Summary
Здесь мы описываем надежный метод определения идентичности и чистоты иммунных клеток с помощью эпигенетических подписей, обнаруженных с помощью количественного ПЦР (qPCR). Деметилирование ДНК в определенном локусе служит уникальным идентификатором для определенного типа клеток и позволяет идентифицировать КЛЕТКи CD8, регулятивные или Th17 T.
Abstract
Иммунные клетки подтипа популяционных частот может иметь большое влияние на эффективность Т-клеток терапии. Современные методы, такие как цитометрия потока, имеют специфические требования к выборке, высокий ввод образцов, имеют низкую пропускную стоимость и трудно стандартизировать, все из которых наносят ущерб характеристике продуктов клеточной терапии во время их разработки и Производство.
Анализы, описанные здесь, точно идентифицируют и количественно определяют типы иммунных клеток в разнородной смеси клеток с использованием изолированной геномной ДНК (gDNA). Модели метилирования ДНК выявляются через преобразование бисульфита, процесс, в котором неметилированные цитозины преобразуются в урацилы. Неметилированные области ДНК обнаруживаются с помощью усиливаемого qPCR с помощью грунтовок, нацеленных на преобразованные области. Один уникальный локус за асссеизм измеряется и служит точным идентификатором для конкретного типа клеток. Анализы являются надежными и определить CD8 ", нормативных, и Th17 Т-клеток в высокой пропускной форме. Эти оптимизированные анализы потенциально могут быть использованы для тестирования в процессе и выпуска продукта для процесса клеточной терапии.
Introduction
Использование Т-клеток в клеточной иммунотерапии значительно возросло за последнее десятилетие, особенно с появлением химерных рецепторов антигена (CAR) Т-клеток технологии1. В то время как Т-клеточная терапия была встречена с большим клиническим успехом, они неоднородны и клеточные характеристики и идентичности могут значительно варьироваться между донорами2. Неоднородность популяций Т-клеток может оказывать значительное влияние на терапевтическую эффективность и усложнять выводы клинических испытаний. По этой причине, очень важно понять неоднородность Т-клеток во время производства продукта и разработки для определения оптимальных формулировок иммунотерапии Т-клеток.
В широком смысле, Т-клетки могут быть разделены на две группы: CD4 "помощник Т-клеток, которые выделяют иммуномодулирующие цитокины, и CD8" цитотоксических Т-клеток, которые непосредственно лизать клетки, представляющие коньяк антигена на основных комплекс гистосовместимости (MHC) I молекул. CD4 "помощник Т-клетки могут дифференцироваться в множество конкретных подмножеств, которые производят уникальный набор цитокинов. Некоторые предполагают, что определенное соотношение CD4 "к CD8" Т-клеток в конечных клеток продукта максимизировать эффективность и настойчивость vivo, но может осложнить производство клеток3. Регуляторные Т-клетки (Tregs), подмножество CD4 "Т-клеток, являются иммуносупрессивными и уменьшают активацию иммунных клеток. Регуляторные Т-клетки были вовлечены в посредничество толерантности к опухоли и, если присутствует во время производства Т-клеток CAR, может ингибировать противоопухолевый иммунный ответ CAR Т-клеток4,5,6. Другие подмножества CD4, такие как T-помощник 17 (Th17) Т-клетки способствуют очистке опухоли и могут быть использованы для повышения эффективности Т-клеточной терапии. Таким образом, увеличение Т-клеток Th17 CD4', представляет особый интерес в твердых опухолевых условиях, где увеличение производства интерлейкина 17 (IL-17) способствует противоопухолевому иммунному ответу5,7,8,9. Понимание важности T17 клеток в опухолевых реакций побудило больше исследований в стратегии для создания этих клеток в пробирке7,9. Таким образом, методы для обнаружения этих Подмножества Т-клеток имеют решающее значение для оптимизации Т-клеточной терапии и должны быть надежными, легкими, масштабируемыми и воспроизводимыми.
Цитометрия потока является наиболее распространенным методом для определения идентичности иммунной клетки. Тем не менее, поток цитометрии требует живых, нетронутых клеток, которые должны быть проанализированы в тот же день они собирают. Для внутриклеточного окрашивания цитокинов (ICS) ингибирование секреции белка необходимо для удержания цитокинов в Т-клетках. Однако различные ингибиторные соединения оказывают дифференцирующее воздействие на секрецию специфических цитокинов, заставляя пользователей создавать специализированные коктейли для обнаружения цитокинов интереса10,11. Кроме того, верность потока цитометрии опирается на клоны антител, которые связывают сяконкретно и мощно к своей цели. Использование различных клонов антител может вызвать различные результаты и привести к неточным выводам, что затрудняет стандартизацию12. Кроме того, анализ данных, собранных с помощью цитометрии потока, и, таким образом, выводы, сделанные из данных, может сильно варьироваться между пользователями в зависимости от того, как ворота установлены13,14. По этим причинам цитометрия потока не идеально подходит для точного контроля качества при развитии клеточной терапии.
Оценка геномного метилирования на конкретных генных локусах является альтернативным методом определения клеточной идентичности. Обоснование использования метилирования ДНК для выявления конкретных типов клеток было описано в нескольких статьях и опирается на конкретные модели метилирования, присутствующие в данной популяции клеток15,16,17. В целевых ячейках некоторые участки содержат неметилированные нуклеотиды, в то время как в нецелевых ячеек эти участки метилируются. Эта модель может быть обнаружена с помощью преобразования бисульфита, процесса, который исключительно преобразует неметилированные нуклеотиды цитозин (C) в uracil (U). Праймеры и зонды могут быть разработаны против преобразованных сайтов, а затем усилены и обнаружены через qPCR16.
Анализ, описанный в настоящем тексте, измеряет частоту подтипов иммунных клеток в разнородных популяциях путем количественной оценки числа конкретных неметилированных локусов по сравнению с геном домашнего хозяйства. Копии неметилированных регулятивных элементов гена CD8 B измеряются в тесте CD8, FoxP3 в Treg и IL-17 в Th17 в этом ассее. Эти локусы были определены путем изоляции конкретной популяции клеток, представляющих интерес (например, CD8 "Т-клетки) и выполнения бисульфитного секвенирования для выявления локусов, которые неметилируются только в этой клетке типа15. Праймеры и зонды разрабатываются против уникально неметилированных локусов, а образцы анализируются с помощью qPCR. Стандартная кривая известных номеров копий создается из разбавления стандартного плазмида высокого номера копий, что позволяет преобразовало значение Ct в номер копии стенограммы.
Для оценки эффективности анализа необходимы контрольные образцы, в том числе эталонная гДНК и калибраторная плазмида. Справочный геномный материал представляет собой объединенный образец крови от нескольких доноров с известными частотами иммунных клеток и используется для проверки производительности качества (КК). Образец калибратора представляет собой синтезированный плазмид, содержащий последовательности генов CD8, FoxP3 и GAPDH в эквимолярном соотношении. Он используется в качестве меры эффективности преобразования бисульфита, потому что конверсии бисульфита в различных геномных регионах будут варьироваться в эффективности. Соотношение целевого показателя к GAPDH внутри калибратора составляет 1, но из-за различий в эффективности преобразования бисульфита соотношение может варьироваться. Этот фактор калибровки применяется к анализу CD8 и Treg. FoxP3, ген, используемый в Treg asay, расположен на Х-хромосоме. Потому что этот ассс измеряет только неметилированные копии FoxP3, и только одна копия FoxP3 неметилируется в Tregs, это мнение является секс агностик и может быть использован как с мужчинами и женщинами образцы18. Анализ Th17 не использует образец калибратора или GAPDH в качестве гена домашнего хозяйства. Вместо этого включается еще один набор грунтовок, ориентированный на метилированные локусы, присутствующие в клетках, не относятсях от Th17, и общее количество ячеек отражается в сумме метилированных и неметилированных копий IL-17. Данные, полученные из qPCR, вводятся в шаблон заранее заданный анализ, который выполняет контроль качества данных и вычисляет процент целевой ячейки в исходной популяции. Это обеспечивает автоматизированный и объективный анализ данных, тем самым устраняя субъективность пользователя и улучшая возможности стандартизации.
Этот анализ использует gDNA, которые могут быть изолированы по процедуре лейкапереза с использованием культивированных или фиксированных клеток, или замороженных клеточных гранул. Низкая потребность в выборке, гибкость в исходном материале образца, высокая точность и стандартизированный анализ устраняют ограничения, связанные с цитометрией потока, и идеально подходят для целей контроля качества во время развития процесса клеточной терапии.
Protocol
Все образцы человека были получены из коммерческого источника в соответствии с их руководящими принципами в области этики человеческих исследований.
1. Геномная изоляция ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Геномная изоляция ДНК осуществляется с использованием коммерчески доступного комплекта (см. Таблица Материалов) из любых гематопоиетических клеток, таких как периферийные моноядерные клетки крови (ПБМК), очищенные Т-клетки или любой другой тип гематопоитических клеток. В этом эксперименте были использованы периферийные моноядерные клетки крови (ПБМК) и Т-клетки трех различных доноров человека.
- Поместите 1-2 x 10 6 гематопоиэтических клеток в коническую трубку и центрифугу при 400 х г в течение 10 мин.
- Аспирируй супернатант полностью.
- Добавьте в образец 350 кЛ лисиса/связывающего буфера и инкубируйте в течение 10 мин при 55 градусах Цельсия.
- Добавьте 50 кл лэк протеиназа K (20 мг/мл) до 350 л клеточной суспензии и вихря на 30 с.
- Добавьте 50 qL парамагнитных бусинок, связывающих ДНК, и 400 л 100% изопропанола и инкубировать в течение 3 мин при комнатной температуре (RT).
- Поместите трубку на магнитную стойку на 2 мин и снимите супернатант, позаботившись, чтобы не беспокоить бисер. ДНК связана с магнитными бусинами на этом этапе.
- Добавьте 950 л буфера для мытья 1. Вихрь для 30 с и повторить шаг 1.6.
- Повторите шаг 1.7.
- Добавьте 950 л буфера для мытья 2. Вихрь для 30 с и повторить шаг 1.6.
- Добавьте 100 кл.л элекционного буфера и вихря в течение 2 мин. Поместите трубку на магнитную подставку в течение 1 мин и перенесите супернатант, содержащий гднк, в новую трубку.
- Используйте 1 кЛ гДНК, изолированных от гематопоиетических клеток, для измерения чистоты гДНК с помощью спектрофотометрии с помощью фторметра, получая ОД на 260 нм, 280 нм и 230 нм. Убедитесь, что соотношение оптической плотности (соотношения OD) на уровне 260 и 280 нм составляет от 1,7-2,0, а коэффициент OD на уровне 260 и 230 нм составляет от 1,5 до 2,4.
2. Подготовка образцов
- Разогреть термомиксдора до 56 градусов по Цельсию.
- Этикетка 2 мл труб для всех образцов, калибратор, и справочный материал.
- Разбавить образцы и калибратор с elution буфера (доступно с комплектом, используемым для шага 1) на RT.
- Для всех экспериментальных образцов разбавить гДНК в общей сумме 142 Л. Например, разбавить 4 л гДНК при 100 нг/Л в 138 л буфера элюции.
ПРИМЕЧАНИЕ: 400-1200 нг гДНК могут быть использованы для анализа. - Разбавить 75 л калибратора в общей сумме 142 л.
- Проверьте ссылку концентрации гДНК с спектрофотометром, используя TE (pH 8.0) в качестве пробела.
- Разбавить 1000-1200 нг от эталонной гДНК в общем объеме 142 л. Например, разбавить 10 л эталонных гДНК при 100 нг/Л в 132 л элюционного буфера.
- Для всех экспериментальных образцов разбавить гДНК в общей сумме 142 Л. Например, разбавить 4 л гДНК при 100 нг/Л в 138 л буфера элюции.
- Инкубировать трубки при 56 градусах по Цельсию в течение 5 мин при 900 об/мин в термомиксере. Кратко спина вниз трубки для сбора образцов.
3. Преобразование Бисульфита
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что время инкубации во время преобразования бисульфита следует рекомендуемому времени. На результаты проверки повлияет переинкубация или недоинфинация.
- Установите термомиксдос до 80 градусов по Цельсию.
- Добавьте ко всем трубам 270 л бисульфита аммония и 90 л тетрагидрофурфурила (THFA). Vortex смешать полностью и кратко спина вниз образцы, чтобы собрать жидкость на дне.
- Инкубировать трубки в термомиксе при 80 градусах по Цельсию в течение 45 мин при 900 об/мин. При использовании теплоблока, вихрь труб для 1-2 с каждые 4,5 мин во время инкубации.
- Кратко спина вниз образцы и дайте остыть на RT в течение 3-5 минут, прежде чем продолжить с шагом 4 или 5. Окончательный том должен быть 500 евро.
4. CD8 и Treg анализы
- Очистка ДНК после преобразования бисульфита
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется с использованием коммерчески доступного комплекта для очистки ДНК (см. Таблица Материалов) на бисульфит-преобразованной ДНК. Убедитесь, что реагенты нагреваются до RT перед использованием.- Перед началом очистки создайте однородную смесь парамагнитных бусин окрева ДНК на 30 с. Добавьте этанол и изопропанол в буферы для мытья, следуя перечисленным на бутылках объемам, и установите теплоблок до 65 градусов по Цельсию.
- На RT добавьте 870 л лизис/связывающий буфер и 105 л парамагнитных бусин ДНК к каждой трубке со ступени 3.4. Vortex, чтобы смешать полностью и кратко спина вниз труб.
- Добавьте 570 л 2-пропанола и вихря, чтобы полностью перемешать.
- Инкубировать трубки на RT в течение 7 мин при 50 об/мин в термомиксере или стандартном вращающемся миксере.
- Кратко спина вниз труб. Поместите трубки на магнитную стойку и инкубировать в течение 5 минут.
- С образцами еще на магнитной стойке, удалить супернатант, не нарушая бисера.
ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК привязана к бисеру. - Снимите трубки с магнитной стойки и добавьте 900 л буфера для мытья 1. Vortex труб, чтобы полностью resuspend бисер, а затем кратко спина вниз труб.
- Верните трубки в магнитную стойку и инкубируют в течение 3 мин.
- С образцами еще на магнитной стойке, удалить супернатант, не нарушая бисера.
- Повторите моет (4.1.7-4.1.9), один раз с буфером мытья 1, затем дважды с буфером мытья 2.
- После удаления супернатанта, кратко спина вниз труб и вернуться к магнитной стойке в течение 3 минут.
- Удалите все остаточные буфер амванты 2 и удалите трубки из магнитной стойки.
- Сухие бусы с трубчатыми крышками, открытыми при 65 градусах по Цельсию в течение 15 мин.
- Добавьте 60 qL буфера elution к каждой пробке и инкубировать на RT на 7 min на 1.400 rpm. Кроме того, вихрь на умеренной скорости с помощью пенного адаптера.
- Кратко спина вниз трубки и место на магнитной стойке в течение 2 минут.
- Передача 55 злителю eluate в новую трубку, не нарушая бисера. Элуат содержит бисульфит-преобразованную ДНК. Измерение концентрации ДНК не требуется.
- Настройка и запуск qPCR
- Включите машину qPCR и компьютер, который управляет своим программным обеспечением.
- На программном обеспечении пользовательский интерфейс создайте новый эксперимент и выберите, какой блок используется для запуска эксперимента.
- Выберите стандартную кривую в качестве типа эксперимента.
- Если это применимо, выберите, какую химию обнаружения вы хотите использовать. В этом ассее используются реагенты TaqMan. В противном случае выберите ROX в качестве пассивной ссылки.
- Если это применимо, выберите свойства инструмента, запускаемого как Standard.
- Определите свой экспериментальный дизайн, назначив цели (например, GAPDH или CD8 с FAM в качестве репортера) и нелюфлуоресцентным утозначением.
- Присваивайте имена образцов для стандартов, образцов и элементов управления.
- Далее, назначить каждую позицию скважины в соответствии с qPCR пластины. Каждая скважина требует цели, такой как CD8 или GAPDH, и названия образца. Каждый образец работает в тройном и должен быть отражен на макете пластины для инструмента.
- Назначайте каждому стандарту стандарт задачи и укажите окончательные номера копий в соответствии с таблицей 1.
- Присвоите образцы, калибратор и ссылку на задачу Неизвестный.
- Обозначьте скважины без шаблона управления, как NTC или N.
- Подготовьте серийные разбавления ДНК лямбды (10 нг/Л), которые будут использоваться в качестве стандарта (см. таблицу 1).
- Приготовьте коктейли из мастер-микса qPCR, один для целевого типа ячейки и один для GAPDH (см. таблицу 2). Запустите все образцы, стандарты и контроль NTC в тройном.
ПРИМЕЧАНИЕ: GAPDH используется для количественной оценки общего числа ячеек и работает параллельно с целевым усилением. Копии неметилированных регулятивных элементов гена CD8 B измеряются в асссе CD8, FoxP3 в Treg и IL-17 в Th17. - Используйте пластину 96 скважин для qPCR. Сначала загрузите в скважины 3 Зл шаблона ДНК. Далее, загрузите 7 зл мастер-микс.
- Запечатайте тарелку пленкой qPCR и кратко покрутите вниз по пластине, прежде чем поместить ее в инструмент qPCR.
- Выполнить qPCR, как показано в таблице 3.
- После завершения выполнения экспортировать данные qPCR в виде файла .txt или .xlsx.
- Проанализируйте данные с помощью шаблонов анализа CD8 и анализа Treg (см. Таблица материалов),чтобы вычислить Ct Average, Ct Standard Deviation и Copy Number.
| Первоначальный плазмидНый номер копий/3 Зл | Объем | Разбавивая ДНК | Окончательный номер копии на 3 ЗЛ | Метки |
| 31250 | 1000 л | - | 31250 | STD-1 |
| 31250 | 200 зл. | 800 л | 6250 | STD-2 |
| 6250 | 200 зл. | 800 л | 1250 | STD-3 |
| 1250 | 200 зл. | 800 л | 250 | STD-4 |
| 250 | 200 зл. | 800 л | 50 | STD-5 |
| 1250 | 30 зл | 1200 л | 30 | STD No6 |
| 10 нг/Л Л Л. Ламбда ДНК в TE (10 мм Трис, 1 мМ EDTA, рН 8.0) | ||||
| Используйте STD-3 для подготовки ЗППП No6 | ||||
Таблица 1: Подготовка стандартных разбавлений. 4-журнал разбавления стандарты, охватывающие 31250-30 экземпляров были подготовлены в соответствии с таблицей с использованием TE / Lambda ДНК в качестве разбавитель. Те же стандартные разбавления использовались как для CD8, так и для GAPDH. Стандарты хранились при -20 градусов по Цельсию.
| Реагентов | Сумма |
| ЛДА Ламбда (50 нг/л в TE, pH8.0) | 1 зл |
| ТакМан ассси | 0,5 л л |
| Вода, Без Нуклиза | 0,5 л л |
| Мастер Микс | 5 зл |
| Общая | 7 л |
Таблица 2: Приготовление коктейля qPCR. Подготовьте мастерскую смесь qPCR в двух отдельных трубках, по одной для CD8 и GAPDH, исключив ДНК шаблона в соответствии с таблицей.
| Шаг | Время | Temp | Циклов |
| Предварительная инкубация | 35 мин. | 95 градусов по Цельсию | 1X |
| Усиления | 15 сек | 95 градусов по Цельсию | 50X |
| 1 мин. | 61 градус по Цельсию | ||
| Перезарядка | 5 сек | 42 градусов по Цельсию | 1X |
Таблица 3: параметры выполнения qPCR для cd8 и Treg. qPCR был запущен в соответствии с параметрами, указанными в таблице.
5. Th17 асссес
- Очистка ДНК после преобразования бисульфита
- Выполните шаги очистки, описанные в разделе 4.1.
- Чтобы подвести образец, добавьте 25 ql элютионного буфера к каждой трубке и инкубировать на RT в течение 7 минут при 1400 об/мин. Кроме того, вихрь на умеренной скорости с помощью пенного адаптера.
- Кратко спина вниз трубки и место на магнитной стойке в течение 2 минут.
- Передача 20 злителю eluate в новую трубку, не нарушая бисера. Элуат содержит бисульфит-преобразованную ДНК.
- Предусилитель ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Преамплификация ДНК рекомендуется для низких целей изобилия для точной количественной оценки через qPCR19. По этой причине был разработан асссецид метилирования Th17, требующий предусилительации.- Передача 2 Зл бисульфит-преобразовательной ДНК в прокладки ПЦР. Создайте трубку NTC с 2 л воды.
- Создайте мастер-микс для всех образцов (см. таблицу 4).
- Добавьте 23 кл из мастер-микски к каждой трубке. Крышка труб, вихрь, и кратко спина вниз труб.
- Запустите протокол предампрятия на термоцикле с помощью нагретой крышки. (Таблица 5). После завершения пробега, кратко спина вниз труб.
- Перенесите 2 злителк усиленной ДНК в новые трубки и добавьте 78 л воды, разбавив образцы 1:40.
- qPCR настроен и запущен
- Следуйте разделу 4.2 для настройки и запуска qPCR.
- Проанализируйте данные с помощью шаблона анализа th17 (см. Таблицу материалов),чтобы вычислить значение Ct Average, Ct Standard Deviation и Copy Number.
| Реагента | Сумма |
| Вода, Без Нуклиза | 9,5 л л |
| Горячий старт PCR Мастер Mix | 12,5 л |
| Th17 PCR Праймер | 1 зл |
| Общая | 23 Зл |
Таблица 4: Предварительно усиливаем ДНК для анализа Th17. В соответствии с таблицей была подготовлена мастер-микс предусилительной реакции.
| Шаг | Время | Temp | Циклов |
| Предварительная инкубация | 35 мин. | 95 градусов по Цельсию | 1X |
| Денатурация | 1 мин. | 95 градусов по Цельсию | 12X |
| Отжига | 45 сек | 55 градусов по Цельсию | |
| Удлинение | 30 сек | 72 градусов по Цельсию | |
| Окончательное удлинение | 10 мин. | 72 градусов по Цельсию | 1X |
| Держать | Неопределенный | 4 градуса по Цельсию |
Таблица 5: Преусилите TH17 ДНК. TH17 ДНК была предварительно усилена в течение 12 циклов до фактического qPCR.
Representative Results
Все три анализа метилирования начинаются с входной гДНК и приводят к проценту клеток CD8, Treg или Th17 в общей популяции клеток. Данные, полученные из qPCR после преобразования бисульфита, были проанализированы с помощью предоставленного шаблона анализа. Этот шаблон использовал стандартные кривые, полученные из стандартных образцов, для оценки количества копий целей и общего количества ячеек в тестовых образцах. Затем тип ячейки процент вычислялся с использованием формул, интегрированных в шаблоны анализа. На рисунке 1 показаны репрезентативные данные анализа CD8, полученные в результате анализа как периферических моноядерных клеток крови (ПБМК), так и Т-клеток трех различных доноров, использующих цитометрию потока и описанную метилирование. Тенденции между этими двумя методами среди всех доноров в обоих типах клеток были одинаковыми. На рисунке 2 показаны репрезентативные данные анализа Treg. Три очищенных донора Treg были проанализированы с использованием как метилирования основе qPCR и потока цитометрии и результаты были построены на графике показано. Результаты по обоим методам были относительно одинаковыми. Однако во всех случаях цитометрия течет выше значений. На рисунке 3 показано сравнение клеток Th17, обнаруженных с помощью цитометрии потока и метилирования. На этом графике существуют стимулируемые и нестимулированные условия для экспериментальных методов. Клетки требуют стимуляции с PMA и иомамицин и лечения с ингибитором переноса белка, чтобы увеличить количество IL-17A присутствует в каждой клетке, так что он может быть обнаружен с помощью потока цитометрии20. Статус метилирования может быть обнаружен независимо от состояния стимуляции. Цитометрия потока дала более низкие уровни клеток Th17 по сравнению с метилированием. Чувствительность и специфичность ассеа были продемонстрированы пределом пробела (LOB), пределом обнаружения (LOD) и ограничением значений количественной оценки (LOЗ), отображаемыми в таблице 6.
Рисунок 1: Сравнение потока и метилирования процентных ставок CD8 для ПБМК и Т-клеток для трех различных доноров. ПБМК и Т-клетки из трех различных доноров были просачились на процент CD8 "Т-клеток во всей популяции с использованием либо поток цитометрии или метилирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Сравнение потока и метилирования процентов Treg для очищенного Treg для трех различных доноров. Очищенные клетки Treg были обсированы на процент клеток Treg в всей популяции, используя либо цитометрию потока или метилирование. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Сравнение потока и метилирования процентов Th17 для стимулируемых и нестимулированных экспериментальных групп. Стимулированные и нестимулированные Т-клетки анализировались с использованием цитометрии потока и метилирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Анализа | Lob | Лод | Лоз |
| CD8 | 0 | 19 | 52 |
| Гапх | 0 | 7 | 21 |
| FoxP3 | 0 | 3 | 12 |
| Th17 TpG | 0 | 35 | 73 |
| Th17 CpG | 0 | 38 | 73 |
Таблица 6: LoB, LoD, Лоз копий номеров для анализов на основе метилирования. Чувствительность и специфика ацензии подробно описаны в значениях LoB, LoD и Lo, полученных руководящими принципами21,22. В общем, всего лишь 40 экземпляров могут быть точно обнаружены этими анализами.
Discussion
С появлением новых иммунотерапевтических препаратов, существует необходимость в стандартизированных методах обнаружения иммунной идентичности клеток и чистоты. Методы оценки для тестирования в процессе и выпуске, которые являются надежными, проверенными и масштабируемыми, еще предстоит установить и создать серьезную проблему для коммерциализации клеточных методов лечения. В то время как цитометрия потока в настоящее время является наиболее распространенным методом фенотипирования иммунных клеток, высокое качество образца и требования к количеству затрудняют регулярное использование. Кроме того, внедрение цитометрии потока в хорошую производственную практику (GMP) среды ограничивается оператором зависимых стратегий gating и требование эталонных стандартов для каждого маркера используется13,14. Хотя было показано, что автоматизированная gating улучшает надежность анализа, она еще не является хорошо отлаженной стратегией контроля качества. В то время как профилирование экспрессии генов может также использоваться для характеристики идентичности продукта клеточной терапии и чистоты, данные являются полуколичественными и трудоемкими. Кроме того, РНК и микроРНК относительно менее стабильны, чем ДНК, и могут способствовать отсутствию надежных и воспроизводимых результатов. Таким образом, использование эпигенетического состояния метилирования ДНК конкретного локуса обеспечивает стабильный, простой в исполнении, надежный и масштабируемый метод выявления и количественной оценки клеточного типа интереса.
Обнаружение метиловых моделей для клеток фенотипа опирается на три критических шага: Во-первых, анализ требует использования гДНК, которая изолирована в соответствии с описанными методами. Высокое качество ДНК требуется, и если не используется, бисульфит преобразования могут быть затронуты23,24. При получении ДНК низкого качества рекомендуется дальнейшая очистка для обеспечения надежности анализа. Во-вторых, требуется успешное превращение бисульфита неметилированный цитозин в урацил. Наиболее важным шагом в преобразовании бисульфита является денатурация ДНК23,25. Высокая температура денатурации с использованием бисульфита аммония, в отличие от бисульфита натрия, повышает эффективность преобразования и консистенции и является рекомендуемым процессом для этих анализов25,26. Пользователи должны убедиться, что реакция происходит при 80 градусах Цельсия и что смешивание образцов выполняется часто. По этим причинам рекомендуется цифровой термомиксер (см. Таблицу материалов). В-третьих, при подготовке qPCR необходимо соблюдать надлежащий метод трубачирования. Три технических репликаций требуется во время реакции qPCR придерживаться минимальной информации для публикации количественных экспериментов PCR в реальном времени (MI'E) руководящие принципы27. Включение большего количества технических повторов является приемлемым, но не обязательным. Неправильный метод трубачирования и/или неведомость технических репликаций приведет к ненадежным результатам qPCR.
Если критические шаги выполняются и желаемые результаты все еще не получены, несколько элементов управления в рамках проверки могут быть использованы для выявления проблемы. Правильное преобразование бисульфита является наиболее важным шагом в этом анализе. Неправильное преобразование бисульфита будет выделено неудавшимся фактором калибровки и/или эталонными значениями, рассчитанными шаблоном анализа. Если бы конверсия бисульфита была выполнена неправильно (например, если бы реакция была проведена на RT), не было бы усиления во время qPCR. Кроме того, не будет замечено усиления, если ошибка была допущена во время подготовки к реакции qPCR (например, если не была добавлена мастер-микс qPCR). Эти две проблемы могут быть разделены путем изучения стандартных образцов. Усиление в стандартных образцах, но не в эталонных, калибраторных и экспериментальных образцах, указывает на то, что преобразование бисульфита было выполнено неправильно. Никакое усиление ни в одном из образцов не указывает на то, что qPCR был выполнен неправильно.
Хотя этот анализ касается строгих требований к выборке и изменчивости анализа, связанной с другими методами фенотипирования, в частности цитометрией потока, существуют ограничения, которые необходимо отметить. Этот анализ нацелен на один локус, который используется в качестве уникального идентификатора для целевой ячейки, который запрещает мультиплексный анализ, который обычно выполняется с цитометрией потока. Это затрудняет выявление сложных типов клеток, таких как Th17. Тем не менее, использование метилирования моделей на одном локусе было показано, что точный фенотипический маркер нескольких клеток и был использован в нескольких клинических испытаниях15,16. Это верно, особенно в Tregs, где оценка FOXP3 метилирования подписей является точным и недвусмысленным методом для обнаружения истинных Tregs от переходно FOXP3 выражения клеток28. Потеря мультиплексного анализа компенсируется точностью опрошенных локусов. Будущие итерации ассея могут включать в себя несколько красителей qPCR и утолятелей, чтобы обеспечить обнаружение нескольких локутов в одной реакции qPCR.
Этот ассеможно использовать в качестве альтернативного метода цитометрии потока при определении фенотипа и идентичности клеток. Следует отметить, что этот процесс не дает точных значений, которые поток цитометрии делает(Рисунки 1-3). Отчасти это объясняется изменчивостью анализа данных, связанной с цитометрией потока. В зависимости от стратегии gating, результаты от цитометрии потока могут значительно варьироваться. Это особенно актуально при использовании сложных протоколов окрашивания для изучения внутриклеточных целей, таких как Ил-17, где коэффициент вариации (CV) может достигать 15%14. Между несколькими пользователями, ассс, представленный последовательно, было резюме в размере 15%, поддерживая надежность асссея и улучшенные возможности стандартизации. Наибольшие различия между эпигенетической и потока цитометрии на основе фенотипирования наблюдается, когда стимуляция клеток требуется(Рисунок 3). Обнаружение т17 клеток с помощью цитометрии потока было достигнуто с помощью общего протокола для стимуляции Т-клеток и внутриклеточного цитокина окрашивания29,30,31. Различия, наблюдаемые в th17 фенотипии между эпигенетической измерения и цитометрии потока может быть связано с кинетикой производства IL-17. В то время как метилированные сигнатуры являются устойчивыми, производство белка требует времени и должно присутствовать в достаточном количестве, чтобы быть обнаружены флуоресцентными антителами20,32. Инкубация 6 ч с ингибитором переноса белка и коктейлем стимуляции клеток, возможно, потребуется расширить, чтобы увидеть уровень клеток Th17, обнаруженных с помощью эпигенетических методов фенотипирования. Необходимы дополнительные исследования, чтобы определить точную причину, почему значения не совпадают, и определить наиболее точный метод фенотипирования.
В этом отчете мы подробно описываем и количественно определяем типы иммунных клеток в разнородной смеси клеток простым и надежным способом. Анализы разработаны и оптимизированы для потенциального использования для в процессе и выпустить тестирование клеточной терапии. Описанные анализы отвечают требованиям для высококвалифицированного сырья, которые будут использоваться в приложениях клеточной терапии. Устранив недостатки цитометрии потока и других молекулярных методов, таких как стабильность, требования к выборке, предварительная стимуляция, клеточная пермяковость для внутриклеточного окрашивания и субъективность анализа данных, описанные анализы находятся в соответствии с целями коммерциализации клеточной терапии.
Disclosures
Суман К. Прадхан, Джерри Гузман, Карл Даргиц, Марк Лэндон и Ума Лакшмипати работают в Thermo Fisher Scientific. Свен Олек, Бьорн Саманс и Ульрих Хоффмюллер являются учредителями и сотрудниками компании Epiontis, соответственно. При производстве этой рукописи не использовалась помощь в написании.
Acknowledgments
Проект финансировался за счет научного интрамурального гранта Thermo Fisher.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 22363344 | |
| Analysis template for CD8 assay | Click Here | ||
| Analysis template for Th17 assay | Click Here | ||
| Analysis template for Treg assay | Click Here | ||
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer, blue/red/violet6/yellow | Thermo Fisher Scientific | A29004 | |
| CTS PureQuant CD8+ T-Cell Assay | Thermo Fisher Scientific | A43674 | |
| CTS PureQuant Th17 Assay | Thermo Fisher Scientific | A43676 | |
| CTS PureQuant Treg Assay | Thermo Fisher Scientific | A43675 | |
| Dynabeads SILANE Genomic DNA Kit | Thermo Fisher Scientific | 37012D | Used for genomic DNA isolation and purification after bisulfite conversion. Contains elution buffer to dilute samples. |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Used as a magnetic rack during DNA isolation and purification |
| eBioscience Essential Human T cell Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42923 | |
| eBioscience Essential Human Th1/Th17 Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42927 | |
| eBioscience Essential Human Treg Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42925 | |
| Eppendorf SmartBlock 2 mL | Eppendorf | 5362000035 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | Recommended sample mixer |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND 1000 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Applied Biosystems | AM12450 | |
| QuantStudio 12S Flex | Applied Biosystems | 4470661 | |
| TE, pH 8.0, RNase-free | Thermo Fisher Scientific | AM9849 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | H2KT17113 |
References
- Hartmann, J., Schüßler-Lenz, M., Bondanza, A., Buchholz, C. J. Clinical development of CAR T cells-challenges and opportunities in translating innovative treatment concepts. EMBO Molecular Medicine. 9, 1183-1197 (2017).
- Graham, C., Jozwik, A., Pepper, A., Benjamin, R. Allogeneic CAR-T Cells: More than Ease of Access? Cells. 7, E155 (2018).
- Turtle, C. J., et al. CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B cell ALL patients. Journal of Clinical Investigation. 126, 2123-2138 (2016).
- Akalin, I., et al. Effects of Chimeric Antigen Receptor (CAR) Expression on Regulatory T Cells. Molecular Therapy. 17, S25 (2009).
- Knochelmann, H. M., et al. CAR T Cells in Solid Tumors: Blueprints for Building Effective Therapies. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Chen, M. L., et al. Regulatory T cells suppress tumor-specific CD8 T cell cytotoxicity through TGF-β signals in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 419-424 (2005).
- Muranski, P., et al. Tumor-specific Th17-polarized cells eradicate large established melanoma. Blood. 112, 362-373 (2008).
- Majchrzak, K., et al. Exploiting IL-17-producing CD4+ and CD8+ T cells to improve cancer immunotherapy in the clinic. Cancer Immunology, Immunotherapy. 65, 247-259 (2016).
- Guedan, S., et al. ICOS-based chimeric antigen receptors program bipolar TH17/TH1 cells. Blood. 124, 1070-1080 (2014).
- Vicetti Miguel, R. D., Maryak, S. A., Cherpes, T. L. Brefeldin A, but not monensin, enables flow cytometric detection of interleukin-4 within peripheral T cells responding to ex vivo stimulation with Chlamydia trachomatis. Journal of Immunological Methods. 384, 191-195 (2012).
- Lovelace, P., Maecker, H. T. Multiparameter Intracellular Cytokine Staining. Methods in Molecular Biology. 699, 165-178 (2011).
- Presicce, P., Moreno-Fernandez, M. E., Lages, C. S., Orsborn, K. I., Chougnet, C. A. Association of two clones allows for optimal detection of human FOXP3. Cytometry A. 77, 571-579 (2010).
- Pachón, G., Caragol, I., Petriz, J. Subjectivity and flow cytometric variability. Nature Reviews Immunology. 12, 396 (2012).
- Westera, L., et al. Centrally Determined Standardization of Flow Cytometry Methods Reduces Interlaboratory Variation in a Prospective Multicenter Study. Clinical and Translational Gastroenterology. 8, e126 (2017).
- Baron, U., et al. Epigenetic immune cell counting in human blood samples for immunodiagnostics. Science Translational Medicine. 10, (2018).
- Kleen, T. O., Yuan, J. Quantitative real-time PCR assisted cell counting (qPACC) for epigenetic - based immune cell quantification in blood and tissue. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 46 (2015).
- Rapko, S., et al. DNA methylation analysis as novel tool for quality control in regenerative medicine. Tissue Engineering. 13, 2271-2280 (2007).
- Wieczorek, G., et al. Quantitative DNA Methylation Analysis of FOXP3 as a New Method for Counting Regulatory T Cells in Peripheral Blood and Solid Tissue. Cancer Research. 69, 599-608 (2009).
- Andersson, D., et al. Properties of targeted preamplification in DNA and cDNA quantification. Expert Review of Molecular Diagnosis. 15, 1085-1100 (2015).
- Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 159, 197-207 (1993).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of Blank, Limit of Detection and Limit of Quantitation. Clinical Biochemistry Reviews. 29, S49-S52 (2008).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55, 611-622 (2009).
- Li, Y., Tollefsbol, T. O. DNA methylation detection: Bisulfite genomic sequencing analysis. Methods in Molecular Biology. 791, 11-21 (2011).
- Warnecke, P. M., et al. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods. 27, 101-107 (2002).
- Genereux, D. P., Johnson, W. C., Burden, A. F., Stöger, R., Laird, C. D. Errors in the bisulfite conversion of DNA: modulating inappropriate- and failed-conversion frequencies. Nucleic Acids Research. 36, e150 (2008).
- Darst, R. P., Pardo, C. E., Ai, L., Brown, K. D., Kladde, M. P. Bisulfite Sequencing of DNA. Current Protocols in Molecular Biology. 91, 7.9.1-7.9.7 (2010).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50, S1-S5 (2010).
- Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. European Journal of Immunology. 37, 2378-2389 (2007).
- Yao, Z., et al. Human IL-17: a novel cytokine derived from T cells. Journal of Immunology. 155, 5483-5486 (1995).
- Lockhart, E., Green, A. M., Flynn, J. L. IL-17 production is dominated by gammadelta T cells rather than CD4 T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. Journal of Immunology. 177, 4662-4669 (2006).
- Liang, S. C., et al. Interleukin (IL)-22 and IL-17 are coexpressed by Th17 cells and cooperatively enhance expression of antimicrobial peptides. Journal of Experimental Medicine. 203, 2271-2279 (2006).
- Olsen, I., Sollid, L. M. Pitfalls in determining the cytokine profile of human T cells. Journal of Immunological Methods. 390, 106-112 (2013).
