risa, A., Krifaton, C., Kukolya, J., Kriszt, B., Cserháti, M., Táncsics, A. Aflatoxin B1 and Zearalenone-Detoxifying Profile of Rhodococcus Type Strains. Current Microbiology. 75 (7), 907-917 (2018).
