Summary
Hier beschreiben wir eine robuste Methode zur Bestimmung der Immunzellidentität und -reinheit durch epigenetische Signaturen, die mit quantitativer PCR (qPCR) nachgewiesen wurden. Die DNA-Deethylierung an einem bestimmten Ort dient als eindeutiger Identifikator für einen bestimmten Zelltyp und ermöglicht die Identifizierung von CD8+-, regulatorischen oder Th17-T-Zellen.
Abstract
Die Häufigkeiten der Population des Immunzellsubtyps können einen großen Einfluss auf die Wirksamkeit von T-Zelltherapien haben. Aktuelle Methoden, wie die Durchflusszytometrie, haben spezifische Probenanforderungen, einen hohen Probeneingang, sind geringer Durchsatz und schwer zu standardisieren, was sich nachteilig auf die Charakterisierung von Zelltherapieprodukten während ihrer Entwicklung und Herstellung.
Die hier beschriebenen Assays identifizieren und quantifizieren Immunzelltypen in einer heterogenen Zellmischung mit isolierter genomischer DNA (gDNA). DNA-Methylierungsmuster werden durch Bisulfitumwandlung aufgedeckt, ein Prozess, bei dem unmethylierte Zytosine in Uracils umgewandelt werden. Unmethylierte DNA-Regionen werden durch qPCR-Verstärkung mit Primern nachgewiesen, die auf umgewandelte Bereiche abzielen. Ein eindeutiger Lokus pro Assay wird gemessen und dient als genauer Identifikator für einen bestimmten Zelltyp. Die Assays sind robust und identifizieren CD8+-, regulatorische und Th17-T-Zellen in einer Art und Weise mit hohem Durchsatz. Diese optimierten Assays können potenziell für In-Process- und Produktfreigabetests für den Zelltherapieprozess verwendet werden.
Introduction
Die Verwendung von T-Zellen in der zellulären Immuntherapie hat in den letzten zehn Jahren deutlich zugenommen, insbesondere mit dem Aufkommen des chimären Antigenrezeptors (CAR) T-Zelltechnologie1. Während T-Zell-basierte Therapien mit großem klinischen Erfolg erfüllt wurden, sind sie heterogen und Zelleigenschaften und Identitäten können zwischen den Spendern erheblich variieren2. Die Heterogenität von T-Zellpopulationen kann erhebliche Auswirkungen auf die therapeutische Wirksamkeit haben und Schlussfolgerungen aus klinischen Studien erschweren. Aus diesem Grund ist es wichtig, die Heterogenität von T-Zellen während der Produktherstellung und -formulierung zu verstehen, um die optimalen Formulierungen von T-Zell-Immuntherapien zu bestimmen.
Im weiteren Sinne können T-Zellen in zwei Gruppen eingeteilt werden: CD4+-Hilfs-T-Zellen, die immunmodulatorische Zytokine absondern, und CD8+ zytotoxische T-Zellen, die direkt Lysezellen, die das Cognate-Antigen auf großen Histokompatibilitätskomplexen (MHC) I-Molekülen darstellen. CD4+ Hilfszellen können sich in eine Vielzahl spezifischer Teilmengen differenzieren, die einen einzigartigen Satz von Zytokinen erzeugen. Einige schlagen vor, dass ein definiertes Verhältnis von CD4+ zu CD8+ T-Zellen im Endzellprodukt die In-vivo-Wirksamkeit und Persistenz maximieren, aber die Zellherstellung erschweren könnte3. Regulatorische T-Zellen (Tregs), eine Teilmenge von CD4+ T-Zellen, sind immunsuppressiv und verringern die Aktivierung von Immunzellen. Regulatorische T-Zellen wurden in die Vermittlung von Tumortoleranz verwickelt und können, wenn sie während der Herstellung von CAR T-Zellen vorhanden sind, die Antitumor-Immunantwort von CAR-T-Zellen4,5,6hemmen. Andere CD4+-Teilmengen wie T-Helfer 17 (Th17) T-Zellen fördern die Tumorclearance und können genutzt werden, um die Wirksamkeit von T-Zell-Therapien zu erhöhen. So ist die Erhöhung der Th17 CD4+ T-Zellen von besonderem Interesse für solide Tumoreinstellungen, wo erhöhte Produktion von Interleukin 17 (IL-17) die Antitumor-Immunantwort5,7,8,9fördert. Das Verständnis der Bedeutung von Th17-Zellen in Tumorreaktionen hat zu mehr Untersuchungen zu Strategien zur Generierung dieser Zellen in vitroveranlasst 7,9. Daher sind Methoden zum Nachweis dieser T-Zell-Teilmengen entscheidend für die Optimierung von T-Zelltherapien und sollten robust, einfach, skalierbar und reproduzierbar sein.
Durchflusszytometrie ist die häufigste Methode, um die Identität einer Immunzelle zu bestimmen. Die Durchflusszytometrie erfordert jedoch lebende, intakte Zellen, die am selben Tag analysiert werden müssen, an dem sie geerntet werden. Für intrazelluläre Zytokinfärbung (ICS) ist eine Proteinsekretionshemmung erforderlich, um Zytokine in den T-Zellen zu behalten. Jedoch, verschiedene Inhibitor-Verbindungen haben unterschiedliche Auswirkungen auf die Sekretion von bestimmten Zytokinen, zwingt Benutzer, spezialisierte Cocktails für den Nachweis des Zytokins von Interesse10,11zu erstellen. Darüber hinaus beruht die Genauigkeit der Durchflusszytometrie auf Antikörperklonen, die gezielt und stark an ihr Ziel binden. Die Verwendung verschiedener Antikörperklone kann zu unterschiedlichen Ergebnissen führen und zu ungenauen Schlussfolgerungen führen, was die Standardisierung der Methode erschwert12. Darüber hinaus kann die Analyse der über die Durchflusszytometrie gesammelten Daten und damit die aus den Daten gezogenen Schlussfolgerungen zwischen den Benutzern sehr unterschiedlich sein, je nach Derart, wie Gates eingestellt sind13,14. Aus diesen Gründen ist die Durchflusszytometrie nicht ideal für eine präzise Qualitätskontrolle während der Zelltherapieentwicklung.
Die Bewertung der genomischen Methylierung an bestimmten Gen-Loci ist eine alternative Methode zur Bestimmung der Zellidentität. Die Begründung für die Verwendung von DNA-Methylierung zur Identifizierung bestimmter Zelltypen wurde in mehreren Artikeln beschrieben und stützt sich auf spezifische Methylierungsmuster, die in einer gegebenen Zellpopulation15,16,17vorhanden sind. In Zielzellen enthalten bestimmte Standorte unmethylierte Nukleotide, während diese in Nicht-Zielzellen methyliert sind. Dieses Muster kann durch Dieulfitumwandlung nachgewiesen werden, ein Prozess, der ausschließlich unmethylierte Cytosinnukleotide (C) in Uracil (U) umwandelt. Primer und Sonden können für die konvertierten Standorte ausgelegt, dann verstärkt und durch qPCR16erkannt werden.
Der hier beschriebene Assay misst die Häufigkeit von Immunzellsubtypen innerhalb heterogener Populationen, indem die Anzahl der spezifischen nicht methylierten Loci im Vergleich zu einem Haushaltsgen quantifiziert wird. Kopien der nicht methylierten regulatorischen Elemente für das CD8-B-Gen werden in diesem Test im CD8-Assay, FoxP3 in Treg und IL-17 in Th17 gemessen. Diese Loci wurden identifiziert, indem die spezifische Zellpopulation von Interesse (z. B. CD8+ T-Zellen) isoliert und Bisulfitsequenzierung durchführt wurde, um Loci zu identifizieren, die nur in diesem Zelltyp15unmethyliert sind. Primer und Sonden werden gegen die einzigartig unmethylierten Loci entwickelt und Proben mittels qPCR analysiert. Aus Verdünnungen eines Standardplasmids mit hoher Kopierzahl wird eine Standardkurve bekannter Kopiernummern erstellt, die die Umwandlung eines Ct-Werts in eine Transkriptkopiennummer ermöglicht.
Um die Assay-Leistung zu bewerten, sind Kontrollproben erforderlich, einschließlich einer Referenz-gDNA und eines Kalibrator-Plasmids. Das Referenzgenommaterial ist eine gepoolte Blutprobe von mehreren Spendern mit bekannten Immunzellfrequenzen und wird für eine Qualitätskontrolle (QC) Assay-Leistungsprüfung verwendet. Die Kalibratorprobe ist ein synthetisiertes Plasmid, das die Gensequenzen CD8, FoxP3 und GAPDH in einem Äquimolar-Verhältnis enthält. Es wird als Maß für die Bisulfitumwandlungseffizienz verwendet, da Bisulfit-Umwandlungen innerhalb verschiedener genomischer Regionen in der Effizienz variieren. Das Verhältnis des Ziels zu GAPDH innerhalb des Kalibrators beträgt 1, aber aufgrund der Unterschiede der Bisulfitumwandlungseffizienz kann das Verhältnis variieren. Dieser Kalibrierungsfaktor wird auf die CD8- und Treg-Assays angewendet. FoxP3, das im Treg-Assay verwendete Gen, befindet sich auf dem X-Chromosom. Da dieser Test nur unmethylierte Kopien von FoxP3 misst und nur eine Kopie von FoxP3 in Tregs unmethyliert ist, ist dieser Assay sexagnostisch und kann sowohl mit männlichen als auch mit weiblichen Proben18verwendet werden. Der Th17-Assay verwendet keine Kalibratorprobe oder GAPDH als Housekeeping-Gen. Stattdessen wird ein weiterer Primersatz enthalten, der auf die in Nicht-Th17-Zellen vorhandenen methylierten Loci abzielt, und die Gesamtzahl der Zellen wird durch die Summe der methylierten und nicht methylierten Kopien von IL-17 reflektiert. Die aus der qPCR erhaltenen Daten werden in eine voreingestellte Analysevorlage eingegeben, die Qualitätskontrollen der Daten durchführt und den Prozentsatz der Zielzelle innerhalb der Startgrundgesamtheit berechnet. Dies ermöglicht eine automatisierte und unvoreingenommene Datenanalyse, wodurch die Subjektivität der Benutzer entfernt und die Standardisierungsfunktionen verbessert werden.
Dieser Test verwendet gDNA, die durch ein Leukapherese-Verfahren mit kultivierten oder festen Zellen oder gefrorenen Zellpellets isoliert werden kann. Die geringe Probenanforderung, Flexibilität im Probenausgangsmaterial, hohe Genauigkeit und standardisierte Analyse schließen die Mitflusszytometrie verbundenen Grenzen und sind ideal für Die Qualitätskontrolle während der Zelltherapie-Prozessentwicklung.
Protocol
Alle menschlichen Proben wurden aus einer kommerziellen Quelle nach ihren Richtlinien für die Ethik der menschlichen Forschung gewonnen.
1. Genomische DNA-Isolierung
HINWEIS: Die genomische DNA-Isolierung wird mit einem kommerziell erhältlichen Kit (siehe Materialtabelle)von allen hämatopoetischen Zellen, wie peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs), gereinigten T-Zellen oder einem anderen hämatopoetischen Zelltyp, durchgeführt. In diesem Experiment wurden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) und T-Zellen von drei verschiedenen menschlichen Spendern verwendet.
- 1-2 x 106 hämatopoetische Zellen in ein konisches Rohr und Zentrifuge bei 400 x g für 10 min legen.
- Aspirieren Sie den Überstand vollständig.
- Fügen Sie der Probe 350 l Lyse/Bindungspuffer hinzu und brüten Sie 10 min bei 55 °C.
- Fügen Sie 50 l Proteinase K (20 mg/ml) zu 350 l Zellsuspension und Wirbel für 30 s hinzu.
- Fügen Sie 50 l DNA-bindende paramagnetische Perlen und 400 l 100% Isopropanol hinzu und inkubieren Sie 3 min bei Raumtemperatur (RT).
- Legen Sie das Rohr für 2 min auf ein magnetisches Rack und entfernen Sie den Überstand, wobei Darauf geachtet wird, die Perlen nicht zu stören. Die DNA ist bei diesem Schritt an die magnetischen Perlen gebunden.
- Fügen Sie 950 l Waschpuffer 1 hinzu. Vortex für 30 s und wiederholen Sie Schritt 1.6.
- Wiederholen Sie Schritt 1.7.
- Fügen Sie 950 l Waschpuffer 2 hinzu. Vortex für 30 s und wiederholen Sie Schritt 1.6.
- Fügen Sie 100 l Elutionspuffer und Wirbel für 2 min. Legen Sie das Rohr auf einen magnetischen Ständer für 1 min und übertragen Sie den Überstand, der die gDNA enthält, in ein neues Rohr.
- Verwenden Sie 1 l der aus den hämatopoetischen Zellen isolierten gDNA, um die Reinheit der gDNA durch Spektrophotometrie mittels eines Fluorimeters zu messen, indem Sie die OD bei 260 nm, 280 nm und 230 nm erhalten. Stellen Sie sicher, dass das Verhältnis der optischen Dichte (OD-Verhältnis) bei 260 und 280 nm zwischen 1,7-2,0 und das OD-Verhältnis bei 260 und 230 nm zwischen 1,5-2,4 liegt.
2. Probenvorbereitung
- Thermomixer auf 56 °C vorheizen.
- Etikettieren Sie 2 ml Rohre für alle Proben, Kalibrator und Referenzmaterial.
- Verdünnen Sie die Proben und den Kalibrator mit dem Elutionspuffer (verfügbar mit dem für Schritt 1 verwendeten Kit) bei RT.
- Verdünnen Sie die gDNA für alle Versuchsproben auf ein Gesamtvolumen von 142 l. Verdünnen Sie z. B. 4 l gDNA bei 100 ng/l in 138 l Elutionspuffer.
HINWEIS: 400-1.200 ng gDNA können für den Assay verwendet werden. - Verdünnen Sie 75 l des Kalibrators auf ein Gesamtvolumen von 142 l.
- Überprüfen Sie die Referenz-gDNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer, wobei TE (pH = 8,0) als Rohling verwendet wird.
- Verdünnen Sie 1.000-1.200 ng der Referenz-gDNA auf ein Gesamtvolumen von 142 l. Verdünnen Sie z. B. 10 l Referenz-gDNA bei 100 ng/l in 132 l Elutionspuffer.
- Verdünnen Sie die gDNA für alle Versuchsproben auf ein Gesamtvolumen von 142 l. Verdünnen Sie z. B. 4 l gDNA bei 100 ng/l in 138 l Elutionspuffer.
- Inkubieren Sie die Rohre bei 56 °C für 5 min bei 900 U/min in einem Thermomixer. Drehen Sie die Rohre kurz herunter, um die Proben zu sammeln.
3. Bisulfit-Umwandlung
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Inkubationszeiten während der Bisulfitkonvertierung den empfohlenen Zeiten folgen. Überinkubation oder Unterinkubation wird die Ergebnisse des Assays beeinflussen.
- Stellen Sie einen Thermomixer auf 80 °C.
- Fügen Sie 270 L Ammoniumbisulfit und 90 l Tetrahydrofurfurylalkohol (THFA) in alle Röhrchen. Wirbel vollständig zu mischen und kurz drehen Sie die Proben, um die Flüssigkeit an der Unterseite zu sammeln.
- Inkubieren Sie die Rohre in einem Thermomixer bei 80 °C für 45 min bei 900 U/min. Wenn Sie einen Wärmeblock verwenden, wirbeln Sie die Rohre für 1-2 s alle 4,5 min während der Inkubation.
- Drehen Sie die Proben kurz herunter und lassen Sie sie 3-5 min auf RT abkühlen, bevor Sie mit Schritt 4 oder 5 fortfahren. Das endige Volumen sollte 500 l betragen.
4. CD8- und Treg-Assays
- DNA-Reinigung nach Bisulfitumwandlung
HINWEIS: Dieser Schritt wird mit einem handelsüblichen DNA-Reinigungskit (siehe Materialtabelle)auf Bisulfit-konvertierter DNA durchgeführt. Stellen Sie sicher, dass die Reagenzien vor der Anwendung auf RT erwärmt werden.- Vor Beginn der Reinigung eine homogene Mischung der paramagnetischen DNA-Isolationsperlen durch Wirbeln für 30 s. Ethanol und Isopropanol in die Waschpuffer geben, nach den auf den Flaschen aufgeführten Volumen, und einen Wärmeblock auf 65 °C setzen.
- Fügen Sie bei RT ab Schritt 3.4 870 l Lyse/Bindungspuffer und 105 l DNA-bindende paramagnetische Perlen in jedes Rohr ein. Wirbel vollständig zu mischen und kurz drehen sie die Rohre.
- Fügen Sie 570 l 2-Propanol und Wirbel vollständig zu mischen.
- Inkubieren Sie die Rohre bei RT für 7 min bei 50 U/min in einem Thermomixer oder einem Standard-Drehmischer.
- Drehen Sie die Rohre kurz nach unten. Legen Sie die Rohre auf das Magnetgestell und inkubieren Sie für 5 min.
- Mit den Proben noch auf dem magnetischen Rack, entfernen Sie den Überstand, ohne die Perlen zu stören.
HINWEIS: Die DNA ist an die Perlen gebunden. - Entfernen Sie die Rohre aus dem magnetischen Rack und fügen Sie 900 L Waschpuffer 1 hinzu. Wirbeln Sie die Rohre, um die Perlen vollständig wieder aufzuhängen und dann kurz die Rohre nach unten zu drehen.
- Geben Sie die Rohre in das Magnetgestell zurück und brüten Sie 3 min.
- Mit den Proben noch auf dem magnetischen Rack, entfernen Sie den Überstand, ohne die Perlen zu stören.
- Wiederholen Sie die Wäsche (4.1.7-4.1.9), einmal mit Waschpuffer 1, dann zweimal mit Waschpuffer 2.
- Nach dem Entfernen des Überstandes drehen Sie die Rohre kurz herunter und kehren für 3 min zum magnetischen Rack zurück.
- Entfernen Sie den gesamten Restwaschpuffer 2 und entfernen Sie die Rohre aus dem Magnetischen Rack.
- Trocknen Sie die Perlen mit den Rohrdeckeln bei 65 °C für 15 min öffnen.
- Fügen Sie jedem Rohr 60 l Elutionspuffer hinzu und inkubieren Sie bei RT 7 min bei 1.400 U/min. Alternativ kann mit einem Schaumadapter ein Wirbel mit moderater Geschwindigkeit hergestellt werden.
- Drehen Sie die Rohre kurz herunter und legen Sie sie 2 min auf das Magnetgestell.
- Übertragen Sie 55 l Eluat in ein neues Rohr, ohne die Perlen zu stören. Das Eluat enthält die bisulfitkonvertierte DNA. Die Messung der DNA-Konzentration ist nicht erforderlich.
- Einrichten und Ausführen von qPCR
- Schalten Sie den qPCR-Computer und den Computer ein, der seine Software betreibt.
- Erstellen Sie auf der Software-Benutzeroberfläche ein neues Experiment, und wählen Sie aus, welcher Block zum Ausführen des Experiments verwendet wird.
- Wählen Sie Standardkurve als Versuchstyp aus.
- Wählen Sie ggf. die Erkennungschemie aus, die Sie verwenden möchten. Dieser Test verwendet die TaqMan Reagenzien. Andernfalls wählen Sie ROX als passive Referenz aus.
- Wählen Sie ggf. die Eigenschaften des Instruments als Standardaus.
- Definieren Sie Ihr experimentelles Design, indem Sie Ziele (z. B. GAPDH oder CD8 mit FAM als Reporter) und einen nicht fluoreszierenden Quencher zuweisen.
- Weisen Sie Beispielnamen für die Standards, Beispiele und Steuerelemente zu.
- Als nächstes weisen Sie jede Brunnenposition entsprechend der qPCR-Platte zu. Jeder Brunnen erfordert ein Ziel, z. B. CD8 oder GAPDH, und einen Beispielnamen. Jede Probe wird in dreifacher Ausführung ausgeführt und muss auf dem Plattenlayout des Instruments reflektiert werden.
- Weisen Sie jedem Standard den TaskStandard zu, und geben Sie die endgültigen Kopiernummern gemäß Tabelle 1an.
- Weisen Sie Samples, Kalibrator und Verweisen auf die Aufgabe Unbekanntzu.
- Legen Sie Bohrungen für kein Vorlagensteuerelement als NTC oder N fest.
- Bereiten Sie die seriellen Verdünnungen der Lambda-DNA (10 ng/L) vor, die als Standard verwendet werden sollen (siehe Tabelle 1).
- Bereiten Sie qPCR Master Mix Cocktails vor, einen für den Zielzellentyp und einen für GAPDH (siehe Tabelle 2). Führen Sie alle Beispiele, Standards und die NTC-Steuerung in dreifacher Ausführung aus.
HINWEIS: GAPDH wird verwendet, um die Gesamtzahl der Zellen zu quantifizieren und wird parallel zur Zielverstärkung ausgeführt. Kopien von nicht methylierten regulatorischen Elementen für das CD8-B-Gen werden im CD8-Assay, FoxP3 in Treg und IL-17 in Th17 gemessen. - Verwenden Sie eine 96-Well-Platte für qPCR. Laden Sie zuerst 3 L Vorlagen-DNA in die Brunnen. Als nächstes laden Sie 7 l des Master-Mix.
- Versiegeln Sie die Platte mit einer qPCR-Folie und drehen Sie die Platte kurz nach unten, bevor Sie sie in das qPCR-Instrument legen.
- Führen Sie die qPCR aus, wie in Tabelle 3dargestellt.
- Exportieren Sie nach Abschluss der Ausführung die qPCR-Daten als .txt- oder .xlsx-Datei.
- Analysieren Sie die Daten mithilfe der Analysevorlagen für den CD8-Assay und den Treg-Assay (siehe Materialtabelle), um den Ct-Durchschnitt, die Ct-Standardabweichung und die Kopiernummer zu berechnen.
| Anfängliche Plasmid-Kopiernummer/3 L | Volumen | Verdünnende DNA [1] | Endgültige Kopiernummer pro 3 L | Etikett |
| 31250 | 1000 l | - | 31250 | STD Nr. 1 |
| 31250 | 200 l | 800 l | 6250 | STD Nr. 2 |
| 6250 | 200 l | 800 l | 1250 | STD Nr. 3 |
| 1250 | 200 l | 800 l | 250 | STD Nr. 4 |
| 250 | 200 l | 800 l | 50 | STD Nr. 5 |
| 1250 | 30 l | 1200 l | 30 | STD-Nr. 6 [2] |
| [1] 10 ng/L Lambda DNA in TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) | ||||
| [2] Verwenden Sie STD-3, um STD-6 vorzubereiten | ||||
Tabelle 1: Vorbereitung von Standardverdünnungen. Eine Verdünnungsnorm von 4 Protokollen mit einer Gesamte von 31250-30 Kopien wurde gemäß der Tabelle unter Verwendung von TE/Lambda-DNA als Verdünnungsmittel erstellt. Die gleichen Standardverdünnungen wurden sowohl für CD8 als auch für GAPDH verwendet. Die Normen wurden bei -20 °C gelagert.
| Reagenzien | Menge |
| Lambda DNA (50 ng/l in TE, pH8,0) | 1 L |
| TaqMan-Assay | 0,5 l |
| Wasser, Nukleasefrei | 0,5 l |
| Master Mix | 5 l |
| gesamt | 7 l |
Tabelle 2: Zubereitung des qPCR-Cocktails. Bereiten Sie den qPCR-Master-Mix in zwei separaten Röhren vor, jeweils eines für CD8 und GAPDH, mit Ausnahme der Vorlagen-DNA gemäß der Tabelle.
| Schritt | Zeit | Temp | Zyklen |
| Vorinkubation | 35 Min. | 95°C | 1X |
| Verstärkung | 15 Sek. | 95°C | 50X |
| 1 Min. | 61°C | ||
| Abklingzeit | 5 Sek. | 42°C | 1X |
Tabelle 3: qPCR-Ausführungsparameter für den CD8- und Treg-Assay. Die qPCR wurde gemäß den in der Tabelle angegebenen Parametern ausgeführt.
5. Th17 Assay
- DNA-Reinigung nach Bisulfitumwandlung
- Führen Sie die Infekationsschritte wie in Abschnitt 4.1 beschrieben durch.
- Um die Proben zu löschen, fügen Sie jedem Rohr 25 L Elutionspuffer hinzu und inkubieren Sie bei RT 7 min bei 1.400 U/min. Alternativ kann mit einem Schaumadapter ein Wirbel mit moderater Geschwindigkeit hergestellt werden.
- Drehen Sie die Rohre kurz herunter und legen Sie sie 2 min auf ein magnetisches Rack.
- Übertragen Sie 20 l Eluat in ein neues Rohr, ohne die Perlen zu stören. Das Eluat enthält die bisulfitkonvertierte DNA.
- DNA-Vorverstärkung
HINWEIS: DNA-Vorverstärkung wird für niedrige Häufigkeitsziele für eine genaue Quantifizierung über qPCR19empfohlen. Der Th17-Methylierungstest wurde aus diesem Grund so konzipiert, dass er eine Vorverstärkung erfordert.- Übertragen Sie 2 l Bisulfit-konvertierte DNA in die PCR-Streifenröhren. Erstellen Sie ein NTC-Rohr mit 2 l Wasser.
- Erstellen Sie den Vorverstärkungsmastermix für alle Samples (siehe Tabelle 4).
- Fügen Sie jedem Rohr 23 L des Master-Mix hinzu. Kappen Sie die Rohre, Wirbel, und drehen Sie die Rohre kurz nach unten.
- Führen Sie das Vorverstärkungsprotokoll auf einem Thermocycler mit einem beheizten Deckel aus. (Tabelle 5). Nachdem der Lauf abgeschlossen ist, drehen Sie die Rohre kurz nach unten.
- Übertragen Sie 2 l der verstärkten DNA in neue Röhrchen und fügen Sie 78 l Wasser hinzu, wodurch die Proben 1:40 verdünnt werden.
- qPCR einrichten und ausführen
- Folgen Sie Abschnitt 4.2, um die qPCR einzurichten und auszuführen.
- Analysieren Sie Daten mithilfe der Analysevorlage für den Th17-Test (siehe Materialtabelle), um den Ct-Durchschnitt, die Ct-Standardabweichung und die Kopiernummer zu berechnen.
| Reagenz | Menge |
| Wasser, Nukleasefrei | 9,5 l |
| Hot Start PCR Master Mix | 12,5 l |
| Th17 PCR Primer | 1 L |
| gesamt | 23 l |
Tabelle 4: Vorverstärkung der DNA für den Th17-Test. Der Vorverstärkungs-Reaktionsmaster-Mix wurde entsprechend der Tabelle erstellt.
| Schritt | Zeit | Temp | Zyklen |
| Vorinkubation | 35 Min. | 95°C | 1X |
| Denaturierung | 1 Min. | 95°C | 12X |
| Glühen | 45 Sek. | 55°C | |
| Dehnung | 30 Sek. | 72°C | |
| Enddehnung | 10 Min. | 72°C | 1X |
| Halten | Unbestimmte | 4°C |
Tabelle 5: Preamplify Th17 DNA. Th17 DNA wurde für 12 Zyklen vor dem eigentlichen qPCR vorverstärkt.
Representative Results
Alle drei Methylierungstests beginnen mit einer Eingabe von gDNA und ergeben einen Prozentsatz von CD8+ T-Zellen, Treg- oder Th17-Zellen innerhalb der gesamten Zellpopulation. Die aus der qPCR nach der Bisulfitkonvertierung generierten Daten wurden mit der bereitgestellten Analysevorlage analysiert. Diese Vorlage verwendete die Standardkurven, die aus den Standardstichproben gewonnen wurden, um die Kopiernummer der Ziele und die Gesamtzahl der Zellen in den Teststichproben zu schätzen. Der prozentuale Zelltyp wurde dann anhand der in die Analysevorlagen integrierten Formeln berechnet. Abbildung 1 zeigt repräsentative Daten aus dem CD8+-Test, die aus der Analyse sowohl peripherer mononuklenuanischer Blutzellen (PBMCs) als auch von T-Zellen von drei verschiedenen Spendern gewonnen wurden, die sowohl die Durchflusszytometrie als auch den beschriebenen Methylierungstest verwenden. Die Trends zwischen den beiden Methoden bei allen Spendern in beiden Zelltypen waren ähnlich. Abbildung 2 zeigt repräsentative Daten aus dem Treg-Test. Drei gereinigte Treg-Spender wurden sowohl mit Methylierungsbasierter qPCR- als auch mit Durchflusszytometrie analysiert, und die Ergebnisse wurden auf dem gezeigten Diagramm dargestellt. Die Ergebnisse für beide Methoden waren relativ ähnlich. In allen Fällen ergab die Durchflusszytometrie jedoch höhere Werte. Abbildung 3 zeigt den Vergleich von Th17-Zellen, die über Durchflusszytometrie und Methylierung nachgewiesen wurden. In diesem Diagramm gibt es stimulierte und unstimulierte Bedingungen für die experimentellen Methoden. Zellen benötigen eine Stimulation mit PMA und Ionomycin und eine Behandlung mit einem Proteintransporthemmer, um die menge an IL-17A in jeder Zelle zu erhöhen, so dass sie über die Durchflusszytometrie20nachgewiesen werden kann. Der Methylierungsstatus kann unabhängig vom Stimulationsstatus erkannt werden. Die Durchflusszytometrie führte im Vergleich zur Methylierung zu niedrigeren Th17-Zellen. Die Empfindlichkeit und Spezifität des Assays wurde durch die in Tabelle 6dargestellte Grenze von Leerzeichen (LOB), die Erkennungsgrenze (LOD) und die Quantifizierungsgrenze (LOQ) gezeigt.
Abbildung 1: Durchfluss- und Methylierungsvergleich von CD8+-Prozentsätzen für PBMCs und T-Zellen für drei verschiedene Spender. PBMCs und T-Zellen von drei verschiedenen Spendern wurden auf den Prozentsatz der CD8+ T-Zellen in der gesamten Population mit Entweder-Durchflusszytometrie oder Methylierung geprüft. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Durchfluss- und Methylierungsvergleich der Treg-Prozentsätze für gereinigte Treg für drei verschiedene Spender. Gereinigte Treg-Zellen wurden auf den Prozentsatz der Treg-Zellen in der gesamten Population mit Entweder-Durchflusszytometrie oder Methylierung geprüft. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Durchfluss- und Methylierungsvergleich von Th17-Prozentsätzen für stimulierte und unstimulierte Versuchsgruppen. Stimulierte und unstimulierte T-Zellen wurden sowohl mit Flusszytometrie als auch mit Methylierung analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Assay | LoB | Lod | LoQ |
| CD8 | 0 | 19 | 52 |
| Gapdh | 0 | 7 | 21 |
| FoxP3 | 0 | 3 | 12 |
| Th17 TpG | 0 | 35 | 73 |
| Th17 CpG | 0 | 38 | 73 |
Tabelle 6: LoB, LoD, LoQ der Kopiernummern für methylierungsbasierte Assays. Die Empfindlichkeit und Spezifität des Tests wird durch die LoB-, LoD- und LoQ-Werte beschrieben, die durch die MIQE-Richtlinien21,22ermittelt werden. Im Allgemeinen können nur 40 Kopien durch diese Assays genau erkannt werden.
Discussion
Mit dem Aufkommen neuer Immuntherapeutika sind standardisierte Methoden zur Erkennung der Identität und Reinheit von Immunzellen erforderlich. Bewertungsmethoden für Prozess- und Releasetests, die robust, validiert und skalierbar sind, müssen noch etabliert werden und stellen eine große Herausforderung für die Kommerzialisierung zellbasierter Therapien dar. Während die Durchflusszytometrie derzeit die häufigste Methode zur Immunzell-Phänotypisierung ist, erschweren hohe Probenqualitäts- und Quantitätsanforderungen den regelmäßigen Einsatz. Darüber hinaus wird die Implementierung der Durchflusszytometrie in einer Good Manufacturing Practice (GMP)-Umgebung durch bedienerabhängige Gating-Strategien und die Anforderung von Referenzstandards für jeden verwendeten Marker13,14eingeschränkt. Obwohl sich gezeigt hat, dass automatisiertes Gating die Robustheit des Assays verbessert, ist es noch keine etablierte Strategie zur Qualitätskontrolle. Während Genexpressionsprofiling auch verwendet werden kann, um die Identität und Reinheit des Zelltherapieprodukts zu charakterisieren, sind die Daten semiquantitativ und arbeitsintensiv. Darüber hinaus sind RNA und microRNA relativ weniger stabil als DNA und können zum Mangel an robusten und reproduzierbaren Ergebnissen beitragen. Die Nutzung des epigenetischen DNA-Methylierungsstatus eines bestimmten Ortes bietet somit eine stabile, einfach durchzuführende, robuste und skalierbare Methode zur Identifizierung und Quantifizierung eines Zelltyps.
Der Nachweis von Methylierungsmustern zu Phänotypzellen beruht auf drei kritischen Schritten: Erstens erfordert der Assay die Verwendung von gDNA, die nach den beschriebenen Methoden isoliert wird. Hochwertige DNA ist erforderlich und wenn nicht verwendet, Bisulfit Umwandlung kann betroffen sein23,24. Wenn DNA von geringer Qualität gewonnen wird, wird eine weitere Reinigung empfohlen, um die Testzuverlässigkeit zu gewährleisten. Zweitens ist eine erfolgreiche Bisulfitumwandlung des unmethylierten Cytosins in Uracil erforderlich. Der kritischste Schritt bei der Bisulfitumwandlung ist die DNA-Denaturierung23,25. Hochtemperatur-Denaturierung mit Ammoniumbisulfit, im Gegensatz zu Natriumbisulfit, erhöht die Umwandlungseffizienz und Konsistenz und ist das empfohlene Verfahren für diese Assays25,26. Der Anwender muss sicherstellen, dass die Reaktion bei 80 °C erfolgt und dass das Probenmischen häufig erfolgt. Aus diesen Gründen wird ein digitaler Thermomixer empfohlen (siehe Materialtabelle). Drittens muss während der qPCR-Vorbereitung die richtige Pipettiertechnik befolgt werden. Während der qPCR-Reaktion sind drei technische Replikationen erforderlich, um die Mindestinformationen für die Veröffentlichung quantitativer Echtzeit-PCR-Experimente (MIQE) einzuhalten27. Die Einbeziehung weiterer technischer Repliken ist akzeptabel, aber nicht erforderlich. Unsachgemäße Pipettiertechnik und/oder ohne technische Replikationen führen zu unzuverlässigen qPCR-Ergebnissen.
Wenn die kritischen Schritte befolgt werden und die gewünschten Ergebnisse immer noch nicht erzielt werden, können mehrere Steuerelemente innerhalb des Assays genutzt werden, um das Problem zu ermitteln. Die richtige Bisulfitumwandlung ist der wichtigste Schritt in diesem Test. Eine unsachgemäße Bisulfitkonvertierung würde durch einen fehlgeschlagenen Kalibrierungsfaktor und/oder Referenzwerte hervorgehoben, die von der Analysevorlage berechnet werden. Wenn die Bisulfitumwandlung falsch durchgeführt wurde (z. B. wenn die Reaktion bei RT durchgeführt wurde), würde es während qPCR keine Verstärkung geben. Außerdem wäre keine Verstärkung zu sehen, wenn während der qPCR-Reaktionsvorbereitung ein Fehler gemacht wurde (z. B. wenn der qPCR-Mastermix nicht hinzugefügt wurde). Diese beiden Probleme können durch die Untersuchung der Standardproben getrennt werden. Eine Verstärkung in den Standardproben, nicht jedoch die Referenz-, Kalibrator- und Versuchsproben, würde darauf hindeuten, dass die Bisulfitumwandlung nicht korrekt durchgeführt wurde. Keine Verstärkung in einer der Proben würde darauf hindeuten, dass die qPCR nicht korrekt durchgeführt wurde.
Während dieser Test die strengen Stichprobenanforderungen und Analysevariabilitäten im Zusammenhang mit anderen Phänotypisierungsmethoden, insbesondere der Durchflusszytometrie, berücksichtigt, müssen Einschränkungen beachtet werden. Dieser Test zielt auf einen einzelnen Ort ab, der als eindeutiger Bezeichner für die Zielzelle verwendet wird, wodurch die Multiplexanalyse, die häufig mit Flusszytometrie durchgeführt wird, verboten wird. Dies macht die Identifizierung komplexer Zelltypen wie Th17 schwierig. Jedoch, die Verwendung von Methylierungsmuster an einem einzigen Ort hat sich als ein genauer phätotypischer Marker von mehreren Zellen und wurde in mehreren klinischen Studien15,16verwendet. Dies gilt insbesondere für Tregs, wo die Bewertung von FOXP3-Methylierungssignaturen eine genaue und eindeutige Methode zum Nachweis echter Tregs aus vorübergehend FOXP3-Exzesszellen28ist. Der Verlust der Multiplex-Analyse wird durch die Genauigkeit der verhörten Loci kompensiert. Zukünftige Iterationen des Assays könnten mehrere qPCR-Farbstoffe und Quencher enthalten, um die Erkennung mehrerer Loci in einer qPCR-Reaktion zu ermöglichen.
Dieser Test kann als alternative Methode für die Durchflusszytometrie bei der Bestimmung des Zellphänotyps und der Identität verwendet werden. Es sei darauf hingewiesen, dass dieser Test nicht die genauen Werte liefert, die die Zytometrie durchfließen (Abbildungen 1-3). Dies ist zum Teil auf die Variabilität der Datenanalyse im Zusammenhang mit der Durchflusszytometrie zurückzuführen. Je nach Gating-Strategie können die Ergebnisse der Durchflusszytometrie erheblich variieren. Dies ist insbesondere der Fall, wenn komplexe Färbeprotokolle verwendet werden, um intrazelluläre Ziele wie IL-17 zu betrachten, wo der Variationskoeffizient (CV) bis zu 15%14betragen kann. Zwischen mehreren Benutzern hatte der vorgestellte Test konsistent einen Lebenslauf von <15%, was die Robustheit des Assays und verbesserte Standardisierungsfunktionen unterstützte. Die größten Unterschiede zwischen epigenetischer und durchflusszytometriebasierter Phänotypisierung sind zu beobachten, wenn eine Zellstimulation erforderlich ist (Abbildung 3). Der Nachweis von Th17-Zellen über Durchflusszytometrie wurde mit einem gemeinsamen Protokoll zur T-Zellstimulation und intrazellulären Zytokinfärbung29,30,31durchgeführt. Die Unterschiede, die bei der Th17-Phänotypisierung zwischen epigenetischer Messung und Durchflusszytometrie beobachtet wurden, könnten auf die Kinetik der IL-17-Produktion zurückzuführen sein. Während die Methylierungssignaturen stabil sind, braucht die Proteinproduktion Zeit und muss in ausreichenden Mengen vorhanden sein, um von fluoreszierenden Antikörpern nachgewiesen zu werden20,32. Die 6 h Inkubation mit Protein-Transport-Inhibitor und Zellstimulationscocktail muss möglicherweise erweitert werden, um den Gehalt an Th17-Zellen zu sehen, die über epigenetische Phänotypisierungsmethoden nachgewiesen werden. Weitere Studien sind erforderlich, um den genauen Grund zu bestimmen, warum die Werte nicht übereinstimmen, und die genaueste Phänotypisierungsmethode zu bestimmen.
In diesem Bericht beschreiben wir, wie Immunzelltypen in einer heterogenen Zellmischung auf einfache und robuste Weise identifiziert und quantifiziert werden können. Die Assays sind für den möglichen Einsatz für In-Process- und Release-Tests von zellbasierten Therapeutika konzipiert und optimiert. Die beschriebenen Assays erfüllen die Anforderung, dass hochqualifizierte Rohstoffe in Zelltherapieanwendungen eingesetzt werden müssen. Durch die Behebung der Mängel der Durchflusszytometrie und anderer molekularer Methoden wie Stabilität, Probenanforderungen, vorherige Stimulation, zelluläre Permeabilisierung für intrazelluläre Färbung und Subjektivität der Datenanalyse sind die beschriebenen Assays mit den Zielen der Kommerzialisierung zellbasierter Therapien.
Disclosures
Suman K. Pradhan, Jerry Guzman, Carl Dargitz, Mark Landon und Uma Lakshmipathy sind bei Thermo Fisher Scientific beschäftigt. Sven Olek, Bjoern Samans und Ulrich Hoffmüller sind Gründer und Mitarbeiter der Firma Epiontis. Bei der Erstellung dieses Manuskripts wurde keine schreibunterstützende Hilfe in Den Mund nehmen.
Acknowledgments
Das Projekt wurde durch thermo Fisher Scientific Intramural Grant finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 22363344 | |
| Analysis template for CD8 assay | Click Here | ||
| Analysis template for Th17 assay | Click Here | ||
| Analysis template for Treg assay | Click Here | ||
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer, blue/red/violet6/yellow | Thermo Fisher Scientific | A29004 | |
| CTS PureQuant CD8+ T-Cell Assay | Thermo Fisher Scientific | A43674 | |
| CTS PureQuant Th17 Assay | Thermo Fisher Scientific | A43676 | |
| CTS PureQuant Treg Assay | Thermo Fisher Scientific | A43675 | |
| Dynabeads SILANE Genomic DNA Kit | Thermo Fisher Scientific | 37012D | Used for genomic DNA isolation and purification after bisulfite conversion. Contains elution buffer to dilute samples. |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Used as a magnetic rack during DNA isolation and purification |
| eBioscience Essential Human T cell Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42923 | |
| eBioscience Essential Human Th1/Th17 Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42927 | |
| eBioscience Essential Human Treg Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42925 | |
| Eppendorf SmartBlock 2 mL | Eppendorf | 5362000035 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | Recommended sample mixer |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND 1000 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Applied Biosystems | AM12450 | |
| QuantStudio 12S Flex | Applied Biosystems | 4470661 | |
| TE, pH 8.0, RNase-free | Thermo Fisher Scientific | AM9849 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | H2KT17113 |
References
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