Summary
在这里，我们描述了一个生长条件，以培养伪多蒙多尼亚小殖民地变种。我们还描述了使用传统的尿酸卡巴佐尔测定法和基于藻酸盐的单克隆抗体（mAb）的ELISA检测和定量由P.aeruginosa产生的外糖藻酸盐的两种独立方法。
Abstract
假单组动物，一种机会性革兰氏阴性细菌病原体，可以过度产生外多糖藻酸盐，从而产生一种称为粘凝的独特表型。藻酸盐与慢性肺部感染有关，导致囊性纤维化 （CF） 患者预后不佳。了解调节藻酸盐生产的途径有助于制定针对藻酸盐形成的新型治疗策略。另一种与疾病相关的表型是小菌群变异（SCV）。SCV 是由于细菌生长缓慢，并且经常与抗菌素耐药性增加有关。在本文中，我们首先展示了一种由于苯丙胺生物合成突变而具有遗传定义的P.aeruginosa SCV的培养方法。补充氮碱，尿素或细胞氨酸，返回这些突变体的正常生长，表明存在一个拯救途径，从环境中清除自由碱。接下来，我们将讨论两种测量细菌藻酸盐的方法。第一种方法依靠多糖的水解到其尿酸单体，然后衍生与色原试剂，卡巴佐尔，而第二种方法使用ELISA基于市售的，藻酸盐特异性mAb。两种方法都需要一个标准曲线进行定量。研究还表明，该免疫法是藻酸盐定量的特异性，可用于临床标本的藻酸盐测量。
Introduction
慢性肺部感染与伪单多尼亚龙是囊性纤维化 （CF） 患者发病率和死亡率的主要原因。在幼儿期，患者被多种细菌病原体殖民，包括P.aeruginosa1，2的非粘胶分离物。小菌群变异（SCV）分离物的出现以及粘水井分离物是慢性感染发病的标志。SCV分离物具有很强的抗药性3，因为它们的生长速度缓慢4，这使得他们在治疗团和其他慢性感染5由P.aeruginosa严重威慑。Al Ahmar等人6号的工作表明，SCV与通过新丙胺生物合成所联系的粘体之间存在联系。由于与苯丙胺生产有关的基因突变，苯丙胺饥饿导致非粘凝参考菌株PAO1和粘尿衍生物PAO581（PAO1mucA25）中的SCV表型。
尽管藻酸盐过度生产是CF慢性肺部感染的重要疾病标志物，但尚不清楚藻酸盐量与肺病理学之间是否存在直接相关性，也不清楚藻酸盐能否用作治疗7的预后标志物。藻酸盐生产主要由两个操作器调节，一个调节操作体（algUmucABCD）8，9和生物合成操作子（阿尔格Doperon）10，11。藻酸盐生产受到西格玛因子AlgU9、12（也称为AlgT）和反西格玛因子MucA13的降解的严格调节。从患者的痰样原位监测藻酸盐的产生的能力有助于开发新的治疗方案。
在这里，我们描述了一个生长条件，它检测由不能合成新热胺的突变体引起的SCV的存在。补充尿素和/或细胞氨酸，苯丙胺核苷核苷酸的氮碱，到介质激活抢救途径，从而恢复突变体的正常生长。这种针对这些特定SCV突变体的生长方法可用作筛选方法，以识别患者样本中的丙酰胺突变。此外，我们还讨论了两种检测和测量由P.aeruginosa产生和分泌的藻酸盐的方法。第一种是使用高浓度酸降解多糖的传统方法14、15、16，然后添加一个色度指标来定量样品中的浓度。第二种方法，在我们的实验室开发，利用酶链接免疫吸附测定（ELISA）使用QED生物科学开发的抗藻酸盐单克隆抗体（mAb）。ELISA 方法证明比尿酸测定更具体、更敏感，由于避免了高浓度硫酸，因此可以更安全地使用。ELISA 能够直接用于患者痰样测量藻酸盐，因此可以开发为监测诊断工具，以跟踪感染不同时期肺部存在的藻酸盐量。
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Protocol
1. SCV 生长条件及打捞路径的生理激活
- SCV 检测。
- 在预热的伪单一酶（PIA）板上，在37°C生长48小时，在预加热的伪单子分离琼脂（PIA）板上，将P.aeruginosa菌株PAO1、PAO1+pyrD、PAO581和PAO581_pyrD分发。在生长板上识别具有 SCV 表型的单一菌落隔离物（菌群大小为 1⁄3 mm，而不是正常的 3⁄5 mm 菌落大小）。
- 重复步骤 1.1.1 以获得 SCV 的纯隔离。
注：由于SCV菌落的生长速度缓慢，生长可能需要长达72小时。
- 打捞途径的生理活化。
- 使用无菌接种回路，从 PIA 板中选取 SCV 菌落，并在预加热的 PIA 上条纹，辅以 0.1 mM 的 uracil。在 37°C 下生长板 24~48 小时。
注：本议定书中使用的所有PIA板均含有高压灭菌前添加到混合物中的20 mL/L甘油。高压灭菌后和混合物温度低于55°C后，在浇注板前向液体介质中加入11.21mg/L的尿素（0.1 mM）。这种方法将有助于识别导致P.aeruginosa中引起SCV表型的苯丙氨酸突变。如果 SCV 表型是上述突变的结果，则在 uracil 补充的 PIA 板上观察到正常的菌群生长和大小 （3⁄5 mm）。如果菌株有能力产生藻酸盐，那么粘液表型也将返回尿酸补充。
- 使用无菌接种回路，从 PIA 板中选取 SCV 菌落，并在预加热的 PIA 上条纹，辅以 0.1 mM 的 uracil。在 37°C 下生长板 24~48 小时。
2. 尿酸卡巴佐尔测定
- 从需要测试的纯培养物中，识别单个菌落。使用无菌牙签，拾取菌落，并将牙签放入含有 5 mL的伪单抗隔离汤 （PIB） 的培养试管中。在37°C的摇床培养箱中生长24小时。
注：以下菌株PAO581（PAO1mucA25）、PAO581CarA、PAO581车B和PAO581pyrD生长在PIA板或PIA板上，辅以0.1 mM uracil，以收获藻酸盐进行测量。 - 在预热的 PIA 板上添加 150 μL 的培养 PIB 肉汤（对于 15 mm x 100 mm 板）或 450 μL 的肉汤（对于 15 mm x 150 mm 板）。使用无菌细胞扩张器，将肉汤铺在盘子上。在 37°C 下生长板 24 小时。
注：使用移液器从板中吸出任何多余的液体（如果有），将板倒入一侧。协议中使用的PIB和PIA板均含有20 mL/L的甘油，由细胞用作碳源，以帮助生产藻酸盐。 - 使用移液器控制器和无菌 50 mL 移液器，在种植的草坪上添加 0.85% NaCl，并使用细胞扩张器刮板收集样品。使用新鲜的 50 mL 移液器将样品吸入 50 mL 收集管中。将样品涡旋到高处，将样品混合并放在冰上。
注： 添加的 0.85% NaCl 的体积因板的大小而异。对于 15 mm x 100 mm 板，使用 10⁄30 mL;对于 15 mm x 150 mm 板，使用 20~50 mL。 - 通过将样品的 1 mL 添加到一次性比色皿中并使用分光光度计读取 OD，测量样品 600 nm （OD600）的光学密度。重复此步骤 2x 可获取每个示例的三重读取。
- 将3 mL的硫酸/硼酸盐溶液加入培养管中，放在冰上。将收集的样品的350 μL缓慢地加入试管中的酸混合物中，并在低涡中短暂地加入涡旋。
- 在 45 mL 的水中加入 10.099 克氢氧化钾 （KOH） 粉末，制备硼酸盐。在混合物中加入24.74克硼酸（H3BO3），使体积至100 mL。
- 将 1 L 瓶放入装有冰的水槽中，并装满 500 mL 的浓缩硫酸。缓慢添加 15 mL 的准备硼酸盐股票。让瓶子冷却。
- 再添加 10 mL 的硼酸盐库存，总计 25 mL。一旦瓶子冷却，将体积达到1升。
注意：此方法依赖于使用高浓度硫酸。应使用适当的个人防护设备确保样品的安全和适当的处置协议。
注：对于正对照，已知浓度为D-锰酸和/或已知的细菌藻酸盐样品，通过藻酸盐生产P.aeruginosa菌株（例如：PAO581-PAO1MucA25）进行收获和纯化。对于负控制，请使用 0.85% NaCl 溶液和/或 PAO1+algD（在帧内删除algD基因，使细菌完全无法产生藻酸盐）。可以从每个样品中制成多个管，以增加技术重复次数，以帮助进行统计分析。准备每个样品的3⁄5管。
- 在乙醇溶液中加入100 μL 0.1%的卡巴佐尔，加入酸/样品混合物中。将管子和涡旋盖在中等设置上5秒，在55°C的干浴中放置30分钟。
- 孵育后，在高上短暂取出管和涡流，冷却5分钟。
注：要看到的颜色将是紫色的阴影。颜色将保持稳定，测量1⁄2小时。 - 将 1 mL 的混合物添加到干净的比色皿中，并在分光光度计上读取 530 nm 样品的 OD，读取每个管的 OD530。使用带有 0.85% NaCl 的管子作为分光光度计的空白。
- 通过测量已知浓度D-锰酸（1，024 μg/mL、512 μg/mL、256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL 和 8 μg/mL）的已知浓度的 OD530系列稀释，准备标准曲线。重复 2 次。从这些读数中提取线性方程。
注：标准曲线只需执行一次。从中提取的线性方程可用于以后的测试。- 使用标准曲线计算每个样本中的藻酸盐浓度，并将藻酸盐浓度从线性方程除以OD 600，以获得每OD600的藻酸盐总量。
3. 藻酸盐定量ELISA
- 重复步骤 2.1_2.4 以获得藻酸盐测量样本。
注：使用的菌株为PAO1、PAO1+algD和PAO1携带pHERD20T-algU。 - 使用微移液器将采集的样品的50μL添加到未经处理的96孔板中。向井中加入 50 μL 涂层缓冲液（碳酸盐/碳酸氢缓冲液 pH 9.6）。在37°C下孵育板2小时。
注：对于阳性控制，可以使用已知浓度为D-锰酸和/或已知稳定藻酸盐产生菌株（例如：PAO581-PAO1mucA25）。对于负控制使用 0.85% NaCl 溶液和/或 PAO1+algD（在帧内删除algD基因使细菌完全无法产生任何藻酸盐）。可以从每个样品中制造多个井，以增加技术重复次数，以帮助进行统计分析。准备3~5口样品。 - 使用喷瓶，用1倍磷酸盐缓冲盐（PBS）清洗板孔2倍，用0.05%补间20（PBS-T）填充井，然后翻转板来排空。
- 使用微移液器向井中加入 200 μL 的阻塞缓冲液（PBS-T 中的 10% 脱脂牛奶）。在4°C孵育过夜。
注：将板包裹在石蜡薄膜或收缩包装中，以帮助避免冰箱中出现任何蒸发。 - 使用喷瓶将板孔用PBS-T清洗2倍，填充井，然后翻转板来排空。
- 使用微移液器向井中加入100μL的稀释原抗体（小鼠抗藻酸盐单克隆抗体），并在37°C下孵育1⁄2小时。
注：在抗体稀释溶液（1x PBS中1%脱脂牛奶）中的原抗体（小鼠抗藻酸单克隆抗体）在浓度为0.5μg/mL（稀释1：2，000的1mg/mL） 中提供。 - 使用喷瓶清洗板井3倍与PBS-T填充井，然后通过翻转板排干。
- 使用微移液器向井中加入100μL的稀释二级抗体，并在37°C下孵育1⁄2小时。
注：二级抗体使用的是穿刺山羊抗小鼠多HRP抗体，浓度为0.25微克/mL（稀释1：2，000 0.5mg/mL库存）的抗体稀释溶液。 - 使用喷瓶清洗板井3倍与PBS-T填充井，然后通过翻转板排干。
- 使用微移液器，加入100μL的TMB-ELISA溶液（材料表），在黑暗中在室温下孵育30分钟。
注：正面反应的颜色为蓝色阴影。 - 使用微移液器，加入100 μL的停止溶液（2 N硫酸）。
注： 添加停止溶液时，颜色将从蓝色变为黄色。停止反应后，颜色稳定长达 30 分钟。 - 使用板读取器，读取 450 nm 处的 OD。
- 通过测量已知浓度D-锰酸（1，024 μg/mL、512 μg/mL、256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL 和 8 μg/mL）的已知浓度的 OD450连续稀释，生成标准曲线。重复 2 次。从这些读数中提取一个线性方程。
注： 标准曲线只需执行一次。从中提取的线性方程可用于以后的测试。- 使用标准曲线计算每个样本中的藻酸盐浓度，并将藻酸盐浓度从线性方程除以OD 600，以获得每OD600的藻酸盐总量。
4. 藻酸盐测量的统计分析
- 在图形软件工作表中，使用从标准曲线派生的线性方程设置列。将 y 轴结果设置为藻酸盐浓度，将 x 轴结果设置为尿酸测定的 OD530，为 ELISA 设置 OD450，以获得每个样品中的藻酸盐浓度。
- 要将每个样品中的藻酸盐量标准化为每5.5 x108 CFU/mL（1 OD600）的量，将上述每个样品的浓度除以其各自的OD600值。如果为每个样本测量多个 OD600，则除以平均 OD600。
- 使用首选统计软件（例如，图形板棱镜 7.02）执行统计分析。
- 打开软件。在"新建表和图形"下选择"列"并选择单向方差分析数据集。
- 用测试的应变来命名每列，并在下面添加藻酸盐浓度。
- 输入所有数据后，单击顶部菜单中的"分析"。这将打开一个分析设置窗口。选择适当的测试参数，并指示是否需要运行任何多个比较。
注： 分析后，数据集将包含一个 p 值，可帮助确定数据的统计显著性。如果 p 值小于设置的 + 值（通常为 p < 0.01 设置值），则数据将被视为具有统计显著性。 - 在图形选项卡下选择条形图类型。这将自动绘制输入数据表中指示的标题的数据图表。通过显示感兴趣条之间的连接线上方的 @ 符号，根据需要指示数据的统计显著性。
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Representative Results
图1显示了PAO1和PAO581的板，在pyrD基因（pyrimidine生物合成通路的一个基因）中，无论是否在帧内删除，导致SCV6。PAO1 SCV突变体在响应尿液补充时恢复正常生长（图1A，B）。此外，PAO581®pyrD SCV突变体通过相同的尿素处理返回到粘液，因为母菌株PAO581具有额外的MucA25突变（图1C，D）。尿酸卡巴佐尔测定的结果如图26所示。数据代表PAO581和PAO581的样本，其基因调节在PIA和PIA上生长的硫酰胺生物合成基因突变，并辅以0.1 mM的尿素（图2A）。数据显示，在介质中存在尿素会导致突变菌株转换回粘液（如增加/恢复藻酸盐产量所示）（图2B）。基于ELISA的抗藻酸盐单克隆抗体的结果如图3所示。数据显示，PAO1、PAO1与编码关键藻酸盐生物合成酶GDP-曼诺斯脱氢酶的algD基因的帧内删除，PAO1携带表达质粒pHERD20T与主要藻酸盐特西格玛因子algU，当生长在PIA板上用arabinose诱导pBAD启动子在p HERD20T。此数据显示为 PAO1 和 PAO1+algD测量的非藻酸盐水平与 PAO1+pHERD20T-algU 测量的藻酸盐粘液水平。图 4将藻酸盐测量的两种方法进行比较。使用 p < 0.01 的双向方差分析相比，结果在统计上没有显著性。图5A比较了抗藻酸mAb与其他多糖（包括淀粉蛋白、淀粉糖、胶原蛋白和糖原）的交叉反应。图5B显示了尿酸卡巴佐尔测定的特异性和灵敏度与新开发的抗藻酸单克隆抗体ELISA的特异性和敏感性的比较，利用高纯化海藻藻酸盐（材料表）进行对照。图6显示了ELISA对患者痰样的直接检测，这些样本对粘膜P.aeruginosa和不含粘膜的Aeruginosa患者呈阳性反应。
图1：在PAO1和PAO581中产生SCV表型的二甲苯基合成突变的代表性图像。图为PIA板（A）和PIA板（右）在PIA板（A）和PIA板上补充的紫锥（B）在37°C生长48小时。图显示PIA板（C）和PIA板PAO581（左）和PIA板（右）在37°C生长48小时。这个数字已由Al Ahmar等人所做的工作作了修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：尿酸卡巴佐尔测定的代表性图。（A） 在 PIA 板（左）和 PIA 板（右）上，粘膜P. aeruginosa菌株 PAO581 （PAO1mucA25）在 37°C 下生长 24 小时的图像。（B） 用于 PAO581、PAO581 CarA、PAO581CarB和 PAO581pyrD的藻酸盐生产，当在 PIA 板上生长时，在 37°C 下和无尿酸片，在 37 °C 下 24 小时使用标准卡巴佐尔测定进行收集和测量。显示的值是均值藻酸盐 = 三次斜面读取的标准偏差。（= = p < 0.0001）。这个数字已由Al Ahmar等人所做的工作作了修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：基于抗藻酸盐mAb的ELISA代表图。PAO1、PAO1+allgD和PAO1的藻酸盐生产，携带表达载体pHERD20T-algU在PIA上生长，在37°C下生长0.1%的阿拉伯基诺，24小时。 显示的值是均值藻酸盐 = 三次斜面读取的标准偏差。p < 0.0001.请点击此处查看此图的较大版本。
图4：尿酸测定结果与抗藻酸mAbELISA结果的比较。从5种不同的粘膜P.aeruginosa专有菌株中生产，在37°C的PIA板上生长24小时。显示的值是均值藻酸盐 = 三次斜面读取的标准偏差。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：抗藻酸mAb基ELISA与尿酸卡巴佐尔测定的特异性和灵敏度。（A） ELISA 在海藻藻酸盐的高 （800 μg/mL） 和低 （100 μg/mL） 内部测定控制下运行.这种藻酸盐也被用作ELISA的标准。其他经测试的可能与抗藻酸mAb交叉反应的多糖是淀粉肽、淀粉素、胶原蛋白和糖原（每个500微克/mL）。（B） 乌罗尼酸卡巴佐尔测定和ELISA使用与海藻藻酸盐相同的标准浓度范围：50微克/mL、5微克/mL、1微克/mL、0.5微克/mL、0.1微克/mL和0.05微克/mL。显示的值是均值藻酸盐 = 三次斜面读取的标准偏差。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：直接患者样本测试。抗藻酸盐ELISA在患者的痰样上测试，没有先在板上生长。使用了三个粘膜P.aeruginosa生长的CF痰样本以及两个患者痰样，其中含有非粘膜P.aeruginosa（Neg 1）或无P.aeruginosa生长（Neg 2）。显示的值是均值藻酸盐 = 三次斜面读取的标准偏差。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
SCV 和藻酸盐都是与多种慢性感染相关的重要疾病标志物。因此，能够生长SCV以及研究由P.aeruginosa调节和生产的藻酸盐是发现这些慢性疾病的新疗法不可或缺的。
SCV菌株是出了名的难以生长，由于其缓慢的生长速度4相比，其他P.aeruginosa菌株，这有助于他们的抗微生物药物耐药性3。我们的工作确定了一种特定形式的P.aeruginosa SCV，这是新丙二烯生物合成突变的结果。在这里，我们讨论这种SCV的生长条件，当提供核苷尿素时恢复到正常生长表型。但是，当 UMP/UTP 添加到介质中时，未恢复有缺陷的增长（未显示数据）。需要进一步研究导致这种选择性的porin。用uracil补充生长介质，帮助缓解因苯丙胺饥饿引起的压力（图1）。同样，在介质中加入游免费细胞氨酸，以相同的方法添加尿素，有助于缓解苯丙胺饥饿（未显示数据）。介质中的游自由尿酸和游自由细胞氨酸进入细胞，帮助细胞中返回尿当单磷酸盐 （UMP） 和尿氨酸三磷酸盐 （UTP）6的正常水平，这是 SCV 分离物恢复正常生长的方式。
藻酸盐测量存在几个关键步骤，可能有助于结果的可重复性。最初，样品在从板材上报废后，必须留在冰上，以帮助阻止样品中藻酸盐的降解，并导致测量的浓度降低。此外，在 OD600测量之前，必须彻底混合样品以获得均匀的溶液，因为块状物确实在已坐了一段时间的样品中形成，并且可能会干扰 OD 测量，从而影响最终浓度计算。使用 ELISA 方法时，可能需要稀释生长板中的样品，尤其是在使用产生大量藻酸盐的菌株时，因为结果可能超出标准曲线范围。使用尿酸时，在加入卡巴佐尔后和孵育后彻底涡涡培养管，以确保样品均匀。使用尿酸测定时，处理酸混合物时必须谨慎，并妥善处理样品。
上述要求酸水解藻酸盐的传统测量方法已显示出巨大的潜力，已被许多研究人员使用多年。在这项工作中，我们展示了传统测定的过程以及使用抗藻酸盐单克隆抗体的内部开发的ELISA。这些抗体是在小鼠中开发的，可以在尚未识别的表位上识别藻酸盐。ELISA 方法的特异性针对P. aeruginosa和海藻的藻酸盐进行了彻底测试。此外，ELISA在测试的细菌样本中量化藻酸盐的尿酸测定与尿酸测定相当（图3）。此外，它被测试针对其他多糖，可能会导致假阳性结果。我们的工作显示了对藻酸盐的抗体的高特异性及其区分藻酸盐和其他经测试的多糖的能力（图5A）。与尿酸测定（图5B）相比，ELISA协议具有更高的灵敏度，因为我们能够检测使用ELISA的微量水平，在检测患者痰样时未使用尿酸检测检测（图6）。ELISA 方法可适用于从患者痰中进行藻酸盐体内测量（图 6）。使用尿液补充的生长条件以及新开发的ELISA都将是更好地了解CF中P.aeruginosa发病机制的有力工具。
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Disclosures
作者余红卫是Pro创世科技有限公司的首席科学官和联合创始人。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究院（NIH）授予R44GM113545和P20GM103434的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | via Fisher Scientific |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
| Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
| Boric Acid | Research Products International Corp. | 10043-35-3 | |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbazole | Sigma | C-5132 | |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma | C3041 | |
| Centrifuge Tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Culture Test Tubes | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Cuvette Polystyrene (1.5 mL) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
| Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| D-Mannuronic Acid Sodium | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginate | FMC | 2133 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP906-5 | For Molecular Biology |
| Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody | QED Biosciences | N/A | Lot # :15725/15726 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody | Thermo Scientific | 32230 | via Fisher Scientific |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 1310-58-3 | via Fisher Scientific |
| Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Isolation Broth (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
| Round Toothpicks | Diamond | Any brand | |
| Seaweed alginate (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Skim Milk | Difco | 232100 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BioRad | 170-2525 | or preferred vendor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader | Molecular Devices | i3x | or preferred vendor |
| Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A298-212 | Technical Grade |
| Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) | R&D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
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