Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

En rotte halspulsåren Tryk-kontrolleret segmental ballon skade med Periadventitial Terapeutisk Application

Published: July 9, 2020 doi: 10.3791/60473

Summary

Den rotte halspulsåren ballon skade efterligner den kliniske angioplastik procedure, der udføres for at genoprette blodgennemstrømningen i aterosklerotiske fartøjer. Denne model fremkalder arteriel skade respons ved distending arteriel væg, og benægte intimal lag af endotelceller, i sidste ende forårsager remodeling og en intimal hyperplastisk reaktion.

Abstract

Hjerte-kar-sygdomme er fortsat den hyppigste årsag til død og handicap på verdensplan, dels på grund af åreforkalkning. Aterosklerotisk plak indsnævrer det luminale overfladeareal i arterierne og reducerer derved tilstrækkelig blodgennemstrømning til organer og distal væv. Klinisk, revascularization procedurer såsom ballon angioplastik med eller uden stent placering har til formål at genoprette blodgennemstrømningen. Selvom disse procedurer genopretter blodgennemstrømningen ved at reducere plakbyrden, beskadiger de karvæggen, som indleder den arterielle helbredende reaktion. Den langvarige helbredende reaktion forårsager arteriel restenosis, eller re-indsnævring, i sidste ende begrænser den langsigtede succes af disse revascularization procedurer. Derfor er prækliniske dyremodeller en integreret del af analysen af de patofysiologiske mekanismer, der driver restenosis, og giver mulighed for at teste nye terapeutiske strategier. Murine modeller er billigere og lettere at operere på end store dyremodeller. Ballon eller wire skade er de to almindeligt accepterede skade modaliteter, der anvendes i murine modeller. Især ballonskademodeller efterligner den kliniske angioplastikprocedure og forårsager tilstrækkelig skade på arterien til udvikling af restenose. Heri beskriver vi de kirurgiske detaljer for at udføre og histologisk analysere den modificerede, trykstyrede rotte halspulsåren ballon skade model. Derudover fremhæver denne protokol, hvordan lokal periadventitial anvendelse af terapi kan bruges til at hæmme neointimal hyperplasi. Endelig præsenterer vi lysark fluorescens mikroskopi som en ny tilgang til billeddannelse og visualisering af arteriel skade i tre dimensioner.

Introduction

Hjerte-kar-sygdomme (CVD) er fortsat den hyppigste dødsårsag på verdensplan1. Åreforkalkning er den underliggende årsag til de fleste CVD-relaterede sygelighed og dødelighed. Åreforkalkning er opbygningen af plak inde i arterierne, der resulterer i en indsnævret lumen, der hindrer korrekt blodperfusion til organer og distal væv2. Kliniske indgreb til behandling af svær åreforkalkning omfatter ballon angioplastik med eller uden stent placering. Denne intervention indebærer at fremme en ballon kateter til det sted, plak, og oppustning af ballonen til at komprimere plak til arteriel væg, udvidelse af luminal område. Denne procedure skader arterien, dog indlede arteriel skade svar3. Langvarig aktivering af denne skadesrespons fører til arteriel restenosis, eller re-indsnævring, sekundær til neointimal hyperplasi og fartøj remodeling. Under angioplastik den intimale lag er denuded af endotelceller, der fører til øjeblikkelig blodplade rekruttering og lokal inflammation. Lokal signalering fremkalder fænotypiske ændringer i vaskulære glatte muskelceller (VSMC) og adventitial fibroblaster. Dette fører til migration og spredning af VSMC og fibroblaster indad til lumen, hvilket fører til neointimal hyperplasi4,5. Cirkulerende stamceller og immunceller bidrager også til det samlede volumen af restenosis6. Hvor det er relevant, er narkotika-eluting stenter (DES) den nuværende standard for hæmning af restenosis7. DES hæmmer arteriel re-endothelialization, dog skabe en pro-trombotisk miljø, der kan resultere i sent in-stent trombose8. Derfor er dyremodeller integreret for både at forstå patofysiologien af restenosis og for at udvikle bedre terapeutiske strategier for at forlænge effekten af revasculariseringsprocedurer.

Flere store og små dyremodeller9 bruges til at studere denne patologi. Disse omfatter ballon-skade3,10 eller wire-skade11 af luminal side af en arterie, samt delvis ligation12 eller manchet placering13 omkring arterien. Ballonen og wire skade både denude den endotel lag af arterien, efterligne, hvad der sker klinisk efter angioplastik. Især ballon-skade modeller udnytte lignende værktøjer som i den kliniske indstilling (dvs. ballon kateter). Ballonen skade er bedst udføres i rotte modeller, som rotte arterier er en passende størrelse for kommercielt tilgængelige ballon katetre. Heri beskriver vi en trykstyret segmentåre skade, en veletableret, modificeret version af rotte halspulsåren ballon skade. Denne trykstyrede tilgang efterligner nøje den kliniske angioplastikprocedure og giver mulighed for reproducerbar neointimal hyperplasidannelse to uger efter skade14,15. Derudover resulterer denne trykkontrollerede arteriel skade i fuldstændig endotellagsgendannelse med 2 uger efter operationen16. Dette direkte kontrasterer den oprindelige ballon skade model, beskrevet af Clowes, hvor endotel lag aldrig vender tilbage til fuld dækning3.

Efter operationen, kan terapeutiske anvendes til eller rettet mod den skadede arterie gennem flere tilgange. Den metode, der er beskrevet heri, bruger periadventitial anvendelse af et lille molekyle indlejret i en pluronisk gelopløsning. Specifikt anvender vi en opløsning på 100 μM cinnamic aldehyd i 25% Pluronic-F127 gel til arterien umiddelbart efter skade for at hæmme neointimal hyperplasidannelse15. Pluronic-F127 er en ikke-giftig, termo-reversibel gel i stand til at levere lægemidler lokalt på en kontrolleret måde17. I mellemtiden arteriel skade er lokal, og derfor lokale administration giver mulighed for at teste et aktivt princip og samtidig minimere off-target effekter. Ikke desto mindre vil effektiv levering af en terapeutisk ved hjælp af denne metode afhænge af kemien i det lille molekyle eller den anvendte biologiske.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra University of North Carolina på Chapel Hill.

1. Præoperative procedurer

  1. Steriliser kirurgiske instrumenter. Autoklave alle kirurgiske instrumenter før operationen. Hvis du udfører flere operationer på samme dag, sterilisere instrumenter mellem operationer ved hjælp af en tør perle sterilisator.
  2. Forbered terapeutisk i 25% Pluronic-127 gel (fortyndet i sterilt destilleret vand).
  3. Opret et 2F Fogarty ballonkateter til insufflatoren, og placer kateterets ballonende i en 1 ml sprøjte fyldt med saltvandsopløsning.
  4. Fremkalde anæstesi ved at placere rotten i et kammer med 5% isofluran.
    1. Fjern rotten fra kammeret og registrer rottens vægt. Brug hårklipper til at barbere pels på ventral hals regionen.
    2. Placer rotten tilbage i kammeret med 5% isoflurane for at sikre induktion af anæstesi.
  5. Placer rotten liggende på en kirurgisk platform, indsætte ansigtet i næsen kegle, så rotte ansigt er mod kirurgen.
    1. Reducer inhalationsbedøvelse til 1,5% isofluran. Kontroller dybden af anæstesi ved en tå-knivspids refleks på alle fire fødder.
    2. Tape alle fire ben ned til den kirurgiske platform.
  6. Tænd for varmelampen.
  7. Injicere Atropin (0,01 mg/kg) subkutant for at reducere luftvejssekretioner.
  8. Injicere Carprofen (5 mg/kg) subkutant for profylaktisk smertebehandling. Hvis antiinflammatoriske lægemidler ikke er acceptable for forsøget, henvises til trin 3.2.2 og 3.2.3.
  9. Påfør smøremiddel øjenssement på begge øjne ved hjælp af en steril vatpind for at forhindre hornhinder i at tørre under operationen.
  10. Svaber nakken tre gange i en cirkulær bevægelse skiftevis mellem 70% ethylalkohol efterfulgt af Betadine fra midten af barberet regionen udad for at sterilisere indsnit site.
  11. Infiltrere indsnit linje s.c. med 0,25% bupivacaine.
  12. Tag sterile kirurgiske handsker på, før du håndterer sterile kirurgiske instrumenter og forsyninger.
  13. Læg alle autoklaveret kirurgiske instrumenter på et sterilt kirurgisk ark.
  14. Skær tre uafhængige 1 tommer tråde af sterile 7-0 Prolen sutur.
  15. Placer vatpinde og gaze på kirurgisk ark.
  16. Drapere rotten med et sterilt kirurgisk ark, der kun udsætter den steriliserede halsregion.
  17. Skær en ekstra lille åbning i ark, der udsætter en del af næsekeglerne. Dette vil være stedet for tape ned ballon kateter under skade.

2. Operative procedurer

  1. Under hele den kirurgiske procedure, vurdere dybden af anæstesi ved at overvåge åndedrætsfrekvensen (sats bør være konsekvent og anses for normal) samt ved tå klemme hver 15 min. Hvis åndedrætsfrekvensen stiger, eller der er en reaktion på tåklemrlingen, skal du sætte kirurgisk manipulation på pause og øge isofluranen op til 2,5%.
  2. Udsæt den almindelige halspulsåre (CCA).
    1. Lav et overfladisk, lige, langsgående halsudskæringssnit mellem rottens kæbeben. Snittet vil være ca. 1,5-2 cm i længden.
    2. Lav et snit gennem bindevævet under huden, indtil muskellaget er udsat. Forskyd spytkirtlerne under huden for at få adgang til muskelvævet.
    3. Stumpt adskille bindevævet fra musklen ved at indsætte en lukket saks mellem muskellaget og bindevævet og forsigtigt åbne saksen, mens du trækker huden opad.
  3. Dissekere de to synlige muskler (sternohyoid og sternomastoid) langs venstre side af luftrøret, indtil en tredje muskel (omohyoid), der løber vinkelret på de to overfladiske muskler er observeret.
  4. Brug pincet til at skabe et vindue, der adskiller denne vinkelret muskel (omohyoid) fra langsgående muskel (sternohyoid), der kører på toppen af luftrøret. Udfør forsigtigt denne adskillelse for at forhindre stumpe traumer på luftrøret.
  5. Nå pincet under vinkelret muskel og skæres for at adskille de to langsgående muskler og udsætte CCA.
  6. Dissekere CCA.
    1. Dissekere CCA nær bifurcation indtil den indre halspulsåren (ICA) og eksterne halspulsåren (ECA) er udsat.
    2. Dissekere den overlegne skjoldbruskkirtelarterie (STA), som grene fra ECA.
    3. Ved hjælp af de forskårne Prolene suturer, ligate STA og ECA nær deres respektive bifurcation. Lad størstedelen af suturen stå på den ene side af knuden og tag fat i hver sutur med en buet hæmostat.
    4. Afslut dissekering omkring ICA, nå pincet under og omkring ICA, og brug en ikke-knusende vaskulær klemme for at opnå distal kontrol. Klem nakkepulsåren sammen med ICA.
    5. Disseker CCA proksimal til bifurcation, der sikrer at adskille vagus nerve fra CCA.
    6. Nå pincet under og omkring CCA og brug en ikke-knusende vaskulær klemme for at opnå proksimal kontrol. Placer klemmen mindst 5 mm fra bifurcationen.
  7. Udfør ballonskade.
    1. Manøvrer de buede hæmostater, der holder hver ligated arteriegren for at afsløre bifurcationen mellem REVISIONSRETTEN og den overlegne gren.
    2. Disseker forsigtigt væv ved bifurcationen, og lav derefter et arteriotomiindsnit mellem Revisionsretten og den overlegne gren ved hjælp af mikrodissection saks.
    3. Brug en vatpind til at skubbe alt blod ud af CCA og rydde op i arteriotomi site.
    4. Indsæt det uinfladede ballonkateter gennem arteriotomien og gå videre ind i CCA, indtil den proksimale ende af ballonen er forbi bifurcationen.
    5. Tape kateter til næsen kegle, så ballonen ikke glider ud af arterien under inflationen.
    6. Langsomt puste ballonen til 5 atmosfærer af tryk og lad i CCA i 5 min at fremkalde arteriel skade. Sørg for, at trykket forbliver konstant i hele 5 minutter.
    7. Efter 5 min, deflatere ballon og forsigtigt fjerne fra CCA gennem arteriotomi.
    8. Skyl CCA ved forsigtigt at klemme på klemmen ved CCA. Fjern ikke klemmen.
    9. Ligate ECA proksimal til arteriotomi og derefter fjerne klemmer fra CCA og ICA at genoprette blodgennemstrømningen gennem CCA til ICA. Sørg for, at der ikke er synlige blødninger omkring arteriotomien, og at CCA pulserer.
  8. Påfør 100 μL terapeutisk eller pluronisk gel køretøj alene periadventitially langs den skadede CCA. Det gør du ved at anvende 50 μL på venstre side af CCA og derefter 50 μL på højre side af CCA for at sikre jævn belægning af den skadede arterie.
  9. Luk såret.
    1. Skær overskydende Prolene suturer.
    2. Luk såret ved hjælp af afbrudte 4-0 eller 6-0 vicryl lag langs bindevævet.
    3. Afslut lukke såret ved hjælp af kører 4-0 nylon sutur langs huden.

3. Procedurer efter drift

  1. Placer rotten alene i et rent bur med halvdelen af buret under en varmelampe og overvåge, indtil rotten genvinder tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal recumbency. Hold rotten i et separat bur, indtil dyret er fuldt opmærksomt og mobilt, før det overføres tilbage til deres oprindelige bur.
  2. Overvåg rotten dagligt i de næste tre dage og derefter tre gange om ugen indtil aktiv dødshjælp. Aflive ved hjælp af isofluran overdosis efterfulgt af bilateral thoracotomy som beskrevet nedenfor.
    1. Udnyt det nationale center for udskiftning raffinement & reduktion af dyr i forskning (NC3Rs) grimasse skala til at identificere postoperative smerte niveauer. Hvis et dyr ser ud til at opleve smerte eller udvikle et neurologisk kompromis, ofres straks.
    2. For dyr, der ikke modtager carprofen, administrere acetaminophen 6 mg / ml i deres drikkevand 24 timer før operationen gennem 48 timer efter operationen. Acetaminophen giver analgesi med minimal antiinflammatoriske virkninger.
    3. Alternativt kan andre analgesistrategier med minimale antiinflammatoriske virkninger anvendes, såsom buprenorphin eller buprenorphin udvidet frigivelse. Kontakt veterinærteamet på din institution.

4. Høst og billeddannelse af væv

  1. To uger efter operationen aflives rotten ved overdosis af anæstesi (5% isoflurane). Alternativt aflive rotter på et tidligere tidspunkt for at analysere de forskellige aspekter af arteriel skade respons.
    1. Når vejrtrækningen stopper udføre bilateral thoracotomy som en sekundær metode til aktiv dødshjælp.
  2. Lav et lateralt snit gennem maven, og skær derefter opad gennem mellemgulvet og ribbenene og udsætter brysthulen.
  3. Perfuse og fastsætte arterierne.
    1. Indsæt en 18 G kanyle fastgjort til en gravitationel perfusion-fiksering system gennem venstre hjertekammer. Opretholde et tilsvarende tryk mellem rotter ved at markere perfusionssystemets højde i forhold til bordpladen (120 cm højde, svarende til 91 ± 3 mmHg).
    2. Klem kanylen sammen med hjertekammeret ved hjælp af en buet hæmostat.
    3. Lav et snit i højre atrium, åbn det vaskulære kredsløb, og begynd perfusion med PBS efterfulgt af 2-4% paraformaldehyd (ca. 250 mL hver).
    4. Forbered paraformaldehyd fortyndet i PBS dagen for ofringen, eller højst natten før ofringen. Hvis du forbereder dig på offerdagen, skal du sørge for, at paraformaldehyd er afkølet til stuetemperatur, før perfusionen påbegyndes. Paraformaldehyd opbevares ved 4 °C.
  4. Efter fiksering udtrækkes venstre og højre halspulsårer og opbevares ved 4 °C i 2-4% paraformaldehyd.
  5. Arterierne overføres til 30% saccharose og opbevares natten over ved 4 °C.
  6. Efter 16-24 timer, indlejre arterierne i optimal skæretemperatur (OCT) sammensatte og fryse OCT-indlejrede arterie blokke.
    1. Tilstand arterier i OLT ved stuetemperatur i 10 min. Placer arterien parallelt med planet af cryomold fyldt med OCT, der markerer den side af cryomold, som arteriel bifurcation står over for. Snap-fryse i flydende nitrogen.
    2. Frosne blokke opbevares på lang sigt ved -80 °C.
  7. Sektion frosne blokke ved hjælp af en kryostat.
    1. Indsamle seks 5 μm tykke arterielle tværsnit pr dias, med dias 1 starter ved bifurcation.
    2. Sektion frosne blokke, indtil hyperplasi ikke længere synlige (omkring 100 dias).
  8. Hematoxylin og eosin (H&E) plet dias18
    1. Find skadesområdet ved at plette en ud af ti lysbilleder langs hele arterien fra bifurcationen (f.eks. glider 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 og 100).
    2. Stain yderligere dias omkring det sted, hvor skaden for at finde dias med peak okklusion (f.eks dias 20, 30 og 40 havde synlige hyperplasi, således pletten dias 15, 25, 35 og 45).
    3. Plette og kvantificere dias med peak okklusion og lige langt dias før og efter toppen okklusion dias (f.eks peak okklusion findes på dias 35, derefter pletten og kvantificere dias 25, 45, osv.) for i alt 3-10 dias pr rotte.
  9. For lysark fluorescensmikroskopi imaging, gemme arterier natten over ved 4 °C efter fiksering i trin 4.4.
    1. Sonde arterie med 1:500 fortynding af kanin anti-CD31 primære antistof i fortyndingsmiddel (pH 7,4) i 3 dage. Derefter counterstain arterie med 1:500 fortynding af anti-kanin Alexa Fluor 647 sekundære antistof i 2 dage19.
    2. Ryd arterien ved hjælp af iDISCO+20.
    3. Billede arterien ved hjælp af et lysark fluorescens mikroskop21. Gengiv billeder ved hjælp af software (f.eks. Imaris)19.
  10. Kvantificer neointimal hyperplasi. Udfør kvantificering på en blændet måde, hvis det er muligt.
    1. Brug ImageJ software til at spore omkredsen af intima, intern elastisk lamina (IEL), og eksterne elastiske lamina (ÅL) af en arterie på hver af de 3-10 dias bestemmes ovenfor (trin 4.8.3).
    2. Kvantificer arealet for hvert sporet område i ImageJ, og eksporter disse værdier. Intimasporet giver lumen-området, IEL-sporet giver IEL-området, og ÅL-sporet giver EEL-området.
    3. Gennemsnit de værdier, der opnås fra 3-10 dias for at få den gennemsnitlige skade (% okklusion, intima: medier (I:M) ratio, neointimal hyperplasi) pr rotte halspulsåren.
      Neointimal Hyperplasi = IEL-området - Lumen-området
      Equation 1
      Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser alle de materialer og kirurgiske værktøjer, der anvendes til at udføre denne operation. Hematoxylin & eosin (H & E) farvning af to-ugers skadet arteriel tværsnit giver mulighed for klar visualisering af neointimal hyperplasi. Figur 2 viser repræsentative billeder af H&E-farvede arterielle tværsnit af en sund, såret og behandlet arterie. Figur 2 beskriver også, hvordan man kvantificerer niveauet af neointimal hyperplasi i en skadet arterie ved hjælp af ImageJ, en udbredt billedbehandlingssoftware. Ved hjælp af denne tilgang spores neointimaens omkreds samt den interne og eksterne elastiske lamina for at kvantificere de respektive områder. Den trykregulerede segmentskademetode, vi beskriver, resulterer i et intima til medieforhold på 0,80 med en standardafvigelse på 0,29 (2 forskellige kirurger og n=11 rotter). Behandling med periadventitial anvendelse af CA i pluroniske resulterer i en hæmning af neointimal hyperplasi, som vi har vist før (61% reduktion i procent okklusion)15.

Figur 3 giver en illustration for at skabe en optimal arteriotomi ved bifurcation af ECA og STA. Endelig viser figur 4, hvordan lysark fluorescensmikroskopi kan bruges til at visualisere hele skadeområdet langs arteriens længde. CD31 farvning at visualisere endotelceller foring intimal lag kan udføres på faste arterier. Arterier kan derefter integreres i 1% agarose og ryddes ved hjælp af iDISCO+-metoden til homogenisere brydningsindekset for prøven20. Derefter kan arterierne afbildes i et lysark fluorescensmikroskop, og billederne kan gengives ved hjælp af software til kvantificering af I:M-forholdet. Ved hjælp af denne tilgang opnåede vi et I:M-forhold på 0,86, hvilket er i overensstemmelse med H&E-resultaterne.

Sektionsnummer Reference
10 afsnit 27
8 afsnit 28
6-10 afsnit 29
6 afsnit 30
5 afsnit 31
3 afsnit 32

Tabel 1. Almindeligt anvendt antal arterielle tværsnit til hyperplasi analyse.

Figure 1
Figur 1. Kirurgiske instrumenter og værktøj. I urets rækkefølge, der starter i øverste venstre hjørne af billedet: (A) Vatpinde; b)Betadinopløsning; c) gaze; d) 70 % ethylalkoholopløsning (E) 1cc sprøjter med kanyle f)Atropin; g) retractorer; bøjede papirclips, der anvendes her; (H) Rimadyl; I)Mikroserafinklemmer, der anvender pincet j) Nåleholder; (K) 4-0 nylon sutur; (L) 4-0 vicryl sutur; (M) Sterile gardiner; (N) Mayo saks; (O) Standard pincet; (P) Fine buede pincet; (Q) Mikrodissection saks; (R) Micro serrefine klemmer; (S)Fin saks; (T)T-stifter; (U)Buede hæmostater; (V) Tre 7-0 Prolen suturer skåret til ca 1-tommer; (W) 100 μL af 25% pluronic-127 gel; (X) Smørende øjenstænding; (Y) 2 fransk ballonembolikateter i steril saltvandsopløsning; (Z) Insufflator. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Hematoxylin & Eosin (H&E) farvning og analyse af rottepulsåre tværsnit. (A) Tværsnit af sunde, uskadt højre halspulsåren. IEL = Intern Elastisk Lamina, ÅL = Ekstern Elastisk Lamina. (B) Tværsnit af to uger tilskadekomne venstre halspulsåren behandlet med Pluronic-F127 køretøj. (C) Tværsnit af to ugers skadet venstre halspulsåre behandlet med 100 μM cinnamic aldehyd. Skalastang = 100 μm. (D) Sektionsskematisk over frosne arterier til kvantificering af skader. Skub 1 starter ved bifurcation og seks arterielle sektioner 5 μm i bredden er taget pr dias. Sektionsopdelning fortsætter typisk med at glide 70, da skaden normalt opstår før dette dias. (E) Tværsnit af tilskadekomne venstre halspulsåre behandlet med pluroniske køretøj (B). Den inderste sorte linje sporer neointima og afgrænser det luminale område. Den midterste gule linje afgrænser arealet af den indre elastiske lamina, eller tunica intima. Den ydre blå linje afgrænser arealet af den eksterne elastiske lamina, eller tunica adventitia. Skalalinje = 100 μm. (F) Beregninger anvendt til måling af forholdet mellem beholdere og I:M-forhold (I:M) baseret på målinger fra (E). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Arteriotomi skabelse. Illustration af trinene til at skabe en ordentlig arteriotomi, og undgå en falsk tarmkanalen. CCA = Almindelig halspulsåre, ECA = Ekstern halspulsåre, ICA = Intern halspulsåre, OA = Occipital Arterie, STA = Overlegen skjoldbruskkirtelarterie. Isolater bifurcationen mellem Revisionsrettens og STA's filialer. Disseker denne bifurcation, indtil området skifter til en lysere farve, der angiver udtynding af arteriel væg, og derefter oprette en arteriotomi ved hjælp af mikrodissection saks. Løft arteriotomi ved hjælp af fine pincet til at hjælpe med ballon indsættelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Lysark fluorescens mikroskopi at visualisere arteriel skade. Langsgående tværsnit langs længden af den fælles halspulsåre fra en 14 uger gammel Sprague Dawley rotte med en repræsentativ tværgående sektion nedenfor. Arterier er plettet med CD31 og counterstained med AF647. (A) Tværsnit af sunde, uskadt højre halspulsåren. Hvid = CD31, Grøn = Elastisk Lamina, L = Lumen, Skala bar = 200-500 μm. (B) Tværsnit af tilskadekomne, venstre halspulsåre behandlet med Pluronic-F127 køretøj. Pilespidser angiver områder af neointimal hyperplasi. (C) Intima til medier (I:M) forholdet mellem uskadt og skadet halspulsåre, med nøjagtig værdi noteret for hver gruppe (n = 1). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rottepulsåreballonskaden er en af de mest udbredte og undersøgte dyremodeller. Både den oprindelige ballon skade model3 og den modificerede trykstyrede segmentale skade variation10 har informeret mange aspekter af arteriel skade svar, der også forekommer hos mennesker, med de få begrænsninger er, at fibrin-rige thrombus sjældent udvikler sig og lokal inflammation er minimal i forhold til andre skade modeller såsom i hypercholesterolemic kanin eller svin modeller9,22. Rotterne kan også ofres på forskellige tidspunkter for at kvantificere og analysere de forskellige aspekter af arteriel skadesrespons. For eksempel kan tidligere tidspunkter bruges til at studere aspekter af tidlig reaktion på skade som cellespredning, fænotypisk skift af vaskulære glatte muskelceller og den tidlige immunrespons. Vi har tidligere vist, at leukocyt infiltration og cellespredning er maksimal mellem 3 dage og 1 uge16. Mellemliggende tidspoint kan bruges til at vurdere hastigheden af re-endotelisering. De to-ugers tid punkt er den tidligste foreslåede tidspunkt for måling neointimal hyperplasi som arterien er for det meste re-endoteliseret på dette punkt16. En væsentlig begrænsning for at oversætte denne model er, at skaden udføres i en sund arterie, mens denne procedure forekommer hos patienter med aterosklerotisk sygdom. Denne begrænsning eksisterer til dels på grund af den tidligere mangel på tilgængelige rotte åreforkalkning modeller23,24. Fremskridt inden for genredigeringsteknologier har dog gjort det muligt at udvikle pålidelige aterosklerotiske rottemodeller24, hvilket kan give ny indsigt i at studere patofysiologien af restenosis.

Forholdsvis giver hanrotter en mere robust skade end kvindelige rotter, som typisk udvikler mindre neointimal hyperplasi muligvis på grund af en beskyttende virkning af østrogen25. Den beskrevne model er dog stadig egnet til at studere arteriel heling hos kvinder. Hanrotter, der ældes 12-16 uger, giver mellem 300-400 g den mest robuste og reproducerbare neointimale dannelse. Rotter under 12 uger kan anvendes. arterierne af disse yngre rotter kan dog være for små til, at 2F-ballonen let kan komme ind i arterien afhængigt af rottestammen. Rotter, der vejer under 200 gram, bør ikke opereres med denne model, da ballonen ikke let passer gennem arteriotomien og faktisk kan rive arterien, hvis den tvinges. Derudover kan brug af rotter over 16 uger give et variabelt respons i neointimal dannelse. Forskellige rottestammer kan bruges til at udføre denne skadesmodel, hvor Sprague Dawley rotter er de oftest anvendte i hele litteraturen26. For at starte operationen får du først den korrekte justering og orientering af snitstedet i nakken ved at føle for kæbeknoglerne og bruge rottenæsen til at finde midterlinjen. Efter det første snit dissekeres vævet, indtil to langsgående muskler (sternohyoid og sternomastoid), der løber parallelt med hinanden, visualiseres. Brug nakkemusklen (massøren) som den nedre grænse for operationsvinduet mod hovedet. Adskil de parallelle muskler, der løber mod kroppen, fra hinanden, indtil en muskel, der løber vinkelret på disse to, visualiseres. Skæring af vinkelret muskel vil give mulighed for nem tilbagetrækning af de to parallelle muskler, udsætter halspulsåren. Da anatomien kan variere lidt fra hvert dyr sammen med deres placering, kan der være en mindre arteriel gren, der hviler oven på ICA. Denne mindre gren kan spændes sammen med ICA; Men når denne lille gren ikke er fastspændt, bør der ikke være problemer med at udføre proceduren. Derudover skal du sørge for at dissekere væk vagus nerve fra både ICA og CCA, før nogen fastspænding og suturering finder sted. Det er vigtigt at være blid og for at undgå nerveskader på dette punkt. Hvis dyret spjætter efter at have sat på en klemme, der kan være en reaktion fra vagusnerven, der kommer i kontakt med metalklemmen; overveje at justere klemmen.

Velsagtens den vanskeligste skridt i hele proceduren er at gøre arteriotomi. Dette skyldes, at det er muligt at lave en 'falsk' arteriotomi, og indsætte en ballon gennem denne 'falske' arteriotomi vil få ballonen til rent faktisk at køre over arterien, snarere end inde i arterien. Hvis dette sker, så gør en ny arteriotomi tættere på bifurcation på CCA er en mulig løsning, men hvis ballonen blev tvunget ind i arterien, så operationen kan ikke reddes. For at forhindre en 'falsk' arteriotomi (Figur 3), dissekere adventitial lag på ECA og STA bifurcation ved hjælp af fine pincet, indtil udseendet er betydeligt rødere end nærliggende regioner, og den del af arterien synes at stikke ud. Bagefter skal du bruge mikro-saks til at skabe arteriotomi ved hurtigt at indsætte en gren af saksen i det ryddede område på bifurcation og derefter skære. Efter at have gjort arteriotomi, skal du bruge de fine pincet til at løfte åbningen af arterien og skubbe ballonen ind i lumen. Ballonen skal glide let gennem arteriotomi og ind i CCA. Afhængigt af rottepositionering kan det være nyttigt at føre ballonen ind i CCA ved at bruge fine pincet til forsigtigt at trække opad på ydersiden af CCA, mens du guider ballonkateteret ind i CCA. Når ballonen er indsat i CCA, tape kateteret ned, så ballonen ikke forlader arterien, da det bliver oppustet.

Periadventitial anvendelse af den terapeutiske giver mulighed for lokale og rettet medicin levering kun på det sted, hvor skaden. Denne tilgang begrænser potentielle off-target effekter samt dosering begrænsninger i forhold til noget leveret systemisk af mundtlige, intraperitoneal, eller intravenøs administrationer. Pluronic-F127 er termo-reversibel, hvilket betyder, at det er flydende ved kold temperatur og geler ved stuetemperatur. Dette gør det muligt for den terapeutiske let at blive forberedt i en flydende opløsning før pluroniske geler, mens gelen kan anvendes jævnt på arterien umiddelbart efter skade. Mens toppen af CCA er let tilgængelig for effektivt at dække hele skadeområdet, bør CCA forsigtigt løftes for at belægge den nederste del af CCA. Forskerne skal dog sikre, at undersøgelsen styrkes på passende vis for at tage højde for den potentielle variation mellem behandlede dyr. Det er vigtigt at have et skøn over den forventede effektstørrelse og standardafvigelsen for resultatet for at drive undersøgelsen korrekt. Begrænsningen af den periadventitiale leveringsmetode er, at det ikke er en klinisk relevant tilgang, da en patients arterie ikke eksponeres under en angioplastik, der udføres som en perkutan procedure. Ikke desto mindre giver periadventitial anvendelse mulighed for indledende test af molekyler og biologier, der leveres lokalt til skadesstedet15,27,28,29,30.

Den nuværende standardmetode til kvantificering af neointimal hyperplasi er baseret på morfometrisk analyse af H&E-farvede dias. Den tilskadekomne halspulsåre er fysisk sektion på dias i 5 μm skiver. Disse dias farves derefter ved hjælp af H&E, og billeder tages ved hjælp af et let mikroskop. ImageJ software bruges derefter til at måle de områder og omkredse afgrænset af intima, intern lamina, og eksterne lamina. Selv om vi har rapporteret øget præcision ved hjælp af 10 dias til at kvantificere hyperplasi19, findes der ingen konsensus i litteraturen om, hvor mange dias der skal måles, med rapporteret metode, der varierer fra 3 til 10 jævnt fordelte sektioner (Tabel 1)31,32,33,34,35,36. Et I:M-forhold på 0,8 med en standardafvigelse på 0,29 (n=11) kan forventes ved hjælp af denne metode (område: 0,54-1,51). Vi og andre har tidligere rapporteret lysark fluorescens mikroskopi (LSFM) giver en ny tilgang til visualisering arteriel skade19,37. LSFM giver mulighed for billeddannelse af hele halspulsåren i x, y og z flyet. LSFM giver mulighed for optisk udskæring til at generere arteriel tværsnit til analyse, hvilket giver mere præcise skøn over hyperplasi (variationskoefficient: 28% af LSFM vs 41% af histologi) end traditionelle histologiske tilgange19,37. Som det fremgår af figur 4, kan I:M-forholdet opnået ved LSFM (0,86, n=1) sammenlignes med de resultater, vi opnåede ved klassisk histologisk analyse (0,8 ± 0,29).

Afslutningsvis opsummerer den trykregulerede segmentskade den arterielle skadesrespons, der opstår efter kliniske revasculariseringsprocedurer, hvilket gør det til en ideel model til at studere patofysiologien af restenose. Periadventitial drug ansøgning er en nyttig proof-of-concept leveringsmetode for at analysere den terapeutiske effekt af lokale lægemidler levering, og kan informere udviklingen af målrettede systemiske lægemiddel levering tilgange.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter i forbindelse med udgivelsen af dette manuskript.

Acknowledgments

N.E.B. blev støttet af et uddannelsesstipendium fra National Institute of Environmental Health Sciences (5T32ES007126-35, 2018) og et pre-ph.d.-stipendium fra American Heart Association (20PRE35120321). E.S.M.B. var en KL2-forsker delvist støttet af UNC Clinical and Translational Science Award-K12 Scholars Program (KL2TR002490, 2018) og National Heart, Lung, and Blood Institute (K01HL145354). Forfatterne takker Dr. Pablo Ariel fra UNC Microscopy Services Laboratory for at hjælpe med LSFM. Light Sheet Fluorescens Mikroskopi blev udført på Mikroskopi Services Laboratory. Microscopy Services Laboratory, Institut for Patologi og Laboratoriemedicin, støttes delvist af P30 CA016086 Cancer Center Core Support Grant til UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe Fisher 14955450
1 mL Syringe with needle BD 309626
2 French Fogarty Balloon Embolectomy Catheter Edwards LifeSciences 120602F
4-0 Ethilon (Nylon) Suture Ethicon Inc 662H
4-0 Vicryl Suture Ethicon Inc J214H
7-0 Prolene Suture Ethicon Inc 8800H
70% ethyl alcohol
Anti-Rabbit Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific A21245
Atropine Sulfate Vedco Inc for veterinary use
Cotton Swabs Puritan 806-WC
Curved Hemostats Fine Science Tools 13009-12
Fine Curved Forceps Fine Science Tools 11203-25
Fine Scissors Fine Science Tools 14090-11
Gauze Covidien 2252
IHC-Tek Diluent (pH 7.4) IHC World IW-1000
Insufflator Merit Medical IN4130
Iodine solution
Lubricating Eye Ointment Dechra for veterinary use
Mayo Scissors Fine Science Tools 14010-15
Micro Serrefines Fine Science Tools 18055-05
Microdissection Scissors Fine Science Tools 15004-08
Micro-Serrefine Clamp Applying Forceps Fine Science Tools 18057-14
Needle Holder Fine Science Tools 12003-15
Pluronic-127 (diluted in sterile water) Sigma-Aldrich P2443 25% prepared
Rabbit Anti-CD31 Abcam ab28364
Retractor Bent paper clips work well
Rimadyl (Carprofen) Zoetis Inc for veterinary use
Saline solution
Standard Forceps Fine Science Tools 11006-12
Sterile Drape Dynarex 4410
T-Pins

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Heart Association. Cardiovascular Disease: A Costly Burden for America, Projections Through 2035. American Heart Association CVD Burden Report. , (2017).
  2. Singh, R. B., Mengi, S. A., Xu, Y. J., Arneja, A. S., Dhalla, N. S. Pathogenesis of atherosclerosis: A multifactorial process. Experimental and Clinical Cardiology. 7 (1), 40-53 (2002).
  3. Clowes, A. W., Reidy, M. A., Clowes, M. M. Mechanisms of stenosis after arterial injury. Laboratory Investigation. 49 (2), 208-215 (1983).
  4. Clowes, A. W., Reidy, M. A., Clowes, M. M. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. I. Smooth muscle growth in the absence of endothelium. Laboratory Investigation. 49 (3), 327-333 (1983).
  5. Sartore, S., et al. Contribution of adventitial fibroblasts to neointima formation and vascular remodeling: from innocent bystander to active participant. Circulation Research. 89 (12), 1111-1121 (2001).
  6. Tanaka, K., et al. Circulating progenitor cells contribute to neointimal formation in nonirradiated chimeric mice. The FASEB Journal. 22 (2), 428-436 (2008).
  7. Henry, M., et al. Carotid angioplasty and stenting under protection. Techniques, results and limitations. The Journal of Cardiovascular Surgery. 47 (5), Torino. 519-546 (2006).
  8. Kounis, N. G., et al. Thrombotic responses to coronary stents, bioresorbable scaffolds and the Kounis hypersensitivity-associated acute thrombotic syndrome. Journal of Thoracic Disease. 9 (4), 1155-1164 (2017).
  9. Jackson, C. L. Animal models of restenosis. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (3), 122-130 (1994).
  10. Shears, L. L., et al. Efficient inhibition of intimal hyperplasia by adenovirus-mediated inducible nitric oxide synthase gene transfer to rats and pigs in vivo. Journal of the American College of Surgeons. 187 (3), 295-306 (1998).
  11. Takayama, T., et al. A murine model of arterial restenosis: technical aspects of femoral wire injury. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
  12. Zhang, L. N., Parkinson, J. F., Haskell, C., Wang, Y. X. Mechanisms of intimal hyperplasia learned from a murine carotid artery ligation model. Current Vascular Pharmacology. 6 (1), 37-43 (2008).
  13. Jahnke, T., et al. Characterization of a new double-injury restenosis model in the rat aorta. Journal of Endovascular Therapy. 12 (3), 318-331 (2005).
  14. Gregory, E. K., et al. Periadventitial atRA citrate-based polyester membranes reduce neointimal hyperplasia and restenosis after carotid injury in rats. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (10), 1419-1429 (2014).
  15. Buglak, N. E., Jiang, W., Bahnson, E. S. M. Cinnamic aldehyde inhibits vascular smooth muscle cell proliferation and neointimal hyperplasia in Zucker Diabetic Fatty rats. Redox Biology. 19, 166-178 (2018).
  16. Bahnson, E. S., et al. Long-term effect of PROLI/NO on cellular proliferation and phenotype after arterial injury. Free Radical Biology and Medicine. 90, 272-286 (2016).
  17. Gilbert, J. C. W., Davies, M. C., Hadgraft, J. The behaviour of Pluronic F127 in aqueous solution studied using fluorescent probes. International Journal of Pharmaceutics. 40 (1-2), 93-99 (1987).
  18. Tulis, D. A. Histological and morphometric analyses for rat carotid balloon injury model. Methods in Molecular Medicine. 139, 31-66 (2007).
  19. Buglak, N. E., et al. Light Sheet Fluorescence Microscopy as a New Method for Unbiased Three-Dimensional Analysis of Vascular Injury. Cardiovascular Research. , (2020).
  20. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  21. Ariel, P. UltraMicroscope II - A User Guide. , (2018).
  22. Touchard, A. G., Schwartz, R. S. Preclinical restenosis models: challenges and successes. Toxicologic Pathology. 34 (1), 11-18 (2006).
  23. Xiangdong, L., et al. Animal models for the atherosclerosis research: a review. Protein Cell. 2 (3), 189-201 (2011).
  24. Chen, H., Li, D., Liu, M. Novel Rat Models for Atherosclerosis. Journal of Cardiology and Cardiovascular Sceinces. 2 (2), 29-33 (2018).
  25. Xing, D., Nozell, S., Chen, Y. F., Hage, F., Oparil, S. Estrogen and mechanisms of vascular protection. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (3), 289-295 (2009).
  26. Tulis, D. A. Rat carotid artery balloon injury model. Methods in Molecular Medicine. 139, 1-30 (2007).
  27. Pellet-Many, C., et al. Neuropilins 1 and 2 mediate neointimal hyperplasia and re-endothelialization following arterial injury. Cardiovascular Research. 108 (2), 288-298 (2015).
  28. Wu, B., et al. Perivascular delivery of resolvin D1 inhibits neointimal hyperplasia in a rat model of arterial injury. Journal of Vascular Surgery. 65 (1), 207-217 (2017).
  29. Tan, J., Yang, L., Liu, C., Yan, Z. MicroRNA-26a targets MAPK6 to inhibit smooth muscle cell proliferation and vein graft neointimal hyperplasia. Scientific Reports. 7, 46602 (2017).
  30. Pearce, C. G., et al. Beneficial effect of a short-acting NO donor for the prevention of neointimal hyperplasia. Free Radical Biology and Medicine. 44 (1), 73-81 (2008).
  31. Cao, T., et al. S100B promotes injury-induced vascular remodeling through modulating smooth muscle phenotype. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (11), 2772-2782 (2017).
  32. Madigan, M., Entabi, F., Zuckerbraun, B., Loughran, P., Tzeng, E. Delayed inhaled carbon monoxide mediates the regression of established neointimal lesions. Journal of Vascular Surgery. 61 (4), 1026-1033 (2015).
  33. Khurana, R., et al. Angiogenesis-dependent and independent phases of intimal hyperplasia. Circulation. 110 (16), 2436-2443 (2004).
  34. Tsihlis, N. D., Vavra, A. K., Martinez, J., Lee, V. R., Kibbe, M. R. Nitric oxide is less effective at inhibiting neointimal hyperplasia in spontaneously hypertensive rats. Nitric Oxide. 35, 165-174 (2013).
  35. Chen, J., et al. Inhibition of neointimal hyperplasia in the rat carotid artery injury model by a HMGB1 inhibitor. Atherosclerosis. 224 (2), 332-339 (2012).
  36. Mano, T., Luo, Z., Malendowicz, S. L., Evans, T., Walsh, K. Reversal of GATA-6 downregulation promotes smooth muscle differentiation and inhibits intimal hyperplasia in balloon-injured rat carotid artery. Circulation Research. 84 (6), 647-654 (1999).
  37. Becher, T., et al. Three-Dimensional Imaging Provides Detailed Atherosclerotic Plaque Morphology and Reveals Angiogenesis after Carotid Artery Ligation. Circulation Research. 126 (5), 619-632 (2020).

Tags

Medicin Rat Halspulsåren Ballon Skade Vaskulær skade Restenosis Neointimal Hyperplasia Periadventitial Drug Delivery Arteriel Skade Response Vessel Remodeling hjerte-kar-sygdomme perifer arteriesygdom vaskulær glat muskelcelle lys ark fluorescerende mikroskopi
En rotte halspulsåren Tryk-kontrolleret segmental ballon skade med Periadventitial Terapeutisk Application
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buglak, N. E., Bahnson, E. S. M. AMore

Buglak, N. E., Bahnson, E. S. M. A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application. J. Vis. Exp. (161), e60473, doi:10.3791/60473 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter