Summary
Denne protokol indeholder detaljerede eksperimentelle skridt til at etablere en tre-dimensionel in vitro kultur af blæretumor organoider stammer fra kræftfremkaldende-induceret murine blærekræft. Kultur metoder, herunder passaging, genteknologi, og ortotoptransplantation af tumor organoider er beskrevet.
Abstract
Udviklingen af avancerede tumormodeller har længe været opmuntret, fordi de nuværende kræftmodeller har vist begrænsninger såsom mangel på tredimensionel (3D) tumorarkitektur og lav relevans for kræft hos mennesker. Forskere har for nylig udviklet en 3D in vitro kræft model benævnt tumor organoids, der kan efterligne de særlige kendetegn ved en indfødt tumor i en kultur parabol. Her, eksperimentelle procedurer er beskrevet i detaljer for etablering af blæretumor organoider fra en kræftfremkaldende-induceret murine blære tumor, herunder kultur, passage, og vedligeholdelse af den resulterende 3D tumor organoider in vitro. Desuden er protokoller til at manipulere de etablerede blæretumor organoid linjer for genteknologi ved hjælp af lentivirus-medieret transduktion er beskrevet, herunder optimerede betingelser for effektiv indførelse af nye genetiske elementer i tumor organoider. Endelig er proceduren for ortotoptransplantation af blæretumor organoider ind i væggen af murine blæren til yderligere analyse er lagt ud. De metoder, der er beskrevet i denne artikel kan lette etableringen af en in vitro model for blærekræft til udvikling af bedre terapeutiske muligheder.
Introduction
Blærekræft er den mest udbredte urinvejskræft, med ca 165.000 patienter dør årligt1. Blandt de forskellige typer af blærekræft, muskel-invasiv urothelial karcinom udviser en aggressiv fænotype, og dens 5 år overlevelsesrate er lavere end 50%2. Nye terapeutiske muligheder for invasive uroteltumorer er ikke blevet udvidet i løbet af de sidste par årtier1.
Kræft celle linjer har været flittigt brugt til narkotika screening3. Selv om gunstige resultater er blevet observeret i mange lægemiddelkandidater i kræft cellelinjer, dårlige resultater er rapporteret i kliniske forsøg4. Efter øget tilpasning til in vitro to-dimensionelle (2D) kultur miljøer, er det blevet stadig vanskeligere at opsummere indfødte tumorer i cellelinjer. Dyrekræft modeller eller patient-afledt tumor xenografts kan bruges til at løse de begrænsninger, der observeres i blærekræft cellelinjer. Men, animalsk kræft modeller er tid og ressourcekrævende. Derfor har forbedrede sygdomsmodeller været på efterspørgslen i årevis, og der er udviklet et nyt modelsystem, organoider, for at afhjælpe manglerne ved eksisterende modeller5.
En organoid er en multicellulær 3D konstruktion, der kan opsummere in vitro de fysiologiske egenskaber af dens tilsvarende in vivo organ. Normale og tumor organoids kan udledes af enten pluripotente eller voksne stamceller, og primære tumorceller, henholdsvis5,6. I løbet af de sidste mange år, tumor organoids er blevet etableret fra et stort antal forskellige tumorvæv7, herunder kolon8,9, blære10,bugspytkirtel11,12, prostata13, lever14, og bryst15 tumor væv. Sådanne tumor organoider efterligne deres oprindelige tumorer fænotypisk og genetisk. På grund af deres lighed med in vivo tumorvæv og deres mange praktiske anvendelser, forskere har vedtaget dem som nye sygdomsmodeller i studiet af kræft patogenese.
Her er procedurerne for etablering af tumororganoider fra en kræftfremkaldende-induceret murine invasiv urotellial tumor16 lagt ud. N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamin (BBN) anvendes som kræftfremkaldende til at fremkalde invasiv urotelkarcinom i mus17 og tumororganoider, som udviser de patologiske egenskaber ved musemuskel-invasive blæretumorer, er etableret fra BBN-induceret murine blærekræft16. Metoden til genetisk manipulere tumor organoids er illustreret ved hjælp af lentivirus-medieret transduktion til at udvikle en model system til at studere det molekylære grundlag for udviklingen af blærekræft. Desuden er en metode til transplantation organoids ortotopisk i en blære til at undersøge den rolle, som den indfødte blære miljø i blærekræft er beskrevet.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt og gennemført i henhold til retningslinjerne fra Det Institutionelle Dyrepleje- og Brugsudvalg hos POSTECH (IACUC-nummer: POSTECH-2019-0055).
1. In Vitro Kultur af Blære Tumor Organoids
- Etablere blæretumor organoider fra murine blære tumor (Figur 1A).
BEMÆRK: Proceduren for generering af BBN-induceret mus blære tumorer er skitseret i Shin et al.17.- Giv 0,1% BBN-holdige vand i en mørk flaske til mus ad libitum i 6 måneder. Skift BBN-holdigt vand 2x om ugen.
BEMÆRK: Der blev anvendt en C57BL/6-hanmus med en kropsvægt på ca. 25 g ved 8-10 uger. BBN-holdigt vand kan administreres til op til fem mus i et enkelt bur. - Efter 6 måneder, aflive musen ved hjælp af kuldioxid indånding og isolere hele blæren tumor. Overfør den til en 90 mm petriskål.
- Fjern ikke-kræft dele og nekrotiske regioner ved hjælp af sterile kirurgiske saks og vask blæren tumor fragmenter 2-3 gange med kolde 1x Dulbecco's fosfat-buffered saltvand (DPBS). Saml fragmenterne og overføre dem til en ny 90 mm petriskål.
- Der tilsættes 1 ml Dulbeccos modificerede minimumsessentielle medium (DMEM) med 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonsyre (HEPES).
- Hakke tumorvævet i stykker så lille som muligt (0,5-1 mm3)ved hjælp af et steriliseret barberblad.
- Der tilsættes 9 ml DMEM med 10 mM HEPES, 250 μg/ml kollagennase type I, 250 μg/ml kollagentype II og 250 U/ml termolysin. Inkubere det hakkede tumorvæv i 1,5-2 timer på en orbital shaker i en kuvøse (37 °C, 5% CO2)for at adskille fragmenterne i cellesuspensionen. Overfør celleaffjedringen til et 50 ml rør.
BEMÆRK: Hvis størrelsen af tumor høstet fra musen er større end 1 cm3,behandle det med 2x mængden af termosynd eller øge inkubationstiden. - Røret centrifugeres ved 400 x g i 5 min ved 4 °C, og supernatanten aspireres.
- Ophæng pellet ved hjælp af 5 ml ammonium-chlorid-kalium (ACK) lysing buffer til lyse eventuelle røde blodlegemer. Inkuber røret i 3-5 min ved stuetemperatur (RT), indtil den komplette lysis af røde blodlegemer.
BEMÆRK: Hvis de røde blodlegemer ikke observeres, skal du udelade lysingprocessen. - Tilsæt 20 ml DMEM i røret. Røret centrifugeres ved 400 x g i 5 min ved 4 °C, og supernatanten aspireres.
- Resuspenderpellet med 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA og 10 μM Y-27632 dihydrochlorid (Y-27632) for at adskille pellet i enkelte celler. Inkuber røret i 5 min i et vandbad på 37 °C.
BEMÆRK: Overhold tumoren under et mikroskop for at bekræfte fuldstændig dissociation i enkelte celler. Hvis der stadig er stykker af celler, pipette suspensionen yderligere. - Neutralisere trypsin ved hjælp af 10 ml DMEM med 10% føtal kvægserum (FBS). Celleaffjedringen filtreres gennem en 100 μm cellesi på et nyt 50 ml rør for at fjerne det ufordøjede affald.
- Røret centrifugeres ved 400 x g i 5 min ved 4 °C, og supernatanten aspireres.
- Coat en brønd i en 24 brønd plade ved hjælp af 150 μL iskold vækstfaktor reduceret kælder membran matrix (Tabel over materialer)og læg 24 godt plade i en kuvøse (37 °C, 5% CO2)i 30 min at størkne kælderen membran matrix.
BEMÆRK: Tø og vedligehold kældermembranmatrixen ved 4 °C for at forhindre størkning før brug. - Resuspenderpellet ved hjælp af 1 ml DMEM og tælle cellerne ved hjælp af et hæmocytometer. Overfør 3-4 x 104 tumorceller til en 1,5 ml mikrorør på is.
- Mikrorøret centrifugeres ved 400 x g i 3 min ved 4 °C, og supernatanten kasseres forsigtigt.
- Cellerne suspenderes igen med 500 μL forvarmet organoidmedium (tabel 1) og 10 μM Y-27632, og de overføres til den belagte brønd. 24 brøndpladen anbringes i en kuvøse (37 °C, 5% CO2).
- Ekstra blæretumorceller kan fyldes med 1 ml DMEM indeholdende 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin og 10% dimethylsulfoxid (DMSO) i 1,5 ml kryovialer. Anbring dem i en kryolig frysebeholder, og beholderen overføres til en -80 °C-fryser. Efter opbevaring i fryseren natten over, overføre kryovialer i flydende kvælstof til langtidsopbevaring.
- Mediet ændres hver 2. dag med 500 μL forvarmet organoidmedium (figur 1B).
- Giv 0,1% BBN-holdige vand i en mørk flaske til mus ad libitum i 6 måneder. Skift BBN-holdigt vand 2x om ugen.
- Subkultur blære tumor organoider.
BEMÆRK: Passage af blæretumor organoids, når de når 100-150 μm i diameter anbefales.- Tilsæt 500 μL kollagen/dispase til organoid medium i 24 godt plade med tumor organoids. Pipette op og ned i kælderen membran matrix og mediet. Inkuber i 20 min ved 37 °C, og høst cellerne i et 15 ml rør.
BEMÆRK: Undersøg de organoider, der er isoleret fra kældermembranmatrixen under et mikroskop. Hvis organoiderne ikke er løsrevet fra kældermembranen matrix, øge inkubationstiden eller pipette flere gange. - Der tilsættes 5 ml forvarmet DMEM, centrifugeres røret ved 400 x g i 3 min ved 4 °C, og supernatanten aspireres.
- Resuspenderpellet med 1 ml prævarmet 0,25% trypsin-EDTA og 10 μM Y-27632. Inkuber i 5 min i et vandbad på 37 °C. Kraftigt pipette cellerne op og ned og neutralisere trypsin ved hjælp af 5 ml DMEM med 10% FBS.
- Røret centrifugeres ved 400 x g i 3 min ved 4 °C, og supernatanten aspireres.
- Resuspenderpellet ved hjælp af 1 ml af prævarmet organoid medium og tælle antallet af enkelt tumorceller.
- Gentag trin 1.1.14−1.1.18.
- Tilsæt 500 μL kollagen/dispase til organoid medium i 24 godt plade med tumor organoids. Pipette op og ned i kælderen membran matrix og mediet. Inkuber i 20 min ved 37 °C, og høst cellerne i et 15 ml rør.
2. Genetisk manipulation af blæretumor organoider ved hjælp af lentivirus-medieret transduktion (Figur 2A)
- Fremstil gfp-udtrykkende lentivirale partikler.
- På dag 0 plade HEK 293T celler ved en tæthed på 5-6 x 106 celler pr 10 cm celle kultur plade i cellelinje kultur medium (dvs. DMEM med 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin).
- På dag 1 fremstilles DNA-omfektionsopløsningen, herunder overføringsplasmid indeholdende GFP (8 μg), forbrændingsemballageplasmid (10 μg pCMVR 8.74 og 3 μg pMD2.G) og 1 ml reduceret serummedium (Materialetabel).
- Der tilsættes 3 μL transfektionsreagens (materialetabel) pr. 1 μg samlet plasmid i henhold til fabrikantens anvisninger og blandes forsigtigt ved pipettering. Inkubere i 20 min på RT og tilsæt 9 ml DMEM med 10% FBS.
- Aspirer kulturmediet i cellekulturpladen med HEK 293T-celler. Overfør omhyggeligt 10 ml dna-transfektionsopløsning til HEK 293T-cellerne og inkuber esuge i en cellekulturkuvøse ved 37 °C.
- På dag 3 skal cellerne observeres under et fluorescensmikroskop (excitation ved 488 nm og emission ved 512 nm) for at bestemme transfektionseffektiviteten. Næsten 90% -100% af cellerne i hele cellepopulationen bør udtrykke GFP.
- Supernatantet (indeholdende virus) og filtrate supernatantet med et 0,45 μm polyethersulfonfilter (PES).
BEMÆRK: Brug et lavt proteinbindende filter, f.eks. - For at koncentrere virussen centrifugeres virussen supernatant ved 98.768 x g i en ultracentrifuge i 2 timer ved 4 °C i en svingende spandrotor (Materialetabel) og kassér forsigtigt supernatantet.
- Resuspenderpellet i 2,5 ml koldt organoid medium.
- Til langtidsopbevaring, aliquot 250 μL af lentiviral medium i kryogene hætteglas og snap-fryse dem ved hjælp af flydende nitrogen. De frosne virale lagre opbevares i en -80 °C-fryser.
- Udfør lentivirus-medieret transduktion af blæretumor organoids.
- På dag 2, opdele tumor organoids som beskrevet ovenfor (trin 1,2) 12 h før lentivirus-medieret transduktion.
- På dag 3, hurtigt tø en aliquot (trin 2.1.9) indeholdende virus i en 37 °C vandbad og tilsæt 250 μL organoid medium med 10 μM Y-27632 og 8 μg/ml hexadimethrinbromide.
- Udskift organoidmediet i 24 brøndpladen med tumororganoider med 500 μL virusholdigt medium og inkubator i 12-16 timer i en inkubator (37 °C, 5% CO2).
- På dag 4 skal mediet udskiftes med 500 μL frisk organoidmedium.
BEMÆRK: Efter 12-16 timers inkubation skal mediet ændres, fordi mediet indeholdende lentivirus og hexadimethrinbromid er cytotoksisk. - På dag 6 skal GFP-signalet overvåges fra tumororganoiderne 3 dage efter transduktion under et fluorescensmikroskop (figur 2B).
- På dag 10, passage og lager organoiderne 7 dage efter transduktion som beskrevet i trin 1.2, for at opretholde de genetisk modificerede tumor organoid linjer.
3. Ortopisk transplantation af blæreorganoid (figur 3A)
- Forbered blæretumor organoids for ortotoptransplantation.
- Før transplantation, kultur blæren tumor organoids i 5-7 dage, som beskrevet ovenfor (trin 1.2).
- Tilsæt 500 μL kollagen /dispase til organoid medium i en 24 godt plade med tumor organoids. Pipette op og ned i kælderen membran matrix og medium. Inkuber i 20 min ved 37 °C og opsamles cellerne i et 15 ml rør.
- Der tilsættes 5 ml forvarmet DMEM, centrifugeres røret ved 400 x g i 3 min ved 4 °C, og supernatanten aspireres.
- Pelletret med 1 ml DMEM og genindsættes i en 90 mm petriskål.
- Under et mikroskop, afhente 10-100 tumor organoids ved hjælp af en p200 mikropipette og indsamle dem i et mikrorør på is.
- Røret centrifugeres ved 400 x g i 3 min ved 4 °C, og supernatanten kasseres forsigtigt.
- Vedligehold cellepellet på is, indtil musene er klar til operation.
- Submucosal blære væg transplantation
BEMÆRK: Denne procedure ændres fra den protokol , der er offentliggjort af Fu etal. 18.- Forbered en 8 til 10 uger gamle mandlige nøgen mus (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) mindst 1 uge før forsøget for at gøre det muligt at akklimatisere sig til et nyt miljø. Injicer enrofloxacin (5 mg/kg) subkutant 24 timer før operationen.
- Rengør bænkoverfladen med sæbe og vand. Autoklavde de kirurgiske instrumenter forud for den kirurgiske procedure og udføre kirurgi ved hjælp af sterile instrumenter.
- Opbevar 29 G insulinsprøjten, pipettespidserne og kældermembranmatrixen på is. Administrere ketoprofen (5 mg/kg) subkutant før administration af anæstesi.
- Bedøve musen med 4% isofluran i et induktionskammer. Når generel anæstesi opnået, lægge musen i en supine position og opretholde anæstesi ved maske indånding af 2% fordampet isofluran.
BEMÆRK: Hvis bedøvelsestiden er over 30 min. - Påfør povidone-jod med en steril gaze og tør det ned med 70% ethanol. Gentag 3x med en ny gaze eller en vatpind hver gang.
- Dæk anus og det kirurgiske felt ved hjælp af engangstændere, sterile kirurgiske gardiner.
- Ved hjælp af et dissekeret mikroskop til forstørrelse skal du lave et lille tværgående snit (mindre end 1,5 cm) i huden og muskulær væg i den nedre midterdel af maven med steril kirurgisk saks. Udsæt blæren fra bughulen og støtte det med saltvand-gennemblødt vatpinde.
BEMÆRK: Hvis blæren er fuld af urin, skal du forsigtigt trykke blæren for at dekomprimere den en smule. - Kasesuspenderer organoidpellets (trin 3.1.7) i 80 μL organoidmedium, der indeholder 50 % højkoncentrationskældermembranmatrix (Materialetabel).
- Injicer organoidsuspensionen i blærekuplens terioraspekt ved hjælp af 29 G-insulinsprøjten under et dissectingmikroskop.
- Luk det indre lag af bugvæggen med antibakterielabsorberbar sutur og luk derefter det ydre lag med 4-0 nylonsutur. Desinficere operationsstedet med povidon-jod og 70% ethanol.
- Lad musen komme sig under en infrarød irradiator 10-15 min. Monitor musen, indtil den genvinder bevidsthed og motilitet.
- En dag efter operationen, kontrollere den generelle tilstand af musen og anastomotisk lækage. Administrere ketoprofen (5 mg/kg) én gang dagligt i 3 dage efter operativt og behandle enrofloxacin (5 mg/kg) én gang dagligt i 10 dage efter operativt.
- Når snitstedet er helet (10-14 dage efter operationen), skal suturerne fjernes. Overvåg væksten af musen blære tumor i 2-3 uger efter tumor organoid injektion.
- Hvis blæretumor vækst er observeret, aflive musen ved hjælp af kuldioxid indånding, og høste hele blæren tumor. Vask det ved hjælp af kolde DPBS (figur 3B)16.
- For at analysere blæretumorhistologien skal paraffin-indlejret del af vævet plette ved hjælp af hæmatoxylin og eosin (H og E) farvning (figur 3B)16.
Representative Results
In vitro kultur mus blære tumor organoids
Antallet af tumorceller adskilt fra en ~ 1 cm3 BBN-induceret tumor er mindst 4 x 105 celler. Når cellerne i første omgang er seedet i kælderen membran matrix, ikke-kræftceller og snavs kan observeres. Vragdele blev gradvist fortyndet ud ved at fortsætte subkulturen. Figur 1B viser billeder af de dyrkede organoider på forskellige tidspunkter. Hvis tumorcellerne ikke danner tumororganoider, cellerne er potentielt døde under dissociation trin. I et sådant tilfælde skal dissociationsprocedurer, herunder inkubationstid med enzymet, justeres for at øge cellens levedygtighed.
Ekspression af GFP i blæretumor organoids ved hjælp af lentivirus-medieret genetisk manipulation
Blæretumor organoider udstillet stærke GFP signaler med vellykket lentiviral infektion (Figur 2B). Efter koncentration, i alt 250 μL af virus-holdige medier var nok til at inficere 3 x 104 enkelt tumorceller på kælderen membran matrix, opretholde 90% -100% infektion effektivitet. GFP signaler kunne påvises fra blæren tumor organoids 3 dage efter lentiviral transduktion. Hvis lysstofstanden signaler er lave, effektiviteten af virusinfektion er potentielt lav. Dette kan skyldes en lang række faktorer, såsom lav viral titer, og procedurerne skal justeres i overensstemmelse hermed.
Ortotoptransplantation af blæretumor organoids
En blæretumor allograft fremstillet af BBN-induceret blæretumor organoider er præsenteret i figur 3B16. Blæretumor allografts blev høstet 3 uger efter ortotopisk transplantation. Histologien af den transplanterede blæretumor blev analyseret ved hjælp af H og E farvning. Ortotopisk transplantationer af tumor organoids kan vokse som blæretumorer i 2-3 uger.
Figur 1: In vitro kultur mus blære tumor organoids. (A)Skemadiagram for etablering af mus blære tumor organoids. (B) Repræsentative billeder til kulturen i blæretumor organoids på forskellige tidspunkter. Mus blære tumor organoider blev etableret og dyrket over 9 dage. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Ekspression af GFP i blæretumororganoider ved hjælp af lentivirusmedieret genetisk manipulation. (A) Skemadiagram over lentiviral omladning og transduktion af blæretumor organoider. (B) Repræsentative billeder af blæretumor organoids udtrykke GFP. Skalastænger = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Ortotoptransplantation af blæretumororganoider. (A)Skematisk diagram over ortotoptransplantation af blæretumor organoider til en nøgen mus. (B) Repræsentative billeder af blærer og H og E farvede sektioner fra mus ortotopisk transplanteret med blæretumor organoider. Forstørrede visninger af de boksede områder i de midterste paneler vises i venstre paneler. Skalastang = 500 μm. Dette tal er gengivet fra figur 1-Figur Supplement 1, Kim et al.16, offentliggjort under Creative Commons Attribution 4.0 International Public License (CC BY 4.0; https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Mus blære tumor organoids medium | |
| Avanceret DMEM/F-12 (Basismedium) | 10 mM HEPES(pH 7.4) |
| 10 mM Nicotinamid | 0,5 x Serumfrit tillæg |
| 2 mM L-alanyl-L-glutamin dipeptide | 1% Penicillin/Streptomycin |
| 1 mM N-acetyl-L-cystein | 50 ng/mL Murine epidermal vækstfaktor |
| 1 μM A 83-01 | |
Tabel 1: Sammensætning af blæretumor organoid medium.
Discussion
Denne protokol beskriver de eksperimentelle procedurer for kultur og vedligeholde blæretumor organoider stammer fra kræftfremkaldende-induceret murine blære tumorer.
I denne protokol er der flere eksperimentelle trin, hvor procedurerne kan have brug for fejlfinding. For det første er antallet af tumorceller, der oprindeligt er seedet, en kritisk faktor, fordi lavt antal tumorceller i kultur (<2 x 104 celler) for det meste fører til celledød på grund af manglende interaktioner mellem tumorceller. I modsætning hertil, begyndende med alt for mange celler (> 5 x 104 celler) ved såning fører til overfyldte organoider, hvilket resulterer i vanskeligheder ved håndtering af kulturer med dårlig vækst af hver organoid. Det foreslås kraftigt, at der i begyndelsen etableres flere plader med forskellige antal celler for at optimere forsøgsbetingelserne. Identifikation af det rigtige antal indledende tumorceller er afgørende for at opnå den højeste celle levedygtighed og for at etablere en vellykket blæretumor organoider. Også, i langsigtet kultur på over 2 uger uden passaging, de fleste tumor organoider stoppe voksende, potentielt på grund af utilstrækkelig forsyning af næringsstoffer i midten af organoider og udtynding af vækstfaktor i kælderen membran matrix. Derfor, subculturing organoider i tide er et kritisk skridt til at opretholde tumor organoid kultur.
For det andet, produktionen af høj-titer lentivirale partikler er afgørende for en effektiv genetisk manipulation af tumor organoider. At foretage fejlfinding af virustiterrelaterede problemer foreslås det kraftigt, at virustiters bestemmes før viral transduktion hver gang, fordi lentivirale konstruktioner har tendens til at producere virale partikler med varierende effektivitet. Hvis tumor organoider udviser lav levedygtighed efter virusinfektion, er det sandsynligt, at de virale titers er potentielt for høj. Det er stærkt foreslået at bruge lavere mængde virus i dette tilfælde. For det tredje, under ortotoptransplantation af BBN-induceret blæretumor organoider, Det er afgørende at opretholde integriteten af blærevæggen. Hvis injektionen når blærens lumen ved at trænge ind i blærevægslaget, skal forsøget afsluttes og kasseres. Hvis det er muligt, monitorering af blæretumor vækst ved hjælp af en ultralyd imaging system anbefales.
En begrænsning af de nuværende teknikker er fraværet af tumor mikromiljø eller stroma i disse organoids. For at løse dette problem, Det er stærkt foreslået, at ortotoptransplantation af tumor organoider bruge en in vivo system til at efterligne den indfødte tumor mikromiljø. I fremtiden vil det være nødvendigt at udvikle 3D in vitro organoid systemer, der er sammensat af tumor organoids med andre komponenter af tumor stroma.
En af de største konsekvenser af vores teknik er, at, i ortotoptransplantation af tumor organoider, kun 10 blæretumor organoider kan fremkalde tumor vækst i blæren. Sammenlignet med de konventionelle tumortransplantation eksperimenter, der kræver 5 x 105-1 x 106 enkelt blære tumorceller, vores metoder er langt mere effektive og robuste. En anden væsentlig forskel er, at organoider kan manipuleres forskelligt ved hjælp af forskellige lentivirale vektorer, såsom lentivirale konstruktioner, der indeholder korthårede RNA, CRISPR-Cas9-systemet eller gener af interesse. Disse ville være kraftfulde værktøjer til at tilføje til nuværende organoid teknologi. Samlet set kan de eksperimentelle tilgange præsenteres her lette etableringen af in vitro tumor modeller, der kan forbedre vores forståelse af patogenesen af blærekræft i stedet for at bruge 2D blærekræft cellelinjer.
Denne metode var i stand til at etablere blæretumor organoids stammer fra en kræftfremkaldende-induceret murine blære tumor. Artiklen giver en beskrivelse af lentivirus-medieret eksperimentelle procedurer, hvorigennem de genetiske modifikationer er indført og stably vedligeholdes i blæretumor organoider. Desuden er en procedure for ortotoptransplantation af tumororganoider inkluderet. I kombination med nuværende in vivo kræft modeller, denne teknik vil være et nyttigt redskab til at studere det molekylære grundlag af blære tumorigenese.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af tilskud fra National Research Foundation of Korea til K.S: NRF-2017R1A2B4006043, NRF-2017M3C7A1047875, NRF-2017R1A5A1015366, Leading Technology Development Programme for Kreativ økonomi (SF317001A), POSCO (2018Y06) og BK21 Plus Forskningsstipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm syringe filter (PES membrane) | Millipore | SLHP033RS | |
| 10 cm culture plate | Eppendorf | 0030-702-115 | |
| 90 mm Petri dish | SPL | 10090 | |
| 100 µm cell strainer | Corning | 352360 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 29 G 1/2 insulin syringe | SHINA | B299473538 | |
| 3 mL syringe | Norm-ject | N7.A03 | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| A8301 | Tocris | 2939 | stock concentration: 25 mM |
| Absolute ethanol | Daejung | 4023-2304 | |
| Absorbable suture | Henry Schein | 039010 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo | 12634028 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Thermo | A1049201 | |
| B-27 | Gibco | 17504-044 | stock concentration: 50X |
| BBN(N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine) | Tokyo Chemical Industry | B0938 | |
| Blue nylon 5/0-13mm | AILEE | NB521 | |
| C57BL Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (nude mouse) | Charles River | 194 | |
| Collagenase type I | Thermo | 17100017 | stock concentration: 20 mg/mL |
| Collagenase type II | Thermo | 17100015 | stock concentration: 20 mg/mL |
| Collagenase/dispase | Sigma | 10269638001 | stock concentration: 1 mg/mL |
| Cyrovial | Corning | 430488 | |
| DMEM(Dulbecco's modified minimum essential media) | Gibco | 11965-118 | |
| DMSO(Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D8418 | |
| DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Welgene | LB 001-02 | |
| Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Healthcare | DIN: 02169428 | |
| FBS(Fetal bovine serum) | Millipore | ES009B-KC | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | 100X |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Welgene | BB001-01 | |
| Isoflurane | Hana Pharm Co., Ltd. | ||
| Ketoprofen (Anafen) | Merial | DIN: 02150999 | |
| Matrigel growth factor reduced (GFR) Growth Factor Reduced (GFR) |
Corning | 354230 | use for organoid culture in plate |
| Matrigel high concentration (HC) | Corning | 354248 | use for organoid transplantation |
| 1.5 mL microtube | Axygen | MCT-150-C | |
| LT1 transfection reagent | Mirus Bio | MIR 2300 | |
| murine EGF(epidermal growth factor) | Peprotech | 315-09 | stock concentration: 100 µg/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | stock concentration: 200 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | stock concentration: 1M |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| pCMV.R 8.74 | Addgene | 22036 | Packaging plasmid |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | 100X |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Envelope plasmid |
| Polybrene(hexadim ethrine bromide) | Sigma | H9286 | stock concentration: 2 µg/mL |
| pSiCoR | Addgene | 11579 | Lentiviral plasmid |
| Razor blade | |||
| Saline buffer | JW Pharmaceutical | ||
| SW41Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| Thermolysin, Bacillus thermoproteolyticus | Millipore | 58656-2500KUCN | stock concentration: 250 KU/mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | |
| Ultracentrifugation tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Abmole | M1817 | stock concentration: 10 mM |
References
- Sanli, O., et al. Bladder cancer. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17022 (2017).
- Stenzl, A., et al. Treatment of muscle-invasive and metastatic bladder cancer: update of the EAU guidelines. European Urology. 59 (6), 1009-1018 (2011).
- Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603 (2012).
- Caponigro, G., Sellers, W. R. Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 179 (2011).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407 (2018).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246 (2016).
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-517 (2018).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364 (2015).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer–derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424 (2017).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Kim, S., et al. Epigenetic regulation of mammalian Hedgehog signaling to the stroma determines the molecular subtype of bladder cancer. eLife. 8, 43024 (2019).
- Shin, K., et al. Cellular origin of bladder neoplasia and tissue dynamics of its progression to invasive carcinoma. Nature Cell Biology. 16 (5), 469 (2014).
- Fu, C. L., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse bladder wall injection. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (53), e2523 (2011).
