Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man efterligner Suckling-til-fravænning overgang in vitro ved hjælp af mus sene føtale tarm organoider dyrket i 30 dage.
Abstract
Ved slutningen af dienings perioden gennemgår mange pattedyrarter store ændringer i tarm Epitelet, der er forbundet med evnen til at fordøje fast føde. Denne proces kaldes Suckling-til-fravænning overgang og resulterer i udskiftning af neonatal epitel med voksen epitel, som går hånd i hånd med metaboliske og morfologiske justeringer. Disse komplekse udviklingsmæssige ændringer er resultatet af et genetisk program, der er iboende i de intestinale epitelceller, men kan til en vis grad være moduleret af ydre faktorer. Langvarig kultur af mus primære tarm epiteliale celler fra sen føtal periode, rekapitulerer Suckling-til-fravænning overgang in vitro. Her beskriver vi en detaljeret protokol for mus føtal tarm organoid kultur bedst egnet til at modellere denne proces in vitro. Vi beskriver flere nyttige assays designet til at overvåge ændringen af tarmfunktioner i forbindelse med Suckling-til-fravænning overgang med tiden. Derudover indeholder vi et eksempel på en extrinsisk faktor, der er i stand til at påvirke Suckling-til-fravænning overgang in vivo, som en repræsentation af modudrende timing af Suckling-til-fravænning overgang in vitro. Denne in vitro-tilgang kan bruges til at studere molekylære mekanismer i den Suckling-til-fravænning overgang samt modulatorer af denne proces. Hvad vigtigere er, hvad angår Dyreetik inden for forskning, bidrager udskiftning af i nvivo-modeller med denne in vitro-model til at raffinerer dyreforsøg og eventuelt til en reduktion i brugen af dyr til at studere tarm modnings processer.
Introduction
I mange pattedyrarter, herunder mus og mænd, den neonatal tarm har flere funktioner, der adskiller sig fra den fuldt modne tarm epitelet. Disse funktioner letter neonatal enterocytcellerne at fordøje og absorbere mælk, som indeholder højt fedtindhold og lave kulhydrater, med lactose som den største kulhydrat. Pensel kanten af de neonatal tarm epiteliale celler udtrykker disaccharidase lactase-phlorizin hydrolase (LCT)1 til at fordøje mælken disaccharid lactose. Efter diegivning periode, enterocytter tilpasse sig fordøje solid mad, der er rig på komplekse kulhydrater og lavt fedtindhold. Dette manifesterer sig ved en switch i pensel kant disaccharidase udtryk fra laktase til sucrase-isomaltase (SIS) og trehalase (treh), som kan fordøje mere komplekse kulhydrater til stede i fast food2. En anden metabolisk switch er relateret til den lave koncentration af arginin i mælk. For at sikre behovet for arginin, neonatal enterocytcellerne udtrykke den sats begrænsende enzym i arginin biosyntese, argininosuccinate syntase-1 (Ass1), at syntetisere arginin3. I modsætning, voksne enterocytcellerne Express arginase 2 (arg2), et enzym i stand til kataboliserende arginin, der er rigelige i faste fødevarer. Desuden udtrykker det neonatal intestinale epitel den neonatal FC-receptor for immunglobuliner (fcrn), som medierer absorptionen af den maternelle IgG fra mælken til cirkulation/blodbanen4. Ekspression af FcRn falder betydeligt under den Suckling-til-fravænning5. I mus forekommer modning af Paneth celler postnatalt, tilfældigt med dannelsen og modning af Krypter, og er karakteriseret ved udtryk af antimikrobielle peptider lysosomet (lyz) og defensiner6.
Alle disse ændringer er en del af den Suckling-til-fravænning overgang, en proces, der sker gradvist efter fødslen til en måned af alder i mus, når tarm epitelet når sin modne voksne tilstand. Suckling-til-fravænning overgang er uløseligt reguleret og udviklingsmæssigt sat i tarm røret. Transkriptionsfaktor B lymfocyt-induceret modnings protein-1 (Blimp-1) spiller en central rolle i denne iboende modningsproces7. Blimp-1 udtrykkes i høj grad i neonatal epithelium, mens dets ekspression falder og går tabt under den Suckling-til-fravænning overgang og derfor kan tjene som en pålidelig markør for neonatal tarm epitelet. På trods af at være en iboende proces, den Suckling-til-fravænning overgang kan modutes af eksterne faktorer. For eksempel er den syntetiske analog af cortisol, dexamethason, kendt for at accelerere tarm modning i vivo8,9.
Nuværende in vitro-modeller, der anvendes til at studere tarm epitelial modning herunder Suckling-til-fravænning overgang, udnytte voksne epiteliale cellelinjer og/eller voksne organoider, som bærer egenskaber af voksne tarm epitelet. Vi har for nylig påvist, at primære tarm epiteliale celler isoleret fra den sene føtale tarm modne og rekapitulere den Suckling-til-fravænning overgang, når de vokser in vitro som organoider10. Vi viste yderligere, at denne tarm modning proces in vitro forekommer i samme tempo som in vivo. Endelig brugte vi dexamethason til at fremskynde modnings processen på samme måde som beskrevet i in vivo -undersøgelser.
Her skitserer vi en præcis protokol for isolation og kultur af mus sene føtale tarm organoider. Vi beskriver den foretrukne måde at indsamle prøver til langvarig organoid kultur og metoder til at overvåge Suckling-til-fravænning overgang in vitro. Denne protokol kan anvendes til in vitro-studier af intestinal epitelial modning og modulatorer af denne proces og resulterer i højere gennemløb, øget kvalitet og translationel værdi af data og en reduktion af brugen af dyr.
Protocol
Denne undersøgelse blev gennemført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for pleje og anvendelse af forsøgsdyr, der er oprettet af den etiske komité for dyreforsøg ved universitetet i Amsterdam, i fuld overensstemmelse med den nationale lovgivning om dyreforskning efter EU-direktiv 2010/63/EU om anvendelse af dyr til videnskabelige formål (ALC312).
1. isolering af føtal små tarm organoider
- Ofrer E18-E20 fostre ved hugning med kirurgisk saks, i henhold til de godkendte etiske regler.
- Umiddelbart efter eutanasi, omhyggeligt skåret åbne underlivet af fosteret med tarm saks og fjerne hele tarmen.
Bemærk: isolationen skal udføres med tarme mellem E18 og E20 for at opnå den rette overgang til fravænning og modning in vitro. - Med to små pincet, strække tarmen. Ved hjælp af maven og tillægget som hjælpelinjer skæres den proksimale og distale del af tyndtarmen ud.
Bemærk: Hvis dissektion er gjort omhyggeligt, er det muligt at isolere tyktarmen samt. Skær den fra hinanden ved hjælp af appendiks som vejledning (figur 1). - Gør tarmen åben i længderetningen: Fastgør tarmen ved hjælp af et barberblad placeret i længderetningen og træk tarmen ved at skubbe pincet (en arm af pincet på hver side af barberbladet) langs barberbladet. Derefter skæres den åbne tarm i 1 cm stykker.
- Forbered 2 50 mL rør med 10 mL iskold fosfat-Buffered saltvand (PBS). Den proksimale og distale del af tyndtarmen (og eventuelt kolon) overføres separat til rørene. Hold rørene på is, mens du dissekting tarmene af yderligere mus. Saml alle intestinale dele af et kuld sammen i samme rør.
Bemærk: et kuld har normalt 6-10 fostre. Tarmene af alle fostre skal kombineres. Dette beløb bør være nok til at give 4-8 brønde med organoider, i en 48-brønd plade, pr tarm del. - Fortsæt med organoid isolation som tidligere beskrevet11. Kort sagt, vask tarm stykker med iskold PBS, Inkuber med 2 mM ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA) i 30 minutter ved 4 °C, dissociér krypterne fra vævet ved hårdt at vaske brikkerne med iskold PBS + 10% føtal kalveserum (FCS), Filtrer ved hjælp af en 70 μm cellefilter og centrifuge for at indsamle krypterne ved 150 x g i 5 min ved 4 °c.
- Plade 4 til 8 brønde med Krypter i ekstracellulære matrix gel, afhængigt af pellet størrelse, i en varm 48-brønd plade. Brug 20 μL af Krypter suspenderet i ekstracellulær matrix gel per brønd. Lad ekstracellulær matrix gel størkne i en 37 °C inkubator i 10 min.
Bemærk: i betragtning af at kun 40% til 50% af isolerede Krypter danner organoider, sigter efter en tæthed på 250 til 300 organoider per brønd. Først tilsættes mindre ekstracellulære matrix gel end nødvendigt. Kig under mikroskop efter platting den første brønd til at analysere, om tætheden af de isolerede Krypter er ideel. Hvis det er nødvendigt, tilsættes mere ekstracellulær matrix gel. - I mellemtiden forberedes ENR medium: 14 mL avanceret Dulbecco's modificerede Eagle medium/skinke F-12 (DMEM/F12) 1:1 + + + (suppleret med 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethansulfonsyre (HEPES) 1x, L-glutamin 0,01 M og 0,2 e/mL penicillin/streptomycin), 4 mL Noggin-konditionerede medier, 2 mL Rspondin-konditionerede medier, 400 μL af B27 supplement 1x, 200 μL af N2 supplement 1x, 50 μL af 1,25 mM n-acetylcystein, 20 μL af 0,05 μg/mL epidermal vækstfaktor (EGF).
Bemærk: når dyrkning kolon organoider, supplere med 50% WNT konditioneret medier. - Tilsæt 250 μL ENR-medium pr. brønd.
2. dyrkning af fostrets organoider
- Skift mellem kulturerne 3 gange om ugen. Modning af organoider opnås efter 1 måned af kultur.
- På dag 3 efter hver passage tælles antallet af sfæroider og organoider ved hjælp af et optisk mikroskop. Kvantificere mindst 3 brønde per tilstand og alle de organoider til stede i hver brønd.
Bemærk: antallet af sfæroider reduceres med tiden, mens antallet af organoider øges (figur 2). - Passere organoider en gang om ugen ved mekanisk dissociation som beskrevet nedenfor.
- Fjern mediet, og tilsæt 1 mL iskoldt avanceret DMEM/F12 1:1 + + +. Saml alle ekstracellulære matrix gel med organoider i et 15 mL rør. Brug en 200 μL spids oven på et 1000 μL filter spids, og pipetten op og ned 20 gange for at forstyrre organoiderne.
- Centrifugeres ved 150 x g i 5 minutter ved 4 °c. Supernatanten kasseres, og pelleten opslæmmes i 20 μL ekstracellulær matrix gel pr. brønd. Normalt, fostrets organoider kan udvides i en 1:2 ratio.
- Lad ekstracellulær matrix gel størkne i 5-10 min. Tilsæt 250 μL ENR-medium pr. brønd.
3. modnings analyse på RNA-og Proteinniveau
- Analyser kultur hver 3 dage efter hver passage, i en periode på 1 måned (dvs. tid, hvor fuldstændig modning er opnået) (figur 3).
Bemærk: føtal organoid kultur er dynamisk (film 1) og for at undgå variation fra den normale regenerering af organoider efter mekanisk afbrydelse, er det nødvendigt altid at indsamle prøver på samme dag efter passage. -
RNA-isolation
- Saml 3 brønde af organoider med 200 μL RNA-lyse buffer for hver brønd suppleret med 2 μL β-mercaptoethanol. Efter tilsætning af RNA lysis buffer + β-mercaptoethanol til brønden, Sørg for at alle ekstracellulære matrix gel med organoider overføres til en RNase-fri 1,5 mL rør.
- Vortex kraftigt og opbevares ved-80 °C i højst 1 måned. Isoler RNA ved hjælp af kommercielt tilgængelige silica spin kolonne kits.
- For at øge RNA kvalitet, efter vask trin tilsættes 500 μL 80% EtOH og forsigtigt blandes ved at invertere søjlen. Centrifuge i 2 min ved 11.000 x g for at tørre søjlen helt.
Bemærk: Sørg for at vaske indersiden af låget af røret med 80% EtOH ved at svirpe røret på hovedet tre til fem gange for at slippe af med alle spor af guanidin thiocyanate. - For at øge RNA-udbyttet skal du vente 1-2 min efter påføring af RNase-frit vand før centrifuge. Re-elute RNA ved at anvende den første flow-through eluatet til kolonnen en anden gang.
Bemærk: isoleret RNA-kvalitet er tilstrækkelig til brug i Genome-dækkende udtryks analyse. Kontroller, om RNA-integritets nummeret er over 8.
-
Protein isolering
- Saml 5 brønde af organoider ved hjælp af 250 μL iskoldt celle genvindings løsning i 1 15 mL rør. Inkuber i mindst 30 minutter på is for at opløse den ekstracellulære matrix gel (dette vil reducere proteintilførslen fra ekstracellulær matrix gel).
- Vask med iskold PBS. Tilsæt 250 μL cellelyse buffer og opbevar ved-80 °C.
Bemærk: efter sonikering kan prøverne bruges til at detektere enzymaktivitet eller til vestlige blots.
-
Immun
- Saml 2 brønde af organoider ved hjælp af 250 μL iskoldt celle genvindings løsning i et 15 mL rør. Inkuber i mindst 30 minutter på is for at opløse den ekstracellulære matrix gel (dette vil reducere farvnings baggrunden). Vask med iskold PBS.
- Organoiderne fastsættes med 500 μL af 4% paraformaldegyde (PFA) i 1 time ved 4 °C. Vask med iskold PBS. Fortsæt til hel-organoid immunofluorescenstest eller til paraffin indlejring, ifølge offentliggjorte protokoller12.
Bemærk: Brug en plastik Pasteur-pipette til at håndtere organoiderne. Dette vil undgå forstyrrelse af dets struktur.
4. effekt af extrinsisk faktor (dexamethason som et eksempel) på organoid modningsproces
- På dag ét af kulturen tilsættes 0,01 M dexamethason til organoider. Organoiderne med dexamethason inkubates i hele kulturmåneden ved at tilføje ny dexamethason, hver gang mediet skiftes.
- Analyse af genekspression
- Isoler RNA som beskrevet ovenfor. Syntetisere, på samme tid, cDNA af alle prøver, der skal sammenlignes (behandlet og ubehandlet). Fortsæt med den foretrukne qRTPCR-metode.
- Brug GeNorm til at identificere de to mest stabile reference gener, hver gang der anvendes en ny behandling på fostrets organoider. Brug det geometriske gennemsnit af de to valgte reference gener til beregning af relative udtryk.
Bemærk: forslag til reference gener til at teste for muse føtale organoider: cyclophilin, Gapdh, βactin, 36b4, Hprt, Rpl4, Rpl32, Ppib og TBP. - For at undersøge, hvordan en bestemt ydre faktor påvirker føtal modning efter fødslen, bør alle følgende gener evalueres.
- Undersøg om føtal markører laktase (LCT), argininosuccinat syntase 1 (Ass1), B lymfocyt-induceret modning protein 1 (Blimp-1) og neonatal FC receptor (fcrn) fald i ekspression i de første to uger af kulturen og er fraværende for den resterende kulturtid (figur 4c). Analysér, om dette mønster ændres.
- Kontroller, om voksne markører sucrase-isomaltase (SIS), arginase 2 (arg2), Trehalase (treh) og lysozym (lyz) stigning i ekspression efter to ugers kultur (figur 4d). Analysér, om dette mønster ændres af den eksterne faktor.
Bemærk: dexamethason er en ekstern faktor, der kan fremskynde modning af føtale organoider og kan bruges som en positiv kontrol i alle forsøg med henblik på at teste andre ydre faktorer.
- Enzymaktivitet analyse
- Isoler protein som beskrevet ovenfor. Opdage tarm i aktivitet i henhold til protokoller offentliggjort af dahlqvist og messer13,14.
- Forbered 0,625 M maleic-buffer pH 6,0 (hold i 3 måneder ved 4 °C). Ved hjælp af denne buffer, forberede 0,05 M lactose (tilsæt p-hydroxymercuribenzoatnatrium som stabilisator til at hæmme lysosomale p-galactosidase aktivitet); 0,05 M maltose; 0,05 m saccharose og 0,05 M trehalose.
Bemærk: alle disse opløsninger kan opbevares i 5 dage ved 4 °C. Hold på isen, mens du forbereder analysen. - Forbered analysestandarder ved at fortynde 5,56 m glucoseopløsning med ultrarent vand for at opnå opløsninger med følgende koncentrationer: 0,125 M; 0,1 M; 0,075 M; 0,05 m og 0,025 M.
Bemærk: opløsningen er stabil i mindst 3 måneder ved 4 °C. - Der inkubates i en 96-brønd plade til 60 min ved 37 °C:
-30 μL organoid-lysat med 30μL lactose
-30 μL organoid-lysat med 30μL saccharose
-30 μL 10 gange fortyndet organoid-lysat med 30 μL maltose
-30 μL af fem gange fortyndet organoid-lysat med 30 μL trehalase
-30 μL ufortyndet organoid-lysat med 30 μL maleinsyre som stikprøve baggrund
-30 μL af hver glukose standard
-30 μl ultrarent vand, som tomt
-30 μl positiv kontrol (Optimer fortynding; lyseres føtal tarm væv kan anvendes som kontrol for lactaseaktivitet, mens lyseres voksen tarm væv kan anvendes som kontrol for sucrase, maltase og trehalase)
Bemærk: fortynding af prøverne skal foretages med cellelyse buffer. Opbevar prøverne og pladen på isen, mens analysen forberedes. - For at bestemme mængden af glucose, der produceres af de enzymer, der er til stede i organoid lysatet efter inkubation med deres respektive substrater, tilsættes hurtigt 200 μL PGO-farveopløsning og måle absorbans ved 450 Nm hver 5 min for 30 min ved 37 °C.
Bemærk: gør PGO-farveopløsning frisk. Brug 10 U/mL glucoseoxidase, 2 U/mL peroxidase og 7,88 mmol/L o-dianisidin i 0,5 mol/L Tris-HCl buffer ved pH 7,0. Opløsningen skal være ved stuetemperatur, når den tilsættes til pladen. - Beregn aktivitet i henhold til glucose standard og korrigere for den samlede mængde af protein (bestemt af bicinchonininsyre assay (BCA)). Enzymaktivitet skal udtrykkes som μM glucose/μg protein · min-1 (figur 5b).
Bemærk: mål arginase aktivitet ved hjælp af en kommercielt tilgængelig arginase aktivitet assay kit.
Representative Results
Langvarig kultur af føtal tarm epiteliale celler
Protokollen for efterligning af Suckling-til-fravænning overgang in vitro afhænger af korrekt håndtering af føtale organoider under langvarig kultur. Proksimal og distale tarm, der er isoleret fra E18-E20-musefostre, adskilles som vist i (figur 1). Ved isolation er epiteliale celler seedet i ekstracellulære matrix gel kupler (figur 2). Det tager typisk fire passager og ca. 28-30 dages kultur for føtale organoider at modne til den voksne tilstand. I løbet af denne tid, celler på forskellige stadier af modning kan indsamles (figur 3).
Repræsentativ downstream-analyse af overgangen fra diegivning til fravænning in vitro
For at bekræfte, at isolerede føtale organoider er tydeligt proksimale eller distale, Sammenlign udtryks niveauet for proksimale markører et snit domæne familiemedlem 2 (Onecut2) og Gata bindende protein 4 (Gata4) og distale markører fedtsyre bindende protein 6 (Fabp6) og guanylatcyclase aktivator 2a (Guca2a) mellem både proksimale og distale organoid kulturer (figur 4A, B). Overgangen fra diegivning til fravænning in vitro kan overvåges af to sæt gener: føtal (figur 4c) og voksne markører (figur 4d). Fostrets markører bør gradvist falde i løbet af kulturen, mens ekspression af voksne markører gradvist bør øges (figur 4C, D).
Anvendelse af extrinsisk faktor som modifikator af sugende-til fravænnings overgang in vitro
I denne protokol blev dexamethason et syntetisk glukokortikoid, der blev anvendt som et eksempel på ydre-faktor, som kunne ændre overgangen fra diegivning til fravænning in vitro. Repræsentative data i figur 5 antyder, at virkningerne af ydre faktorer bedst kan bestemmes af flere assays, da de ikke nødvendigvis bør være genomiske. F. eks. i tilfælde af sucrase-isomaltase induceres både RNA og protein ekspression med dexamethason (figur 5a), hvorimod trehalaseekspression kun ændres på proteinniveauet. (Figur 5b).
Figur 1: isolering af muse føtal tyndtarmen. A) fotografi af dissekeret og strakt føtal tarm, herunder mave, proksimal og distale tyndtarmen, tillæg og kolon. Sort linje indikerer, hvor tarmen skal skæres til at opdele den proksimale og den distale tyndtarmen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative mikroskopiske billeder af proksimal og distale fostrets organoid-kultur på dag 3, dag 17 og dag 28 i kulturen. Alle billeder blev opnået på dag 3 efter passage og viser faldet i antallet af sfæroider overarbejde. Skala bjælke: 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: repræsentativ video viser føtal organoid kultur dynamik, fra dag 4 til 6 i kulturen. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Figur 3: skematisk gengivelse af organoid Collection til analyse af tarm modning over tid. Proksimale og distale føtale organoide kulturer skal dyrkes i en måned og urerne hver uge. Prøver til modnings analyse skal indsamles 3 dage efter isolation og hver 3 dage efter hver passage. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative qRTPCRs af tarm modning markører i proksimale og distale føtal organoider. (A) proksimale markører Onecut2 og Gata4 udtrykkes hovedsageligt i den proksimale Organoide kultur, mens (B) distale markører Fabp6 og Guca2a for det meste udtrykkes i den distale organoide kultur. (C) føtal markører LCT, Ass1, Blimp-1 og Fcrn fald og (D) voksne markører SIS, arg2, treh og lyz stige over tid i både proksimale og distale organoid kulturer. Fejllinjer repræsenterer SEM. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: ekstern faktor dexamethason kan moduere modning af fostrets organoider. A) genekspression af føtal markør Blimp-1 er faldet på dag 12 i kulturen hos dexamethason-behandlede organoider sammenlignet med kontrol organoider, mens både genekspression (B) og enzymaktivitet (C) af voksen markør sucrase-isomaltase (SIS) øges. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne protokol beskriver dyrkning af sene føtale tarm organoider for langvarig tid til at efterligne Suckling-til-fravænning overgang in vitro. Processen med modning svarer til tempoet in vivo og er afsluttet efter en måned i kulturen. Downstream analyse af denne kultur ved hjælp af kvantitative RNA og protein teknikker er detaljeret.
I denne protokol anvendes primære tarmceller fra E18-E20-muse embryoner. Den udviklingsmæssige fase af primære museceller, der anvendes til at generere organoider til denne protokol er særlig vigtig. Ved hjælp af tidligere udviklingsmæssige fase vil resultere i generation af tarm sfæroider, der opretholder deres specifikke føtal genekspression over en længere periode med begrænset overgang til voksne organoider15,16. Kun sene fostrets sfæroider er i stand til at transitte til voksne organoider in vitro10. For at maksimere vinduet af muligheder med hensyn til virkningen af ydre faktorer på tarm modning, tarme fra sent føtal fase anbefales og ikke tarme fra fødte unger, der har været udsat for mikrober og modermælk. Det er rapporteret, at visse bakterielle metabolitter og mælkekomponenter kan fungere som modifikatorer af modnings processen17.
For at opnå tilstrækkelige mængder af celler til at opretholde kulturen i en måned til at studere hele modning fra fødsel op til voksenalderen, mens indsamle prøver til downstream-analyser, tarme fra 6-8 embryoner bør anvendes som udgangsmateriale. Det foretrækkes at bruge embryoner fra samme udviklingsstadium til at generere kulturen. Vi anbefaler ikke at samle forskellige kuld som små forskelle i udviklingsmæssige fase kan påvirke ekspression af modnings gener.
Den protokol, der er beskrevet her, tegner sig for organoid generation fra den proksimale og distale tyndtarmen for at opretholde udviklingsmæssige træk i forskellige segmenter af tarmen. Som et alternativ kan hele tarmen bruges til at undersøge den samlede modning med hensyn til stigningen/formindske ekspression af de specifikke markører. I sidstnævnte tilfælde kan færre embryoner bruges til at isolere tarmcellerne til at starte kulturen.
Denne protokol er udviklet ved hjælp af tredimensionale organoid kulturer. Da organoider undergår en dynamisk vækst i kulturen, er det vigtigt at indsamle prøver til downstream-analyser på samme tidspunkt efter passaging. I denne protokol har vi valgt dag 3 efter passage, da det repræsenterer mellemtiden mellem to opdelinger, hvor organoider indeholder robuste knopper og lidt til ingen celledød. Et alternativt tidspunkt efter passaging kan bruges, men det skal være konsistent under hele eksperimentet. Vi anbefaler ikke dyrkning af organoider i mere end 7 dage efter en passage, da forøgelse af døds cellerne i organoid lumen kan påvirke resultaterne.
I vores eksperimenter har vi brugt dexamethason som et eksempel på en extrinsisk faktor, der er vist og bedst undersøgt i litteratur for at accelerere intestinal modning i vivo9,18. Dexamethason udøver sin virkning via både genomiske og ikke-genomiske ruter. F. eks. kan der i forbindelse med genomregulering observeres en Ronaldos store vakte stigning i SIS -mRNA-niveauerne. På et ikke-genomisk niveau iagttager vi ændringer i aktiviteten af fordøjelsesenzymer såsom trehalase. Begge er i overensstemmelse med beskrevne specifikke aspekter af dexamethason på isomaltase genaktivering og ikke-genomisk aktivering effekt på tarm børste grænse enzymer observeret i vivo19. Det faktum, at ydre faktorer, ligesom syntetiske glukokortikoider, kan modulere visse aspekter af Suckling-til-fravænning overgang i organoid kultur, på samme måde som beskrevet in vivo, yderligere etablerer muse føtale tarm organoider som en model for undersøgelse af forskellige slags modulatorer af tarm modning.
Selv om den morfologiske modning af humant tarm epitel er afsluttet i utero på svangerskabs stadium af 22 uger, den intestinale barriere funktion modnes indtil barndommen i et nært forhold til den type fodring, udvikling af mikrobiota og Immunrespons. På grund af den begrænsede tilgængelighed af humane væv på disse udviklingsmæssige stadier, den translationelle værdi af in vitro murine model ligger i muligheden for høj gennemløb skærme af faktorer, der kan modulere tarm modning, en proces bevaret blandt patte pattedyr.
Hvad vigtigere er, kan denne model med hensyn til Dyreetik inden for forskning bidrage til at raffinerer dyreforsøg, da den ikke omfatter interventioner udført på dyr. Antallet af dyr kan reduceres yderligere ved at omlægge forskningsspørgsmål til et eller to tidspunkter i kulturen, hvilket vil gøre det muligt at afprøve flere komponenter inden for én kultur.
Disclosures
="jove_content">This project was financially supported by Danone Nutricia Reserarch. I.B.R. and R.M.v.E are employees of Danone Nutricia Research.
-->Forfattere erklærer intet at afsløre.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 1:1 | Invitrogen | 12634-028 | |
| Arginase Activity Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK112-1KT | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 100x |
| BCA protein assay Kit | Fisher | 10741395 | |
| Cell lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9803S | |
| Cell Recovery Solution | Corning B.V. | 354253 | |
| Cell strainer 70µM | BD/VWR | 734-0003 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| EDTA | Merck | 10,84,18,250 | EDTA Titriplex III |
| EGF | Invitrogen | PMG8045 | |
| Ethanol | Merck | 1,00,98,31,000 | |
| Glucose solution | Sigma-Aldrich | G6918 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | 100x |
| Hepes | Invitrogen | 15630-056 | 1M |
| Isolate II RNA Mini Kit | Bioline | BIO-52073 | |
| Lactose | Sigma-Aldrich | L3625 | a-Lactose monohydrate |
| Maleic Buffer | Sigma-Aldrich | M0375 | Maleic acid |
| Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | D-(+)-Maltose monohydrate >99% |
| Matrigel | Corning B.V. | 356231 | Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix |
| Millipore water | N.A. | ||
| N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100x |
| n-Acetylcystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Noggin-conditioned media | Homemade | ||
| o-dianisidine | Sigma-Aldrich | 191248 | |
| PBS | Homemade | ||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 0,2 U/mL |
| PGO-enzyme preparation | Sigma-Aldrich | P-7119-10CAP | capsules with Peroxidase/ Glucose Oxidase |
| p-hydroxymercuribenzoate sodium | Sigma-Aldrich | 55540 | |
| Rspondin-conditioned media | Homemade | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | T5251 | D-Trehalose dihydrate |
| Tris-HCl Buffer | Homemade | ||
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
- Henning, S. J. Postnatal development: coordination of feeding, digestion, and metabolism. American Journal of Physiology. 241 (3), 199-214 (1981).
- Krasinski, S. D., et al. Transcriptional regulation of intestinal hydrolase biosynthesis during postnatal development in rats. American Journal of Physiology. 267 (4), 584-594 (1994).
- Hurwitz, R., Kretchmer, N. Development of arginine-synthesizing enzymes in mouse intestine. American Journal of Physiology. 251 (1), 103-110 (1986).
- Rath, T., et al. The immunologic functions of the neonatal Fc receptor for IgG. Journal of Clinical Immunology. 33, Suppl 1 9-17 (2013).
- Martin, M. G., Wu, S. V., Walsh, J. H. Ontogenetic development and distribution of antibody transport and Fc receptor mRNA expression in rat intestine. Digestive Diseases and Sciences. 42 (5), 1062-1069 (1997).
- Bry, L., et al. Paneth cell differentiation in the developing intestine of normal and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10335-10339 (1994).
- Muncan, V., et al. Blimp1 regulates the transition of neonatal to adult intestinal epithelium. Nauret Communications. 2, 452 (2011).
- Beaulieu, J. F., Calvert, R. Influences of dexamethasone on the maturation of fetal mouse intestinal mucosa in organ culture. Comparative Biochemistry and Physiology A Comparative Physiology. 82 (1), 91-95 (1985).
- Nanthakumar, N. N., Henning, S. J. Ontogeny of sucrase-isomaltase gene expression in rat intestine: responsiveness to glucocorticoids. American Journal of Physiology. 264 (2), 306-311 (1993).
- Navis, M., et al. Mouse fetal intestinal organoids: new model to study epithelial maturation from suckling to weaning. EMBO Reports. 20 (2), (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L., Montenegro-Miranda, P. S., Van den Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (98), e52531 (2015).
- Dahlqvist, A. Assay of intestinal disaccharidases. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 44 (2), 169-172 (1984).
- Messer, M., Dahlqvist, A. A one-step ultramicro method for the assay of intestinal disaccharidases. Anal Biochemistry. 14 (3), 376-392 (1966).
- Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
- Mustata, R. C., et al. Identification of Lgr5-independent spheroid-generating progenitors of the mouse fetal intestinal epithelium. Cell Reports. 5 (2), 421-432 (2013).
- Holscher, H. D., Bode, L., Tappenden, K. A. Human Milk Oligosaccharides Influence Intestinal Epithelial Cell Maturation In Vitro. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 296-301 (2017).
- Solomon, N. S., Gartner, H., Oesterreicher, T. J., Henning, S. J. Development of glucocorticoid-responsiveness in mouse intestine. Pediatric Research. 49 (6), 782-788 (2001).
- Kedinger, M., Simon, P. M., Raul, F., Grenier, J. F., Haffen, K. The effect of dexamethasone on the development of rat intestinal brush border enzymes in organ culture. Developmental Biology. 74 (1), 9-21 (1980).
