Summary
Detta protokoll ger detaljerade experimentella steg för att upprätta en tredimensionell in vitro kultur av urinblåsan tumör organoider härrör från cancerframkallande-inducerad urinblåsan cancer. Kulturmetoder inklusive passaging, genteknik och orthotopic transplantation av tumör organoider beskrivs.
Abstract
Utvecklingen av avancerade tumörmodeller har länge uppmuntrats eftersom nuvarande cancermodeller har visat begränsningar såsom brist på tredimensionell (3D) tumör arkitektur och låg relevans för mänsklig cancer. Forskare har nyligen utvecklat en 3D in vitro cancer modell som kallas tumör organoider som kan efterlikna egenskaperna hos en infödd tumör i en kultur skålen. Här beskrivs experimentella förfaranden i detalj för inrättandet av urinblåsan tumör organoider från en cancerframkallande-inducerad urinblåsan tumör, inklusive kultur, passage och underhåll av de resulterande 3D tumör organoider in vitro. Dessutom beskrivs protokoll för att manipulera de etablerade urinblåsan tumör organoid linjer för genteknik med lentivirus-medierad transduktion, inklusive optimerade villkor för effektiv införande av nya genetiska element i tumör organoider. Slutligen läggs förfarandet för ortotopic transplantation av urinblåsan tumör organoider i väggen i urinblåsan för ytterligare analys. De metoder som beskrivs i denna artikel kan underlätta inrättandet av en in vitro-modell för cancer i urinblåsan för utveckling av bättre terapeutiska alternativ.
Introduction
Urinblåsan cancer är den vanligaste urinvägscancer, med cirka 165.000 patienter dör årligen1. Bland de olika typerna av cancer i urinblåsan, muskel-invasivurothelial carcinom uppvisar en aggressiv fenotyp, och dess 5 år överlevnad är lägre än 50%2. Nya terapeutiska alternativ för invasiva urothelial tumörer har inte utökats under de senaste decennierna1.
Cancer cellinjer har använts i stor utsträckning för läkemedelsscreening3. Även om gynnsamma resultat har observerats i många läkemedelskandidater i cancer cellinjer, dåliga resultat rapporteras i kliniska prövningar4. Efter ökad anpassning till in vitro tvådimensionella (2D) kulturmiljöer, har det blivit allt svårare att sammanfatta inhemska tumörer i cellinjer. Djurcancer modeller eller patient-härledda tumör xenografts kan användas för att ta itu med de begränsningar som observerats i blåscancer cellinjer. Djurcancermodeller är dock tids- och resursintensiva. Därför har förbättrade sjukdomsmodeller varit efterfrågade i flera år och ett nytt modellsystem, organoider, har utvecklats för att övervinna bristerna i befintliga modeller5.
En organoid är en multicellulär 3D-konstruktion som kan sammanfatta in vitro de fysiologiska egenskaperna hos dess motsvarande in vivo organ. Normala och tumör organoider kan härledas från antingen pluripotenta eller vuxna stamceller, och primära tumörceller, respektive5,6. Under de senaste åren har tumör organoider fastställts från ett stort antal olika tumörvävnader7, inklusive kolon8,9, urinblåsan10, bukspottkörtel1,12, prostata13, lever14och bröst15 tumörvävnader. Sådana tumör organoider efterlikna deras ursprungliga tumörer fenotypiskt och genetiskt. På grund av deras likhet med in vivo tumörvävnader och deras många praktiska tillämpningar, forskare har antagit dem som nya sjukdomsmodeller i studien av cancer patogenes.
Här läggs förfarandena för inrättandet av tumörorganoider från en cancerframkallande murin invasiv urothelial tumör16 ut. N-butyl-N-(4-hydroxibutyl) nitrosamin (BBN) används som cancerframkallande för att inducera invasiva urothelial carcinom hos möss17 och tumör organoider, som uppvisar patologiska egenskaper mus muskel-invasiva urinblåsan tumörer, är etablerade från BBN-inducerad urinblåsan cancer16. Metoden för att genetiskt manipulera tumörorganoider illustreras med lentivirusmedierad transduktion för att utveckla ett modellsystem för att studera den molekylära grunden för utvecklingen av cancer i urinblåsan. Dessutom beskrivs en metod för transplantation av organoider ortotopiskt i en blåsa för att undersöka den inhemska urinblåsans roll i urinblåsan cancer.
Protocol
Alla förfaranden godkändes och genomfördes enligt riktlinjerna från kommittén för vård och användning av den institutionella djurvården vid POSTECH (IACUC-nummer: POSTECH-2019-0055).
1. In Vitro Kultur av urinblåsan tumör organoider
- Upprätta urinblåsan tumör organoider från murin urinblåsan tumör (Figur 1A).
OBS: Förfarandet för att generera BBN-inducerad musblåsan tumörer beskrivs i Shin et al.17.- Ge 0,1% BBN-innehållande vatten i en mörk flaska till mus ad libitum i 6 månader. Ändra BBN-innehållande vatten 2x i veckan.
OBS: En C57BL/6 hanmus med en kroppsvikt på cirka 25 g vid 8–10 veckors ålder användes. BBN-innehållande vatten kan administreras till upp till fem möss i en enda bur. - Efter 6 månader, avliva musen med hjälp av koldioxid inandning och isolera hela urinblåsan tumör. Överför den till en 90 mm petriskål.
- Ta bort icke-cancerogena delar och nekrotiska regioner med steril kirurgisk sax och tvätta blåstumörfragmenten 2–3 gånger med kalla 1x Dulbeccos fosfatbuffrad koks (DPBS). Samla fragmenten och överför dem till en ny 90 mm petriskål.
- Tillsätt 1 ml Dulbeccos modifierade minsta essentiella medium (DMEM) med 10 mM 4-(2-hydroxietyl)-1-piperazineetesulfonsyra (HEPES).
- Finhacka tumörvävnaden i bitar så liten som möjligt (0,5–1 mm3) med hjälp av ett steriliserat rakblad.
- Tillsätt 9 ml DMEM med 10 mM HEPES, 250 μg/ml kollagen styp I, 250 μg/ml kollagenstyp II och 250 U/ml thermolysin. Inkubera den malnade tumörvävnaden i 1,5–2 h på en orbital shaker i en inkubator (37 °C, 5% CO2) för att skilja fragmenten i cellsuspensionen. Överför cellsuspensionen till ett 50 ml-rör.
OBS: Om storleken på tumör som skördats från musen är större än 1 cm3,behandla den med 2x mängden thermolysin eller öka inkubationstiden. - Centrifuge röret vid 400 x g i 5 min vid 4 °C och aspirera supernatanten.
- Omdu återupphäver pelleten med 5 ml ammoniumkloridkalium (ACK) lysningsbuffert för att lysa röda blodkroppar. Inkubera röret i 3–5 min vid rumstemperatur (RT) tills den fullständiga lysen av röda blodkroppar.
OBS: Om de röda blodkropparna inte observeras, utelämna lysningsprocessen. - Tillsätt 20 ml DMEM i röret. Centrifuge röret vid 400 x g i 5 min vid 4 °C och aspirera supernatanten.
- Omför pelleten med 1 ml 0,25% trypsin-EDTA och 10 μM Y-27632 dihydroklorid (Y-27632) för att dissociate pelleten i enstaka celler. Kusote röret i 5 min i ett 37 °C vattenbad.
OBSERVERA: Observera tumören under ett mikroskop för att bekräfta fullständig dissociation i enstaka celler. Om bitar av celler kvarstår, pipettsuspensionen ytterligare. - Neutralisera trypsin med 10 ml DMEM med 10% fetalt nötkreatursserum (FBS). Filtrera cellsuspensionen genom en 100 μm cellsil på ett nytt 50 ml-rör för att avlägsna det osmälta skräpet.
- Centrifuge röret vid 400 x g i 5 min vid 4 °C och aspirera supernatanten.
- Coat a well in a 24 well plate using 150 μL ice-cold growth factor reduced basement membrane matrix (Table of Materials) och placera 24 brunnsplattan i en inkubator (37 °C, 5% CO2) i 30 min för att stelna källaren membran matris.
OBS: Tina och underhåll källarenmembranmatrisen vid 4 °C för att förhindra stelning före användning. - Omdu återuppställer pelleten med 1 ml DMEM och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer. Överför 3–4 x 104 tumörceller till en 1,5 ml mikrorör på is.
- Centrifug mikroröret vid 400 x g i 3 min vid 4 °C och kassera försiktigt supernatanten.
- Omblanda cellerna med 500 μl förvärmt organoidmedium (tabell 1) och 10 μM Y-27632 och överför dem till det belagda brunnen. Placera 24-brunnsplattan i en inkubator (37 °C, 5 % CO2).
- Extra urinblåsan tumörceller kan fyllas med 1 ml DMEM innehållande 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, och 10% dimetylsulfoxid (DMSO) i 1,5 ml kryovialer. Placera dem i en kryovial frysbehållare och överför behållaren till en -80 °C frys. Efter förvaring i frysen över natten, överför kryovialerna till flytande kväve för långtidsförvaring.
- Byt medium varannan dag med 500 μL förvärmt organoidmedium(figur 1B).
- Ge 0,1% BBN-innehållande vatten i en mörk flaska till mus ad libitum i 6 månader. Ändra BBN-innehållande vatten 2x i veckan.
- Subkultur urinblåsan tumör organoider.
OBS: Passage av urinblåsan tumör organoider när de når 100-150 μm i diameter rekommenderas.- Tillsätt 500 μL kollagen/dispase till organoidmediumt i 24-brunnsplattan med tumörorganoider. Pipette upp och ner i källaren membran matris och medium. Inkubera i 20 min vid 37 °C och skörda cellerna i ett 15 ml-rör.
OBS: Undersök organoider isolerade från källaren membran matris under ett mikroskop. Om organoiderna inte lossnar från källaren membran matris, öka inkubationstiden eller pipetten fler gånger. - Tillsätt 5 ml förvärmd DMEM, centrifug röret vid 400 x g i 3 min vid 4 °C och aspirera supernatanten.
- Omför du om pelleten med 1 ml förvärmd 0,25% trypsin-EDTA och 10 μM Y-27632. Kuv i 5 min i ett 37 °C vattenbad. Kraftigt pipett cellerna upp och ner och neutralisera trypsin med 5 ml DMEM med 10% FBS.
- Centrifuge röret vid 400 x g i 3 min vid 4 °C och aspirera supernatanten.
- Resuspend pelleten med 1 ml förvärmt organoid medium och räkna antalet enstaka tumörceller.
- Upprepa steg 1.1.14−1.1.18.
- Tillsätt 500 μL kollagen/dispase till organoidmediumt i 24-brunnsplattan med tumörorganoider. Pipette upp och ner i källaren membran matris och medium. Inkubera i 20 min vid 37 °C och skörda cellerna i ett 15 ml-rör.
2. Genetisk manipulation av urinblåsan tumör organoider med lentivirus-medierad transduktion (Figur 2A)
- Producera GFP-uttrycker lentivirala partiklar.
- Dag 0, platta HEK 293T celler med en densitet av 5-6 x 106 celler per 10 cm cell kulturplatta i celllinje odling medium (dvs DMEM med 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin).
- På dag 1, förbereda DNA-transfektionslösningen inklusive överföring plasmid innehållande GFP (8 μg), lentiviral förpackning plasmid (10 μg pCMVR 8,74 och 3 μg pMD2.G) och 1 ml reducerat serummedium (Materialtabell).
- Tillsätt 3 μL transfektionsreagens (Materialförteckning) per 1 μg total plasmid enligt tillverkarens anvisningar och blanda försiktigt genom rörledningar. Inkubera i 20 min på RT och tillsätt 9 ml DMEM med 10% FBS.
- Aspirera kulturmediet i cellkulturplattan med HEK 293T-celler. Överför försiktigt 10 ml av DNA-transfektionslösningen till HEK 293T-cellerna och inkubera i en cellkulturinkubator vid 37 °C.
- På dag 3, observera cellerna under ett fluorescensmikroskop (excitation vid 488 nm och utsläpp vid 512 nm) för att bestämma transfektionseffektiviteten. Nästan 90%–100% av cellerna i hela cellpopulationen bör uttrycka GFP.
- Samla supernatanten (som innehåller viruset) och filtrera supernatanten med ett 0,45 μm polyetersulfonfilter (PES).
Obs! - För att koncentrera viruset, centrifugviruset supernatant på 98.768 x g i en ultracentrifug i 2 h vid 4 °C i en svängande hink rotor(Table of Materials)och försiktigt kasta supernatant.
- Omblanda pelleten i 2,5 ml kallt organoidmedium.
- För långtidsförvaring, aliquot 250 μL lentiviralmedium i kryogena injektionsflaskor och snap-frysa dem med flytande kväve. Förvara de frysta viruslagren i frysen -80 °C.
- Utför lentivirus-medierad transduktion av urinblåsan tumör organoider.
- På dag 2, dela tumör organoider som beskrivs ovan (steg 1.2) 12 h innan lentivirus-medierad transduktion.
- Dag 3, tina snabbt en alikvot (steg 2.1.9) som innehåller virus i ett 37 °C vattenbad och tillsätt 250 μL organoid medium med 10 μM Y-27632 och 8 μg/ml hexadimetredbromid.
- Byt ut det organoida mediet i 24-brunnsplattan med tumörorganoider med 500 μl virusinnehållande medium och inkubering i 12–16 timmar i en inkubator (37 °C, 5 % CO2).
- På dag 4, ändra mediet med 500 μL färskt organoidmedium.
OBS: Efter 12–16 h inkubation bör mediet ändras, eftersom mediet som innehåller lentivirus och hexadimetrinbromid är cytotoxiskt. - På dag 6, övervaka GFP-signalen från tumörorganoiderna 3 dagar efter transduktion under ett fluorescensmikroskop(figur 2B).
- Dag 10, passage och lager organoider 7 dagar efter transduktion som beskrivs i steg 1.2, för att upprätthålla genetiskt modifierade tumör organoid linjer.
3. Ortotopic Transplantation av urinblåsan Organoid(figur 3A)
- Förbered urinblåsan tumör organoider för ortotopic transplantation.
- Före transplantation, kultur urinblåsan tumör organoider i 5-7 dagar, enligt beskrivningen ovan (steg 1.2).
- Tillsätt 500 μL kollagen/dispase till organoid medium i en 24 brunnsplatta med tumörorganoider. Pipette upp och ner i källaren membran matris och medium. Inkubera i 20 min vid 37 °C och samla in cellerna i ett 15 ml-rör.
- Tillsätt 5 ml förvärmd DMEM, centrifug röret vid 400 x g i 3 min vid 4 °C och aspirera supernatanten.
- Omblanda pelleten med 1 ml DMEM och överför lösningen till en 90 mm petriskål.
- Under ett mikroskop, plocka upp 10-100 tumör organoider med hjälp av en p200 micropipette och samla in dem i ett mikrorör på is.
- Centrifugröret vid 400 x g i 3 min vid 4 °C och kassera försiktigt supernatanten.
- Håll cellpelleten på isen tills mössen är redo för operation.
- Submucosal urinblåsan vägg transplantation
Obs!- Förbered en 8 till 10 veckor gammal manlig naken mus (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) minst 1 vecka före experimentet för att tillåta den att acklimatisera sig till en ny miljö. Injicera enrofloxacin (5 mg/kg) subkutant 24 timmar före operation.
- Rengör bänkytan med tvål och vatten. Autoklav kirurgiska instrument före kirurgiska ingrepp och utföra kirurgi med sterila instrument.
- Förvara 29 G insulinspruta, pipettspetsar och källare membranmatris på is. Administrera ketoprofen (5 mg/kg) subkutant före administrering av anestesi.
- Anestesimus med 4% isoflurane i en induktionkammare. När narsats uppnås, lägg musen i en supinposition och upprätthålla anestesi genom mask inandning av 2% förångad isoflurane.
OBS: Om anestesitiden är över 30 min, applicera ögonsalva på båda ögonen med hjälp av en bomullstuss för att undvika hornhinnans torkning. - Applicera povidone-jod med en steril gasväv och torka av den med 70% etanol. Upprepa 3x med en ny gasväv eller en bomullspinne varje gång.
- Täck anus och kirurgiska fältet med engångs, sterila kirurgiska draperier.
- Med hjälp av ett dissekerande mikroskop för förstoring, gör ett litet tvärgående snitt (mindre än 1,5 cm) i huden och muskulös vägg i den nedre mittlinjen buken med steril kirurgisk sax. Exponera urinblåsan från bukhålan och stödja den med saltlösning-indränkta bomullspinnar.
OBS: Om urinblåsan är full av urin, tryck försiktigt urinblåsan för att expandera den något. - Omblanda organoidpellets (steg 3.1.7) i 80 μL organoidmedium innehållande 50% högkoncentration källare membran matris (Materialtabell).
- Injicera organoidsuspensionen i den främre aspekten av urinblåsan kupolen med hjälp av 29 G insulinsprutan under ett dissekerande mikroskop.
- Stäng det inre lagret av bukväggen med antibakteriell absorberbar sutur och stäng sedan det yttre lagret med 4-0 nylon sutur. Desinficera operationsstället med povidonjod och 70% etanol.
- Låt musen återhämta sig under en infraröd irradiator 10–15 min. Övervaka musen tills den återfår medvetande och motilitet.
- En dag efter operationen, kontrollera det allmänna tillståndet för musen och anastomotic läckage. Administrera ketoprofen (5 mg/kg) en gång dagligen i 3 dagar efter operativt och behandla enrofloxacin (5 mg/kg) en gång dagligen i 10 dagar efter operativt.
- När snitt platsen har läkt (10-14 dagar efter operationen), ta bort suturer. Övervaka tillväxten av musblåsan tumör i 2-3 veckor efter tumör organoid injektion.
- Om urinblåsan tumör tillväxt observeras, avliva musen med hjälp av koldioxid inandning, och skörda hela urinblåsan tumör. Tvätta den med kall DPBS(figur 3B)16.
- För att analysera urinblåsan tumör histologi, fläcka paraffin-inbäddaddel av vävnaden med hematoxylin och eosin (H och E) färgning(Figur 3B)16.
Representative Results
In vitro kultur av mus blåsa tumör organoider
Antalet tumörceller dissociated från en ~ 1 cm3 BBN-inducerad tumör är minst 4 x 105 celler. När cellerna först är seedade i källaren membran matris, icke-cancerceller och skräp kan observeras. Skräp späddes gradvis ut genom att fortsätta subkulturen. Figur 1B visar bilder av odlade organoider vid olika tidpunkter. Om tumörcellerna inte bildar tumörorganoider, cellerna är potentiellt döda under dissociation steg. I sådana fall måste dissociationsförfaranden inklusive inkubationstid med enzymet justeras för att öka cellens lönsamhet.
Uttryck för GFP i urinblåsan tumör organoider med lentivirus-medierad genetisk manipulation
Urinblåsan tumör organoider uppvisade starka GFP signaler med framgångsrik agensinfektion (Figur 2B). Efter koncentrationen var totalt 250 μL virusinnehållande media tillräckligt för att infektera 3 x 104 enstaka tumörceller på källarenmembranmatrisen, vilket bibehåller 90%–100% infektionseffektivitet. GFP signaler kan upptäckas från urinblåsan tumör organoider 3 dagar efter lentiviral transduktion. Om fluorescenssignalerna är låga är virusinfektionens effektivitet potentiellt låg. Detta kan bero på många faktorer, såsom låg viral titer, och förfarandena måste justeras i enlighet därmed.
Orthotopic transplantation av urinblåsan tumör organoider
En urinblåsan tumör allograft erhållits från BBN-inducerad urinblåsan tumör organoider presenteras i figur 3B16. Urinblåsan tumör allografts skördades 3 veckor efter ortotopic transplantation. Histologin av den transplanterade urinblåsan tumör analyserades med H och E färgning. Orthotopic transplantationer av tumör organoider kan växa som urinblåsan tumörer i 2-3 veckor.
Figur 1: In vitro kultur av mus blåsa tumör organoider. (A) Schematiskt diagram för inrättandet av musblåsan tumör organoider. (B) Representativa bilder för odling av urinblåsan tumör organoider vid olika tidpunkter. Musblåsan tumör organoider fastställdes och odlade sen över 9 dagar. Skalbar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Uttryck för GFP i urinblåsan tumör organoider med lentivirus-medierad genetisk manipulation. (A) Schematisk diagram över lentiviral transfektion och transduktion av urinblåsan tumör organoider. (B) Representativa bilder av urinblåsan tumör organoider uttrycker GFP. Skalstänger = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Orthotopic transplantation av urinblåsan tumör organoider. (A) Schematiskt diagram över ortotopic transplantation av urinblåsan tumör organoider till en naken mus. (B) Representativa bilder av blåsor och H och E färgade sektioner från möss ortotopiskt transplanterade med urinblåsan tumör organoider. Förstorade vyer över de förpackade regionerna i de mellersta panelerna visas i de vänstra panelerna. Skalstång = 500 μm. Denna siffra återges från figur 1-figur tillägg 1, Kim et al.16, publicerad under Creative Commons Attribution 4.0 International Public License (CC BY 4.0; https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Mus blåsa tumör organoider medium | |
| Avancerat DMEM/F-12 (basmedium) | 10 mM HEPES (pH 7.4) |
| 10 mM Nikotinamid | 0.5x Serumfritt tillägg |
| 2 mM L-alanyl-L-glutamindipeptid | 1% Penicillin/Streptomycin |
| 1 mM N-acetyl-L-cystein | 50 ng/ml Murin epidermal tillväxtfaktor |
| 1 μM A 83-01 | |
Tabell 1: Sammansättning av urinblåsan tumör organoid medium.
Discussion
Detta protokoll beskriver experimentella förfaranden för att odla och upprätthålla urinblåsan tumör organoider härrör från cancerframkallande murine urinblåsan tumörer.
I det här protokollet finns det flera experimentella steg där procedurerna kan behöva viss felsökning. För det första är antalet tumörceller som ursprungligen sådd en kritisk faktor eftersom lågt antal tumörceller i kulturen (<2 x 104 celler) främst leder till celldöd på grund av brist på interaktioner mellan tumörceller. Däremot leder början med för många celler (>5 x 104 celler) vid sådd till överfulla organoider, vilket resulterar i svårigheter vid hantering av kulturer med dålig tillväxt av varje organoid. Det föreslås starkt att flera plattor med olika antal celler etableras i början för att optimera de experimentella förhållandena. Identifiera rätt antal inledande tumörceller är avgörande för att uppnå den högsta cellen lönsamhet och att fastställa framgångsrika urinblåsan tumör organoider. Också, i långsiktig kultur över 2 veckor utan passaging, de flesta tumör organoider sluta växa, potentiellt på grund av otillräcklig tillgång på näringsämnen i mitten av organoider och utarmning av tillväxtfaktor i källaren membran matris. Därför subculturing organoider i tid är ett kritiskt steg för att upprätthålla tumör organoid kultur.
För det andra är produktionen av högtiter lentivirala partiklar avgörande för effektiv genetisk manipulation av tumör organoider. För att felsöka virustiter-relaterade problem, det är starkt föreslås att viruset titers bestämmas före viral transduktion varje gång eftersom lentiviralkonstruktioner tenderar att producera viruspartiklar med varierande effektivitet. Om tumör organoider uppvisar låg lönsamhet efter virusinfektion, Är det troligt att virustiters är potentiellt för hög. Det föreslås starkt att använda lägre mängd virus i detta fall. För det tredje, under orthotopic transplantation av BBN-inducerad urinblåsan tumör organoider, Är det viktigt att upprätthålla integriteten hos urinblåsan väggen. Om injektionen når blåsans lumen genom att tränga in i blåsväggsskiktet, ska experimentet avslutas och kasseras. Om möjligt rekommenderas övervakning av urinblåsan tumörtillväxt med hjälp av ett ultraljudsavbildningssystem.
En begränsning av de nuvarande teknikerna är frånvaron av tumörmikromiljön eller stroma i dessa organoider. För att övervinna denna fråga, Det är starkt föreslagit att ortotopic transplantation av tumör organoider använda ett in vivo-system för att efterlikna den inhemska tumör mikromiljön. I framtiden kommer det att bli nödvändigt att utveckla 3D in vitro organoidsystem som består av tumör organoider med andra komponenter i tumör stroma.
En av de största konsekvenserna av vår teknik är att i ortotopic transplantation av tumör organoider, endast 10 urinblåsan tumör organoider kan inducera tumörtillväxt i urinblåsan. Jämfört med de konventionella tumörtransplantationexperiment som kräver 5 x 105–1 x 106 enstaka tumörceller i urinblåsan är våra metoder mycket effektivare och robustare. En annan betydande skillnad är att organoiderna kan manipuleras mångsidigt med hjälp av olika lentivirala vektorer, såsom lentivirala konstruktioner som innehåller korthårsnål RNA, CRISPR-Cas9-systemet eller gener av intresse. Dessa skulle vara kraftfulla verktyg för att lägga till nuvarande organoid teknik. Sammantaget kan de experimentella metoder som presenteras här underlätta inrättandet av in vitro tumör modeller som kan förbättra vår förståelse av patogenesen vid cancer i urinblåsan snarare än att använda 2D-blåscancer cellinjer.
Denna metod kunde fastställa urinblåsan tumör organoider härrör från en cancerframkallande-inducerad urinblåsan tumör. Artikeln ger en beskrivning av lentivirus-medierad experimentella förfaranden genom vilka de genetiska modifieringarna införs och stabilt upprätthålls i urinblåsan tumör organoider. Dessutom ingår ett förfarande för ortotopic transplantation av tumör organoider. I kombination med nuvarande in vivo cancermodeller, denna teknik kommer att vara ett användbart verktyg för att studera den molekylära grunden för urinblåsan tumorigenesis.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av bidrag från Koreas nationella forskningsstiftelse till KS: NRF-2017R1A2B4006043, NRF-2017M3C7A1047875, NRF-2017R1A5A1015366, Creative Economy Leading Technology Development Programme (SF317001A), POSCO (2018Y060) BK21 Plus Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm syringe filter (PES membrane) | Millipore | SLHP033RS | |
| 10 cm culture plate | Eppendorf | 0030-702-115 | |
| 90 mm Petri dish | SPL | 10090 | |
| 100 µm cell strainer | Corning | 352360 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 29 G 1/2 insulin syringe | SHINA | B299473538 | |
| 3 mL syringe | Norm-ject | N7.A03 | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| A8301 | Tocris | 2939 | stock concentration: 25 mM |
| Absolute ethanol | Daejung | 4023-2304 | |
| Absorbable suture | Henry Schein | 039010 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo | 12634028 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Thermo | A1049201 | |
| B-27 | Gibco | 17504-044 | stock concentration: 50X |
| BBN(N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine) | Tokyo Chemical Industry | B0938 | |
| Blue nylon 5/0-13mm | AILEE | NB521 | |
| C57BL Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (nude mouse) | Charles River | 194 | |
| Collagenase type I | Thermo | 17100017 | stock concentration: 20 mg/mL |
| Collagenase type II | Thermo | 17100015 | stock concentration: 20 mg/mL |
| Collagenase/dispase | Sigma | 10269638001 | stock concentration: 1 mg/mL |
| Cyrovial | Corning | 430488 | |
| DMEM(Dulbecco's modified minimum essential media) | Gibco | 11965-118 | |
| DMSO(Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D8418 | |
| DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Welgene | LB 001-02 | |
| Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Healthcare | DIN: 02169428 | |
| FBS(Fetal bovine serum) | Millipore | ES009B-KC | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | 100X |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Welgene | BB001-01 | |
| Isoflurane | Hana Pharm Co., Ltd. | ||
| Ketoprofen (Anafen) | Merial | DIN: 02150999 | |
| Matrigel growth factor reduced (GFR) Growth Factor Reduced (GFR) |
Corning | 354230 | use for organoid culture in plate |
| Matrigel high concentration (HC) | Corning | 354248 | use for organoid transplantation |
| 1.5 mL microtube | Axygen | MCT-150-C | |
| LT1 transfection reagent | Mirus Bio | MIR 2300 | |
| murine EGF(epidermal growth factor) | Peprotech | 315-09 | stock concentration: 100 µg/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | stock concentration: 200 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | stock concentration: 1M |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| pCMV.R 8.74 | Addgene | 22036 | Packaging plasmid |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | 100X |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Envelope plasmid |
| Polybrene(hexadim ethrine bromide) | Sigma | H9286 | stock concentration: 2 µg/mL |
| pSiCoR | Addgene | 11579 | Lentiviral plasmid |
| Razor blade | |||
| Saline buffer | JW Pharmaceutical | ||
| SW41Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| Thermolysin, Bacillus thermoproteolyticus | Millipore | 58656-2500KUCN | stock concentration: 250 KU/mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | |
| Ultracentrifugation tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Abmole | M1817 | stock concentration: 10 mM |
References
- Sanli, O., et al. Bladder cancer. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17022 (2017).
- Stenzl, A., et al. Treatment of muscle-invasive and metastatic bladder cancer: update of the EAU guidelines. European Urology. 59 (6), 1009-1018 (2011).
- Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603 (2012).
- Caponigro, G., Sellers, W. R. Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 179 (2011).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407 (2018).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246 (2016).
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-517 (2018).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364 (2015).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer–derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424 (2017).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Kim, S., et al. Epigenetic regulation of mammalian Hedgehog signaling to the stroma determines the molecular subtype of bladder cancer. eLife. 8, 43024 (2019).
- Shin, K., et al. Cellular origin of bladder neoplasia and tissue dynamics of its progression to invasive carcinoma. Nature Cell Biology. 16 (5), 469 (2014).
- Fu, C. L., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse bladder wall injection. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (53), e2523 (2011).
