Summary
여기에 에스트로겐 효과의 검출을위한 제브라피시 배아 Tg (vtg1 : mCherry)의 사용을위한 자세한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 물고기의 전파와 배아의 치료를 커버하고 내분비 방해 화합물 (EDC)에 의해 유도 된 형광 신호의 검출, 문서화 및 평가를 강조한다.
Abstract
많은 내 분 비 방해 화합물 (EDC) 환경에, 특히 에스트로겐 물질. 이러한 물질의 검출은 화학적 다양성으로 인해 어렵습니다. 따라서 에스트로겐 효과에 민감한 바이오 모니터/바이오 지표 유기체와 같은 점점 더 많은 효과 검출 방법이 사용됩니다. 이러한 생체 모니터링 유기체는 여러 물고기 모델을 포함한다. 이 프로토콜은 제브라피쉬 Tg(vtg1: mCherry) 형질전환선을 생체 모니터링 유기체로서 사용하는 것을 다루며, EDC에 의해 유도된 형광 신호의 검출, 문서화 및 평가에 중점을 두고 물고기의 전파 및 배아 의 치료를 포함한다. 이 작업의 목적은 에스트로겐 효과를 검출하기 위해 Tg (vtg1 : mCherry) 형질 전환선 배아의 사용의 데모입니다. 이 작품은 2개의 에스트로겐성 물질, α 및 β 제아롤레놀을 시험해서 에스트로겐성 효과의 검출을 위한 형질제 제브라피시 배아 Tg(vtg1: mCherry)의 사용을 문서화합니다. 설명된 프로토콜은 분석 설계를 위한 기초일 뿐입니다. 시험 방법은 테스트 끝점 및 샘플에 따라 다양할 수 있다. 더욱이, 다른 분석 방법과 결합하여 형질전환선의 향후 사용을 용이하게 할 수 있다.
Introduction
우리 환경에서 가장 유해 물질 중 하나 인 내분비 방해 화합물 (EDC)의 상당수가 있습니다. 이들은 주로 천연 자원에서 물을 오염 하는 에스트로겐 화합물. 그룹에 속하는 물질의 화학적 다양성은 검출을 위해 다른 분석 방법이 필요하기 때문에 존재에 대한 테스트를 어렵게 만듭니다. 그들의 화학 구조에 따라 물질이 실제로 에스트로겐으로 작용할 수 있는지 여부를 결정하는 것은 매우 어렵습니다. 또한, 이러한 물질은 환경에 있는 순수한 형태로 결코 존재하지 않습니다, 그래서 그들의 효력은 그밖 화합물에 의해 영향을 받을 수 있습니다, 너무1. 이러한 문제점은 에스트로겐 효과를 보이는 바이오모니터/바이오지표 유기체의 사용과 같은 효과검출 방법에 의해 해결될 수 있다2,,3,,4,,5.
최근에는 다양한 세포주6 및 효모 기반 시험 시스템2,,3이 에스트로겐성 효과를 검출하기 위해 개발되었다. 그러나, 이들은 일반적으로 에스트로겐 수용체2,,3에물질의 결합을 검출할 수 있다. 또한, 그들은 유기체에서 복잡 한 생리 과정을 모델링 할 수 없습니다., 또는 생활 단계의 호르몬 에 민감한 단계를 감지; 따라서, 그들은 종종 거짓 결과로 이어질.
특정 유전자가 살아있는 유기체7에서에스트로겐에 민감하게 반응하는 것으로 알려져 있다. 분자 생물학 방법에 의한 유전자 제품의 검출은 단백질 또는 mRNA 수준8,,9에서또한 가능하지만, 일반적으로 동물 희생을 수반한다. 동물보호법은 더욱 엄격해졌으며, 실험에 사용되는 동물의 수와 고통을 최소화하거나 동물 모델의 다른 모델시스템(10)을대체하는 대체 시험 시스템에 대한 수요가 증가하고 있다. 형광 단백질의 발견과 바이오 마커 라인의 생성과 함께, 형질 전환 기술은 좋은 대안11을제공합니다. 이 라인을 사용하여, 에스트로겐 에스트로겐 에민감한 유전자의 활성화는 생체 내에서 시험될 수 있습니다.
척추 동물 중, 환경 위험 평가에서 물고기의 잠재력은 뛰어난. 그들은 포유류 모델에 비해 많은 장점을 제공합니다 : 수생 유기체인, 그들은 몸 전체를 통해 오염 물질을 흡수 할 수 있습니다, 자손의 많은 수를 생산하고, 그들의 종의 일부는 짧은 세대 시간을 특징으로한다. 그들의 내분비 체계 및 생리 적 과정은 다른 척추 동물과 심지어 인간 을 포함한 포유 동물과 큰 유사성을 보여줍니다12.
물고기에 있는 에스트로겐 효과의 검출을 위한 몇몇 유전자는 또한 알려져 있습니다. 가장 중요한 것은 에스트로겐 수용체 아로마타제-b, 초리오게닌-H, 비텔로게닌(vtg)7,,13이다. 최근에는 제브라피쉬(Daniorerio)4,,5,,14,,15,,16, 17등 실험실에서 사용되는 생선 모델에서 여러 에스트로겐 생산 바이오센서 라인이 생성되고있다.17 바이오센서 라인을 만드는 데 있어 제브라피쉬의 주요 장점은 형광 기자 신호가동물(10)을희생시키지 않고 생체내에서 쉽게 연구될 수 있기 때문에 배아와 애벌레의 투명한 바디이다. 동물 보호 외에도, 치료18의다른 시기에 동일한 개인의 반응을 연구할 수 있기 때문에 귀중한 기능이기도 하다.
이러한 실험은 비텔로게닌 기자 트랜스제닉 제브라피쉬 라인15를사용합니다. Tg(vtg1:mCherry) 개발에 사용되는 트랜스진 구조는 긴(3.4kbp) 천연 비텔로게닌-1 프로모터를 갖는다. 에스트로겐 수용체(ER)는 스테로이드/핵 수용체 슈퍼패밀리를 대표하는 리간드에 의해 활성화된 증강 단백질이다. ER은 에스트로겐 반응 원소(ERE)라고 불리는 특정 DNA 서열에 높은 친화성을 가지며 에스트라디올 및 기타 에스트로겐 물질에 반응하여 유전자 발현을 트랜스활성화하므로 프로모터에서 ERE가 많을수록 더 강한 반응을일으킨다(19). Tg(vtg1:mCherry) 유전자 생성물의 프로모터 영역에는 17개의 ERE 부위가 있으며, 네이티브 vtg유전자(15)의발현을 모방할 것으로 예상된다. 성적으로 성숙한 여성에서 형광 신호의 지속적인 표현이 있다. 그러나, 남성 및 배아에서 간발현은 에스트로겐성 물질로 치료시만 볼 수있다(도 1).
그림 1: vtg1:mCherry 트랜스제닉 성 제브라피시와 5dpf 배아의 간에서 적색 형광 신호, 17-ß-estradiol (E2) 유도에 따라. 여성 및 E2(25 μg/L 노출 시간:48시간:48시간)로 치료된 남성에서는 간의 강한 형광이 안료 피부를 통해서도 볼 수 있다. 치료되지 않은남성(A)에서형광 신호가 보이지 않습니다. E2 유도(50 μg/L 노출 시간: 0-120 hpf)에 이어, 5dpf 배아의 간에서 적색 형광 신호도 관찰될B수 있으며, 이는 대조군 배아(B)에서 볼 수 없다. 형광 신호는 성인 여성에서 지속적으로 존재하는 동안, 주로 남성과 라인의 배아는 에스트로겐 효과를 검출하기에 적합합니다. (BF: 밝은 필드, mCherry: 빨간 형광 필터 보기, 단일 일반 이미지, 스케일 바 A: 5mm, 스케일 바 B: 250 μm) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
내인성 비텔로게닌과 마찬가지로, mCherry 리포터는 간에서만 표현됩니다. 비텔로게닌은 에스트로겐의 존재에서만 생산되기 때문에 컨트롤에는 형광 신호가 없습니다. 발현은 간에서만 있기 때문에 결과의 평가는훨씬 쉽게 15.
이 선의 배아의 민감도 및 유용성은 다양한 에스트로겐 화합물 혼합물과 또한 환경 샘플15,,20에대해 조사되었으며, 대부분의 경우 용량 반응 관계가 문서화되었다(그림2). 그러나, 고독성, 주로 간독성, 물질(예를 들어, 제랄레네네)의 경우, 처리된 배아의 간에서 매우 약한 형광 신호만이 볼 수 있으며, 발생되는 최대 강도형 형광 신호는 매우 작은 농도 범위 내에 도달할 수 있어 투여 효과관계(20)를확립하기 어렵게 만든다.
도 2: 투여 반응 다이어그램(A) 및 형광 이미지(mCherry)가 17-α-ethynilestradiol(EE2)에 노출된 간(B)의 형광 이미지(mCherry)를 5dpf vtg1:mCherry 애벌레로 노출시켰다. 결과는 신호 강도 및 영향 영역의 크기(±SEM, n = 60)로부터 생성된 통합 밀도로 표현됩니다. 100% 관찰된 최대값을 나타냅니다. 형광 신호 강도는 농도로 점차적으로 증가했습니다. 스케일 바 = 250 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
환경에는 몇 가지 에스트로겐 성 물질이 존재합니다. 17-β-estradiol (환경 농도: 0.1-5.1 ng/L)21,17-α-에티닐에스트라디오(환경 농도: 0.16-0.2 μg/L)2 2,제랄레네(환경 농도: 0.095-0.22 μg/L)23,비스페놀-A(환경 농도: 0.45-17.2 mg/L)24. mCherry 형질전환 배아의 도움으로 순수한 활성 형태로 이러한 물질을 테스트 할 때, 형광 기호 검출을 위한 가장 낮은 관찰 효과 농도(LOEC)는 17-ß-estradiol용 100 ng/L, 17-α-에티닐에스트라디오l용 1ng/L, 제아라레놀용 100ng/L, 비스페놀-A(96-120hpf)15내1mg/L, 1mg/L 또는 1/1의 근사 또는 환경범위 내에 매우 근접한 15개의 환경범위 내에 있었다. Tg (vtg1:mCherry) 형질 전환선은 직접 노출 후 폐수 샘플에서 에스트로겐성을 감지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 라인은 일반적으로 사용되는 효모 에스트로겐 시험, 생물루미니스센트 효모 에스트로겐(BLYES) 분석15만큼민감하다. 이 라인의 도움으로, 제랄레네유발 독성에 대한 베타-사이클로덱스트린의 보호 효과는 화학혼합물(20)을사용하여 확인되었다.
최근 보고서에서, 형질대사의 생체 내 사용은 2개의 에스트로겐제일릭 제아롤론(ZEA) 대사산물, α-및 β-제아롤레놀(α-ZOL 및 β-ZOL)25의도움으로 입증되었다. 프로토콜 기준선은 Tg (vtg1:mCherry) 배아에 여러 화합물 또는 환경 샘플의 에스트로겐 효과를 연구하는 것이 적절하다.
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Protocol
동물 의정서는 헝가리 동물 복지법에 따라 승인되었으며 치료된 개인이 무료 수유 단계에 이르기 전에 모든 연구가 완료되었습니다.
1. 배아 수확 및 치료
- Tg(vtg1:mCherry) 얼룩말피를 25.5 ± 0.5°C, pH = 7±0.2, 525 ± 50 μS/m, 산소 수준 ≥80% 포화, 14h 광 및 10h 암흑 사이클에서 유지하십시오.
- 결합 탱크에 시스템 물을 채우고 계란을 수확하기 전에 오후를 짝짓기위해 물고기를 설정합니다.
- 수컷과 암컷 물고기를 탱크에 넣고 칸막이의 도움으로 분리합니다.
- 다음날 아침에 조명이 켜지면서 탱크에서 디바이더를 제거합니다. 15-20분마다 짝짓기 탱크에서 계란을 확인하십시오.
- 차 스트레이너 또는 조밀하게 짠 미세 메쉬를 사용하여 모든 배아를 수확하고 E3 버퍼 (염화 나트륨 5mM, 염화 0.17 mM 칼륨, 0.33 mM 칼슘 염화칼슘, 0.33 mM 황산염) 또는 깨끗한 시스템 물하나 큰 페트리 접시에 결합합니다.
- 배아를 25.5 ± 0.5 °C로 설정된 인큐베이터에 놓습니다.
- 1-1.5 h 후, 제거 하 고 제거 하 고 제거 하 고 제거 하 고 제거 또는 부적절하게 해부 현미경에서 플라스틱 전송 파이프와 계란을 분할.
참고: 수정되지 않은 계란은 불투명합니다. 수정란은 투명합니다. 개발의 후반 단계에서 치료를 시작 하려면, 치료 되 고 개인의 정상적인 개발에 주의. - 이미 표지되고 시험 물질의 다른 농도로 채워진 처리 혈관(예를 들어, 페트리 접시 또는 조직 배양 판)에 선택된 배아를 놓습니다.
- 실험이 끝날 때까지 배아를 25.5 ± 0.5°C에서 배양한다.
참고: 배아는 다양한 에스트로겐 화합물에 대한 중요한 개별 감도로 반응할 수 있으므로 실험을 제대로 평가하기 위해 적어도 3개의 반복 치료에 적어도 15개의 배아를 사용하는 것이 좋습니다. 용기를 선택할 때, 배아의 발달은 물26의적어도 200 μL가 필요하다는 것을 명심하십시오. 본 실험에서 배아는 25.5± 0.5°C에서 120hpf까지 배양하였다. - 치료 농도를 유지하기 위해 괴상한 경우 시험 용액을 새로 고칩니다. 배아를 손상시키지 않도록 테스트 용액을 변경할 때주의하십시오.
참고: 실험 중에 사망률 또는 치명적인 증상을 조사할 수도 있습니다. 사용 된 농도 신뢰할 수 있는 결과 얻기 위해 가능한 한 안정적으로 유지 해야 합니다. 이는 테스트 솔루션을 새로 고쳐 쉽게 달성할 수 있습니다. 상쾌한 빈도는 시험 물질에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서 분석 측정에 의해 시험 물질의 농도를 확인하여 솔루션 업데이트의 빈도를 결정하는 것이 좋습니다.
2. 사진 촬영을 위한 애벌레 준비
- MS-222(트리카인 메탄-설포네이트)를 미리 준비하여 4% 메틸셀룰로오스를 준비합니다.
- 이렇게 하려면, 4 mg/mL MS-222 ~ 100 mL 이중 증류수를 0.168 mg/mL의 최종 농도로 추가하고 용액을 4°C로 가져옵니다. 그런 다음 메틸셀룰로오스 4 g를 추가합니다. 자기 교반기로 저은 다음 하룻밤 사이에 4 °C로 둡니다.
- 다음 날, 다시 저어 솔루션사용할 준비가 되어 있어야 합니다. 메틸셀룰로오스가 완전히 용해되지 않으면 4 °C에서 다시 넣고 몇 시간을 더 기다립니다.
- 5일 된 애벌레를 트리트먼트 그룹당 5cm 페트리 접시에 파스퇴르 파이펫을 넣습니다.
- 플라스틱 파이펫으로 애벌레에서 처리 용액을 제거한 다음 페트리 접시를 0.02% MS-222 마취용으로 채웁니다.
참고: 마취는 일반적으로 1분 이내에 효과적입니다. 애벌레는 만져서 수영을 하지 않으면 마취됩니다. MS-222의 과다 복용은 애벌레를 죽일 수 있습니다. - MS-222(그림 3)와4 % 메틸 셀룰로오스와 특별히 설계된 10cm 페트리 접시의 각 사각형을 채웁니다.
참고: 페트리 접시 바닥에 1.5 x 1.5cm 의 사각형 면적 두 개를 플라스틱 시트(높이 1mm, 너비 5mm)를 사용하여 접착제로 붙입니다. 20 개의 애벌레는 광장에 나란히 배치 할 수 있습니다. 특별히 설계된 페트리 접시 대신, 또 다른 저온 용기는 배아의 위치를 고치기 위해 사용될 수 있습니다.
그림 3: 10cm 페트리 접시에 1.5 x 1.5cm 너비, 1mm 두께의 플라스틱 시트 스퀘어가 붙어 사진 촬영을 위한 애벌레 준비를 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 마취된 유충을 메틸셀룰로오스로 옮기고 두 칸 중 하나에 약간의 물을 넣습니다. 첫 번째 광장에서 애벌레를 두 번째 사각형으로 옮킨다.
참고 : 이 전송의 도움으로 사진에 사용되는 4 % 메틸 셀룰로오스는 희석되지 않으며 애벌레는 이미징 중에 회전하지 않습니다. - 두 번째 광장에서는 왼쪽으로 회전하고 오리엔트 유충을 왼쪽으로 돌리고 마이크로 로더 파이펫 팁이 최대 2cm까지 자른 셀룰로오스 바닥으로 부드럽게 누릅니다.
참고: 애벌레에 부상을 입기 때문에 다른 파이펫 팁을 사용하지 마십시오.
3. 현미경 검사법
참고 : 사진은 동물을 죽이지 않습니다. 동물은 메틸셀룰로오스에서 제거하여 신선한 시스템 물 또는 처리 용액에 배치하여 깨어날 수 있으므로 치료 중에 동일한 개인을 여러 번 검사 할 수 있습니다.
- 표현된 리포터의 신호를 평가하기 위해 배아를 동일한 보기와 설정으로 이미지화한다.
참고: 최적의 배아 포지셔닝을 위해 2.6단계를 참조하십시오. 원고의 사진은 설명된 조건하에서 촬영되었습니다. 밝은 필드: 60x 배율, 6 ms 박람회, 아이리스 100%, 게인:1.1, 형광 사진: 60배율, 300ms 박람회, 아이리스: 100%, 게인:1, mCherry 필터, 형광광원: 수은 금속 할리데 전구. 형광 성 입체 현미경, 전용 카메라 및 현미경용 소프트웨어 촬영 사진을 촬영하기 위해 사용되었습니다. - 페트리 접시를 현미경의 무대에 놓습니다.
- 배아의 간장에 초점을 맞추고 관련 소프트웨어를 사용하여 밝은 필드 이미지를 캡처합니다.
- 현미경을 mCherry 필터로 전환하고 관련 소프트웨어를 사용하여 형광등 하에서 간형 이미지를 취하십시오.
참고: 어둠 속에서 모든 형광 단계를 수행합니다. 이는 이미지 의 분석에 도움이 될 것이기 때문에 밝은 필드와 형광 이미지를 캡처하는 배율, 초점 또는 배아의 위치를 변경하지 마십시오. - 실험의 모든 배아가 이미지화될 때까지 3.3 및 3.4 단계를 반복합니다.
4. 통합 밀도 결정
참고: 형광 신호 강도를 비교하기위한 가장 좋은 지표 중 하나는 통합 밀도 값 (즉, 영역의 제품 및 평균 회색 값)입니다. 통합 밀도를 결정하는 가장 쉬운 방법 중 하나는 ImageJ프로그램(27)을사용하는 것입니다. 이 프로그램은 인터넷에서 사용할 수 있으며 컴퓨터에 설치할 수 있습니다.
- 그런 다음 ImageJ를 열어 이미지를 드래그앤드롭하거나 File| 클릭하여 분석할 형광 이미지를 업로드합니다. 열립니다.
- 이미지 클릭 | 색상 | RGB 컬러 차트에 따라 형광 필터로 만든 이미지를 분할하는 채널을 분할합니다.
- 빨간색 채널 이미지 스펙트럼으로 작업하고 다른 채널을 닫습니다.
- 이미지에 유사한 크기의 타원형 영역을 지정하여 거짓 신호가 평가를 방해하지 않도록 합니다. 타원형 도구를 사용하여 강조 표시된 간 부위에 가능한 한 정확하게 타원을 그립니다.
- 신호가 약한 경우 간 위치를 결정하기 위해 가벼운 현미경 이미지 (즉, 형광 이미지의 밝은 필드 쌍)를 사용합니다.
- 분석 을 클릭 | 영향을 받는 영역의 신호 강도 및 크기를 결정 하기 위해 측정. 통합 밀도 값은 소프트웨어(차트의 IntDen 열)에 의해 자동으로 계산됩니다.
- 치료군 내의 모든 배아의 모든 형광 영상을 분석할 때까지 4.1-4.6단계를 반복하여 분석을 계속한다.
- 데이터를 저장한 다음 통합 밀도 값을 분석합니다.
참고: 분석 하는 동안 이미지에서 항상 동일한 영역 크기를 선택 합니다. 분석할 영역의 크기는 배율, 이미지 해상도, 촬영용 기타 설정 등에 따라 다릅니다. 분석을 위해 개인 매크로를 사용하여 분석을 가속화하거나 보다 정확하게 만들 수 있습니다. 예를 들어 매크로를 사용하여 선택한 영역이 검사된 이미지에서 항상 동일하도록 할 수 있습니다. 특정 사진 설정에 따라 최상의 이미지 분석을 허용하는 매크로 를 만들기 위한 자세한 설명은 ImageJ 웹 사이트에서 확인할 수 있습니다.
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Representative Results
이 원고에 제시된 실험에서, Tg (vtg1:mCherry) 제브라피시 배아에 5 일 동안 수정에서 시작하는 5 개의 농도에서 두 개의 에스트로겐 성 물질의 효과를 테스트하였다. 우리는 물질 때문에 노출 시간의 끝에 의해 물고기의 간에서 형광 신호가 나타났는지 여부와 두 물질의 에스트로겐성에 차이가 있었는지 여부를 조사했습니다. 결과는 형광 영상과 통합 밀도 값에 기초하여 평가되었다. 일반적으로, 두 물질 모두 개인이 살아남은 시험 농도에서 노출 시간이 끝날 때까지 트랜스진의 발현을 유도한다. 처리되지 않은 대조군 물고기의 경우 형광 신호가 보이지 않았습니다.
α-ZOL의 경우, 가장 높은 시험 농도(8 μM)에서 모든 개인이 사망하므로 이 경우 형광 신호를 검사할 수 없었습니다. 낮은 농도(0.5 μM-4 μM)에서 배아의 간에서 강한 형광 신호가 관찰되었다(도4A). 형광 강도와 형광 영역의 크기(p&05)에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. α-ZOL 통합 밀도값(도 4C)은물질이 형광 신호의 출현을 유도했음을 보여준다. 통합 밀도 값과 치료(p&05) 사이에는 큰 차이가 발견되지 않았습니다. 평균 통합 밀도는 31.26 ± 13.95 (0.5 μM) 및 34.25 ± 15.36 (4 μM) 사이 다양했다.
β-ZOL을 가진 처리 도중 어떤 사망도 문서화되지 않았고, 모든 처리 농도에서 물질 유도된 유전자 활성. 형광도 및 형광영역의 크기는 형광영상(도4B)에서볼 수 있듯이 농도가 증가함에 따라 증가했다. α-및 β-ZOL의 형광 영상을 시각적으로 비교하면, 신호 강도와 형광 영역의 크기는 두 물질의 동일한 치료 농도에서 β-ZOL에 대해 눈에 띄게 약했다. β-ZOL(도4D)의통합값을 연구하여 평균 집약밀도 값은 가장 낮고 가장 높은 처리 농도 사이에서 거의 두 배로 증가했습니다. 그러나, β-ZOL의 경우 개별 농도(p&05)의 통합 밀도 값 사이에는 유의한 차이가 없었다. 평균 통합 밀도는 15.86 ± 4.08 (0.5 μM)과 21.73 ± 5.94 (8 μM) 사이 다양했다.
도 4: 5일 전Tg(vtg1:mCherry) 형질제브라피시 배아에 대한 α-β-제아라레놀 처리로 인한 영향 부위의 크기와 간내 형광 신호의 강도로부터 유래된 통합 밀도 값의 발표. 실험에서, 바이오마커 제브라피쉬 라인의 에스트로겐 에스트로겐 에민감한 배아라인(매 3개의 처리 농도에서 3개의 복제군당 20개의 애벌레)은 5일 동안 수정으로부터 α-및 β-ZOL의 0.5 μM-8 μM 농도로 처리되었다. α-ZOL(A) 및 β-ZOL(B)용 물고기B간 이미지는 물질이 형광 신호의 출현을 유도했음을 명확하게 보여준다.A 통합 밀도 데이터는 평균 ±표준 편차(SD = 오류 표시줄)로 표시됩니다. 데이터는 제외된 이상값을 식별하기 위해 반복적인 Grubbs'로 분석되었습니다. 샤피로-윌크 정상 성 검사와 파라메트릭 방법의 요구 사항을 준수하여 정상성을 위해 데이터를 검사했습니다. 통계 분석은 ANOVA가 던넷의 테스트를 따랐을 때 단방향으로 수행되었습니다. 통합 밀도 값을 연구하면서 α-ZOL(C) 및 β-ZOL(D)의 경우(p&05)의 경우 치료 사이에 유의한 차이가 발견되지 않았다.CD 스케일 바 = 200 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
α-ZOL은 두 물질의 동일한 처리 농도로부터 얻은Figure 5통합 밀도 값을 검사함으로써 형광 이미지에서 관찰되는 신호 강도 간의 차이와 일치하는 β-ZOL에 비해 각 경우에 더 높은 통합 밀도 평균을 제시하였다. 모든 치료 농도의 경우, 상당한 차이(0.5 μM, p = 0.0011; 1 μM, p = 0.0003; 2 μM, p = 0.0329; 및 4 μM, p = 0.0325)가 발견되었다.
그림 5: α 및 β 제아라레놀 통합 밀도 값의 비교. 통합 밀도 데이터는 평균 ± 표준 편차 SD = 오류 표시줄로 표시됩니다. 데이터는 반복적인 Grubbs'로 분석되어 제외된 이상값을 식별했습니다. 샤피로-윌크 정상 성 검사와 파라메트릭 방법의 요구 사항을 준수하여 정상성을 위해 데이터를 검사했습니다. 각 농도의 경우 α-ZOL과 β-ZOL 사이의 페어링되지 않은 t-Test(0.5 μM, p = 0.0011; 1 μM, p = 0.0003; 2 μM, p = 0.0329; 및 4 μM, p = 0.0325)로 유의한 차이가 확인되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
에스트로겐 효과에 대 한 바이오 모니터/생물 지표의 사용은 독성 연구에서 확산 되었습니다. 생체 내 모델은 시험외 검사와 달리 세포 또는 수용체의 반응에 대한 정보를 제공할 뿐만 아니라 유기체내의 복잡한 공정에 대한 조사를 허용하기 때문에 뛰어난 역할을 한다. 에스트로겐 효과를 연구하기위한 여러 형질 전환 선은 제브라피시에서 생산되었으며, 그 중 하나는 Tg (vtg1:mCherry) 이러한 연구에 사용되었습니다. 여기서 설명된 방법은 순수하고 활성적인 성분에서 생체내에서 에스트로겐 활성을 검출하기 위해 이 선의 배아 를 시험하기 위한 프로토콜을 보여 준다.
라인의 남성과 배아는 또한 에스트로겐 효과를 검출하는 데 적합하지만, 배아는 그들의 유용성을 촉진하는 몇 가지 장점이 있습니다. 특히, 신체는 투명하므로 간내형 신호를 쉽게 관찰할 수 있다. 제브라피쉬 간은 수정 후 6시간(hpf 6hpf)을 개발하기 시작하고 50시간(50hpf) 후에 작동하기 시작합니다. 첫째, 간좌엽이 형성되고, 96시간(96hpf)에서 간 오른쪽 엽도 나타난다. 간의 최종 형상은 5일째(120hpf)28,,29일경에 개발된다. 간은 배아14의2-3일 의 나이로부터 내인성 비텔로게닌을 생성할 수 있으며, 이는 Tg(vtg1:mCherry) 선15호선에서형광 신호의 출현과 일치한다. 따라서 실험을 설계할 때는 그 때부터 배아 간에서만 형광 신호가 예상될 수 있다는 점을 고려해야 합니다. 5일 배아의 간은 이미 비교적 넓은 지역에서 잘 정의되어 있으며, 여기서 형광 신호는 스테레오 현미경으로 쉽게 검출될 수 있다. 따라서 동물 보호법의 적용을 받지 않는 테스트 프로토콜의 개발이 가능합니다. 비텔로게닌, 그리고 마찬가지로 형광 단백질은 배아의간(15)의좌엽에 의해 생성된다. 따라서, 배아의 공간 배향은 형광 신호를 조사하거나 사진을 찍을 때 가장 강한 신호의 검출에 중요하다. 이것이 이것이 태아가 프로토콜의 왼쪽에 놓인 이유입니다. 대표적인 결과에서 볼 수 있듯이, 시험 샘플의 에스트로겐 효과는 간내 형광 신호에 의해 명확하게 표시되므로 결과도 시각적으로도 평가할 수 있다. 결과의 정량화가 필요한 경우 ImageJ 프로그램에 의해 정의된 통합 밀도 값이 적절합니다. 그러나 적절한 평가를 위해서는 실험 중에 동일한 설정으로 이미지를 촬영하고 강조 표시된 형광 영역의 크기가 각 이미지에서 동일하다는 것이 필수적입니다. 배아의 정확한 위치와 함께, 이들은 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. 배아의 경우 내인성 비텔로게닌의 생산과 유사하게, 개별 감도에서 큰 분산 및 차이를 나타낸다는 것을 언급하는 것이 중요하다. 경우에 따라 실험을 설계할 때 고려해야 하는 결과에 큰 변화가 발생할 수 있습니다.
치료 농도를 결정하는 중요한 측면은 배아의 세포, 따라서 간 세포가 고독성 물질의 고농도에 의해 손상될 수 있으며, 이는 비텔로게닌 유도의 감소로 이어질 수 있다는 것입니다. 따라서, 시험은 LC10 1515이하의 농도에서 수행되어야 합니다.
에스트로겐에 민감한 어선의 민감도를 서로 비교하는 것은 어려운 작업이며, 지금까지 설명된 선은 서로 다른프로토콜5,,14,,15,,16에따라 테스트되었기 때문이다. 이 프로토콜에서 테스트된 라인은 순수 활성 성분, 혼합 및 환경 샘플의 경우 투여 효과 관계를 검출할 수 있으며, 얻어진 결과는 BLYES 테스트 및 HeLa 세포15,,20의결과와 잘 연관되어 있다.
시험에이전트에 대한 배아의 유용성은제랄레온(15)을포함하여 입증되었다. 이 작품에서는 독소, α-및 β-제아라롤놀의 2개의 대사산물이 시험되었다. 문헌 데이터에 따르면, α-ZOL은 β-ZOL30보다 독성이 높고 에스트로겐성도31더높다. 이러한 결과는 우리의 연구에 의해 확인됩니다. 따라서, 라인의 배아에 대한 연구는 또한 다른 에스트로겐 성 물질의 에스트로겐 효과를 비교하기에 적합합니다.
식품 체인의 진균소 오염은 세계적인 문제이므로 동물 사료 및 인간식품(25,,32)의진균소 수준을 줄이기 위한 여러 가지 절차가 개선되었습니다. 가장 유망한 솔루션 중 하나는 미생물이나 효소에 의한 진균소 생분해입니다. 그것은 감소 하거나 mycotoxin 오염 제거를 제거 하는 필수 후 수확 방법 수 있습니다. 수많은 세균성 균주의 ZEA 분해 능력은 지금까지 문학에서 테스트되었습니다, 그러나, 독소의 높은 저하를 증명하는 최근 연구 결과는 거의 대사 산물의 부작용을지정하지 33. 이 선의 배아는 이론적으로 유기물질함량(15)을가진 시료의 에스트로겐효과를 테스트하기에 적합하기 때문에, ZEA의 생분해 생성물 및 분해균균의 자격을 테스트하는 데 도움이 되는 치료 프로토콜을 개발할 수 있다.
이 프로토콜은 계획된 테스트 끝점(예를 들어, 노출 개시 및 길이)과 다른 테스트 방법(예를 들어, 분자 방법)으로 완료될 수 있는 샘플(예를 들어, 혼합물 또는 환경 샘플)에 따라 여러 가지 방법으로 변경될 수 있다. 따라서 Tg(vtg1:mCherry) 라인의 사용이 에스트로겐성 테스트및 표준 테스트 방법의 모델이 되기를 바랍니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국가 연구 개발 및 혁신 기금 (NKFIA)에서 국가 연구 개발 및 혁신 사무소 (NKFIH)에 의해 지원되었다; 보조금 계약: NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 프로젝트는 유럽 연합 (EU)이 공동 조달하고, 주제 우수 프로그램 NKFIH-831-10/2019 Szent István 대학의 혁신 및 기술 부문수상.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jet Biofil | TCP011024 | |
| Calcium-chloride (CaCl2) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 16383-0-27-39 | |
| GraphPad Prism 6.01 software | GraphPad Software Inc. | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health, USA | Public access software, downloadable from: http://imagej.nih.gov/ | |
| Leica Application Suite X calibrated software | Leica Microsystems GmbH. | We used the softver described in the experiments, but any photographic software complies with the tests | |
| Leica M205 FA stereomicroscope, Leica DFC 7000T camera | Leica Microsystems GmbH. | We used the equipments described in the experiments, but any fluorescent stereomicroscope is suitable for the tests | |
| Magnesium-sulphate (MgSO4) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 20342-0-27-38 | |
| mCherry filter | Leica Microsystems GmbH. | ||
| Mehyl-cellulose | Sigma Aldrich Ltd. | 274429 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf GmbH. | 5242956003 | |
| Pasteur pipette | VWR International LLC. | 612-1684 | |
| Petri-dish | Jet Biofil | TCD000060 | |
| Potassium-chloride (KCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 18050-0-01-33 | |
| Sodium-chloride (NaCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 24640-0-01-38 | |
| Tricane-methanesulfonate (MS-222) | Sigma Aldrich Ltd. | E10521 |
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