Summary
פרוטוקול זה מספק צעדים ניסיוני מפורט כדי ליצור תלת מימדי תרבות מבחנה של אורגנואידים גידול שלפוחית השתן נגזר מסרטן שלפוחית השתן מורטין ממורדית. שיטות תרבות כולל פאסאייג ', הנדסה גנטית, והשתלת אורתוטופית של אורגנואידים הגידול מתוארים.
Abstract
הפיתוח של מודלים סרטניים מתקדם כבר מאוד מעודד כי המודלים הנוכחיים של הסרטן הראו מגבלות כגון חוסר מימדי (3D) הגידול בארכיטקטורה ורלוונטיות נמוכה לסרטן האנושי. חוקרים פיתחו לאחרונה 3D במודל סרטן מבחנה המכונה אורגנואידים גידול שיכולים לחקות את המאפיינים של גידול יליד בצלחת תרבות. כאן, הליכים ניסיוניים מתוארים בפירוט עבור הקמתה של אורגנואידים גידול שלפוחית השתן מן סרטן שלפוחית מסרטנים המושרה מורטין, כולל תרבות, מעבר, ותחזוקה של אורגנואידים גידול תלת-ממד כתוצאה מבחנה. בנוסף, פרוטוקולים לתמרן את קווי הגידול שלפוחית השתן הוקמה שורות עבור הנדסה גנטית באמצעות התמרה וירוס-מתווך מתוארים, כולל תנאים ממוטבים עבור הקדמה יעילה של אלמנטים גנטיים חדשים לגידול אורגנואידים. בסופו של דבר, ההליך השתלת אורתוטופית של אורגנואידים גידול שלפוחית השתן לתוך הקיר של שלפוחית השתן murine לניתוח נוסף הוא הניח. השיטות המתוארות במאמר זה יכולות להקל על הקמת מודל מתורבת לסרטן שלפוחית השתן לפיתוח אפשרויות טיפוליות טובות יותר.
Introduction
סרטן שלפוחית השתן היא הנפוצה ביותר סרטן בדרכי העיכול, עם כ 165,000 חולים מתים מדי שנה1. בין הסוגים השונים של סרטן שלפוחית השתן, שרירים פולשנית קרצינומה של אורוטאליאל מוצגים פנוטיפ אגרסיבי, ושיעור ההישרדות שלה 5 שנים הוא נמוך יותר 50%2. הרומן אפשרויות טיפוליות גידולים אורוטאליאל פולשנית לא הורחבה בעשורים האחרונים1.
תאי תאים סרטניים שימשו באופן נרחב עבור סינון סמים3. למרות תוצאות חיוביות נצפו במועמדים סמים רבים בקווי הסרטן, התוצאות העניות מדווחות בניסויים קליניים4. בעקבות הסתגלות מוגברת לסביבה תרבותית דו מימדית (2D) התרבות, זה הפך להיות קשה יותר ויותר כדי ללכוד גידולים מקומיים בקווי התאים. סרטן בעלי חיים מודלים או המטופל נגזר xenografts תלי הגידול ניתן להשתמש כדי לטפל במגבלות שנצפו בתאי שלפוחית השתן סרטן. עם זאת, מודלים של סרטן בעלי חיים הם זמן ומשאבים אינטנסיביים. לכן, מודלים מחלות משופרות כבר על פי דרישה במשך שנים ומערכת מודל הרומן, אורגנואידים, פותחה כדי להתגבר על החסרונות של דגמים קיימים5.
אורגנואיד הוא בניית מדור תלת-ממד שיכול ללכוד את מבנה הגוף הפיזי של המאפיינים הפיזיולוגיים של המקבילה שלה בעוגב vivo. אורגנואידים נורמלי והגידול יכול לנבוע או בתאי גזע בוגרים או מבוגרים, ותאים סרטניים ראשוניים, בהתאמה5,6. בשנים האחרונות, אורגנואידים הגידול הוקמו ממספר גדול של רקמות גידול מגוונות7, כולל המעי הגס8,9, שלפוחית השתן10, לבלב11,12, ערמונית13, כבד14, השד15 רקמות הגידול. אורגנואידים גידולים כאלה לחקות המקורי שלהם פנפנואידים וגנטית. בשל הדמיון שלהם ברקמות הגידול vivo ויישומים מעשיים רבים שלהם, החוקרים אימצו אותם כמו מודלים המחלה הרומן בחקר הפתוגנזה סרטן.
כאן, ההליכים להקמת אורגנואידים סרטניים מתוך גידול מסרטנים פולשני מוראליל16 הניח החוצה. N-בוטיל-N-(4-הידרוקסיבוטיל) ניטרוסאמין (BBN) משמש כחומר מסרטן כדי לגרום לקרצינומה של אורוטאליאל פולשנית בעכברים17 ואת אורגנואידים הגידול, אשר מוצג את המאפיינים הפתולוגיים של שריר העכבר-פולשני גידולים שלפוחית השתן, הם הוקמהמסרטןשלפוחית השתן השיטה כדי לטפל גנטית באורגנואידים הגידול מומחש באמצעות התמרה וירוס בתיווך כדי לפתח מערכת מודל לחקר הבסיס המולקולרי של התפתחות סרטן שלפוחית השתן. בנוסף, שיטה להשתילת אורגנואידים לתוך שלפוחית השתן כדי לחקור את התפקיד של סביבת שלפוחית השתן יליד סרטן שלפוחית השתן מתוארת.
Protocol
כל ההליכים אושרו ונערכו תחת ההנחיות של טיפול בעלי חיים מוסדיים ולהשתמש בוועדה POSTECH (מספר IACUC: POSTECH-2019-0055).
1. תרבות מבחנה של אורגנואידים גידול שלפוחית השתן
- להקים אורגנואידים גידול שלפוחית השתן מן הגידול בשלפוחית השתן murine (איור 1קצת).
הערה: ההליך ליצירת BBN המושרה גידולים בשלפוחית העכבר מתואר ב שין et al.17.- לספק 0.1% BBN המכילים מים בבקבוק כהה כדי להעביר את מודעת העכבר למשך 6 חודשים. לשנות את BBN המכיל מים 2x בשבוע.
הערה: עכבר זכר C57BL/6 עם משקל הגוף של כ 25 גרם ב 8 – 10 שבועות של גיל שימש. ניתן לערוך מים המכילים את BBN עד חמישה עכברים בכלוב אחד. - לאחר 6 חודשים, המתת החסד העכבר באמצעות שאיפת פחמן דו חמצני לבודד את גידול שלפוחית השתן כולה. . להעביר אותו לצלחת פטרי 90 מ"מ
- הסרת חלקים שאינם סרטניים ואזורי נמק באמצעות מספריים כירורגי סטרילי ולשטוף את שברי הגידול שלפוחית השתן 2 – 3 פעמים עם תמיסת מלח באגירה ושות של מלוחים 1x הקרה (DPBS). אספו את השברים והעבירו אותם לצלחת פטרי חדשה 90 מ"מ.
- להוסיף 1 מ ל של מדיום מינימום שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10 מ"מ 4-(2-הידרוקסיל) -1-piperazinefonic חומצה (HEPES).
- האוהב את רקמת הגידול לחתיכות קטנות ככל האפשר (0.5 – 1 מ"מ3) באמצעות להב תער מעוקר.
- הוסף 9 מ ל של Dמאמ עם 10 מ"מ HEPES, 250 μg/mL קולגן סוג אני, 250 μg/mL קולגן סוג II, ו 250 U/mL thermolysin. דגירה רקמות הגידול טחון עבור 1.5 – 2 h על שייקר מסלולית באינקובטור (37 ° צ', 5% CO2) כדי לנתק את השברים לתוך ההשעיה התא. להעביר את ההשעיה התא לתוך צינור 50 mL.
הערה: אם גודל הגידול שנקטפו מן העכבר הוא גדול מ 1 ס מ3, לטפל בו עם 2x את כמות thermolysin או להגדיל את זמן הדגירה. - צנטריפוגה את הצינור ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ומכה את סופרנטאנט.
- השהה מחדש את הגלולה באמצעות 5 מ ל של אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) לישיר מאגר לlysing כל כדוריות הדם האדומות. מודיית את השפופרת עבור 3 – 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עד הפירוק המלא של כדוריות הדם האדומות.
הערה: אם תאי הדם האדומים אינם מצופים, השמט את תהליך lysing. - הוסף 20 מ ל של DMEM לתוך השפופרת. צנטריפוגה את הצינור ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ומכה את סופרנטאנט.
- להשעות מחדש את הגלולה עם 1 מ ל של 0.25% טריפסין-EDTA ו 10 μM Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון (Y-27632) לנתק את הגלולה לתוך תאים בודדים. מודקון את הצינור עבור 5 דקות באמבט מים 37 ° c.
הערה: שימו לב לגידול שמתחת למיקרוסקופ כדי לאשר את הדיסוציאציה המוחלטת לתאים בודדים. אם גושי תאים ממשיכים, ההשעיה נוספת. - נטרל טריפסין באמצעות 10 מ ל של DMEM זיכרון עם 10% סרום העובר (FBS). לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 100 יקרומטר על שפופרת חדש 50 mL כדי להסיר את הפסולת מתעכל.
- צנטריפוגה את הצינור ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ומכה את סופרנטאנט.
- מעיל טוב בצלחת 24 הבאר באמצעות 150 μL של מקדם גידול קרח קר מופחתת מטריקס קרום המרתף (הטבלה של חומרים) ומניחים את הצלחת 24 טוב באינקובטור (37 ° צ', 5% CO2) עבור 30 דקות כדי לגבש את מטריצת קרום המרתף.
הערה: הפשרת ושמירה על מטריצת הממברנה בקומת המרתף ב-4 ° צ' כדי למנוע העצמה לפני השימוש. - השהה מחדש את הגלולה באמצעות 1 mL של DMEM ולספור את התאים באמצעות הומוציטוטומטר. העברה 3 – 4 x 104 תאים סרטניים לתוך מיקרוtube 1.5 mL על הקרח.
- צנטריפוגה את המיקרוצינורית ב 400 x g עבור 3 דקות ב 4 ° c ובזהירות למחוק את supernatant.
- להשעות מחדש את התאים עם 500 μL של בינונית מראש אורגנואיד (טבלה 1) ו 10 Μm Y-27632 ולהעביר אותם לבאר מצופה. מניחים את הצלחת 24 הבאר באינקובטור (37 ° c, 5% CO2).
- תאים סרטניים נוסף שלפוחית השתן יכול להיות מצויד עם 1 מ ל של DMEM המכיל 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, ו 10% diמתיל סולפוקסיד (DMSO) ב 1.5 mL קריובקבוקונים. והעבירו את המיכל למקפיא. של 80 ° c לאחר האחסון במקפיא לילה, להעביר את הקריובקבוקונים לתוך חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
- שנה את המדיום כל 2 ימים באמצעות 500 μL של מדיום טרום-שחומם (איור 1B).
- לספק 0.1% BBN המכילים מים בבקבוק כהה כדי להעביר את מודעת העכבר למשך 6 חודשים. לשנות את BBN המכיל מים 2x בשבוע.
- . גידול בשלפוחית השתן של תת-תרבות
הערה: מעבר של גידול שלפוחית השתן אורגנואידים כאשר הם מגיעים 100 – 150 יקרומטר בקוטר מומלץ.- הוסף 500 μL של הקוליואז/dispcase למדיום אורגאיד בצלחת 24 הטוב עם אורגנואידים הגידול. , פיפטה למעלה ולמטה. מטריצת הקרום והמדיום מודקון למשך 20 דקות ב 37 ° c ו למסוק את התאים לתוך שפופרת 15 מ ל.
הערה: בדוק את האורגנואידים מבודדים מתוך מטריצת קרום המרתף תחת מיקרוסקופ. אם האורגנואידים אינם מנותקים מתוך מטריצת קרום המרתף, הגדילו את זמן הדגירה או הפיפטה יותר פעמים. - הוסף 5 מ ל של מחמם לקדם, צנטריפוגה את הצינור ב 400 x g עבור 3 דקות ב 4 ° c, ו לבשל את supernatant.
- להשעות מחדש את הגלולה באמצעות 1 מ ל של prewarmed 0.25% טריפסין-EDTA ו 10 μM Y-27632. מודטה עבור 5 דקות באמבט מים 37 ° c. צינורות במרץ התאים למעלה ולמטה ולנטרל את טריפסין באמצעות 5 מ ל של DMEM זיכרון עם 10% FBS.
- צנטריפוגה את הצינור ב 400 x g עבור 3 דקות ב 4 ° c ומכה את סופרנטאנט.
- השהה מחדש את הגלולה באמצעות 1 מ ל של בינונית מראש אורגנואיד ולספור את מספר התאים הסרטניים בודד.
- חזור על שלבים 1.1.14-1.1.18.
- הוסף 500 μL של הקוליואז/dispcase למדיום אורגאיד בצלחת 24 הטוב עם אורגנואידים הגידול. , פיפטה למעלה ולמטה. מטריצת הקרום והמדיום מודקון למשך 20 דקות ב 37 ° c ו למסוק את התאים לתוך שפופרת 15 מ ל.
2. מניפולציה גנטית של הגידול שלפוחית השתן אורגנואידים באמצעות וירוס-התמרה בתיווך (איור 2א)
- מייצרים את החלקיקים. האנטי-ויראליות של הביטוי
- ביום 0, צלחת HEK 293T תאים בצפיפות של 5 – 6 x 106 תאים לכל 10 ס מ התרבות התא לוחית התרבות קו התא בינונית (כלומר, DMEM זיכרון עם 10% fbs ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין).
- ביום 1, להכין את הפתרון מעבר DNA כולל העברת הפלסטיק המכיל GFP (8 μg), האריזה ויראלי פלמיד (10 μg של pCMVR 8.74 ו-3 μg של pMD2. G), ו 1 mL של סרום מופחת בינונית (לוח חומרים).
- הוסף 3 μL של העברה מגיב (טבלת חומרים) עבור 1 μg של הפלסטיות הכולל על פי הוראות היצרן ולערבב בעדינות על ידי ליטוף. מודטה עבור 20 דקות ב RT ולהוסיף 9 מ ל של dmem זיכרון עם 10% FBS.
- מנושף את מדיום התרבות בצלחת תרבות התא עם התאים HEK 293T. בזהירות להעביר 10 מ ל של הפתרון העברת ה-DNA על התאים HEK 293T ו-דגירה בחממה תרבות התא ב 37 ° c.
- ביום 3, להתבונן בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית (עירור על 488 ננומטר ופליטה ב 512 ננומטר) כדי לקבוע את היעילות הטרנסאפילנטית. כמעט 90%-100% של התאים באוכלוסייה התא כולו צריך לבטא GFP.
- לאסוף את supernatant (המכיל את הווירוס) ו פילטרט את supernatant עם 0.45 יקרומטר polyethersulfone (PES) מסנן.
הערה: השתמש במסנן של איגוד חלבונים נמוך, כגון מסנן PES. - כדי לרכז את הווירוס, צנטריפוגה את הווירוס supernatant ב 98,768 x g ב ultracentrifuge עבור 2 h ב 4 ° c ב רוטור דלי מנופף (טבלה של חומרים) ובזהירות להיפטר supernatant.
- השהה מחדש את הגלולה ב-2.5 מ ל של בינונית-אורגאידית קרה.
- לאחסון לטווח ארוך, סדרת מחלקים 250 μl של בינוני ויראלי לתוך מבחנות קריוגניים ולהצמיד-להקפיא אותם באמצעות חנקן נוזלי. לאחסן את המניות ויראלי קפוא במקפיא-80 ° c.
- לבצע את התמרה-בתיווך של הסרטן שלפוחית השתן אורגנואידים.
- ביום 2, לפצל את אורגנואידים הגידול כפי שמתואר לעיל (שלב 1.2) 12 h לפני התמרה בתיווך-וירוס.
- ביום 3, במהירות להפשיר סדרת מחלקים (שלב 2.1.9) המכיל וירוס באמבט מים 37 ° c ולהוסיף 250 μl של בינוני אורגנואיד עם 10 μm Y-27632 ו-8 μg/mL הקסאדין ברומיד.
- להחליף את המדיום אורגאיד ב 24 צלחת עם האורגנואידים הגידול על ידי 500 μL של וירוס המכיל בינונית ו-דגירה עבור 12-16 h בחממה (37 ° c, 5% CO2).
- ביום 4, לשנות את המדיום עם 500 μL של מדיום אורגנואיד טרי.
הערה: לאחר 12 – 16 מתוך הדגירה, יש לשנות את המדיום, כי המדיום המכיל את הנגיף וההקאדימורין ברומיד הוא ציטוטוקזה. - ביום 6, לעקוב אחר האות GFP מאורגנואידים הגידול 3 ימים לאחר התמרה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית (איור 2B).
- ביום 10, מעבר ומניות האורגנואידים 7 ימים לאחר התמרה כמתואר בשלב 1.2, כדי לשמור על שינוי גנטי שונה הגידול הקווים.
3. השתלת אורתוטופית של שלפוחית השתן אורגאיד (איור 3א)
- להכין את הגידול שלפוחית השתן אורגנואידים להשתלה אורתוגרפית.
- לפני ההשתלה, תרבות הגידול שלפוחית השתן אורגנואידים עבור 5 – 7 ימים, כפי שמתואר לעיל (שלב 1.2).
- הוסף 500 μL של הקוליואז/dispcase למדיום אורגאיד בצלחת 24 היטב עם אורגנואידים הגידול. , פיפטה למעלה ולמטה. מטריצת קרום המרתף והמדיום דגירה של 20 דקות ב 37 ° צ' ולאסוף את התאים לתוך שפופרת 15 מ ל.
- הוסף 5 מ ל של מחמם לקדם, צנטריפוגה את הצינור ב 400 x g עבור 3 דקות ב 4 ° c, ו לבשל את supernatant.
- השהה מחדש את הגלולה עם 1 מ ל של DMEM ולהעביר את הפתרון לתוך צלחת פטרי 90 מ"מ.
- תחת מיקרוסקופ, להרים את 10-100 אורגנואידים הגידול באמצעות מיקרופיפטה p200 ולאסוף אותם לתוך מיקרוצינורית על הקרח.
- צנטריפוגה את הצינור ב 400 x g עבור 3 דקות ב 4 ° c ובזהירות לבטל את supernatant.
- לשמור על הגלולה תא על הקרח עד העכברים מוכנים לניתוח.
- שלפוחית השתן submucosal השתלת קיר
הערה: הליך זה משתנה מהפרוטוקול שפורסם על ידי פו et al18.- הכינו מגבר בן 8 עד 10 שבועות בעירום גברי (CAnN. Cg-Foxn1nu/Crl) לפחות שבוע לפני הניסוי כדי לאפשר לו לבצע האקלים בסביבה חדשה. הכנס enrofloxacin (5 מ"ג/ק"ג) תת-עורי 24 שעות לפני הניתוח.
- נקו את משטח הספסל באמצעות סבון ומים. אוטוקלב כלים כירורגיים לפני הליך כירורגי ולבצע ניתוח באמצעות כלי סטרילי.
- שמור על 29 מזרק אינסולין, פיפטה, ומטריצת קרום המרתף על הקרח. ניהול ketoprofen (5 מ"ג/ק"ג) תת-עורי לפני הניהול של הרדמה.
- . שיהיה בחדר האינדוקציה לאחר הרדמה כללית השיגה, להניח את העכבר במצב פרקדן ולשמור על הרדמה על ידי שאיפת מסכה של 2% מתאדה isofלאנה.
הערה: אם זמן ההרדמה הוא מעל 30 דקות, להחיל משחה העין על שתי העיניים באמצעות ספוגית כותנה כדי למנוע ייבוש הקרנית. - החל povidone-יוד עם גזה סטרילית ולנגב אותו עם 70% אתנול. חזור על 3x עם גזה חדש או לנקות כותנה בכל פעם.
- כסו את פי הטבעת ואת השדה כירורגי באמצעות וילונות חד פעמיות, סטרילי.
- באמצעות מיקרוסקופ מבתר להגדלה, לעשות חתך רוחבי קטן (קטן יותר מ 1.5 ס מ) בעור וקיר שרירי הבטן התחתונה באמצע הדרך עם מספריים כירורגי סטרילי. לחשוף את שלפוחית השתן מחלל הבטן ולתמוך בו עם מטליות כותנה ספוג מלוחים.
הערה: אם שלפוחית השתן מלאה בשתן, לחץ בעדינות על שלפוחית השתן כדי לשחרר אותו מעט. - השהה מחדש את כדורי ה-אורגנואיד (שלב 3.1.7) ב-80 μL של מדיום אורגנואיד המכיל 50% מטריצת ממברנה בעלת ריכוז גבוה (טבלת חומרים).
- הכנס את ההשעיה הארגונית לתוך ההיבט הקדמי של כיפת שלפוחית השתן באמצעות 29 G מזרק אינסולין תחת מיקרוסקופ מבתר.
- סגור את השכבה הפנימית של קיר הבטן עם תפר אנטיבקטריאלי הנספג ולאחר מכן לסגור את השכבה החיצונית עם 4-0 ניילון תפר. לחטא את האתר כירורגי עם povidone-יוד ו 70% אתנול.
- אפשר לעכבר להתאושש תחת הסקה אינפרא אדום 10 – 15 דקות. נטר את העכבר עד שהוא חוזר להכרה ולתנועתיות.
- יום אחד לאחר הניתוח, לבדוק את המצב הכללי של העכבר ואת הדליפה anastomotic. ניהול ketoprofen (5 מ"ג/ק"ג) פעם ביום עבור 3 ימים לאחר הניתוח ולטפל enrofloxacin (5 מ"ג/ק"ג) פעם ביום עבור 10 ימים לאחר הניתוח.
- כאשר החתך האתר נרפא (10-14 ימים לאחר הניתוח), להסיר את התפרים. ניטור התפתחותם של גידול שלפוחית השתן של העכבר עבור 2 – 3 שבועות לאחר הזרקה אורגאיד הגידול.
- אם גידול שלפוחית השתן הוא נצפתה, המתת חסד העכבר באמצעות שאיפת פחמן דו חמצני, והקציר של גידול שלפוחית השתן כולה. שטוף אותו באמצעות דPBS קר (איור 3ב)16.
- כדי לנתח את הגידול שלפוחית השתן היסטולוגיה, כתם את הקטע פרפין-מוטבע של הרקמה באמצעות המטאוקסילין ו אאוזין (H ו-E) צביעת (איור 3ב)16.
Representative Results
בתרבות חוץ גופית של הסרטן שלפוחית השתן הגידול אורגנואידים
מספר תאי הגידול המונתק מ-~ 1 ס מ3 גידול bbn המושרה הוא לפחות 4 x 105 תאים. כאשר התאים נזרע בתחילה בתוך מטריצת קרום המרתף, תאים סרטניים ופסולת ניתן לצפות. פסולת הייתה מדוללת בהדרגה על ידי המשך התת-תרבות. איור 1B מראה תמונות של האורגנואידים המתורחיים בנקודות זמן שונות. אם התאים הסרטניים לא יוצרים אורגנואידים הגידול, התאים עלולים למות במהלך שלב הדיסוציאציה. במקרה כזה, הליכי דיסוציאציה כולל זמן דגירה עם האנזים צריך להיות מותאם כדי להגדיל את הכדאיות התא.
ביטוי של GFP ב הגידול שלפוחית השתן אורגנואידים באמצעות מניפולציה גנטית מתווכת וירוס בתיווך
אורגנואידים גידול שלפוחית השתן הציגו אותות GFP חזקים עם זיהום מוצלח לנטינגיל (איור 2B). לאחר הריכוז, סך של 250 μL של מדיה המכילה וירוסים היה מספיק כדי להדביק 3 x 104 תאים סרטניים בודד על מטריצת קרום המרתף, שמירה על 90% – 100% יעילות הזיהום. אותות GFP יכול להתגלות מן הגידול שלפוחית השתן אורגנואידים 3 ימים לאחר התמרה ויראלית. אם האותות הפלואורסצנטית נמוכים, היעילות של זיהום נגיפי עלולה להיות נמוכה. זה יכול להיות בגלל גורמים רבים, כגון titer ויראלי נמוך, ואת ההליכים צריך להיות מותאם בהתאם.
השתלת אורתוטופית של אורגנואידים גידול שלפוחית השתן
השתלת סרטן שלפוחית השתן המתקבל מ BBN המושרה סרטן שלפוחית השתן אורגנואידים מוצג באיור 3ב16. סרטן שלפוחית השתן האלושתלים נקצרו 3 שבועות לאחר השתלת אורתוגרפית. היסטולוגיה של גידול שלפוחית השתן המושתלים נותחו באמצעות כתמים H ו-E. השתלות אורתודפית של אורגנואידים גידול יכול לגדול כמו גידולים בשלפוחית השתן עבור 2 – 3 שבועות.
איור 1: בתרבות מבחנה של שלפוחית השתן הגידול אורגנואידים העכבר. (A) תרשים סכמטי להקמת הגידול של שלפוחית השתן של העכבר אורגנואידים. (ב) תמונות מייצגות לתרבות של אורגנואידים גידול שלפוחית השתן בנקודות זמן שונות. שלפוחית השתן העכבר הגידול אורגנואידים הוקמו ומתורבתים מעל 9 ימים. סרגל בקנה מידה = 100 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ביטוי של GFP ב גידול שלפוחית השתן אורגנואידים באמצעות מניפולציה גנטית מתווכת וירוס. (א) תרשים סכמטי של הזיהום והתמרה של גידול בשלפוחית השתן. (ב) תמונות מייצגות של גידול שלפוחית השתן אורגנואידים המבטא gfp. קנה מידה ברים = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השתלת אורתוגרפית של אורגנואידים גידול שלפוחית השתן. (A) תרשים סכמטי של השתלת אורתוטופית של גידול שלפוחית השתן אורגנואידים לעכבר עירום. (ב) דמויות מייצגות של שלפוחיות ו H ו-E מוכתם סעיפים מעכברים אורתולמריחה עם גידול שלפוחית השתן אורגנואידים. תצוגות מוגדלות של האזורים הסגורים בלוחות האמצעיות מוצגות בלוחות השמאליים. סרגל קנה מידה = 500 μm. איור זה שוחזר מאיור 1 – מוסף לנספח 1, קים ואח '16, פורסם ברשיון הציבורי הבינלאומי לקריאייטיב 4.0 (CC by 4.0; https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| שלפוחית השתן העכבר הגידול אורגנואידים בינוני | |
| מתקדם _ זיכרון/F-12 (בינוני בסיסי) | 10 מ"מ HEPES (pH 7.4) |
| 10 מילימטר ניטינאמיד | 0.5 x סרום-תוסף חינם |
| 2mm L-alanyl-ל-גלוטמין דיפפטיד | 1% פניצילין/סטרפטומיצין |
| 1 מ"מ-מרחש-ל-ציסטאין | 50 ng/mL מורטין גורם גידול עוריות |
| 1 μM A 83-01 | |
שולחן 1: הרכב של גידול שלפוחית השתן בינונית אורגאיד.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את ההליכים הניסיוניים לתרבות ולתחזק אורגנואידים גידול שלפוחית השתן נגזר גידולים מסרטנים המושרה מורטין שלפוחית השתן.
בפרוטוקול זה, קיימים מספר שלבים ניסיוניים שבהם ההליכים עשויים להזדקק לפתרון בעיות. ראשון, מספר תאי הגידול הנזרע בתחילה הוא גורם קריטי כי מספרים נמוכים של תאים סרטניים בתרבות (< 2 x 104 תאים) בעיקר להוביל למוות התאים בשל חוסר האינטראקציות בין תאי הגידול. לעומת זאת, החל עם תאים רבים מדי (> 5 x 104 תאים) ב זריעה מוביל לאורגנואידים צפוף, וכתוצאה מכך קושי בעת טיפול בתרבויות עם צמיחה ירודה של כל אורגנואיד. זה הציע מאוד לוחיות רישוי מרובות עם מספר שונה של תאים להיות מבוסס בתחילת לייעל את התנאים ניסיוני. זיהוי המספר הנכון של תאי הגידול הראשוני הוא חיוני כדי להשיג את הכדאיות הגבוהה ביותר תאים להקים אורגנואידים גידול שלפוחית השתן מוצלחת. כמו כן, בתרבות ארוכת טווח של למעלה מ 2 שבועות ללא הזדקנות, ברוב אורגנואידים הגידול להפסיק לצמוח, פוטנציאל בשל אספקת מספקת של חומרים מזינים במרכז האורגנואידים ואת דלדול גורם הגדילה בתוך מטריצת קרום המרתף. לכן, אורגנואידים suboid בזמן הזמן הוא צעד קריטי כדי לשמור על התרבות אורגאיד הגידול.
שנית, הייצור של חלקיקים high-titer ויראלי הוא קריטי עבור מניפולציה גנטית יעילה של אורגנואידים הגידול. כדי לפתור בעיות הקשורות לווירוסים הקשורים בווירוס, מומלץ מאוד לקבוע כי הנגיף ייקבע לפני התמרה ויראלית בכל פעם, משום שמבנים מבוססי-ויראלי נוטים לייצר חלקיקים ויראליים ביעילות משתנה. אם הגידול אורגנואידים התערוכה הכדאיות נמוכה בעקבות זיהום נגיפי, סביר להניח כי מגדל הנגיפי הם פוטנציאל גבוה מדי. זה הציע מאוד להשתמש בכמות נמוכה יותר של וירוס במקרה זה. שלישית, במהלך השתלת אורתוגרפט של המושרה BBN גידול שלפוחית השתן, זה קריטי לשמור על שלמות של הקיר שלפוחית השתן. במקרה הזריקה מגיע לומן של שלפוחית השתן על ידי חדירה שכבת הקיר שלפוחית השתן, הניסוי צריך להסתיים ונמחק. אם אפשרי, ניטור גידול שלפוחית השתן באמצעות מערכת הדמיה אולטרסאונד מומלץ.
מגבלה אחת של הטכניקות הנוכחיות היא היעדר הסביבה המיקרו של הגידול או משתית באורגנואידים אלה. כדי להתגבר על בעיה זו, זה הציע בתוקף כי השתלת אורתוטופית של הגידול אורגנואידים להשתמש במערכת vivo כדי לחקות את הסביבה מיקרו הגידול הטבעי. בעתיד, יהיה צורך לפתח 3D במערכות מתורבת המורכבת מאורגנואידים הגידול עם רכיבים אחרים של הגידול משתית.
אחת ההשלכות העיקריות של הטכניקה שלנו היא כי, ב השתלת אורתוגרפית של אורגנואידים הגידול, רק 10 שלפוחית השתן אורגנואידים הגידול יכול לגרום לצמיחת הגידול בשלפוחית השתן. לעומת ניסויים קונבנציונליים השתלת הגידול שדורשים 5 x 105– 1 x 106 תאים סרטניים יחיד בשלפוחית השתן, השיטות שלנו הם הרבה יותר יעיל וחזק. הבדל משמעותי נוסף הוא כי האורגנואידים יכול להיות מניפולציות באופן משונה באמצעות וקטורים שונים ויראליים, כגון בנייה לנטינגיי המכילים רנ א קצר, מערכת CRISPR-Cas9, או גנים של עניין. אלה יהיו כלים רבי-עוצמה להוספה לטכנולוגיית ארגונית נוכחית. בסך הכל, גישות ניסיוני שהוצגו כאן יכול להקל על הקמתה של מודלים סרטניים בלתי מתורבת שיכולים לשפר את הבנתנו את הפתוגנזה של סרטן שלפוחית השתן ולא באמצעות 2D שלפוחית השתן סרטן התאים.
שיטה זו היתה אפשרות להקים אורגנואידים גידול שלפוחית השתן נגזר גידול שלפוחית מסרטנים מורבית המושרה. המאמר מספק תיאור של הליכים ניסיוני בתיווך-מתווך שדרכו השינויים הגנטיים הם הציג באופן מספק באופן שוטף בגידול שלפוחית השתן אורגנואידים. בנוסף, הליך להשתלה אורתוגרפית של אורגנואידים הגידול הוא כלול. בשילוב עם הנוכחי בדגמי סרטן vivo, טכניקה זו תהיה כלי שימושי כדי ללמוד את הבסיס המולקולרי של tuמוריגנזה שלפוחית השתן.
Disclosures
המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מקרן המחקר הלאומי של קוריאה כדי K. S: NRF-2017R1A2B4006043, NRF-2017R1A2B4006043, NRF-2017R1A2B4006043, הכלכלה היצירתית תוכנית פיתוח טכנולוגיה (SF317001A), POSCO (2018Y060) ו BK21 פלוס מלגת מחקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm syringe filter (PES membrane) | Millipore | SLHP033RS | |
| 10 cm culture plate | Eppendorf | 0030-702-115 | |
| 90 mm Petri dish | SPL | 10090 | |
| 100 µm cell strainer | Corning | 352360 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 29 G 1/2 insulin syringe | SHINA | B299473538 | |
| 3 mL syringe | Norm-ject | N7.A03 | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| A8301 | Tocris | 2939 | stock concentration: 25 mM |
| Absolute ethanol | Daejung | 4023-2304 | |
| Absorbable suture | Henry Schein | 039010 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo | 12634028 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Thermo | A1049201 | |
| B-27 | Gibco | 17504-044 | stock concentration: 50X |
| BBN(N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine) | Tokyo Chemical Industry | B0938 | |
| Blue nylon 5/0-13mm | AILEE | NB521 | |
| C57BL Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (nude mouse) | Charles River | 194 | |
| Collagenase type I | Thermo | 17100017 | stock concentration: 20 mg/mL |
| Collagenase type II | Thermo | 17100015 | stock concentration: 20 mg/mL |
| Collagenase/dispase | Sigma | 10269638001 | stock concentration: 1 mg/mL |
| Cyrovial | Corning | 430488 | |
| DMEM(Dulbecco's modified minimum essential media) | Gibco | 11965-118 | |
| DMSO(Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D8418 | |
| DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Welgene | LB 001-02 | |
| Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Healthcare | DIN: 02169428 | |
| FBS(Fetal bovine serum) | Millipore | ES009B-KC | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | 100X |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Welgene | BB001-01 | |
| Isoflurane | Hana Pharm Co., Ltd. | ||
| Ketoprofen (Anafen) | Merial | DIN: 02150999 | |
| Matrigel growth factor reduced (GFR) Growth Factor Reduced (GFR) |
Corning | 354230 | use for organoid culture in plate |
| Matrigel high concentration (HC) | Corning | 354248 | use for organoid transplantation |
| 1.5 mL microtube | Axygen | MCT-150-C | |
| LT1 transfection reagent | Mirus Bio | MIR 2300 | |
| murine EGF(epidermal growth factor) | Peprotech | 315-09 | stock concentration: 100 µg/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | stock concentration: 200 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | stock concentration: 1M |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| pCMV.R 8.74 | Addgene | 22036 | Packaging plasmid |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | 100X |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Envelope plasmid |
| Polybrene(hexadim ethrine bromide) | Sigma | H9286 | stock concentration: 2 µg/mL |
| pSiCoR | Addgene | 11579 | Lentiviral plasmid |
| Razor blade | |||
| Saline buffer | JW Pharmaceutical | ||
| SW41Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| Thermolysin, Bacillus thermoproteolyticus | Millipore | 58656-2500KUCN | stock concentration: 250 KU/mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | |
| Ultracentrifugation tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Abmole | M1817 | stock concentration: 10 mM |
References
- Sanli, O., et al. Bladder cancer. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17022 (2017).
- Stenzl, A., et al. Treatment of muscle-invasive and metastatic bladder cancer: update of the EAU guidelines. European Urology. 59 (6), 1009-1018 (2011).
- Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603 (2012).
- Caponigro, G., Sellers, W. R. Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 179 (2011).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407 (2018).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246 (2016).
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-517 (2018).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364 (2015).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer–derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424 (2017).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Kim, S., et al. Epigenetic regulation of mammalian Hedgehog signaling to the stroma determines the molecular subtype of bladder cancer. eLife. 8, 43024 (2019).
- Shin, K., et al. Cellular origin of bladder neoplasia and tissue dynamics of its progression to invasive carcinoma. Nature Cell Biology. 16 (5), 469 (2014).
- Fu, C. L., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse bladder wall injection. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (53), e2523 (2011).
