Summary
该协议提供了详细的实验步骤，以建立从致癌性鼠膀胱癌衍生的膀胱肿瘤器官的三维体外培养。介绍了肿瘤器官的传体内、遗传工程、正交移植等培养方法。
Abstract
长期以来，先进的肿瘤模型的发展一直受到鼓励，因为目前的癌症模型已经显示出一些局限性，如缺乏三维（3D）肿瘤架构和与人类癌症的相关性低。研究人员最近开发出一种3D体外癌症模型，称为肿瘤器官，可以模仿培养皿中原生肿瘤的特征。在这里，详细描述了从致癌物引起的鼠膀性肿瘤中建立膀胱肿瘤器官的实验程序，包括培养、通过和在体外维持产生的3D肿瘤器官。此外，还介绍了利用慢病毒介导转导操作遗传工程中已建立的膀胱肿瘤器官系的方案，包括有效引入肿瘤新遗传元素的优化条件有机物。最后，阐述了膀胱肿瘤器官移植到鼠膀壁的进一步分析程序。本文介绍的方法有助于建立膀胱癌体外模型，以开发更好的治疗方案。
Introduction
膀胱癌是最常见的尿路癌，每年约有165，000名患者死亡。在各类膀胱癌中，肌肉侵入性泌尿癌表现出攻击性表型，其5年生存率低于50%2。侵入性泌尿原肿瘤的新治疗方案在过去几十年里没有扩大1。
癌细胞系已广泛用于药物筛选3。虽然在癌细胞系的众多候选药物中观察到了良好的结果，但在临床试验4中报告的结果不佳。随着对体外二维（2D）培养环境的适应力增强，在细胞系中重述原生肿瘤变得越来越困难。动物癌症模型或患者衍生的肿瘤异种移植可用于解决膀胱癌细胞系中观察到的局限性。然而，动物癌症模型是时间和资源密集型的。因此，改进的疾病模型已经供不应求多年，并开发了一种新颖的模型系统，有机体，以克服现有模型5的缺点。
有机体是一种多细胞三维结构，可以在体外重述其体内器官的生理特性。正常和肿瘤器官可以分别从多能干细胞或成人干细胞和原发性肿瘤细胞中提取，分别为5、6。在过去的几年中，肿瘤器官已经建立从大量的各种肿瘤组织7，包括结肠8，9，膀胱10，胰腺11，12，前列腺13，肝脏14，和乳房15肿瘤组织。这种肿瘤器官模仿其原始肿瘤，在现象和基因上。由于其与体内肿瘤组织的相似性及其众多的实际应用，研究人员在癌症发病机制研究中将其作为新的疾病模型。
这里，从致癌物诱导的鼠入侵泌尿毒症肿瘤16建立肿瘤器官的程序被阐述。N-丁基-N-（4-羟基丁基）亚硝胺（BBN）作为致癌物质，在小鼠17型小鼠中诱导侵入性尿皮癌，而具有小鼠肌肉侵入性膀胱肿瘤病理特征的肿瘤器官16被确定为BBN诱发的鼠膀胱癌16。利用扁豆病毒介导转导的方法，对肿瘤有机体进行基因操作的方法，为研究膀胱癌发展的分子基础开发模型系统进行了说明。此外，还介绍了一种将有机体正射移植到膀胱中的方法，以研究原生膀胱环境在膀胱癌中的作用。
Protocol
所有程序均根据 POSTECH 机构动物护理和使用委员会的准则（IACUC 编号：POSTECH-2019-0055）获得批准和进行。
1. 膀胱肿瘤器官的体外培养
- 建立从鼠膀胱肿瘤的膀胱肿瘤器官 （图 1A).
注：产生BBN诱导小鼠膀胱肿瘤的程序在Shin等人中概述。17.- 在暗瓶中向小鼠提供0.1%含BBN的水，为期6个月。每周2次更换含BBN的水。
注：使用8~10周体重约25克的C57BL/6雄性小鼠。含BBN的水可以在一个笼子里给最多五只老鼠施用。 - 6个月后，使用吸入二氧化碳对小鼠实施安乐死，并分离出整个膀胱肿瘤。将其转移到 90 毫米培养皿中。
- 使用无菌手术剪刀去除非癌性部位和坏死区，用冷1x Dulbeco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）洗涤膀胱肿瘤片段2-3次。收集碎片，并转移到一个新的90毫米培养皿。
- 加入1 mL的Dulbecco的改性最小必需介质（DMEM），10m M 4-（2-羟基乙）-1-烟碱硫酸（HEPES）。
- 使用消毒的剃须刀将肿瘤组织切成尽可能小（0.5–1 mm3）的碎片。
- 加入 9 mL 的 DMEM，带 10 mM HEPES、250 μg/mL 胶原酶 I 型、250 μg/mL 胶原酶 II 型和 250 U/mL 热利辛。在孵化器（37°C，5%CO2）的轨道摇床上孵育切碎的肿瘤组织1.5-2小时，将碎片分离到细胞悬浮液中。将细胞悬浮液转移到50 mL管中。
注：如果从小鼠采集的肿瘤大小大于1cm3，用热化素量的2倍处理或增加孵育时间。 - 在 4°C 下将管在 400 x g下离心 5 分钟，然后吸出上清液。
- 使用5 mL氯化铵-钾（ACK）赖舍缓冲液重新悬浮颗粒，以赖化任何红血球。在室温（RT）下孵育管3~5分钟，直到红血球完全变坏。
注：如果未观察到红血球，则省略莱沙过程。 - 将 20 mL 的 DMEM 添加到管中。在 4°C 下将管在 400 x g下离心 5 分钟，然后吸出上清液。
- 用 1 mL 的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 和 10 μM Y-27632 二盐酸 （Y-27632） 重新悬浮颗粒，将颗粒分离成单个细胞。在 37°C 水浴中孵育管 5 分钟。
注：在显微镜下观察肿瘤，以确认完全分离到单个细胞。如果细胞块仍然存在，进一步移移悬浮液。 - 使用10 mL的DMEM与10%胎儿牛血清（FBS）中和胰蛋白酶。通过新 50 mL 管上的 100 μm 细胞过滤器过滤细胞悬浮液，以清除未消化的碎片。
- 在 4°C 下将管在 400 x g下离心 5 分钟，然后吸出上清液。
- 使用150μL的冷生长因子在24孔板中涂上一口井，减少基底膜基质（材料表），并将24孔板放入孵化器（37°C，5%CO2）30分钟，以凝固基底膜基质。
注：在4°C下解冻并保持基底膜基质，以防止使用前凝固。 - 使用 1 mL DMEM 重新悬浮颗粒，并使用血细胞计对细胞计数。将3⁄4 x 104肿瘤细胞转移到冰上1.5 mL微管中。
- 在 4°C 下将微管在 400 x g下离心 3 分钟，并小心地丢弃上清液。
- 用500μL的预加热有机体介质（表1）和10μM Y-27632重新悬浮细胞，并将其转移到涂层井中。将 24 孔板放入培养箱（37 °C，5% CO2）。
- 额外的膀胱肿瘤细胞可以储存1mL的DMEM，含有10%FBS、1%青霉素/链霉素和10%二甲基亚硫酸盐（DMSO），在1.5 mL冷冻液中。将它们放入冷冻容器中，并将容器转移到 -80°C 冷冻箱中。在冷冻室中储存过夜后，将冷冻液转移到液氮中，以便长期存放。
- 使用500 μL的预加热有机体介质每2天更换一次介质（图1B）。
- 在暗瓶中向小鼠提供0.1%含BBN的水，为期6个月。每周2次更换含BBN的水。
- 亚培养膀胱肿瘤器官。
注：建议膀胱肿瘤器官在直径达到100~150μm时通过。- 在24孔板中加入500μL的胶原酶/消糖，加入肿瘤有机体。上下移液的基底膜基质和介质。在37°C下孵育20分钟，将细胞收获到15 mL管中。
注：在显微镜下检查从地下室膜基质分离的有机物。如果有机物未从基底膜基质分离，则增加孵育时间或移液器更多次。 - 加入5 mL的预预热DMEM，在4°C下以400 x g离心管3分钟，然后吸出上清液。
- 使用 1 mL 预热 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 和 10 μM Y-27632 重新悬浮颗粒。在37°C水浴中孵育5分钟。大力移液细胞上下和中和胰蛋白酶使用5 mL的DMEM与10%FBS。
- 在 4°C 下将管在 400 x g下离心 3 分钟，然后吸出上清液。
- 使用预热的有机物介质的1 mL重新悬浮颗粒，并计算单个肿瘤细胞的数量。
- 重复步骤 1.1.14_1.1.18。
- 在24孔板中加入500μL的胶原酶/消糖，加入肿瘤有机体。上下移液的基底膜基质和介质。在37°C下孵育20分钟，将细胞收获到15 mL管中。
2. 利用伦蒂病毒介导的细胞肿瘤器官的遗传操作（图2A）
- 生产GFP表达的慢病毒颗粒。
- 在第0天，在细胞系培养基中，每10厘米细胞培养板的密度为5~6 x 106细胞的板HEK 293T细胞（即具有10%FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM）。
- 在第1天，制备DNA转染溶液，包括转移含有GFP（8μg）、慢病毒包装质粒（10μgpCMVR 8.74和3μgpMD2.G），以及1 mL的减量血清培养基（材料表）。
- 根据制造商的说明，每1μg总质粒添加3μL转染试剂（材料表），并通过移液轻轻混合。在 RT 孵育 20 分钟，并在 10% FBS 下添加 9 mL 的 DMEM。
- 用HEK 293T细胞在细胞培养板中吸出培养基。小心地将10 mL的DNA转染溶液转移到HEK 293T细胞上，并在37°C的细胞培养箱中孵育。
- 第3天，在荧光显微镜下观察细胞（488nm的激发和512nm的排放），以确定转染效率。在整个细胞群中，几乎90%~100%的细胞应表达GFP。
- 收集上清液（包含病毒），用0.45 μm聚醚素（PES）过滤器过滤上清液。
注：使用低蛋白结合过滤器，如PES过滤器。 - 为了集中病毒，在旋转桶转子（材料表）中，在4°C下在超离心机中，将病毒上清液在98，768 x g处离心2小时，并小心地丢弃上清液。
- 在2.5 mL的冷有机物介质中重新悬浮颗粒。
- 对于长期储存，将250μL的慢病毒介质等分放入低温小瓶中，并使用液氮进行卡冻。将冷冻病毒储存在-80°C冷冻箱中。
- 对膀胱肿瘤器官进行慢病毒介导转导。
- 在第2天，分裂肿瘤器官如上文所述（步骤1.2）12小时之前，慢透病毒介导转导。
- 第3天，在37°C水浴中快速解冻含有病毒的等分（步骤2.1.9），并加入含有10μM Y-27632和8 μg/mL六甲甲酰胺溴化物的250μL有机物介质。
- 用500μL的含病毒介质替换24孔板中的有机体培养基，并在孵化器（37°C，5%CO2）中孵育12-16小时。
- 在第4天，用500μL的新鲜有机物介质更换介质。
注：孵育12~16小时后，应改变培养基，因为含有扁豆病毒和六甲甲酰胺的培养基是细胞毒性的。 - 第6天，在荧光显微镜下转导3天后，监测肿瘤器官的GFP信号（图2B）。
- 第10天，通过并储存器官后7天转导步骤1.2，以保持转基因肿瘤有机体线。
3. 膀胱器官的正交移植（图3A）
- 准备膀胱肿瘤器官进行正交移植。
- 移植前，培养膀胱肿瘤器官5~7天，如上所述（步骤1.2）。
- 在24孔板中加入500μL的胶原酶/消糖，在24孔板中加入肿瘤有机体。上下移液的基底膜基质和介质。在37°C下孵育20分钟，并将细胞收集到15 mL管中。
- 加入5 mL的预预热DMEM，在4°C下以400 x g离心管3分钟，然后吸出上清液。
- 用 1 mL 的 DMEM 重新悬浮颗粒，并将溶液转移到 90 mm 培养皿中。
- 在显微镜下，使用p200微移液器拾取10-100个肿瘤有机体，并将其收集到冰上的微管中。
- 在 4°C 下将管在 400 x g下离心 3 分钟，并小心地丢弃上清液。
- 在冰上保持细胞颗粒，直到小鼠准备好手术。
- 亚粘体膀胱壁移植
注：此过程由 Fu 等人18发布的协议修改。- 在实验前至少1周准备一只8到10周大的雄性裸鼠（CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl），让它适应新的环境。在手术前24小时注射苯丙他素（5毫克/千克）。
- 用肥皂和水清洁台面。在手术前对手术器械进行高压灭菌，并使用无菌器械进行手术。
- 将 29 G 胰岛素注射器、移液器尖端和基底膜基质放在冰上。在麻醉前，先在皮下施用酮洛芬（5毫克/千克）。
- 在感应室中用4%的异常胶麻醉小鼠。一旦达到一般麻醉，将鼠标置于一个苏巴的位置，并通过面罩吸入2%蒸发的异常胶维持麻醉。
注：如果麻醉时间超过30分钟，使用棉签涂抹眼药膏，避免角膜干燥。 - 用无菌纱布涂抹化碘，并用70%乙醇擦拭。每次用新纱布或棉签重复3次。
- 使用一次性无菌手术窗帘覆盖手术场和手术场。
- 使用解剖显微镜放大，用无菌手术剪刀在下中线腹部的皮肤和肌肉壁进行小横向切口（小于 1.5 厘米）。从腹腔暴露膀胱，用盐水浸泡的棉签支撑膀胱。
注：如果膀胱充满尿液，轻轻按膀胱以稍微解压。 - 在含有50%高浓度基底膜基质（材料表）的80μL有机物介质中重新悬浮有机物颗粒（步骤3.1.7）。
- 使用29G胰岛素注射器在解剖显微镜下将有机体悬浮液注射到膀胱圆顶的前部。
- 用抗菌吸收缝合线关闭腹壁的内层，然后用4-0尼龙缝合封闭外层。用波维酮碘和70%乙醇对手术部位进行消毒。
- 让鼠标在红外辐照器下恢复 10-15 分钟。
- 手术后一天，检查小鼠的一般状况和麻醉性渗漏。术后3天每天服用酮洛芬（5毫克/千克），术后10天每天一次治疗苯丙沙星（5毫克/千克）。
- 当切口部位愈合（手术后10-14天）时，切除缝合线。监测小鼠膀胱肿瘤在肿瘤器官注射后2-3周的生长。
- 如果观察到膀胱肿瘤生长，使用吸入二氧化碳对小鼠实施安乐死，并收获整个膀胱肿瘤。使用冷 DPBS 清洗 （图 3B）16.
- 为了分析膀胱肿瘤组织学，使用血氧素和欧辛（H和E）染色染色（图3B）16染色组织石蜡嵌入部分。
Representative Results
小鼠膀胱肿瘤器官体体体培养
从 +1 cm3 BBN 诱导肿瘤分离的肿瘤细胞数量至少是 4 x 105细胞。当细胞最初在基底膜基质中播种时，可以观察到非癌细胞和碎片。碎片通过继续亚文化逐渐被稀释。图 1B显示了不同时间点培养的有机体的图像。如果肿瘤细胞不形成肿瘤有机体，细胞可能在解散步骤中死亡。在这种情况下，需要调整分离程序，包括与酶的孵育时间，以提高细胞的生存能力。
利用慢病毒介导的基因操作表达膀胱肿瘤器官的GFP
膀胱肿瘤器官表现出强烈的GFP信号与成功的慢病毒感染（图2B）。浓缩后，共250μL的含病毒介质足以感染基底膜基质上的3×104个单肿瘤细胞，保持90%~100%的感染效率。GFP信号可在慢病毒转导后3天从膀胱肿瘤器官中检测到。如果荧光信号低，病毒感染的效率可能很低。这可能是由于许多因素，如低病毒性定位，程序需要相应地调整。
膀胱肿瘤器官的正交移植
图3B16给出了从BBN诱导膀胱肿瘤有机体中获得的膀胱肿瘤异体移植物。膀胱肿瘤异体移植在正交移植后3周内收获。利用H、E染色法对移植膀胱肿瘤的组织学进行了分析。肿瘤器官的正交移植可以像膀胱肿瘤一样生长2~3周。
图1：小鼠膀胱肿瘤器官体外培养。（A） 小鼠膀胱肿瘤器官的建立原理图.（B） 不同时间点膀胱肿瘤器官培养的代表性图像.小鼠膀胱肿瘤器官建立和培养超过9天。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：利用慢病毒介导的基因操作，表达膀胱肿瘤器官中的GFP。（A） 膀胱肿瘤器官的慢病毒转染和转导的原理图.（B） 表达GFP的膀胱肿瘤器官的代表性图像。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：膀胱肿瘤器官的正交移植。（A） 膀胱肿瘤器官移植到裸鼠的正交图。（B） 用膀胱肿瘤器官进行正射移植的小鼠的膀胱和H和E染色部分的代表性图像。中间面板中盒装区域的放大视图显示在左侧面板中。刻度条 = 500 μm。这一数字转载于图1_图补编1，Kim等人，根据知识共享归因4.0国际公共许可证（CC BY 4.0;https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）出版。请点击此处查看此图的较大版本。
| 小鼠膀胱肿瘤器官介质 | |
| 高级 DMEM/F-12（基本介质） | 10 mM HEPES （pH 7.4） |
| 10 mM 尼古丁酰胺 | 0.5x 无血清补充剂 |
| 2 mM L-阿兰尼-L-谷氨酰胺二肽 | 1% 青霉素/链霉素 |
| 1 mM N-乙酰-L-半胱氨酸 | 50 纳克/mL 毛质表皮生长因子 |
| 1 μM A 83-01 | |
表1：膀胱肿瘤器官介质的组成。
Discussion
该协议描述了培养和维护来自致癌物诱发的鼠膀性肿瘤的膀胱肿瘤器官的实验程序。
在此协议中，有几个实验步骤，其中的过程可能需要一些故障排除。首先，最初播种的肿瘤细胞数量是一个关键因素，因为培养中的肿瘤细胞数量少（<2 x 104细胞）大多导致细胞死亡，因为肿瘤细胞之间缺乏相互作用。相反，从播种时的细胞过多（>5 x 104细胞）开始会导致过度拥挤的有机物，导致在处理每个有机体生长不良的培养物时遇到困难。强烈建议在开始时建立多个细胞数量不同的板，以优化实验条件。确定正确数量的初始肿瘤细胞对于实现最高的细胞活力和建立成功的膀胱肿瘤器官至关重要。此外，在长期培养超过2周没有通过，大多数肿瘤有机体停止生长，可能是由于在有机体中心营养供应不足和基底膜基质的生长因子耗尽。因此，及时对器官进行亚培养是维持肿瘤器官培养的关键步骤。
其次，高蒂特慢病毒颗粒的产生对肿瘤器官的有效遗传操作至关重要。为了解决病毒定子相关问题，强烈建议每次病毒转导前先确定病毒定子，因为慢病毒结构往往产生效率不同的病毒颗粒。如果肿瘤器官在病毒感染后表现出低的生存能力，则病毒性地子可能过高。强烈建议在这种情况下使用较低数量的病毒。第三，在BBN诱发膀胱肿瘤器官的正交移植中，保持膀胱壁的完整性至关重要。如果注射通过穿透膀胱壁层到达膀胱流明，则应终止和丢弃实验。如果可能的话，建议使用超声波成像系统监测膀胱肿瘤生长。
目前技术的一个限制是这些有机物中缺乏肿瘤微环境或频闪。为了克服这一问题，强烈建议肿瘤器官的正交移植使用体内系统来模拟原生肿瘤微环境。今后，有必要开发由肿瘤器官和肿瘤频闪其他成分组成的3D体外有机体系统。
我们技术的主要意义之一是，在肿瘤器官的正交移植中，只有10个膀胱肿瘤器官能诱导膀胱肿瘤生长。与需要5 x 105+1x 106单膀胱肿瘤细胞的传统肿瘤移植实验相比，我们的方法更加高效和可靠。另一个显著区别是，有机体可以使用各种慢病毒载体进行多种操作，例如含有短发针RNA的慢病毒结构、CRISPR_Cas9系统或感兴趣的基因。这些将是强大的工具，添加到目前的有机体技术。总体而言，这里介绍的实验方法有助于建立体外肿瘤模型，从而增进我们对膀胱癌发病机制的理解，而不是使用二维膀胱癌细胞系。
该方法能够建立从致癌物诱发的鼠膀性肿瘤中提取的膀胱肿瘤有机体。本文描述了以扁豆病毒为中介的实验过程，通过该实验程序，在膀胱肿瘤器官中引入并稳稳地维持着基因修饰。此外，还包括肿瘤器官的正交移植程序。结合目前体内的癌症模型，该技术将成为研究膀胱肿瘤发生分子基础的有用工具。
Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项研究得到了韩国国家研究基金会对K.S的资助：NRF-2017R1A2B4006043、NRF-2017M3C7A1047875、NRF-2017R1A5A1015366、创意经济领先技术发展计划（SF317001A）、POSCO（2018Y060）和BK21 加研究奖学金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm syringe filter (PES membrane) | Millipore | SLHP033RS | |
| 10 cm culture plate | Eppendorf | 0030-702-115 | |
| 90 mm Petri dish | SPL | 10090 | |
| 100 µm cell strainer | Corning | 352360 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 29 G 1/2 insulin syringe | SHINA | B299473538 | |
| 3 mL syringe | Norm-ject | N7.A03 | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| A8301 | Tocris | 2939 | stock concentration: 25 mM |
| Absolute ethanol | Daejung | 4023-2304 | |
| Absorbable suture | Henry Schein | 039010 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo | 12634028 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Thermo | A1049201 | |
| B-27 | Gibco | 17504-044 | stock concentration: 50X |
| BBN(N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine) | Tokyo Chemical Industry | B0938 | |
| Blue nylon 5/0-13mm | AILEE | NB521 | |
| C57BL Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (nude mouse) | Charles River | 194 | |
| Collagenase type I | Thermo | 17100017 | stock concentration: 20 mg/mL |
| Collagenase type II | Thermo | 17100015 | stock concentration: 20 mg/mL |
| Collagenase/dispase | Sigma | 10269638001 | stock concentration: 1 mg/mL |
| Cyrovial | Corning | 430488 | |
| DMEM(Dulbecco's modified minimum essential media) | Gibco | 11965-118 | |
| DMSO(Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D8418 | |
| DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Welgene | LB 001-02 | |
| Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Healthcare | DIN: 02169428 | |
| FBS(Fetal bovine serum) | Millipore | ES009B-KC | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | 100X |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Welgene | BB001-01 | |
| Isoflurane | Hana Pharm Co., Ltd. | ||
| Ketoprofen (Anafen) | Merial | DIN: 02150999 | |
| Matrigel growth factor reduced (GFR) Growth Factor Reduced (GFR) |
Corning | 354230 | use for organoid culture in plate |
| Matrigel high concentration (HC) | Corning | 354248 | use for organoid transplantation |
| 1.5 mL microtube | Axygen | MCT-150-C | |
| LT1 transfection reagent | Mirus Bio | MIR 2300 | |
| murine EGF(epidermal growth factor) | Peprotech | 315-09 | stock concentration: 100 µg/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | stock concentration: 200 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | stock concentration: 1M |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| pCMV.R 8.74 | Addgene | 22036 | Packaging plasmid |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | 100X |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Envelope plasmid |
| Polybrene(hexadim ethrine bromide) | Sigma | H9286 | stock concentration: 2 µg/mL |
| pSiCoR | Addgene | 11579 | Lentiviral plasmid |
| Razor blade | |||
| Saline buffer | JW Pharmaceutical | ||
| SW41Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| Thermolysin, Bacillus thermoproteolyticus | Millipore | 58656-2500KUCN | stock concentration: 250 KU/mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | |
| Ultracentrifugation tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Abmole | M1817 | stock concentration: 10 mM |
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