Summary
Здесь мы описываем состояние роста к культуре малый вариант колонии Pseudomonas aeruginosa. Мы также описываем два отдельных метода обнаружения и количественной оценки экзополисахарида альгината производства P. aeruginosa с использованием традиционной уронической кислоты карбазол анализа и альгината конкретных моноклональных антител (mAb) основе ELISA.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa, оппортунистический грамотрицательный бактериальный патоген, может перепроизводить экзополисахарид альгината в результате чего уникальный фенотип называется слизистой оболочки. Альгинат связан с хроническими легочными инфекциями, что приводит к плохому прогнозу у пациентов с муковисцидозом (КФ). Понимание путей, которые регулируют производство альгината может помочь в разработке новых терапевтических стратегий, направленных на альгинат формирования. Другим фенотипом, связанным с болезнью, является небольшой вариант колонии (SCV). SCV объясняется медленным ростом бактерий и часто связан с повышенной устойчивостью к противомикробным препаратам. В этой работе мы сначала показываем метод культивирования генетически определенной формы P. aeruginosa SCV из-за мутаций биосинтеза пиримидина. Дополнение азотных оснований, урацила или цитозина, возвращает нормальный рост этим мутантам, демонстрируя наличие спасительного пути, который высвобожяет свободные базы от окружающей среды. Далее мы обсудим два метода измерения бактериального альгината. Первый метод опирается на гидролиз полисахарида к его мономеру уроновой кислоты с последующим производным с хромогенным реагентом, карбазолом, в то время как второй метод использует ELISA на основе коммерчески доступного, альгината специфического mAb. Оба метода требуют стандартной кривой для количественной оценки. Мы также показываем, что иммунологический метод специфичен для алгинатной количественной оценки и может быть использован для измерения альгината в клинических образцах.
Introduction
Хронические инфекции легких с Pseudomonas aeruginosa являются основной причиной заболеваемости и смертности у пациентов с муковисцидозом (CF). В раннем детстве пациенты колонизируются несколькими бактериальными патогенами, включая немукоидные изоляты P. aeruginosa1,2. Появление небольшого варианта колонии (SCV) изолятов, а также изоляты слизистой оболочки является маркером для начала хронических инфекций. SCV изоляты высоко лекарственно устойчивы3 из-за их медленных темпов роста4, что делает их тяжелым сдерживающим фактором в лечении полков и других хронических инфекций5 P. aeruginosa. Работа Al Ahmar et al.6 показала связь между SCV и слизистой оболочкой, связанную биосинтезом de novo pyrimidine. Пиримидиновые голодания, из-за мутаций в генах, связанных с производством пиримидина, привели к phenotype SCV в немукоидном референс-напряга е PAO1 и слизистой производной, PAO581 (PAO1mucA25).
Хотя альгинат перепроизводства является важным маркером заболевания для хронических инфекций легких в CF, не ясно, есть ли прямая корреляция между количеством альгината и легочной патологии, и неясно, если альгинат может быть использован в качестве маркера прогноза для лечения7. Производство алгината в основном регулируется двумя оперонами, регулятивным опероном(algUmucABCD)8,9 и биосинтетическим опероном(algD operon)10,11. Производство alginate плотно регулируется фактором сигмы AlgU9,12 (также известный как AlgT) и деградации анти-сигма фактор MucA13. Способность контролировать выработку альгината на месте из образцов моспы пациентов может помочь в разработке новых терапевтических вариантов.
Здесь мы описываем состояние роста, которое обнаруживает наличие SCV, вызванного мутантами, которые не могут синтезировать пиримидин де Ново. Дополнение урацила и/или цитозина, азотного основания пиримидного нуклеотида, к среде активизирует спасительный путь, тем самым восстанавливая нормальный рост мутантов. Этот метод роста для этих конкретных мутантов SCV может быть использован в качестве метода скрининга для выявления пиримидиновых мутаций в образцах пациентов. Кроме того, мы обсуждаем два метода обнаружения и измерения альгината, произведенного и выделяемого P. aeruginosa. Первый метод14,15,16 деградации полисахарида с использованием высокой концентрации кислоты, а затем добавить колориметрический индикатор для количественной концентрации в образце. Второй метод, разработанный в нашей лаборатории, использует фермент-связанных иммуносорбента Ассей (ELISA) с использованием анти-альгината моноклональных антител (mAb), разработанных Зед Biosciences. Метод ELISA оказывается более конкретным и чувствительным, чем ассс ы уроническая кислота, и позволяет более безопасно использовать сяризне из-за избежания высококонцентрированной серной кислоты. С возможностью ELISA быть использованы непосредственно на образцы эмпухи пациента для измерения альгината, он может быть разработан в качестве мониторинга диагностический инструмент, чтобы следить за количество альгината присутствует в легких в разные периоды инфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Условия роста SCV и физиологическая активация пути спасения
- Обнаружение SCV.
- Полоса P. aeruginosa штаммов PAO1, PAO1 йpyrD, PAO581, и PAO581й pyrD на предварительно разогретых Pseudomonas изоляции агар (PIA) пластин и расти при 37 кС для 48 ч. На пластине роста определить одну колонию изолировать, который имеет фенотип SCV (размер колонии 1'3 мм в отличие от нормального размера колонии 3'5 мм).
- Повторите шаг 1.1.1 для получения чистого изолята SCV.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рост может потребовать до 72 ч из-за медленного темпа роста колоний SCV.
- Физиологическая активация спасительного пути.
- Используя стерильную петлю прививки, выберите колонию SCV из пластины PIA и проликна на предварительно разогретом PIA, дополненном 0,1 мМ урацила. Выращивайте тарелку при 37 градусах по Цельсию при 24-48 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все пластины PIA, используемые в этом протоколе, содержат 20 мл/л глицерола, добавленного в смесь перед автоклавированием. После автоклавирования и после смешивания температура ниже 55 градусов по Цельсию добавить 11,21 мг/л uracil (0,1 мм) в жидкие носители перед заливкой пластин. Этот метод поможет определить пиримидин мутации, которые вызывают фенотип SCV в P. aeruginosa. Если фенотип SCV является результатом указанной мутации, то нормальный рост колонии и размер (3-5 мм) будет наблюдаться на урацил дополненных пластинPI. Если штаммы имели возможность производить альгинат, то фенотип слизистой оболочки также вернется после uracil добавок.
- Используя стерильную петлю прививки, выберите колонию SCV из пластины PIA и проликна на предварительно разогретом PIA, дополненном 0,1 мМ урацила. Выращивайте тарелку при 37 градусах по Цельсию при 24-48 ч.
2. Уроновая кислота карбазола Ассей
- Из чистой культуры желаемого штамма, который необходимо проверить, определить одну колонию. Используя стерильную зубочистку, выберите колонию и поместите зубочистку в пробирку культуры, содержащую 5 мл бульона изоляции Pseudomonas (PIB). Выращивайте в шейкере-инкубаторе при 37 градусах по Цельсию в течение 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие штаммы PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carB, и PAO581pyrD были выращены на пластинах PIA или пластины PIA дополнены 0,1 мМ uracil для сбора алгината для измерения. - На предварительно разогретую пластину PIA добавить 150 л культивированного бульона PIB (для 15 мм х 100 мм пластин) или 450 л бульона (для 15 мм х 150 мм пластин). Используя стерильный распределитель клеток, распределите бульон по тарелке. Выращивайте тарелку при 37 градусах по Цельсию в течение 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аспирируйте любую лишнюю жидкость, если таковые имеется, из пластины с помощью трубки, опрокидывая пластину в одну сторону. Оба PIB и PIA пластины, используемые в протоколе содержат 20 мл / л глицерола для использования клетками в качестве источника углерода для оказания помощи в альгинатной продукции. - Используя контроллер пипетки и стерильный 50 мл пипетки, добавить 0,85% NaCl на газон выросли и собирать образец, слом пластины с помощью распределителя клеток. Приготовьте образец, используя свежий трубку 50 мл в трубку для сбора 50 мл. Vortex образец на высоком, чтобы смешать и поместить образцы на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем добавленных 0,85% NaCl варьируется в зависимости от размера пластины. Для 15 мм х 100 мм пластин, использовать 10-30 мл, а для 15 мм х 150 мм пластин, использовать 20-50 мл. - Измерьте оптическую плотность на уровне 600 нм (OD600) образцов, добавив 1 мл образца в одноразовый квет и считывая ОД с помощью спектрофотометра. Повторите этот шаг 2x, чтобы получить тройной считывания для каждого образца.
- Добавьте 3 мл раствора серной кислоты/бората в культурные трубки и дайте сидеть на льду. Добавьте 350 л собранного образца SLOWLY в кислотную смесь в пробирках и вихре на низком кратковременном.
- Приготовьте бульон боратом, добавив 10,099 г порошка гидроксида калия (KOH) до 45 мл воды. Добавьте 24,74 г борной кислоты (H3BO3)в смесь и доведите объем до 100 мл.
- Поместите 1 л бутылки в раковину со льдом и заполните бутылку 500 мл концентрированной серной кислоты. SLOWLY добавить 15 мл подготовленного бульона борате. Дайте бутылке остыть.
- Добавьте еще 10 мл бульона бората на общую сумму 25 мл. После охлаждения бутылки доведите объем до 1 л.
ПРЕДЕКТО: Этот метод опирается на использование высококонцентрированной серной кислоты. Надлежащее индивидуальное защитное оборудование должно использоваться для обеспечения безопасности и надлежащего протокола удаления образца должны соблюдаться.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для положительного контроля известная концентрация D-маннуриновой кислоты и/или известных бактериальных альгината образцов, собранных и очищенных через альгинат, производящие штаммы P. aeruginosa (например: PAO581-PAO1mucA25). Для отрицательного контроля используйте 0,85% раствор NaCl и/илиPAO1'algD (в кадре удаление гена algD, что делает бактерии полностью не способными производить альгинат). Несколько труб может быть сделано из каждой выборки, чтобы увеличить количество технических повторов, чтобы помочь в статистическом анализе. Подготовьте 3-5 трубок каждого образца.
- Добавьте 100 л карбазала в раствор этанола в кислотно-образную смесь. Крышка трубки и вихря на средней настройки в течение 5 с. Поместите в сухую ванну при 55 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
- После инкубации, удалить трубки и вихрь кратко на высоком и дать остыть в течение 5 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет, который будет рассматриваться будет оттенок фиолетового. Цвет останется стабильным для измерения в течение 1 х 2 ч. - Прочитайте OD530 каждой трубки, добавив 1 мл смеси в чистый кювет и считывая OD образцов на 530 нм на спектрофотометре. Используйте трубку с 0,85% NaCl в качестве пробела для спектрофотометра.
- Подготовьте стандартную кривую путем измерения OD530 серийных разбавлений известных концентраций D-Маннуроновой кислоты (1024 мкг/мл, 512 мкг/мл, 256 мкг/мл, 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, 32 мкг/мл, 16 мкг/мл и 8 м/мл). Повторите 2x. Извлеките линейное уравнение из этих показаний.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная кривая должна быть сделана только один раз. Линейное уравнение, извлеченное из него, может быть использовано для последующего тестирования.- Рассчитайте концентрацию альгината в каждом образце, используя стандартную кривую, и разделите концентрацию альгината от линейного уравнения на OD600, чтобы получить общее количество альгината за OD600.
3. ELISA для кальгинатной квантитации
- Повторите шаги 2.1'2.4 для получения образцов для измерения альгината.
ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы, используемые были PAO1,PAO1'algD, и PAO1 проведения pHERD20T-algU. - Используя микропипетт добавить 50 зл и л собранного образца в необработанную 96-колодую пластину. Добавьте в скважины 50 йл буфера покрытия (карбонат/бикарбонатный буфер pH 9.6). Инкубировать тарелку при 37 градусах по Цельсию на 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для положительного контроля можно использовать известную концентрацию D-маннуроновой кислоты и/или известного стабильного штамма, производящего альгинат (например, PAO581-PAO1mucA25). Для отрицательного контроля используйте 0,85% раствор NaCl и/илиPAO1'algD (в кадре удаление гена algD делает бактерии полностью неспособными производить альгинат). Из каждой выборки можно сделать несколько скважин, с тем чтобы увеличить число технических повторов для оказания помощи в статистическом анализе. Подготовьте 3х5 скважин каждого образца. - Используя бутылку шприца, мыть пластины скважин 2x с 1x фосфат буфера солей (PBS) с 0,05% Tween 20 (PBS-T) путем заполнения скважин, а затем слива их, перевернув пластины.
- Используя микропипетт добавить 200 л блокирующего буфера (10% обезжиренного молока в PBS-T) в скважинах. Инкубировать при 4 градусах Цельсия на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оберните пластины в парафина пленки или уменьшить обертку, чтобы помочь избежать любого испарения в холодильнике. - Использование шприц бутылку мыть пластины скважины 2x с PBS-T, заполнив скважины, а затем слива их листать пластины.
- Используя микропипетт добавить 100 qL разбавленного первичного антитела (мышь анти-альгинат моноклональных антител) в колодцы и инкубировать при 37 градусов по Цельсию для 1'2 h.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные антитела (мышь анти-альгинат моноклональных антител) была предоставлена в концентрации 0,5 мкг/мл (разбавление 1:2,000 1 мг/мл бульона) в разбавительных антителах раствор (1% обезжиренного молока в 1x PBS). - Использование шприц бутылку мыть пластины скважин3x с PBS-T, заполнив скважины, а затем слива их листать пластины.
- Используя микропипетт добавить 100 л разбавленных вторичных антител в скважины и инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 1х2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичные антитела, используемые был проколоть козла анти-мышь поли-HRP антитела до концентрации 0,25 мкг/мл (разбавление 1:2,000 0,5 мг/мл запасов) в антитела разбавлятельного раствора. - Использование шприц бутылку мыть пластины скважин3x с PBS-T, заполнив скважины, а затем слива их листать пластины.
- Используя микропипетт, добавьте 100 л раствора TMB-ELISA(Таблица материалов)и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет положительной реакции будет оттенок синего цвета. - Используя микропипетт, добавьте 100 л стоп-раствора (2 N серной кислоты).
ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет превратится из синего в желтый, когда будет добавлен стоп-решение. Цвет стабилен до 30 мин после того, как реакция остановлена. - Используя считыватель пластин, прочитайте OD на 450 nm.
- Производить стандартную кривую путем измерения OD450 серийных разбавлений известных концентраций D-Маннуроновой кислоты (1024 мкг/мл, 512 мкг/мл, 256 мкг/мл, 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, 32 мкг/мл, 16 мкг/мл, и 8 м/мл). Повторите 2x. Из этих показаний извлекаем линейное уравнение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная кривая должна быть выполнена только один раз. Линейное уравнение, извлеченное из него, может быть использовано для последующего тестирования.- Рассчитайте концентрацию альгината в каждом образце, используя стандартную кривую, и разделите концентрацию альгината от линейного уравнения на OD600, чтобы получить общее количество альгината за OD600.
4. Статистический анализ алгината
- В графическом программном листе установите столбец с линейным уравнением, полученным из стандартной кривой. Установите результаты y-оси как концентрация альгината и x-оси результаты как OD530 для анализа уроновой кислоты и OD450 для ELISA для того чтобы получить альгинат концентрации в каждом образце.
- Чтобы нормализовать количество альгината в каждой выборке на сумму 5,5 x108 CFU/mL (1 OD600),разделить концентрацию каждой выборки, полученной выше, по его соответствующей стоимости OD600. Если для каждой выборки было измерено несколько OD600, разделите на средний OD600.
- Проведение статистического анализа с использованием предпочтительного статистического программного обеспечения (например, GraphPad Prism 7.02).
- Откройте программное обеспечение. Выберите колонку под новой таблицей и графиком и выберите односторонний набор данных ANOVA.
- Назовите каждый столбец проверенным штаммом и добавьте под ним альгинатные концентрации.
- После ввода всех данных нажмите на Анализ в верхнем меню. Это откроет окно параметров анализа. Выберите подходящие параметры для тестирования и укажите, нужно ли проводить несколько сравнений.
ПРИМЕЧАНИЕ: После анализа набор данных будет содержать p-значение, которое поможет определить статистическую значимость данных. Данные будут считаться статистически значимыми, если значение p-значение меньше установленного значения (обычно значение устанавливается для p slt; 0.01). - Под вкладкой графика выберите тип Бар Граф. Это автоматически наметит данные с указанным заголовком из листа входных данных. Укажите статистическую значимость данных по мере необходимости, показывая символ q над соединительными линиями между барами интереса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показаны пластины PAO1 и PAO581 с или без удаления в кадре гена пирд (ген в пути биосинтеза пиримидина), что приводит к SCV6. Пао1 SCV мутант был восстановлен в нормальном росте в ответ на урацил добавок(Рисунок 1A,B). Кроме того, PAO581-pyrDSCV мутант был возвращен в мукоидис с той же обработки uracil, потому что родительский штамм PAO581 имеет дополнительную мутацию mucA25 (Рисунок 1C, D). Результаты исследования карбазола на уроновой кислоте показаны на рисунке 26. Данные представляют образцы PAO581 и PAO581 с мутациями в генах, регулирующих биосинтез пиримидина де Ново, выращенных на PIA и PIA, дополненных 0,1 мМ урацила(рисунок 2А). Данные показывают, что наличие uracil в средствах массовой информации приводит к преобразованию штамма мутантов обратно в слизистую (как видно на увеличение / восстановление альгината производства) (Рисунок 2B). Результаты для анти-альгината моноклональных антител на основе ELISA представлены на рисунке 3. Данные показывают, PAO1, PAO1 с в кадре удаления гена algD кодирования ключевых альгината биосинтетического фермента GDP-mannose дегидрогеназы, и PAO1 проведения выражения плазмид pHERD20T с основным альгинатом конкретных сигма фактор algU, когда выращивается на PIA пластин с арабиноза для индукции pBAD. Эти данные показывают, не-мукоидных уровней альгината измеряется для PAO1, и PAO1'algD по сравнению с слизистыми уровнями альгината измеряется для PAO1"pHERD20T-algU. Рисунок 4 сравнивает два метода альгинатных измерений вместе. Результаты не были статистически значимыми по сравнению друг с другом, используя двустороннее ANOVA с p qlt; 0.01. Рисунок 5А сравнивает поперечную реактивность анти-альгината mAb против других полисахаридов, включая амилопектин, амилозу, коллаген и гликоген. Рисунок 5B показывает сравнение в специфичности и чувствительности анализа карбалета уронной кислоты к недавно разработанному антиальгинатному моноклональному антителу eLISA с контролем, используя высокоочищенные водоросли alginate (Таблица Материалов). На рисунке 6 показано прямое тестирование ELISA на образцы эмпушки пациента, которые были положительными для слизистой оболочки P. aeruginosa и пациентов, которые не содержат слизистую оболочку P. aeruginosa.
Рисунок 1: Репрезентативные изображения мутаций биосинтеза де ново-пиримидин, которые приводят к фенотипу SCV в PAO1 и PAO581. Изображение показывает, PAO1(слева) иPAO1'pyrD (справа) на piA пластин (A) и PIA пластин ы дополнены uracil (B) выросли на 37 градусов по Цельсию для 48 ч. Изображение показывает, PAO581 (слева) и PAO581pyrD (справа) на PIA пластин (C) и PIA пластины дополнены с Эта цифра была изменена от работы, проделанной Аль-Ахмар и др.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Представительный график ассы уронной кислоты карбазола. ()Изображение слизистой P. aeruginosa штамм аэругиноса штамма PAO581 (PAO1mucA25) выращены при 37 кс для 24 ч на PIA пластин(слева) и PIA пластин ы с uracil(справа). (B) Alginate производства для PAO581, PAO581carA, PAO581carB, и PAO581pyrD, когда выращивается на PIA пластин с и без uracil на 37 C для 24 h. Alginate был собран и измерен с помощью стандартного карббаза. Показанные значения являются средними альгинатными и стандартными отклонениями считывания тройного. (Я) - стр. 0,0001). Эта цифра была изменена от работы, проделанной Аль-Ахмар и др.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Представительный график анти-альгината mAb основе ELISA. Производство alginate для PAO1,PAO1'algD и PAO1, несущих экспрессионный вектор pHERD20T-algU, выращенный на PIA с 0,1% арабиноза при 37 градусах По Цельсию на 24 ч. Альгината был собран и измерен с помощью антиальгината ELISA с мышью анти-альгинатанального антитела. Показанные значения являются средними альгинатными и стандартными отклонениями считывания тройного. р Злт; 0.0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Сравнение результатов, полученных в результате анализа уроновой кислоты и анти-альгината mAb основе ELISA. Производство алгината из пяти различных смудов P. aeruginosa собственные штаммы, выращенные на пластинах PIA при 37 градусах по Цельсию на 24 ч. Алгинат был собран и измерен ассаем уроновой кислоты и анти-альгината ELISA. Показанные значения являются средними альгинатными и стандартными отклонениями считывания тройного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Специфика и чувствительность анти-альгината mAb основе ELISA по сравнению с анализом карбазол урновой кислоты. (A) ELISA был запущен с высоким (800 мкг/мл) и низким (100 мкг/мл) внутренний контроль анализа водорослей альгината. Этот альгинат также использовался в качестве стандарта для ELISA. Другие испытания полисахаридов, которые могут перекреститься в ответ на анти-альгинат mAb были амилопектин, амилоза, коллаген, и гликоген (500 мкг /мл каждый). (B) Уроновая кислота карбазол анализа и ELISA были запущены с использованием того же диапазона стандартных концентраций с водорослями альгината: 50 мкг/мл, 5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, и 0,05 мкг/мл. Показанные значения являются средними альгинатными и стандартными отклонениями считывания тройного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Прямое тестирование образцов пациента. Антиальгинат ELISA был протестирован на образцах гэмкумы пациентов без предварительного роста на пластинах. Были использованы три образца комоки P. aeruginosa, а также два образца компьумуса пациента, которые содержали либо несмузидные P. aeruginosa (Neg 1), либо отсутствие роста P. aeruginosa (Neg 2). Показанные значения являются средними альгинатными и стандартными отклонениями считывания тройного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Оба SCV и альгинат являются важными маркерами болезни, причастных к нескольким хроническим инфекциям. Таким образом, способность расти SCV, а также изучить регулирование и производство альгината P. aeruginosa является неотъемлемой частью открытия новых методов лечения этих хронических заболеваний.
Штаммы SCV, как известно, трудно расти из-за их медленного темпа роста4 по сравнению с другими штаммами P. aeruginosa, который помогает в их устойчивости к противомикробнымпрепаратам 3. Наша работа определяет специфическую форму P. aeruginosa SCV, которые являются результатом мутаций в биосинтезе de novo pyrimidine. Здесь мы обсуждаем условия роста для такого SCV, чтобы вернуться к нормальному фенотипу роста, когда нуклеозидный uracil поставляется. Однако, когда UMP/UTP был добавлен в среду, дефектный рост не был восстановлен (данные не показаны). Порин (ы), ответственный за эту избирательность, нуждается в дальнейшем изучении. Дополнение средств роста с uracil помогли в снятии стресса, вызванного от пиримидного голодания(рисунок 1). Аналогичным образом, добавление бесплатного цитозина в средствах массовой информации в том же методе добавления uracil, способствовало в облегчении пиримидного голода (данные не показаны). Как свободный урацил, так и свободный цитозин в средствах массовой информации попадают в клетки и помогают вернуть нормальный уровень монофосфата уридина (UMP) и уридина трифосфата (UTP)6 в клетке, которая, как изоляты SCV вернулись к нормальному росту.
Существует несколько важных шагов для альгината измерений, которые могут помочь в воспроизводимости результатов. Первоначально образцы, после того, как были утилизированы из пластин, должны оставаться на льду, чтобы помочь блокировать деградацию альгината в образце и привести к более низкой измеренной концентрации. Кроме того, до измерения OD600 важно тщательно смешивать образец для получения однородного раствора, поскольку комки образуются в образцах, которые сидели некоторое время и которые могут помешать измерению OD и, таким образом, с окончательными расчетами концентрации. При использовании метода ELISA, образцы из пластин роста, возможно, потребуется разбавлять особенно при использовании штаммов, которые производят большое количество альгината, поскольку результаты могут быть вне стандартного диапазона кривой. При использовании уроничной кислоты, тщательно вихрь культуры трубки после добавления карбазол и после инкубации для обеспечения однородного образца. При работе с асссием урновой кислоты, важно быть осторожным при обработке кислотной смеси и распоряжаться образцами должным образом.
Традиционный метод измерения, требующий кислотного гидролизова альгината, описанный выше, показал большой потенциал и использовался многими исследователями в течение нескольких лет. В этой работе мы показываем процедуру традиционного анализа вместе с разработанным ELISA с использованием антиальгинального моноклонального антитела. Эти антитела были разработаны у мышей и могут распознавать альгинат при еще не выявленном эпитопе. Специфика метода ELISA была тщательно протестирована против альгината из P. aeruginosa, а также из морских водорослей. Кроме того, ELISA была сопоставима с ассаем уроновой кислоты в количественной оценке альгината в бактериальных образцах испытания(рисунок 3). Кроме того, он был протестирован на других полисахаридах, что может привести к ложноположительным результатам. Наша работа показала высокую специфичность антитела к альгинату и его способность различать альгинат и другие проверенные полисахариды(рисунок 5А). Протокол ELISA имеет более высокую чувствительность по сравнению с анализом наурической кислоты(Рисунок 5B), так как мы смогли обнаружить следы уровня альгината с помощью ELISA, которые не были обнаружены с помощью анализа уронической кислоты при тестировании образцов коскости пациента (Рисунок 6). Метод ELISA может быть адаптирован для измерения виво альгината из косточки пациентов(рисунок 6). Оба условия роста с использованием uracil добавок, а также недавно разработанные ELISA будет мощным инструментом в лучшем понимании P. aeruginosa патогенеза в CF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор Hongwei D. Yu является главным научным сотрудником и соучредителем Progenesis Technologies, LLC.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) гранты R44GM113545 и P20GM103434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | via Fisher Scientific |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
| Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
| Boric Acid | Research Products International Corp. | 10043-35-3 | |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbazole | Sigma | C-5132 | |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma | C3041 | |
| Centrifuge Tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Culture Test Tubes | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Cuvette Polystyrene (1.5 mL) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
| Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| D-Mannuronic Acid Sodium | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginate | FMC | 2133 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP906-5 | For Molecular Biology |
| Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody | QED Biosciences | N/A | Lot # :15725/15726 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody | Thermo Scientific | 32230 | via Fisher Scientific |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 1310-58-3 | via Fisher Scientific |
| Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Isolation Broth (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
| Round Toothpicks | Diamond | Any brand | |
| Seaweed alginate (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Skim Milk | Difco | 232100 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BioRad | 170-2525 | or preferred vendor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader | Molecular Devices | i3x | or preferred vendor |
| Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A298-212 | Technical Grade |
| Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) | R&D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
References
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
- Hogardt, M., Heesemann, J. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung. International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).
- Evans, T. J. Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis. Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).
- Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection. Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).
- Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).
- Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition. Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).
- Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).
- Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis. Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).
- Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. Alginates: Biology and Applications. Rehm, B. H. A. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Germany. 55-71 (2009).
- Remminghorst, U., Rehm, B. H. Bacterial alginates: from biosynthesis to applications. Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).
- Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).
- Bowness, J. M. Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine. The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).
- Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples. Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).
- Knutson, C. A., Jeanes, A. A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides. Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).
