Summary
Bu protokol, 30 gün boyunca kültürlü fare geç fetal bağırsak organoidleri kullanarak in vitro emzirme--weaning geçiş taklit nasıl açıklanır.
Abstract
Emzirme döneminin sonunda, birçok memeli türü katı gıda sindirmek için yeteneği ile ilişkili bağırsak epitel büyük değişikliklere uğrar. Bu süreç emzirme-evlenmemiş geçiş olarak adlandırılır ve metabolik ve morfolojik ayarlamalarla el ele giden erişkin epitel ile neonatal epitelin değiştirilmesiyle sonuçlanır. Bu karmaşık gelişimsel değişiklikler bağırsak epitel hücrelerine içsel bir genetik programın sonucudur ama bir dereceye kadar dışsal faktörlerle modüle edilebilir. Geç fetal dönemden itibaren fare primer intestinal epitel hücrelerinin uzun süreli kültürü, in vitro emzirme-kesilen geçiş recapitulates. Burada, fare fetal intestinal organoid kültür için ayrıntılı bir protokol en iyi in vitro bu süreci modellemek için uygun açıklar. Biz zaman içinde emzirme--keserek geçiş ile ilişkili bağırsak fonksiyonlarının değişimini izlemek için tasarlanmış birkaç yararlı tahliller açıklar. Ayrıca, biz in vivo emzirme--weaning geçiş etkilemeyeteneğine sahip bir dışsal faktör bir örnek, in vitro emzirme--weaning geçiş zamanlaması modüle bir temsili olarak. Bu in vitro yaklaşım emzirme-evlenmemiş geçiş moleküler mekanizmaları yanı sıra bu sürecin modülatörleri çalışma için kullanılabilir. Daha da önemlisi, araştırmada hayvan etiği açısından, bu in vitro model ile in vivo modellerinin değiştirilmesi, hayvan deneylerinin iyileştirilmesine ve muhtemelen bağırsak olgunlaşma süreçlerini incelemek için hayvanların kullanımının azaltılmasına katkıda bulunmaktadır.
Introduction
Fareler ve erkekler de dahil olmak üzere birçok memeli türünde, yenidoğan bağırsağı tamamen olgun bağırsak epitelinden farklı çeşitli özelliklere sahiptir. Bu özellikler yenidoğan enterositlerin yüksek yağ ve düşük karbonhidrat içeren sütü sindirmesini ve emmesini kolaylaştırır ve büyük karbonhidrat olarak laktoz içerir. Yenidoğan intestinal epitel hücrelerinin fırça sınırı disaccharidase laktaz-phlorizin hydrolase (Lct)1 süt disaccharide laktoz sindirmek için ifade. Emzirme döneminden sonra enterositler kompleks karbonhidratlar açısından zengin ve yağ oranı düşük katı gıdaları sindirmek için uyum sağlarlar. Bu katı gıda mevcut daha karmaşık karbonhidratsindirebilirsiniz lakrasaz-izomaltase (Sis) ve trehalase (Treh), fırça sınır disaccharidase ifade bir anahtar ile kendini gösterir2. Başka bir metabolik anahtar süt arginin düşük konsantrasyonu ile ilgilidir. Arginin ihtiyacını sağlamak için, neonatal enterositler arginin biyosentez, argininosuccinate synthase-1 (Ass1), arginin insinin sentezlemek için enzim sınırlayıcı hızı ifade3. Buna karşılık, yetişkin enterositler argaz 2 (Arg2), katı gıdalarda bol olan katabolize arginin yeteneğine sahip bir enzim ifade. Ayrıca, neonatal intestinal epitel immünglobulinler için neonatal Fc reseptörü ifade eder (FcRn), hangi dolaşımiçine anne IgG emilimini aracılık 4. FcRn ifadesi emzirme---weaninggeçiş5 sırasında önemli ölçüde azalır. Farelerde Paneth hücrelerinin olgunlaşması doğum sonrası, tesadüfen mahzenlerin oluşumu ve olgunlaşması ile oluşur ve antimikrobiyal peptidlerin lizozom (Lyz) ve defensins6ekspresyonu ile karakterizedir.
Tüm bu değişiklikler emzirme---kesecik geçiş bir parçasıdır, farelerde yaş bir ay doğumdan sonra yavaş yavaş meydana gelen bir süreç, bağırsak epitel olgun yetişkin durumuna ulaştığında. Emzirme--kesesel geçiş özünde düzenlenir ve gelişimsel bağırsak tüpü nde ayarlanır. Transkripsiyon faktörü B lenfosit kaynaklı olgunlaşma protein-1 (Blimp-1) bu içsel olgunlaşma sürecinde önemli bir rol oynar7. Blimp-1 neonatal epitel ile yüksek oranda ifade edilirken, emzirme-evrme geçişi sırasında ekspresyonu azalır ve kaybolur ve bu nedenle neonatal intestinal epitelin güvenilir bir belirteci olarak kullanılabilir. İçsel bir süreç olmasına rağmen, emzirme--kesilme geçiş dış faktörler tarafından modüle edilebilir. Örneğin, kortizol sentetik analog, deksametazon, in vivo bağırsak olgunlaşmahızlandırmak için bilinmektedir8,9.
Mevcut in vitro modeller emzirme--evlendirme geçiş de dahil olmak üzere bağırsak epitelyal olgunlaşma çalışma için kullanılan, yetişkin epitel hücre hatları ve / veya yetişkin bağırsak epitel özellikleri taşıyan yetişkin organoidler kullanır. Biz son zamanlarda geç fetal bağırsak olgun izole primer bağırsak epitel hücreleri olgun ve organoidler10olarak in vitro büyürken emzirme-weaning geçiş recapitulate göstermiştir. Ayrıca bu bağırsak olgunlaşma sürecinin in vitro olarak in vivo ile aynı hızda gerçekleştiğini gösterdik. Son olarak, in vivo çalışmalar için açıklanan aynı şekilde olgunlaşma sürecini hızlandırmak için deksametazon kullandı.
Burada, fare geç fetal bağırsak organoidlerinin izolasyonu ve kültürü için kesin bir protokol uyguluyoruz. Biz uzun süreli organoid kültür ve yöntemleri in vitro emzirme--weaning geçiş izlemek için örnek toplama tercih edilen yolu açıklayın. Bu protokol, bağırsak epitelyal olgunlaşmave modülatörlerinin in vitro çalışmaları için kullanılabilir ve bu sürecin modülatörleri daha yüksek iş veri, veri artan kalite ve çeviri değeri ve hayvan kullanımının azaltılması ile sonuçlanır.
Protocol
Bu çalışma, Amsterdam Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından, hayvanların bilimsel amaçlarla kullanılması için 2010/63/EU sayılı Avrupa direktifi (ALC312) uyarınca hayvan araştırmaları hakkındaki ulusal mevzuata tam olarak uygun olarak kurulan laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına ilişkin kurumsal yönergelere uygun olarak yürütülmüştür.
1. Fetal ince bağırsak organoidlerinin izolasyonu
- Onaylanan etik düzenlemelere göre E18-E20 fetuslarını cerrahi makasla kafa keserek kurban edin.
- Ötanaziden hemen sonra, dikkatle bağırsak makas ile fetüsün alt karın açık kesmek ve tüm bağırsak kaldırın.
NOT: Uygun emzirme-sütür geçişi ve olgunlaşmaini sağlamak için gebeliğin E18 ve E20'si arasında bağırsaklarda izolasyon yapılmalıdır. - İki küçük çalgılarla bağırsağı uzat. Kılavuz olarak mide ve apandis kullanarak, ince bağırsağın proksimal ve distal kısmını kesip.
NOT: Diseksiyonu dikkatlice yapılırsa kolon izole etmek de mümkündür. Kılavuz olarak ek kullanarak parçalara ayırın (Şekil 1). - Bağırsağın uzunlamasına açılmasını sağlamak: uzunlamasına yerleştirilen bir jilet kullanarak bağırsağı düzeltin ve tıraş bıçağı boyunca çalgılar (jiletin her iki tarafındaki bir kolu) kayarak bağırsağı çekin. Daha sonra, 1 cm adet açılan bağırsak kesti.
- 10 mL buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki adet 50 mL tüp hazırlayın. İnce bağırsağın proksimal ve distal kısmını (ve varsa kolonu) tüplere ayrı ayrı aktarın. Ek farelerin bağırsaklarını parçalarken tüpleri buzüzerinde tutun. Aynı tüp içinde birlikte bir çöp tüm bağırsak parçaları toplamak.
NOT: Bir çöp genellikle 6-10 fetus vardır. Tüm fetusların bağırsakları birleştirilmelidir. Bu miktar, bağırsak kısmı başına 48 kuyuluk tasimi ile 4-8 kuyu vermeye yeterli olmalıdır. - Daha önce açıklandığı gibi organoid izolasyon ile devam11. Kısacası, buz gibi PBS ile bağırsak parçaları yıkayın, 4 °C'de 30 dakika boyunca 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ile kuluçkaya yatırın, parçaları buz gibi PBS + %10 fetal buzağı serumu (FCS) ile sert bir şekilde yıkayarak, 150 x g'de 150 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca kriptoları toplamak için filtre uygulayArak, 30 dakika boyunca dokudan ayrıştırın.
- Plaka 4-8 ekstrasellüler matris jel crypts ile kuyular, pelet boyutuna bağlı olarak, sıcak bir 48-iyi plaka. Her kuyuda ekstrasellüler matris jeliçinde asılı 20 μL'lik mahzen kullanın. Hücre dışı matriks jelinin 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde 10 dakika boyunca katılamasına izin verin.
NOT: İzole edilmiş mahzenlerin sadece %40 ila %50'sinin organoid ler oluşturduğu düşünülürse, kuyu başına 250 ila 300 organoid yoğunluğu hedeflenir. İlk gerekenden daha az ekstrasellüler matris jel ekleyin. İzole edilmiş mahzenlerin yoğunluğunun ideal olup olmadığını analiz etmek için ilk kuyuyu platting sonra mikroskop altına bakın. Gerekirse, daha fazla hücre dışı matris jel ekleyin. - Bu arada ENR orta hazırlamak: 14 mL Gelişmiş Dulbecco's Modifiye Kartal Orta / Ham's F-12 (DMEM/F12) 1:1 +++ (4-(2-hidroksitil)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES) 1x ile desteklenmektedir, L-glutamin 0.01 M ve 0.2U/mL Penisilin/Streptomisin), 4 mL Noggin klimalı ortam, 2 mL Rspondin klimalı ortam, 400 μL B27 takviyesi 1x, 200 μL N2 takviyesi 1x, 50 μL 1.25 mM n-Asetilsistein, 20 μL 0.05 μg/mL Epidermal Büyüme Faktörü (EGF).
NOT: Kolon organoidleri kültürlenirken, %50 Wnt şartlı ortam ile tamamlanır. - Kuyu başına 250 μL ENR orta ekleyin.
2. Fetal organoidlerin culturing
- Kültürlerin ortasını haftada 3 kez değiştirin. Organoidlerin olgunlaşması 1 aylık kültürden sonra sağlanır.
- Her pasajdan sonra 3. Durum başına en az 3 kuyu ve her kuyuda bulunan tüm organoidleri ölçün.
NOT: Spheroidlerin sayısı zamanla azalırken, organoid sayısı artar (Şekil 2). - Aşağıda açıklandığı gibi mekanik dissosilasyon ile organoidler haftada bir kez passage.
- Orta çıkarın ve buz gibi Gelişmiş DMEM/F12 1:1 +++1 mL ekleyin. 15 mL tüp içine organoidler ile tüm ekstrasellüler matriks jel toplayın. Organoidleri bozmak için 1000 μL filtre ucunun üstüne 200 μL'lik bir uç ve 20 kat yukarı ve aşağı pipet kullanın.
- Santrifüj 150 x g'de 5 dk 4 °C'de. Supernatant atın ve iyi başına ekstrasellüler matris jel 20 μL pelet resuspend. Genellikle fetal organoidler 1:2 oranında genişletilebilir.
- Hücre dışı matriks jel5-10 dakika katılaşmasağlar.
3. RNA ve protein düzeyinde olgunlaşma analizi
- Her pasajdan sonra her 3 günde bir kültürü 1 aylık bir süre için analiz edin (yani tam olgunlaşmanın gerçekleştiği zaman)(Şekil 3).
NOT: Fetal organoid kültür dinamiktir (Film 1) ve mekanik bozulma dan sonra organoidlerin normal rejenerasyon varyasyonönlemek için, her zaman geçişten sonra aynı gün örnek toplamak için gereklidir. -
RNA yalıtımı
- 2 μL β-mercaptoetanol ile desteklenen her kuyu için 200 μL RNA lysis tamponu kullanarak 3 adet organoid toplayın. Kuyuya RNA lysis tampon+β-mercaptoetanol ekledikten sonra, organoidli tüm hücre dışı matriks jelin rnase içermeyen 1.5mL tüpe aktarıldığından emin olun.
- Girdap şiddetle ve en fazla 1 ay süreyle -80 °C'de tutun. RNA'yı ticari olarak kullanılabilen silika spin kolon kitleri kullanarak izole edin.
- RNA kalitesini artırmak için, yıkama adımlarından sonra %80 EtOH'a 500 μL ekleyin ve sütunu ters çevirerek hafifçe karıştırın. 11.000 x g'de 2 dk santrifüj kolon tamamen kuru.
NOT: Guanidin tiyosiyanattüm izleri kurtulmak için tüp baş aşağı üç ila beş kez flicking tarafından% 80 EtOH ile tüp kapağının iç yıkama emin olun. - RNA verimini artırmak için santrifüjden önce RNase içermeyen su uyguladıktan sonra 1-2 dakika bekleyin. Sütuna gelen ilk akışı ikinci kez uygulayarak RNA'yı yeniden elayın.
NOT: Genom genelinde ifade analizinde izole RNA kalitesi yeterlidir. RNA bütünlük numarasının 8'in üzerinde olup olmadığını kontrol edin.
-
Protein izolasyonu
- Bir 15 mL tüp içine 250 μL buz gibi hücre kurtarma çözeltisi kullanarak organoidlerin 5 kuyu toplayın. Ekstrasellüler matriks jeli eritmek için en az 30 dakika buz üzerinde kuluçka (bu ekstrasellüler matriks jel protein katkısını azaltacaktır).
- Buz gibi PBS ile yıkayın. 250 μL hücre lisis tamponu ekleyin ve -80 °C'de saklayın.
NOT: Sonication sonra, örnekler enzim aktivitesini tespit etmek veya Batı Lekeler için kullanılabilir.
-
İmmünoboyama
- 15 mL'lik bir tüpe 250 μL buz gibi hücre kurtarma çözeltisi kullanarak 2 kuyu organoid toplayın. Ekstrasellüler matris jel ilerler (bu arka plan boyama azaltacaktır) buz üzerinde en az 30 dakika kuluçka. Buz gibi PBS ile yıkayın.
- 4 °C'de 1 saat boyunca %4 paraformaldegyde (PFA) 500 μL kullanarak organoidleri düzeltin. Buz gibi PBS ile yıkayın. Yayınlanan protokollere göre tüm organoid immünofluoresans veya parafin katıştırma devam edin12.
NOT: Organoidleri işlemek için plastik pasteur pipetkullanın. Bu, yapısının bozulmasını önleyecektir.
4. Dışsal faktörün (örnek olarak deksametazon) organoid olgunlaşma sürecine etkisi
- Kültürün ilk gününde, organoidlere 0.01M deksametazon ekleyin. Her zaman ortam değiştiğinde yeni deksametazon ekleyerek tüm kültür ayı boyunca organoidleri deksametazon ile kuluçkaya yatırın.
- Gen ekspresyonu analizi
- Yukarıda açıklandığı gibi RNA'yı yalıtın. Sentez, aynı zamanda, tüm örneklerin cDNA karşılaştırıldığında (tedavi ve tedavi edilmez). Tercih edilen qRTPCR yöntemi ile devam edin.
- Fetal organoidler üzerinde her yeni bir tedavi kullanıldığında en istikrarlı iki referans geni tanımlamak için GeNorm kullanın. Göreceli ifade hesaplamaları için seçilen iki referans geninin geometrik ortalamasını kullanın.
NOT: Fare fetal organoidleri için test etmek için referans genönerileri: Siklofilin, Gapdh, βactin, 36b4, Hprt, Rpl4, Rpl32, Ppib ve Tbp. - Belirli bir dışsal faktörün doğum sonrası fare fetal matürasyonunu nasıl etkilediğini araştırmak için aşağıdaki genlerin tümü değerlendirilmelidir.
- Fetal belirteçler laktaz (Lct), argininosuccinate synthase 1(Ass1),B lenfosit kaynaklı olgunlaşma proteini 1 (Blimp-1) ve neonatal Fc reseptörü(FcRn)kültürün ilk iki haftasında ekspresyonda azalma olup olmadığını kontrol edin ve kalan kültür süresi için eksiktir(Şekil 4C). Bu desenin değiştirilip değiştirilmediğini analiz edin.
- Yetişkin belirteçleri sucrase-izomaltase(Sis), arginase 2(Arg2), trehalase (Treh) ve lizozim(Lyz) iki haftalık kültürden sonra ifadede artış olup olmadığını kontrol edin (Şekil 4D). Bu desenin dış faktör tarafından değiştirilip değiştirilmediğini analiz edin.
NOT: Deksametazon fetal organoidlerin olgunlaşmasını hızlandıran ve diğer dışsal faktörleri test etmeyi amaçlayan tüm deneylerde pozitif kontrol olarak kullanılabilen dış saldir.
- Enzim aktivite analizi
- Yukarıda açıklandığı gibi protein izole. Dahlqvist ve Messer13,14tarafından yayınlanan protokollere göre bağırsak disaccharidases aktivitesini tespit edin.
- 0,625 M maleik tampon pH 6.0 hazırlayın (4 °C'de 3 ay bekletin). Bu tampon kullanarak, 0.05 M laktoz hazırlamak (lizozomal p-galaktosidaz aktivitesini inhibe etmek için stabilizatör olarak p-hidroksimercuribenzoate sodyum ekleyin); 0.05 M maltoz; 0.05 M sakaroz ve 0.05 M trehalose.
NOT: Tüm bu çözeltiler 4 °C'de 5 gün saklanabilir. Tislama hazırlarken buz üzerinde tutun. - Aşağıdaki konsantrasyonlarda çözelti elde etmek için 5,56 M glikoz çözeltisini ultra saf suile seyrelterek ölçüm standartlarını hazırlayın: 0,125 M; 0,1 M; 0.075 M; 0,05 M ve 0,025 M.
NOT: çözelti 4 °C'de en az 3 ay stabildir. - 37 °C'de 60 dk boyunca 96 kuyulu bir tabakta kuluçka:
- 30 μL organoid lysate 30μL laktoz ile
- 30 μL organoid lysate 30μL sakaroz ile
- 30 μL maltoz ile seyreltilmiş organoid lysate on kez 30 μL
- 30 μL beş kez seyreltilmiş organoid lisat ile 30 μL trehalase
- 30 μL seyreltilmemiş organoid lisat 30 μL maleik asit ile, örnek arka plan olarak
- Her glikoz standardının 30 μL
- 30 μL ultrasaf su, boş olarak
- 30 μL pozitif kontrol (optimize seyreltme; lysed fetal bağırsak dokusu laktaz aktivitesi için kontrol olarak kullanılabilirken, lysed yetişkin bağırsak dokusu sucrase, maltase ve trehalase için kontrol olarak kullanılabilir)
NOT: Örneklerin seyreltilmesi hücre lisis tamponu ile yapılmalıdır. Titreyi hazırlarken numuneleri ve plakayı buz üzerinde tutun. - Organoid lysate'de bulunan enzimlerin kendi substratlarıyla kuluçkadan sonra ürettiği glikoz miktarını belirlemek için, 37 °C'de 30 dakika boyunca her 5 dakikada 450 nm'de 200 μL PGO rengi çözeltisi ekleyin ve emiciliği ölçün.
NOT: PGO-renk çözümtaze olun. PH 7.0'da 0.5mol/L Tris-HCl tamponunda 10 U/mL glukoz-oksidaz, 2 U/mL peroksidaz ve 7.88 mmol/L o-dianisidin kullanın. Çözelti, tabağa eklendiğinde oda sıcaklığında olmalıdır. - Aktiviteyi glukoz standardına göre hesaplayın ve toplam protein miktarı için doğru (bicinchoninic asit tayı (BCA) ile belirlenir). Enzim aktivitesi μM glukoz/μg protein·min-1 olarak ifade edilmelidir (Şekil 5B).
NOT: Ticari olarak kullanılabilen arginaz aktivite istifinkitini kullanarak arginaz aktivitesini ölçün.
Representative Results
Fetal intestinal epitel hücrelerinin uzun süreli kültürü
Emzirme-keseleme geçişini in vitro olarak taklit etme protokolü, uzun süreli kültür sırasında fetal organoidlerin doğru şekilde işlenmesine bağlıdır. E18-E20 fare fetuslarından izole edilen proksimal ve distal bağırsak lar (Şekil 1)olarak ayrılır. İzolasyon üzerine epitel hücreleri hücre dışı matriks jel kubbelerinde tohumlanır (Şekil 2). Genellikle dört pasajlar ve fetal organoidler için kültür yaklaşık 28-30 gün yetişkin durumuna olgun alır. Bu süre zarfında olgunlaşmanın çeşitli aşamalarındaki hücreler toplanabilir(Şekil 3).
Emzirme-ibleme geçişinin in vitro temsilcisi downstream analizi
İzole fetal organoidlerin belirgin bir şekilde proksimal veya distal olduğunu doğrulamak için, proksimal belirteçlerin ekspresyon düzeyini karşılaştırın Bir kesim etki alanı aile üyesi 2 (Onecut2) ve GATA bağlayıcı protein 4 (Gata4) ve distal belirteçler Yağ asidi bağlayıcı protein 6 (Fabp6) ve Guanyat Siklaz Aktivator 2A (Guca2a) hem proksimal ve distal organoidi kültürleri arasında (Şekil4,B). İnvitro'da emzirme-keseleme geçişi iki gen kümesi tarafından izlenebilir: fetal (Şekil 4C) ve erişkin belirteçler(Şekil 4D). Fetal belirteçler kültür seyri sırasında kademeli olarak azalırken, erişkin belirteçlerin ekspresyonu kademeli olarak artmalıdır (Şekil 4C,D).
Emme-in vitro emzirme geçiş değiştirici olarak dışsal faktör kullanma
Bu protokolde sentetik glukokortikoid deksametazon, in vitro emzirme-kesilen geçiş değiştirme yeteneğine sahip dışsal faktör bir örnek olarak kullanılmıştır. Şekil 5'teki temsili veriler, dışsal faktörlerin etkilerinin birden fazla tahlille belirlenmek üzere en iyi şey olduğunu, çünkü mutlaka genomik olması gerekmediğini göstermektedir. Örneğin, sucrase-izomaltase durumunda hem RNA hem de protein ekspresyonu deksametazon(Şekil 5A)ile indüklenirken, trehalase ekspresyonu sadece protein düzeyinde değiştirilir. (Şekil 5B).
Şekil 1: Fare fetal ince bağırsağın izolasyonu. (A) Mide, proksimal ve distal ince bağırsak, apandis ve kolon dahil olmak üzere diseksiyon lu ve gerilmiş fetal bağırsak fotoğrafı. Siyah çizgi proksimal ve distal ince bağırsak bölmek için bağırsak kesilmesi gerektiğini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Proksimal ve distal fetal organoid kültürünün 3. Tüm görüntüler 3. Ölçek çubuğu: 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Film 1: Kültürün 4'ten 6'sına kadar fetal organoid kültür dinamiklerini gösteren temsili video. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Şekil 3: Zaman içinde bağırsak olgunlaşmaanalizi için organoid koleksiyonuşem. Proksimal ve distal fetal organoid kültürler bir ay kültüre edilmeli ve her hafta geçilmelidir. Olgunlaşma analizi için numuneler izolasyondan 3 gün sonra ve her geçişten 3 günde bir toplanmalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Proksimal ve distal fetal organoidlerde bağırsak olgunlaşma belirteçlerinin temsilcisi qRTPCR. (A) Proksimal belirteçler Onecut2 ve Gata4 çoğunlukla proksimal organoid kültürde,(B) distal belirteçler Fabp6 ve Guca2a çoğunlukla distal organoid kültürde ifade edilir. (C) Fetal belirteçler Lct, Ass1, Blimp-1 ve FcRn azalma ve (D) erişkin belirteçleri Sis, Arg2, Treh ve Lyz hem proksimal hem de distal organoid kültürlerde zaman içinde artış. Hata çubukları SEM.'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Eksternal faktör deksametazon fetal organoidlerin olgunlaşmasını modüle edebilir. (A) Fetal marker Blimp-1'in gen ekspresyonu, deksametazon lu organoidlerde kültürün 12.gününde azalırken, hem gen ekspresyonu(B)hem de erişkin belirteç sucrase-izomaltase (Sis) enzim aktivitesi (C) artmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu protokol, geç fetal intestinal organoidlerin uzun süre emzirme-kesecik li geçişini taklit etmek için tüpbebekte olduğunu açıklar. Olgunlaşma süreci vivo hızı eşittir ve kültürde bir ay sonra tamamlanır. Kantitatif RNA ve protein teknikleri kullanılarak bu kültürün downstream analizi ayrıntılı dır.
Bu protokolde E18-E20 fare embriyolarından birincil bağırsak hücreleri kullanılmaktadır. Bu protokol için organoid oluşturmak için kullanılan birincil fare hücrelerinin gelişim evresi özellikle önemlidir. Daha önceki gelişimevrelerinin kullanılması, yetişkin organoidlere sınırlı geçiş ile uzun bir süre boyunca kendi spesifik fetal gen ekspresyonunu koruyan bağırsak spheroidlerinin neslinin oluşmasına neden olacaktır15,16. Sadece geç fetal evre spheroidler in vitro10erişkin organoidlere geçiş yeteneğine sahiptir. Bağırsak olgunlaşması üzerinde dışsal faktörlerin etkisi açısından fırsat penceresini maksimize etmek için, geç fetal aşamadan bağırsaklar tavsiye edilir ve mikroplar ve anne sütüne maruz kalmış doğan yavrubağırsaklar değil. Bu bazı bakteri metabolitleri ve süt bileşenleri olgunlaşma sürecinin değiştirici olarak hareket edebilir bildirilir17.
Doğumdan yetişkinliğe kadar tüm olgunlaşmayı incelemek için kültürü bir ay boyunca korumak için yeterli miktarda hücre elde etmek için, downstream analizleri için numuneler toplarken, 6-8 embriyodan bağırsaklar başlangıç malzemesi olarak kullanılmalıdır. Kültürü oluşturmak için aynı gelişim aşamasındaki embriyoların kullanılması tercih edilir. Gelişim evresindeki küçük farklılıklar olgunlaşma genlerinin ekspresyonunu etkileyebildiği için farklı çöplerin biraraya konması önermiyoruz.
Burada açıklanan protokol, proksimal ve distal ince bağırsaktan organoid neslinbağırsakların farklı segmentlerinin gelişimsel özelliklerini korumak için hesaplanmaktadır. Alternatif olarak, tüm bağırsak belirli belirteçlerin artış / azalış ifade ile ilgili genel olgunlaşma araştırmak için kullanılabilir. İkinci durumda, daha az embriyo kültür başlatmak için bağırsak hücrelerini izole etmek için kullanılabilir.
Bu protokol üç boyutlu organoid kültürler kullanılarak geliştirilmiştir. Organoidler kültürde dinamik bir büyüme den geçerken, geçiş ten sonra aynı anda downstream analizleri için numune toplamak önemlidir. Bu protokolde, organoidlerin sağlam tomurcuklar içerdiği ve hücre ölümü içermeyen iki bölünme arasındaki orta zamanı temsil ettiği için, geçişten sonraki 3. Geçişten sonra alternatif bir zaman noktası kullanılabilir, ancak tüm deneme sırasında tutarlı olmalıdır. Biz bir geçişten sonra fazla 7 gün boyunca büyüyen organoidler önermiyoruz, organoid lümen ölüm hücrelerinin artması sonuçları etkileyebilir gibi.
Deneylerimizde deksametazon' u vivo9,18'de bağırsak olgunlaşmasını hızlandırmak için literatürde gösterilen ve en iyi şekilde incelenen dışsal bir faktöre örnek olarak kullandık. Deksametazon etkilerini hem genomik hem de genomik olmayan yollarla uygular. Örneğin, genomik regülasyon düzeyinde, Sis mRNA düzeylerinde erken bir artış görülebilir. Genomik olmayan düzeyde, trehalaz gibi sindirim enzimlerinin aktivitesinde değişiklikler gözlemliyoruz. Her ikisi de sukrase gen aktivasyonu ve in vivo19gözlenen bağırsak fırça sınır enzimleri üzerinde non-genomic aktive etkisi deksametazonun açıklanan belirli yönleri ile uygun bulunmaktadır. Aslında, sentetik glukokortikoidler gibi dışsal faktörler, organoid kültürde emzirme--sütüngeçiş bazı yönlerini modüle edebilirsiniz, benzer in vivo açıklanan benzer, daha fazla bağırsak olgunlaşma modülatörleri farklı tür araştırılması için bir model olarak fare fetal bağırsak organoidler kurar.
İnsan bağırsak epitelinin morfolojik olgunlaşması 22 haftalık gebelik evresinde rahimde tamamlanmış olsa da, bağırsak bariyeri fonksiyonu çocukluk çağına kadar beslenme tipi, mikrobiyota gelişimi ve bağışıklık yanıtı. Bu gelişim evrelerinde insan dokularının sınırlı bulunması nedeniyle, in vitro murine modelinin çeviri değeri, bağırsak olgunlaşmasını modüle edebilen faktörlerin yüksek iş yapma ekranlarının emziren memeliler.
Daha da önemlisi, araştırmada hayvan etiği açısından, bu model hayvanlar üzerinde yapılan müdahaleleri içermediği için hayvan deneylerinin iyileştirilmesine katkıda bulunabilir. Hayvan sayısı, araştırma sorularını n içinizde birden fazla bileşenin test edilmesine olanak sağlayacak bir veya iki zaman dilimine yeniden tasarlayarak daha da azaltılabilir.
Disclosures
="jove_content">This project was financially supported by Danone Nutricia Reserarch. I.B.R. and R.M.v.E are employees of Danone Nutricia Research.
-->Yazarlar ifşa etmek için hiçbir şey beyan.
Acknowledgments
Hiçbiri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 1:1 | Invitrogen | 12634-028 | |
| Arginase Activity Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK112-1KT | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 100x |
| BCA protein assay Kit | Fisher | 10741395 | |
| Cell lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9803S | |
| Cell Recovery Solution | Corning B.V. | 354253 | |
| Cell strainer 70µM | BD/VWR | 734-0003 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| EDTA | Merck | 10,84,18,250 | EDTA Titriplex III |
| EGF | Invitrogen | PMG8045 | |
| Ethanol | Merck | 1,00,98,31,000 | |
| Glucose solution | Sigma-Aldrich | G6918 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | 100x |
| Hepes | Invitrogen | 15630-056 | 1M |
| Isolate II RNA Mini Kit | Bioline | BIO-52073 | |
| Lactose | Sigma-Aldrich | L3625 | a-Lactose monohydrate |
| Maleic Buffer | Sigma-Aldrich | M0375 | Maleic acid |
| Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | D-(+)-Maltose monohydrate >99% |
| Matrigel | Corning B.V. | 356231 | Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix |
| Millipore water | N.A. | ||
| N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100x |
| n-Acetylcystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Noggin-conditioned media | Homemade | ||
| o-dianisidine | Sigma-Aldrich | 191248 | |
| PBS | Homemade | ||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 0,2 U/mL |
| PGO-enzyme preparation | Sigma-Aldrich | P-7119-10CAP | capsules with Peroxidase/ Glucose Oxidase |
| p-hydroxymercuribenzoate sodium | Sigma-Aldrich | 55540 | |
| Rspondin-conditioned media | Homemade | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | T5251 | D-Trehalose dihydrate |
| Tris-HCl Buffer | Homemade | ||
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
- Henning, S. J. Postnatal development: coordination of feeding, digestion, and metabolism. American Journal of Physiology. 241 (3), 199-214 (1981).
- Krasinski, S. D., et al. Transcriptional regulation of intestinal hydrolase biosynthesis during postnatal development in rats. American Journal of Physiology. 267 (4), 584-594 (1994).
- Hurwitz, R., Kretchmer, N. Development of arginine-synthesizing enzymes in mouse intestine. American Journal of Physiology. 251 (1), 103-110 (1986).
- Rath, T., et al. The immunologic functions of the neonatal Fc receptor for IgG. Journal of Clinical Immunology. 33, Suppl 1 9-17 (2013).
- Martin, M. G., Wu, S. V., Walsh, J. H. Ontogenetic development and distribution of antibody transport and Fc receptor mRNA expression in rat intestine. Digestive Diseases and Sciences. 42 (5), 1062-1069 (1997).
- Bry, L., et al. Paneth cell differentiation in the developing intestine of normal and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10335-10339 (1994).
- Muncan, V., et al. Blimp1 regulates the transition of neonatal to adult intestinal epithelium. Nauret Communications. 2, 452 (2011).
- Beaulieu, J. F., Calvert, R. Influences of dexamethasone on the maturation of fetal mouse intestinal mucosa in organ culture. Comparative Biochemistry and Physiology A Comparative Physiology. 82 (1), 91-95 (1985).
- Nanthakumar, N. N., Henning, S. J. Ontogeny of sucrase-isomaltase gene expression in rat intestine: responsiveness to glucocorticoids. American Journal of Physiology. 264 (2), 306-311 (1993).
- Navis, M., et al. Mouse fetal intestinal organoids: new model to study epithelial maturation from suckling to weaning. EMBO Reports. 20 (2), (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L., Montenegro-Miranda, P. S., Van den Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (98), e52531 (2015).
- Dahlqvist, A. Assay of intestinal disaccharidases. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 44 (2), 169-172 (1984).
- Messer, M., Dahlqvist, A. A one-step ultramicro method for the assay of intestinal disaccharidases. Anal Biochemistry. 14 (3), 376-392 (1966).
- Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
- Mustata, R. C., et al. Identification of Lgr5-independent spheroid-generating progenitors of the mouse fetal intestinal epithelium. Cell Reports. 5 (2), 421-432 (2013).
- Holscher, H. D., Bode, L., Tappenden, K. A. Human Milk Oligosaccharides Influence Intestinal Epithelial Cell Maturation In Vitro. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 296-301 (2017).
- Solomon, N. S., Gartner, H., Oesterreicher, T. J., Henning, S. J. Development of glucocorticoid-responsiveness in mouse intestine. Pediatric Research. 49 (6), 782-788 (2001).
- Kedinger, M., Simon, P. M., Raul, F., Grenier, J. F., Haffen, K. The effect of dexamethasone on the development of rat intestinal brush border enzymes in organ culture. Developmental Biology. 74 (1), 9-21 (1980).
