Summary
Aquí, describimos una condición de crecimiento para cultivar la pequeña variante de colonia de Pseudomonas aeruginosa. También describimos dos métodos separados para la detección y cuantificación del alginato de exopolisacárido producido por P. aeruginosa utilizando un ensayo tradicional de ácido urónico carbazol y un anticuerpo monoclonal específico de alginato (mAb) basado en ELISA.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa,un patógeno bacteriano Gram-negativo oportunista, puede producir en exceso un alginato de exopolisacárido, lo que resulta en un fenotipo único llamado mucoidy. El alginato está relacionado con infecciones pulmonares crónicas que provocan un mal pronóstico en pacientes con fibrosis quística (CF). Comprender las vías que regulan la producción de alginato puede ayudar en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a la formación de alginato. Otro fenotipo relacionado con la enfermedad es la variante de la pequeña colonia (SCV). El SCV se debe al lento crecimiento de bacterias y a menudo se asocia con una mayor resistencia a los antimicrobianos. En este artículo, primero mostramos un método de cultivo de una forma definida genéticamente de P. aeruginosa SCV debido a mutaciones en la biosíntesis de pirimidina. La suplementación de bases nitrogenadas, uracilo o citosina, devuelve el crecimiento normal a estos mutantes, demostrando la presencia de una vía de salvamento que barre las bases libres del medio ambiente. A continuación, analizamos dos métodos para la medición del alginato bacteriano. El primer método se basa en la hidrólisis del polisacárido a su monómero de ácido urónico seguido de derivatización con un reactivo cromogénico, el carbazol, mientras que el segundo método utiliza un ELISA basado en un mAb específico del alginato disponible comercialmente. Ambos métodos requieren una curva estándar para la cuantificación. También demostramos que el método inmunológico es específico para la cuantificación de alginato y puede utilizarse para la medición del alginato en las muestras clínicas.
Introduction
Las infecciones pulmonares crónicas con Pseudomonas aeruginosa son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en pacientes con fibrosis quística (CF). Durante la primera infancia, los pacientes son colonizados por múltiples patógenos bacterianos, incluyendo aislados no mucoides de P. aeruginosa1,2. La aparición de los aislados de la variante de la pequeña colonia (SCV), así como los aislados mucoides, es un marcador para el inicio de infecciones crónicas. Los aislados de SCV son altamente resistentes a los medicamentos3 debido a sus lentas tasas de crecimiento4, lo que los convierte en un grave elemento disuasorio en los regimientos de tratamiento y otras infecciones crónicas5 por P. aeruginosa. 6mostró un vínculo entre el SCV y la mucoimidicia vinculado por la biosíntesis de novo pirimidina. La inanidinación de pirimidina, debido a mutaciones en genes relacionados con la producción de pirimidina, dio lugar a fenotipo SCV en la cepa de referencia no mucoide PAO1 y el derivado mucoide, PAO581 (PAO1mucA25).
A pesar de que la sobreproducción de alginato es un marcador de enfermedad importante para las infecciones pulmonares crónicas en la FQ, no está claro si existe una correlación directa entre la cantidad de alginato y la patología pulmonar, y no está claro si el alginato se puede utilizar como marcador de pronóstico para el tratamiento7. La producción de alginato está regulada principalmente por dos operons, un operon regulador (algUmucABCD)8,9 y el operon biosintético (algD operon)10,11. La producción de alginato está estrechamente regulada por el factor sigma AlgU9,12 (también conocido como AlgT) y la degradación del factor anti-sigma MucA13. La capacidad de monitorear la producción de alginato in situ a partir de las muestras de esputo de los pacientes puede ayudar en el desarrollo de nuevas opciones terapéuticas.
Aquí, describimos una condición de crecimiento que detecta la presencia de SCV causado por mutantes que no pueden sintetizar la pirimidina de novo. La suplementación de uracilo y/o citosina, la base nitrogenada de nucleótido de pirimidina, al medio activa la vía de salvamento, restaurando así el crecimiento normal en mutantes. Este método de crecimiento para estos mutantes específicos del SCV se puede utilizar como método de cribado para identificar mutaciones de pirimidina en muestras de pacientes. Además, discutimos dos métodos para la detección y medición de alginato producido y secretado por P. aeruginosa. El primero es el método tradicional14,15,16 de degradar el polisacárido utilizando una alta concentración de ácido y luego añadir un indicador colorimétrico para cuantificar la concentración en la muestra. El segundo método, desarrollado en nuestro laboratorio, utiliza el Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA) utilizando un anticuerpo monoclonal anti-alginato (mAb) desarrollado por QED Biosciences. El método ELISA demuestra ser más específico y sensible que el ensayo de ácido urónico y permite un uso más seguro debido a la evitación del ácido sulfúrico altamente concentrado. Con la capacidad de la ELISA para ser utilizado directamente en muestras de esputo del paciente para medir el alginato, se puede desarrollar como una herramienta de diagnóstico de monitoreo para seguir la cantidad de alginato presente en los pulmones en diferentes períodos de la infección.
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Protocol
1. Condiciones de crecimiento del SCV y activación fisiológica de la vía de salvamento
- Detección de SCV.
- Las cepas p. aeruginosa PAO1, PAO1pyrD,PAO581 y PAO581en placas de agar de aislamiento Pseudomonas (PIA) precalentadas y crecen a 37oC durante 48 h. En la placa de crecimiento identificar un aislado de colonia única que tiene el fenotipo SCV (tamaño de la colonia de 1 x 3 mm en comparación con el tamaño normal de la colonia de 3 x 5 mm).
- Repita el paso 1.1.1 para obtener un aislado puro del SCV.
NOTA: El crecimiento puede requerir hasta 72 h debido a la lenta tasa de crecimiento de las colonias de SCV.
- Activación fisiológica de la vía de salvamento.
- Usando un bucle de inoculación estéril, escoja la colonia SCV de la placa PIA y la raya en un PIA precalentado complementado con 0,1 mM de uracilo. Cultivar la placa a 37oC durante 24 x 48 h.
NOTA: Todas las placas PIA utilizadas en este protocolo contienen 20 ml/L de glicerol añadido a la mezcla antes del autoclave. Después de la autoclave y después de la temperatura de la mezcla es inferior a 55 oC añadir 11,21 mg/L de uracilo (0,1 mM) al medio líquido antes de verter las placas. Este método ayudaría a identificar mutaciones de pirimidina que causan fenotipo SCV en P. aeruginosa. Si el fenotipo SCV es el resultado de dicha mutación, entonces el crecimiento normal de la colonia y el tamaño (3 x 5 mm) se observarían en las placas PIA suplementadas con uracilo. Si las cepas tenían la capacidad de producir alginato, entonces el fenotipo mucoide también volverá sobre la suplementación de uracilo.
- Usando un bucle de inoculación estéril, escoja la colonia SCV de la placa PIA y la raya en un PIA precalentado complementado con 0,1 mM de uracilo. Cultivar la placa a 37oC durante 24 x 48 h.
2. Ensayo de ácido urónico carbazol
- A partir de un cultivo puro de cepa deseada para ser probado, identificar una sola colonia. Usando un palillo de dientes estéril, escoja la colonia y coloque el palillo de dientes en un tubo de ensayo de cultivo que contenga 5 ml de caldo de aislamiento Pseudomonas (PIB). Crecer en una incubadora de coctelera a 37oC durante 24 h.
NOTA: Las siguientes cepas PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA,PAO581carBy PAO581pyrD se cultivaron en placas PIA o placas PIA complementadas con uracilo de 0,1 mM para cosechar alginato para la medición. - En una placa PIA precalentada añadir 150 l de caldo PIB cultivado (para placas de 15 mm x 100 mm) o 450 l de caldo (para placas de 15 mm x 150 mm). Usando un esparcidor de células estériles, esparza el caldo sobre el plato. Cultivar la placa a 37oC durante 24 h.
NOTA: Aspirar cualquier exceso de líquido, si lo hay, de la placa usando un pipeta inclinando la placa hacia un lado. Las placas PIB y PIA utilizadas en el protocolo contienen 20 ml/L de glicerol para ser utilizados por las células como fuente de carbono para ayudar en la producción de alginato. - Usando un controlador de pipeta y una pipeta estéril de 50 ml, agregue 0.85% NaCl al césped cultivado y recoja la muestra desguazando la placa usando un esparcidor de células. Aspirar la muestra usando un nuevo pipeta de 50 ml en un tubo de recogida de 50 ml. Vortex la muestra en alto para mezclar y colocar las muestras en hielo.
NOTA: El volumen de NaCl añadido 0.85% varía dependiendo del tamaño de la placa. Para placas de 15 mm x 100 mm, utilice 10 x 30 ml y, para placas de 15 mm x 150 mm, utilice 20 x 50 ml. - Mida la densidad óptica a 600 nm (OD600) de las muestras añadiendo 1 ml de la muestra a una cubeta desechable y leyendo el OD utilizando un espectrofotómetro. Repita este paso 2x para obtener un triplicado de lecturas para cada muestra.
- Añadir 3 ml de la solución de ácido sulfúrico/borato en tubos de cultivo y dejar sentarse en el hielo. Añadir 350 l de la muestra recogida lentamente a la mezcla ácida en los tubos de ensayo y vórtice en baja brevemente.
- Prepare el stock de borato añadiendo 10.099 g de hidróxido de potasio (KOH) en polvo a 45 ml de agua. Añadir 24,74 g de ácido bórico (H3BO3) a la mezcla y llevar el volumen a 100 ml.
- Colocar 1 L de botella en un fregadero con hielo y llenar la botella con 500 ml de ácido sulfúrico concentrado. Añadir LENTAMENTE 15 ml del stock de borato preparado. Deje que la botella se enfríe.
- Añadir otros 10 ml de stock de borato para un total de 25 ml. Una vez enfriada la botella, lleve el volumen a 1 L.
ADVERTENCIA: Este método se basa en el uso de ácido sulfúrico altamente concentrado. Se debe utilizar un equipo de protección personal adecuado para garantizar la seguridad y el protocolo de eliminación adecuado de la muestra.
NOTA: Para un control positivo, una concentración conocida ded ácido -manurónico y/o muestras de alginato bacteriano conocidas cosechadas y purificadas a través de cepas productoras de alginato de P. aeruginosa (por ejemplo: PAO581-PAO1mucA25). Para un control negativo utilizar 0.85% NaCl solución y / o PAO1algD (Deleción en el marco del gen algD que hace que las bacterias completamente incapaces de producir alginato). Se pueden hacer varios tubos de cada muestra para aumentar el número de repeticiones técnicas para ayudar en el análisis estadístico. Prepare 3 x 5 tubos de cada muestra.
- Añadir 100 l de carbazol al 0,1% de carbazol en solución de etanol a la mezcla ácido/muestra. Tapar el tubo y el vórtice en un ajuste medio durante 5 s. Colocar en un baño seco a 55oC durante 30 min.
- Después de la incubación, retire los tubos y el vórtice brevemente en alto y deje enfriar durante 5 min.
NOTA: El color a ver sería un tono de púrpura. El color se mantendrá estable para la medición durante 1 x 2 h. - Lea el OD530 de cada tubo añadiendo 1 ml de la mezcla a una cubeta limpia y leyendo la DoDe de las muestras a 530 nm en un espectrofotómetro. Utilice el tubo con 0.85% NaCl como blanco para el espectrofotómetro.
- Preparar una curva estándar midiendo laDoS 530 de las diluciones en serie de las concentraciones conocidas de ácido D-Manurónico (1.024 g/ml, 512 g/ml, 256 g/ml, 128 g/ml, 64 g/ml, 32 g/ml, 16 g/ml y 8 g/ml). Repita 2x. Extraiga una ecuación lineal de estas lecturas.
NOTA: La curva estándar solo debe realizarse una vez. La ecuación lineal extraída de ella se puede utilizar para pruebas posteriores.- Calcular la concentración del alginato en cada muestra utilizando la curva estándar y dividir la concentración de alginato de la ecuación lineal por OD600 para obtener la cantidad total de alginato por OD600.
3. ELISA para la cuantificación de alginatos
- Repita los pasos 2.1 a 2.4 para obtener muestras para la medición del alginato.
NOTA: Las cepas utilizadas fueron PAO1, PAO1algDy PAO1 que llevaban pHERD20T-algU. - Usando una micropipette añadir 50 l de la muestra recogida a una placa de 96 pocillos sin tratar. Añadir 50 l de tampón de recubrimiento (tamtón de carbonato/bicarbonato pH 9.6) a los pozos. Incubar la placa a 37oC durante 2 h.
NOTA: Para un control positivo, se puede utilizar una concentración conocida de ácido D-manurónico y/o una cepa productora de alginato estable conocida (por ejemplo: PAO581-PAO1mucA25). Para un uso de control negativo 0.85% NaCl solución y / o PAO1algD (deleción en el marco del gen algD hace que la bacteria completamente incapaz de producir cualquier alginato). Se pueden hacer varios pozos de cada muestra para aumentar el número de repeticiones técnicas para ayudar en el análisis estadístico. Prepare 3 x 5 pozos de cada muestra. - Usando una botella de chorro, lave los pozos de la placa 2veces con 1x solución salina tampón de fosfato (PBS) con 0.05% Tween 20 (PBS-T) llenando los pozos, y luego escurriéndolos volteando la placa.
- Usando una micropipette añadir 200 l de tampón de bloqueo (10% de leche descremada en PBS-T) a los pozos. Incubar a 4oC durante la noche.
NOTA: Envuelva la placa en película de parafina o envoltorio para ayudar a evitar cualquier evaporación en el refrigerador. - Usando una botella de chorro lavar los pozos de la placa 2x con PBS-T llenando los pozos, y luego escurrirlos volteando la placa.
- Usando una micropipeta añadir 100 s de anticuerpo primario diluido (anticuerpo monoclonal anti-alginato de ratón) a los pozos e incubar a 37 oC durante 1 x 2 h.
NOTA: Se proporcionó anticuerpoprimario primario (anticuerpo monoclonal anti-alginato de ratón) a una concentración de 0,5 g/ml (dilución de 1:2.000 de 1 mg/ml) en solución diluyente de anticuerpos (1% de leche desnatada en 1x PBS). - Usando una botella de chorro lave los pozos de la placa 3 veces con PBS-T llenando los pozos, y luego escurriéndolos volteando la placa.
- Usando una micropipeta añadir 100 s de anticuerpo secundario diluido a los pozos e incubar a 37 oC durante 1 x 2 h.
NOTA: El anticuerpo secundario utilizado fue el anticuerpo poliratón de cabra perforado a una concentración de 0,25 g/ml (dilución de 1:2.000 de 0,5 mg/ml) en la solución diluyente de anticuerpos. - Usando una botella de chorro lave los pozos de la placa 3 veces con PBS-T llenando los pozos, y luego escurriéndolos volteando la placa.
- Con un micropipeta, añadir 100 ml de solución de TMB-ELISA(Tabla de materiales)e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad.
NOTA: El color de una reacción positiva sería un tono de azul. - Con una micropipeta, añadir 100 ml de solución de parada (2 N de ácido sulfúrico).
NOTA: El color cambiará de azul a amarillo cuando se agregue la solución de parada. El color es estable hasta 30 minutos después de detener la reacción. - Usando un lector de placas, lea el OD a 450 nm.
- Producir una curva estándar midiendo la DoC450 de las diluciones en serie de las concentraciones conocidas de ácido D-Manurónico (1.024 g/ml, 512 g/ml, 256 g/ml, 128 g/ml, 64 g/ml, 32 g/ml, 16 g/ml y 8 g/ml). Repita 2x. De estas lecturas extraer una ecuación lineal.
NOTA: La curva estándar solo debe realizarse una vez. La ecuación lineal extraída de ella se puede utilizar para pruebas posteriores.- Calcular la concentración del alginato en cada muestra utilizando la curva estándar y dividir la concentración de alginato de la ecuación lineal por OD600 para obtener la cantidad total de alginato por OD600.
4. Análisis estadístico de la medición del alginato
- En una hoja de software gráfica, establezca una columna con la ecuación lineal derivada de la curva estándar. Establezca los resultados del eje Y como la concentración de alginato y los resultados del eje X como el OD530 para el ensayo de ácido urónico y oD450 para ELISA para obtener las concentraciones de alginato en cada muestra.
- Para normalizar la cantidad de alginato en cada muestra a la cantidad por 5,5 x 108 CFU/ml (1 OD600),divida la concentración de cada muestra obtenida anteriormente por su respectivo valor OD600. Si se midieron varios OD600 para cada muestra, divida por la media de600OD .
- Realizar análisis estadísticos utilizando el software estadístico preferido (por ejemplo, GraphPad Prism 7.02).
- Abra el software. Elija Columna en Nueva tabla y gráfico y elija el conjunto de datos ANOVA unidireccional.
- Asigne un nombre a cada columna con la cepa probada y agregue las concentraciones de alginato debajo.
- Después de introducir todos los datos, haga clic en Analizar en el menú superior. Esto abrirá una ventana de configuración de análisis. Elija los parámetros adecuados para las pruebas e indique si es necesario ejecutar varias comparaciones.
NOTA: Después del análisis, el conjunto de datos contendrá un valor p que ayudaría a determinar la significancia estadística de los datos. Los datos se considerarían estadísticamente significativos si el valor p es menor que el valor establecido (normalmente se establece el valor de valor para p < 0.01). - En la pestaña de gráfico, elija el tipo Degráfico de barras. Esto trazará automáticamente los datos con el título indicado de la hoja de datos de entrada. Indique la significancia estadística de los datos según sea necesario mostrando el símbolo * sobre las líneas conectivas entre las barras de interés.
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Representative Results
La Figura 1 muestra las placas de PAO1 y PAO581 con o sin deleción en el marco en el gen de la pirretrosa (un gen en la vía de biosíntesis de pirimidina) que da como resultado el SCV6. El mutante PAO1 SCV fue restaurado al crecimiento normal en respuesta a la suplementación con uracilo(Figura 1A,B). Además, el mutante PAO581pyrDSCV fue devuelto a la mucoide con el mismo tratamiento de uracilo, porque la cepa madre PAO581 tiene una mutación mucA25 adicional(Figura 1C,D). Los resultados del ensayo de ácido urónico carbazol se muestran en la Figura 26. Los datos representan muestras de PAO581 y PAO581 con mutaciones en genes que regulan la pirimidina de novo biosíntesis cultivada en PIA y PIA complementada con 0,1 mM de uracilo(Figura 2A). Los datos muestran que la presencia de uracilo en los medios de comunicación da como resultado la conversión de la cepa mutante de nuevo a mucoidy (como se ve por el aumento/restauración de la producción de alginato)(Figura 2B). Los resultados del anticuerpo monoclonal anti-alginato basado en ELISA se representan en la Figura 3. Los datos muestran PAO1, PAO1 con una deleción en el marco del gen algD que codifica la enzima biosintética de alginato clave GDP-mannose deshidrogenasa, y PAO1 llevando un plásmido de expresión pHERD20T con el factor sigma algU específico de alginato principal cuando se cultiva en placas PIA con arabinosa para la inducción el promotor pBAD en pHERD20T. Estos datos muestran los niveles no mucoides de alginato medidos para PAO1, y PAO1algD frente a los niveles mucoides de alginato medidos para PAO1+pHERD20T-algU. La Figura 4 compara los dos métodos de mediciones de alginato. Los resultados no fueron estadísticamente significativos en comparación entre sí utilizando un ANOVA bidireccional con p < 0.01. La Figura 5A compara la reactividad cruzada del anti-alginato mAb con otros polisacáridos como amilopectina, amilosa, colágeno y glucógeno. La Figura 5B muestra la comparación en especificidad y sensibilidad del ensayo de ácido urónico carbazol al ELISA basado en anticuerpos monoclonales anti-alginato recientemente desarrollado con el control utilizando el alginato de algas marinas altamente purificado(Tabla de materiales). La Figura 6 muestra pruebas directas de LAISA en muestras de esputo del paciente que fueron positivas para p. aeruginosa mucosa y pacientes que no contenían mucosa P. aeruginosa.
Figura 1: Imágenes representativas de las mutaciones de la biosíntesis de pirimidina de novo que dan como resultado un fenotipo SCV en PAO1 y PAO581. La imagen muestra PAO1(izquierda)yPIRDe PAO1 (derecha) en placas PIA (A) y placas PIA complementadas con uracilo (B) cultivadas a 37 oC durante 48 h. La imagen muestra PAO581(izquierda)y PAO581 opirD (derecha)en placas PIA (C) y placas PIA complementadas con uracil (D) cultivadas a 37 oC para 48 h. Esta cifra ha sido modificada del trabajo realizado por Al Ahmar et al.6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Gráfico representativo del ensayo de ácido urónico carbazol. (A) La imagen de la cepa mucosa P. aeruginosa PAO581(PAO1mucA25) cultivada a 37oC durante 24 h en placas PIA(izquierda)y placas PIA con uracilo(derecha). (B) Producción de alginato para PAO581, PAO581carA, PAO581carBy PAO581pyrD cuando se cultiva en placas PIA con y sin uracilo a 37 oC durante 24 h. El alginato se recogió y midió utilizando el ensayo estándar de carbazol. Los valores mostrados son alginato medio: desviación estándar de las lecturas triplicadas. (**** á p < 0.0001). Esta cifra ha sido modificada del trabajo realizado por Al Ahmar et al.6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Gráfico representativo de ELISA basado en antialginato mAb. La producción de alginato para PAO1, PAO1oalgD y PAO1 que transportaba el vector de expresión pHERD20T-algU cultivado en PIA con 0.1% arabinose a 37oC durante 24 h. El alginato se recogió y midió utilizando el ELISA anti-alginato con el anticuerpo monoclonal anti-alginato de ratón. Los valores mostrados son alginato medio: desviación estándar de las lecturas triplicadas. p < 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Comparación entre los resultados obtenidos del ensayo de ácido urónico y el ELISA a base de mAb anti-alginato. Producción de alginato a partir de cinco cepas patentadas de P. aeruginosa mucosas diferentes cultivadas en placas PIA a 37 oC durante 24 h. El alginato fue recogido y medido por el ensayo de ácido urónico y el ELISA anti-alginato. Los valores mostrados son alginato medio: desviación estándar de las lecturas triplicadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Especificidad y sensibilidad del ELISA a base de anti-alginato mAb en comparación con el ensayo de ácido urónico de carbazol. (A) ELISA se ejecutó con controles de ensayo interno altos (800 g/ml) y bajos (100 g/ml) del alginato de algas. Este alginato también se utilizó como estándar para el ELISA. Otros polisacáridos analizados que pueden reaccionar cruzadamente con anti-alginato mAb fueron amilopectina, amilosa, colágeno y glucógeno (500 g/ml cada uno). (B) El ensayo de ácido urónico de carbazol y ELISA se ejecutaron utilizando el mismo rango de concentraciones estándar con alginato de algas: 50 g/ml, 5 g/ml, 1 g/ml, 0,5 g/ml, 0,1 g/ml y 0,05 g/ml. Los valores mostrados son alginato medio: desviación estándar de las lecturas triplicadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Análisis directo de muestras de pacientes. Anti-alginato ELISA se probó en muestras de esputo de los pacientes sin crecimiento previo en placas. Se utilizaron tres muestras de esputo de CF que tuvieron crecimiento de p. aeruginosa mucosa, así como dos muestras de esputo del paciente que contenían P. aeruginosa no mucosa (Neg 1) o ningún crecimiento de P. aeruginosa (Neg 2). Los valores mostrados son alginato medio: desviación estándar de las lecturas triplicadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Tanto el SCV como el alginato son marcadores importantes de la enfermedad implicados en varias infecciones crónicas. Por lo tanto, la capacidad de aumentar el SCV, así como estudiar la regulación y producción de alginato por P. aeruginosa es parte integral del descubrimiento de nuevos tratamientos para estas enfermedades crónicas.
Las cepas de SCV son notoriamente difíciles de cultivar debido a su tasa de crecimiento lento4 en comparación con otras cepas de P. aeruginosa, lo que ayuda en su resistencia a los antimicrobianos3. Nuestro trabajo identifica una forma específica de P. aeruginosa SCV que son el resultado de mutaciones en la biosíntesis de novo pirimidina. Aquí, discutimos una condición de crecimiento para este tipo de SCV para volver a un fenotipo de crecimiento normal cuando se suministra uracilo nucleósido. Sin embargo, cuando UMP/UTP se agregó al medio, el crecimiento defectuoso no se restauró (datos no mostrados). Los poros responsables de esta selectividad deben ser estudiados más a fondo. La suplementación de los medios de crecimiento con uracilo ayudó a aliviar el estrés inducido por la inanimidina(Figura 1). Del mismo modo, la adición de citosina libre a los medios de comunicación en el mismo método de adición de uracilo, ayudado en el alivio de la inanidina de pirimidina (datos no mostrados). Tanto el uracilo libre como la citosina libre en los medios entran en las células y ayudan a devolver los niveles normales de monofosfato de uridina (UMP) y trifosfato de uridina (UTP)6 en la célula, que es cómo los aislados de SCV volvieron al crecimiento normal.
Existen varios pasos críticos para las mediciones de alginato que podrían ayudar en la reproducibilidad de los resultados. Inicialmente, las muestras, después de ser desechadas de las placas, deben permanecer en hielo para ayudar a bloquear la degradación del alginato en la muestra y dar lugar a concentraciones más bajas medidas. Además, antes de las mediciones de OD600, es importante mezclar a fondo la muestra para obtener una solución homogénea, ya que los grupos se forman en muestras que han estado sentadas durante un tiempo y que podrían interferir con la medición de la DO y, por lo tanto, con los cálculos de concentración final. Cuando se utiliza el método ELISA, es posible que sea necesario diluir muestras de placas de crecimiento, especialmente cuando se utilizan cepas que producen una gran cantidad de alginato, ya que los resultados pueden estar fuera del rango de curva estándar. Cuando se utiliza el ácido urónico, vórtice a fondo los tubos de cultivo después de la adición del carbazol y después de la incubación para asegurar una muestra homogénea. Cuando se trabaja con el ensayo de ácido urónico, es importante tener cuidado al manipular la mezcla de ácido y eliminar las muestras correctamente.
El método tradicional de medición que requiere hidrólisis ácida de alginato descrito anteriormente ha demostrado un gran potencial y ha sido utilizado por muchos investigadores durante varios años. En este trabajo, mostramos el procedimiento para el ensayo tradicional junto con un ELISA desarrollado internamente utilizando un anticuerpo monoclonal anti-alginato. Estos anticuerpos se desarrollaron en ratones y pueden reconocer el alginato en un epítopo aún por identificar. La especificidad del método ELISA se probó a fondo contra el alginato de P. aeruginosa, así como de las algas marinas. Además, el ELISA fue comparable al ensayo de ácido urónico al cuantificar el alginato en muestras bacterianas analizadas(Figura 3). Además, se probó contra otros polisacáridos que podrían resultar en resultados falsos positivos. Nuestro trabajo mostró una alta especificidad del anticuerpo al alginato y su capacidad para distinguir entre alginato y los otros polisacáridos probados(Figura 5A). El protocolo ELISA tiene una mayor sensibilidad en comparación con el ensayo de ácido urónico(Figura 5B)ya que pudimos detectar niveles de trazas de alginato utilizando ELISA que no se detectaron utilizando el ensayo de ácido urónico al analizar muestras de esputo del paciente(Figura 6). El método ELISA se puede adaptar para la medición in vivo del alginato a partir del esputo de los pacientes(Figura 6). Tanto las condiciones de crecimiento utilizando la suplementación de uracilo, así como el recién desarrollado ELISA serían herramientas poderosas para entender mejor la patogénesis de P. aeruginosa en CF.
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Disclosures
El autor Hongwei D. Yu es el Director Científico y Cofundador de Progenesis Technologies, LLC.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) R44GM113545 y P20GM103434.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | via Fisher Scientific |
Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
Boric Acid | Research Products International Corp. | 10043-35-3 | |
Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
Carbazole | Sigma | C-5132 | |
Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma | C3041 | |
Centrifuge Tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
Culture Test Tubes | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
Cuvette Polystyrene (1.5 mL) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
D-Mannuronic Acid Sodium | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
FMC Alginate | FMC | 2133 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP906-5 | For Molecular Biology |
Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody | QED Biosciences | N/A | Lot # :15725/15726 |
Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) | Sigma | P3813 | |
Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody | Thermo Scientific | 32230 | via Fisher Scientific |
Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 1310-58-3 | via Fisher Scientific |
Prism 7 | GraphPad | ||
Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
Pseudomonas Isolation Broth (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
Round Toothpicks | Diamond | Any brand | |
Seaweed alginate (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
Skim Milk | Difco | 232100 | via Fisher Scientific |
SmartSpec Plus Spectrophotometer | BioRad | 170-2525 | or preferred vendor |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader | Molecular Devices | i3x | or preferred vendor |
Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A298-212 | Technical Grade |
Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) | R&D Systems | DY994 | |
Tween 20 | Sigma | P2287 | |
Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
References
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
- Hogardt, M., Heesemann, J. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung. International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).
- Evans, T. J. Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis. Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).
- Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection. Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).
- Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).
- Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition. Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).
- Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).
- Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis. Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).
- Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. Alginates: Biology and Applications. Rehm, B. H. A. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Germany. 55-71 (2009).
- Remminghorst, U., Rehm, B. H. Bacterial alginates: from biosynthesis to applications. Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).
- Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).
- Bowness, J. M. Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine. The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).
- Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples. Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).
- Knutson, C. A., Jeanes, A. A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides. Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).