Summary
De rat carotis slagader ballon letsel bootst de klinische angioplastiek procedure uitgevoerd om de bloedstroom in atherosclerotische vaten te herstellen. Dit model induceert de arteriële letselrespons door de arteriële wand te verwijderen en de intimale laag endotheelcellen te ontnuderen, wat uiteindelijk remodellering en een intimale hyperplastische respons veroorzaakt.
Abstract
Hart- en vaatziekten blijven wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak en invaliditeit, deels als gevolg van atherosclerose. Atherosclerotische plaque vernauwt het luminale oppervlak in slagaders, waardoor voldoende bloedtoevoer naar organen en distale weefsels wordt verminderd. Klinisch gezien zijn revascularisatieprocedures zoals ballonangioplastiek met of zonder stentplaatsing gericht op het herstellen van de bloedstroom. Hoewel deze procedures de bloedstroom herstellen door de plaquelast te verminderen, beschadigen ze de vaatwand, die de arteriële genezingsreactie initieert. De langdurige genezingsreactie veroorzaakt arteriële restenose, of opnieuw vernauwing, waardoor uiteindelijk het succes op lange termijn van deze revascularisatieprocedures wordt beperkt. Daarom zijn preklinische diermodellen integraal voor het analyseren van de pathofysiologische mechanismen die restenose veroorzaken en bieden ze de mogelijkheid om nieuwe therapeutische strategieën te testen. Murine-modellen zijn goedkoper en gemakkelijker te bedienen dan grote diermodellen. Ballon- of draadletsel zijn de twee algemeen aanvaarde letselmodaliteiten die in murine-modellen worden gebruikt. Met name ballonletselmodellen bootsen de klinische angioplastiekprocedure na en veroorzaken voldoende schade aan de slagader voor de ontwikkeling van restenose. Hierin beschrijven we de chirurgische details voor het uitvoeren en histologisch analyseren van het aangepaste, drukgecontroleerde ratcarotis slagaderballonletselmodel. Bovendien benadrukt dit protocol hoe lokale periadventitial toepassing van therapieën kan worden gebruikt om neointimale hyperplasie te remmen. Ten slotte presenteren we lichtplaatfluorescentiemicroscopie als een nieuwe benadering voor beeldvorming en visualisatie van de arteriële verwonding in drie dimensies.
Introduction
Hart- en vaatziekten (CVD) blijft wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak1. Atherosclerose is de onderliggende oorzaak van de meeste CVD-gerelateerde morbiditeit en mortaliteit. Atherosclerose is de opbouw van plaque in slagaders die resulteert in een vernauwd lumen, waardoor een goede bloedperfusie naar organen en distale weefsels wordt belemmerd2. Klinische interventies voor de behandeling van ernstige atherosclerose omvatten ballon-angioplastiek met of zonder stentplaatsing. Deze ingreep omvat het oppompen van een ballonkatheter naar de plaats van plaque en het opblazen van de ballon om de plaque naar de arteriële wand te comprimeren, waardoor het luminale gebied wordt verbreed. Deze procedure beschadigt echter de slagader en initieert de arteriële letselrespons3. Langdurige activering van deze letselrespons leidt tot arteriële restenose, of hervernauwing, secundair aan neointimale hyperplasie en remodellering van bloedvaten. Tijdens angioplastiek wordt de intimale laag gedenudeerd van endotheelcellen, wat leidt tot onmiddellijke werving van bloedplaatjes en lokale ontstekingen. Lokale signalering induceert fenotypische veranderingen in vasculaire gladde spiercellen (VSMC) en adventitiale fibroblasten. Dit leidt tot de migratie en proliferatie van VSMC en fibroblasten naar binnen naar het lumen, wat leidt tot neointimale hyperplasie4,5. Circulerende voorlopercellen en immuuncellen dragen ook bij aan het totale volume van restenose6. Indien van toepassing zijn drug-eluting stents (DES) de huidige standaard voor het remmen van restenosis7. DES remt echter arteriële re-endothelialisatie, waardoor een pro-trombotische omgeving ontstaat die kan leiden tot late in-stent trombose8. Daarom zijn diermodellen integraal voor zowel het begrijpen van de pathofysiologie van restenose als voor het ontwikkelen van betere therapeutische strategieën om de werkzaamheid van revascularisatieprocedures te verlengen.
Verschillende grote en kleine diermodellen9 worden gebruikt voor het bestuderen van deze pathologie. Deze omvatten ballonletsel3,10 of draadletsel11 van de luminale kant van een slagader, evenals gedeeltelijke ligatie12 of manchetplaatsing13 rond de slagader. De ballon- en draadletselen denudeen beide de endotheellaag van de slagader en bootsen na wat klinisch gebeurt na angioplastiek. In het bijzonder maken ballonletselmodellen gebruik van vergelijkbare hulpmiddelen als in de klinische omgeving (d.w.z. ballonkatheter). De ballonblessure kan het beste worden uitgevoerd in rattenmodellen, omdat rattenslagaders een geschikte maat zijn voor in de handel verkrijgbare ballonkatheters. Hierin beschrijven we een drukgecontroleerde segmentale arteriële verwonding, een gevestigde, gewijzigde versie van de ballonletsel van de ratcarotisslagader. Deze drukgecontroleerde benadering bootst de klinische angioplastiekprocedure nauw na en maakt reproduceerbare neointimale hyperplasievorming mogelijk twee weken na verwonding14,15. Bovendien resulteert deze drukgecontroleerde arteriële verwonding in volledige endotheellaagherstel met 2 weken na operatie16. Dit staat in schril contrast met het oorspronkelijke ballonletselmodel, beschreven door Clowes, waarbij de endotheellaag nooit terugkeert naar volledige dekking3.
Na de operatie kunnen therapeutische middelen via verschillende benaderingen op de gewonde slagader worden aangebracht of gericht. De hierin beschreven methode maakt gebruik van periadventitial toepassing van een klein molecuul ingebed in een Pluronische geloplossing. In het bijzonder brengen we een oplossing van 100 μM cinnamic aldehyde in 25% Pluronisch-F127 gel direct na verwonding aan op de slagader om neointimale hyperplasievorming te remmen15. Pluronisch-F127 is een niet-toxische, thermokeerbare gel die in staat is om geneesmiddelen lokaal op een gecontroleerde manier af te leveren17. Ondertussen is arteriële verwonding lokaal, vandaar dat de lokale overheid het mogelijk maakt om een actief principe te testen en tegelijkertijd off-target effecten te minimaliseren. Niettemin zal de effectieve levering van een therapeutisch gebruik van deze methode afhangen van de chemie van het kleine molecuul of de biologische gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill.
1. Preoperatieve procedures
- Steriliseer chirurgische instrumenten. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten voor de operatie. Als u meerdere operaties op dezelfde dag uitvoert, steriliseer dan instrumenten tussen operaties met behulp van een droge kraalsterilisator.
- Bereid therapeutisch in 25% Pluronisch-127 gel (verdund in steriel gedestilleerd water).
- Plaats een 2F Fogarty ballonkatheter op de insufflator en plaats het balloneinde van de katheter in een 1 ml spuit gevuld met zoutoplossing.
- Induceer anesthesie door de rat in een kamer met 5% isofluraan te plaatsen.
- Haal de rat uit de kamer en noteer het gewicht van de rat. Gebruik tondeuses om bont te scheren op het ventrale nekgebied.
- Plaats de rat terug in de kamer met 5% isofluraan om inductie van anesthesie te garanderen.
- Plaats de rattenpen op een chirurgisch platform en steek het gezicht in de neuskegel zodat het gezicht van de rat naar de chirurg toe is.
- Verminder inhalatie-anesthesie tot 1,5% isofluraan. Controleer de diepte van de anesthesie door een teenknijperreflex op alle vier de voeten.
- Plak alle vier de benen vast op het chirurgische platform.
- Zet de warmtelamp aan.
- Injecteer Atropine (0,01 mg/kg) subcutaan om luchtwegafscheidingen te verminderen.
- Injecteer Carprofen (5 mg/kg) subcutaan voor profylactische pijnbestrijding. Als ontstekingsremmende geneesmiddelen niet aanvaardbaar zijn voor het experiment, raadpleeg dan de stappen 3.2.2 en 3.2.3.
- Breng glijmiddel oogzalf aan op beide ogen met behulp van een steriel wattenstaafje om te voorkomen dat hoornvliezen drogen tijdens de operatie.
- Veeg de nek drie keer in een cirkelvormige beweging afwisselend tussen 70% ethylalcohol gevolgd door Betadine uit het midden van het geschoren gebied naar buiten om de incisieplaats te steriliseren.
- Infiltreer de incisielijn s.c. met 0,25% bupivacaïne.
- Trek steriele chirurgische handschoenen aan voordat u steriele chirurgische instrumenten en benodigdheden gebruikt.
- Leg alle autoclaaf chirurgische instrumenten op een steriel chirurgisch blad.
- Snijd drie onafhankelijke 1 inch strengen steriele 7-0 Prolene hechting.
- Leg wattenstaafjes en gaas op een chirurgisch laken.
- Drapeer de rat met een steriel chirurgisch laken dat alleen het gesteriliseerde nekgebied blootlegt.
- Snijd een extra kleine opening in het vel die een deel van de neuskegel blootlegt. Dit is de locatie voor het aftappen van de ballonkatheter tijdens letsel.
2. Operationele procedures
- Beoordeel tijdens de hele chirurgische procedure de diepte van de anesthesie door de ademhalingsfrequentie te controleren (de snelheid moet consistent zijn en als normaal worden beschouwd) en door elke 15 minuten teenknijpen. Als de ademhalingsfrequentie toeneemt of er een reactie is op de teenknijper, pauzeer dan chirurgische manipulatie en verhoog isofluraan tot 2,5%.
- Stel de gemeenschappelijke halsslagader (CCA) bloot.
- Maak een oppervlakkige, rechte, longitudinale halslijnincisie tussen de kaakbotten van de rat. De incisie zal ongeveer 1,5-2 cm lang zijn.
- Maak een incisie door het bindweefsel onder de huid totdat de spierlaag wordt blootgesteld. Verplaats de speekselklieren onder de huid om toegang te krijgen tot het spierweefsel.
- Scheid het bindweefsel botweg van de spier door een gesloten schaar tussen de spierlaag en het bindweefsel in te brengen en de schaar voorzichtig te openen terwijl u de huid omhoog trekt.
- Ontleed de twee zichtbare spieren (sternohyoid en sternomastoid) in de lengterichting langs de linkerkant van de luchtpijp totdat een derde spier (omohyoid) die loodrecht op de twee oppervlakkige spieren loopt, wordt waargenomen.
- Gebruik een tang om een venster te creëren dat deze loodrechte spier (omohyoid) scheidt van de longitudinale spier (sternohyoid) die bovenop de luchtpijp loopt. Voer deze scheiding voorzichtig uit om stomp trauma aan de luchtpijp te voorkomen.
- Bereik een tang onder de loodrechte spier en snijd om de twee longitudinale spieren te scheiden en de CCA bloot te leggen.
- Ontleed de CCA.
- Ontleed de CCA in de buurt van de splitsing totdat de interne halsslagader (ICA) en de uitwendige halsslagader (ERK) worden blootgesteld.
- Ontleed de superieure schildklierslagader (STA), die vertakt van de ERK.
- Gebruik de voorgesneden proleen hechtingen, ligate de STA en de ERK in de buurt van hun respectieve splitsing. Laat het grootste deel van de hechting aan één kant van de knoop en pak elke hechting met een gebogen hemostaat.
- Voltooi het ontleden rond de ICA, bereik een tang onder en rond de ICA en gebruik een niet-verpletterende vasculaire klem om distale controle te bereiken. Klem de occipitale slagader samen met de ICA.
- Ontleed de CCA proximaal aan de bifurcatie en zorg ervoor dat de nervus vagus van de CCA wordt gescheiden.
- Bereik de tang onder en rond de CCA en gebruik een niet-verpletterende vaatklem om proximale controle te bereiken. Plaats de klem minstens 5 mm van de splitsing.
- Voer ballonletsel uit.
- Manoeuvreer de gebogen hemostaten die elke gestoffeerde slagadertak vasthouden om de splitsing tussen de ERK en de superieure tak bloot te leggen.
- Ontleed voorzichtig weefsel bij de bifurcatie en maak vervolgens een arteriotomie-incisie tussen de ERK en de superieure tak met behulp van een microdissectieschaar.
- Gebruik een wattenstaafje om al het bloed uit de CCA te duwen en de arteriotomieplaats op te ruimen.
- Steek de niet-opgeblazen ballonkatheter door de arteriotomie en ga naar de CCA totdat het proximale uiteinde van de ballon voorbij de bifurcatie is.
- Tape katheter aan de neuskegel zodat de ballon niet uit de slagader glijdt tijdens de inflatie.
- Blaas de ballon langzaam op tot 5 sferen druk en laat 5 minuten in de CCA staan om arteriële letsel op te wekken. Zorg ervoor dat de druk gedurende de hele 5 minuten constant blijft.
- Laat na 5 minuten de ballon leeglopen en verwijder voorzichtig uit de CCA door de arteriotomie.
- Spoel de CCA door voorzichtig op de klem van de CCA te knijpen. Verwijder de klem niet.
- Ligate de ERK proximaal aan de arteriotomie en verwijder vervolgens de klemmen van de CCA en ICA om de bloedstroom door de CCA naar de ICA te herstellen. Zorg ervoor dat er geen zichtbare bloedingen rond de arteriotomie zijn en dat de CCA pulseert.
- Breng 100 μL therapeutisch of Pluronisch gelvoertuig alleen periadventitially langs de gewonde CCA aan. Doe dit door 50 μL aan te brengen op de linkerkant van de CCA en vervolgens 50 μL aan de rechterkant van de CCA om een gelijkmatige coating van de gewonde slagader te garanderen.
- Sluit de wondplaats.
- Snijd overtollige prolene hechtingen.
- Sluit de wond met onderbroken 4-0 of 6-0 vicryllagen langs het bindweefsel.
- Werk af met het sluiten van de wond met behulp van 4-0 nylon hechtingen langs de huid.
3. Postoperatieve procedures
- Plaats de rat alleen in een schone kooi met de helft van de kooi onder een verwarmingslamp en controleer totdat de rat weer voldoende bij bewustzijn is om de strenge ligfiets te behouden. Bewaar de rat in een aparte kooi totdat het dier volledig alert en mobiel is voordat hij terugkeert naar zijn oorspronkelijke kooi.
- Houd de rat de komende drie dagen dagelijks in de gaten en vervolgens drie keer per week tot euthanasie. Euthanasie met behulp van overdosering met isofluraan gevolgd door bilaterale thoracotomie zoals hieronder beschreven.
- Gebruik de grimasschaal van het National Centre for the Replacement Refinement & Reduction of Animals in Research (NC3R's) om postoperatieve pijnniveaus te identificeren. Als een dier pijn lijkt te ervaren of een neurologisch compromis lijkt te ontwikkelen, offer dan onmiddellijk op.
- Voor dieren die geen carprofen krijgen, dient u acetaminophen 6 mg/ml in hun drinkwater toe 24 uur vóór de operatie tot 48 uur na de operatie. Acetaminophen biedt analgesie met minimale ontstekingsremmende effecten.
- Als alternatief kunnen andere analgesiestrategieën met minimale ontstekingsremmende effecten worden gebruikt, zoals buprenorfine of buprenorfine extended release. Raadpleeg het veterinaire team van uw instelling.
4. Weefseloogst en beeldvorming
- Twee weken na de operatie euthanaseer de rat door overdosering van anesthesie (5% isofluraan). U ook ratten op een eerder tijdstip euthanaseren om de verschillende aspecten van de arteriële letselrespons te analyseren.
- Zodra de ademhaling stopt, voert u bilaterale thoracotomie uit als secundaire euthanasiemethode.
- Maak een laterale incisie door de buik en snijd vervolgens naar boven, door het middenrif en ribben, waardoor de borstholte wordt blootgelegd.
- Perfuseer en repareer de slagaders.
- Plaats een canule van 18 G die via de linkerventrikel aan een zwaartekrachtperfusiefixatiesysteem is bevestigd. Houd een gelijkwaardige druk tussen ratten door de hoogte van het perfusiesysteem ten opzichte van de benchtop te markeren (120 cm hoogte, overeenkomend met 91 ± 3 mmHg).
- Klem de canule samen met de ventrikel met behulp van een gebogen hemostaat.
- Maak een snede in het rechter atrium, open het vasculaire circuit en begin met perfusie met PBS gevolgd door 2-4% paraformaldehyde (elk ongeveer 250 ml).
- Bereid paraformaldehyde verdund in PBS op de offerdag, of hooguit de avond voor het offeren. Als u zich voorbereidt op de dag van het offeren, zorg er dan voor dat paraformaldehyde is afgekoeld tot kamertemperatuur voordat u met de perfusie begint. Bewaar paraformaldehyde bij 4 °C.
- Haal na fixatie de linker- en rechter halsslagaders eruit en bewaar bij 4 °C gedurende 2 uur in 2-4% paraformaldehyde.
- Breng de slagaders over op 30% sacharose en bewaar 's nachts bij 4 °C.
- Na 16-24 uur, embed de slagaders in optimale snijtemperatuur (OCT) compound en bevries OCT-ingebedde slagaderblokken.
- Conditie slagaders in OCT bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Plaats de slagader evenwijdig aan het vlak van de cryomold gevuld met OCT en markeer de kant van de cryomold waar de arteriële bifurcatie naar toe gericht is. Invriezen in vloeibare stikstof.
- Bewaar bevroren blokken op lange termijn bij -80 °C.
- Sectie bevroren blokken met behulp van een cryostaat.
- Verzamel zes 5 μm dikke arteriële dwarsdoorsneden per dia, waarbij dia 1 begint bij de splitsing.
- Sectie bevroren blokken tot hyperplasie niet meer zichtbaar (ongeveer 100 dia's).
- Hematoxyline & eosine (H&E)vlekkenglaasjes 18
- Zoek het letselgebied door één op de tien dia's langs de hele slagader te beitsen vanaf de splitsing (bijv. dia's 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 en 100).
- Beits extra dia's rond de plaats van verwonding om de dia met piek occlusie te vinden (bijv. dia's 20, 30 en 40 hadden zichtbare hyperplasie, dus vlekken dia's 15, 25, 35 en 45).
- Beits en kwantificeer de dia met piek occlusie en equidistant dia's voor en na de piek occlusie dia (bijv. piek occlusie gevonden op dia 35, dan vlekken en kwantificeren dia's 25, 45, enz.) voor een totaal van 3-10 dia's per rat.
- Voor beeldvorming van de lichtplaatfluorescentiemicroscopie bewaart u slagaders 's nachts bij 4 °C na fixatie in stap 4.4.
- Sondeslagader met 1:500 verdunning van konijn anti-CD31 primair antilichaam in verdunningslichaam (pH 7.4) gedurende 3 dagen. Dan counterstain slagader met 1:500 verdunning van anti-konijn Alexa Fluor 647 secundaire antilichaam gedurende 2 dagen19.
- Maak de slagader vrij met iDISCO+20.
- Beeld de slagader met behulp van een lichtplaat fluorescentie microscoop21. Afbeeldingen renderen met behulp van software (bijv. Imaris)19.
- Kwantificeer neointimale hyperplasie. Voer indien mogelijk op een geblindeerde manier kwantificering uit.
- Gebruik ImageJ-software om de omtrek van de intima, interne elastische lamina (IEL) en externe elastische lamina (PALING) van een slagader te traceren op elk van de 3-10 dia's die hierboven zijn bepaald (stap 4.8.3).
- Kwantificeer het gebied van elk getraceerd gebied in ImageJ en exporteer deze waarden. Het intima-spoor levert het lumengebied op, het IEL-spoor levert het IEL-gebied op en het PALING-spoor levert het PALING-gebied op.
- Gemiddelde van de waarden verkregen uit de 3-10 dia's om de gemiddelde verwonding te krijgen (% occlusie, intima:media (I:M) ratio, neointimale hyperplasie) per rat halsslagader.
Neointimal Hyperplasie = IEL gebied - Lumen gebied
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont alle materialen en chirurgische hulpmiddelen die worden gebruikt om deze operatie uit te voeren. Hematoxyline & eosine (H&E) kleuring van twee weken gewonde arteriële dwarsdoorsneden zorgt voor een duidelijke visualisatie van neointimale hyperplasie. Figuur 2 toont representatieve afbeeldingen van H&E-bevlekte slagaderdoorsneden van een gezonde, gewonde en behandelde slagader. Figuur 2 schetst ook hoe het niveau van neointimale hyperplasie in een gewonde slagader kan worden gekwantificeerd met behulp van ImageJ, een veelgebruikte beeldverwerkingssoftware. Met behulp van deze aanpak worden de omtrek van de neointima, evenals de interne en externe elastische lamina getraceerd om de respectieve gebieden te kwantificeren. De drukgecontroleerde segmentale letselmethode die we beschrijven resulteert in een intima-mediaverhouding van 0,80 met een standaarddeviatie van 0,29 (2 verschillende chirurgen en n=11 ratten). Behandeling met periadventitial toepassing van CA in Pluronische resultaten in een remming van neointimale hyperplasie, zoals we eerder hebben aangetoond (61% vermindering van het percentage occlusie)15.
Figuur 3 geeft een illustratie voor het creëren van een optimale arteriotomie bij de splitsing van de ERK en STA. Tot slot laat figuur 4 zien hoe lichtplaatfluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om het hele letselgebied over de lengte van de slagader te visualiseren. CD31-vlekken om de endotheelcellen langs de intimale laag te visualiseren, kunnen worden uitgevoerd op vaste slagaders. Slagaders kunnen vervolgens worden ingebed in 1% agarose en worden gewist met behulp van de iDISCO+-methode om de brekingsindex van het monster te homogeniseren20. Vervolgens kunnen de slagaders worden weergegeven in een lichtplaatfluorescentiemicroscoop en kunnen de beelden worden gerenderd met behulp van software voor het kwantificeren van de I:M-verhouding. Met deze aanpak kregen we een I:M ratio van 0,86, wat in overeenstemming is met de H&E resultaten.
| Sectienummer | Verwijzing |
| 10 secties | 27 |
| 8 secties | 28 |
| 6-10 secties | 29 |
| 6 secties | 30 |
| 5 secties | 31 |
| 3 secties | 32 |
Tabel 1. Veelgebruikt aantal arteriële dwarsdoorsneden voor hyperplasieanalyse.
Figuur 1. Chirurgische instrumenten en gereedschappen. Met de klok mee beginnend in de linkerbovenhoek van de afbeelding: (A) Wattenstaafjes; (B) Betadine-oplossing; c)gaas; D) 70% ethylalcoholoplossing; (E) 1cc spuiten met naald; f) atropine; g) oprolmechanismen; gebogen paperclips die hier worden gebruikt; H) Rimadyl; (I) Micro-serrefine klem met een tang; (J) Naaldhouder; (K) 4-0 nylon hechtdraad; (L) 4-0 vicryl hechting; (M) Steriele gordijnen; (N) Mayo schaar; (O) Standaard tang; (P) Fijne gebogen tang; (Q) Microdissectieschaar; (R) Micro serrefine klemmen; (S) Fijne schaar; (T) T-pinnen; (U) Gebogen hemostaten; (V) Drie 7-0 proleen hechtingen gesneden tot ongeveer 1-inch; (W) 100 μL van 25% pluronisch-127 gel; (X) Smerende oogzalf; (Y) 2 Franse ballon embolectomy katheter in steriele zoutoplossing; (Z) Insufflator. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Hematoxyline & Eosine (H&E) kleuring en analyse van rat halsslagader dwarsdoorsneden. (A) Dwarsdoorsnede van gezonde, niet-gewonde rechter halsslagader. IEL = Interne Elastische Lamina, PALING = Externe Elastische Lamina. (B) Doorsnede van twee weken gewonde linker halsslagader behandeld met Pluronisch-F127 voertuig. (C) Doorsnede van twee weken gewonde linker halsslagader behandeld met 100 μM cinnamic aldehyde. Schaalbalk = 100 μm. (D) Doorsnedeschema van bevroren slagaders voor het kwantificeren van letsel. Dia 1 begint bij de splitsing en per dia worden zes arteriële secties van 5 μm breed genomen. Sectioning blijft meestal 70 schuiven, omdat de verwonding meestal optreedt vóór deze dia. (E) Doorsnede van gewonde linker halsslagader behandeld met Pluronisch voertuig (B). De binnenste zwarte lijn volgt de neointima en definieert het luminale gebied. De middelste gele lijn definieert het gebied van de interne elastische lamina, of tunica intima. De buitenste blauwe lijn definieert het gebied van de externe elastische lamina, of tunica adventitia. Schaalbalk = 100 μm. (F) Berekeningen die worden gebruikt voor het meten van procentuele occlusie en intima:media (I:M) ratio op basis van metingen verkregen uit (E). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Arteriotomie creatie. Illustratie van de stappen om een goede arteriotomie te maken en een vals kanaal te vermijden. CCA = Gemeenschappelijke Halsslagader, ERK = Uitwendige Halsslagader, ICA = Interne Halsslagader, ARTOA = Occipitale Slagader, STA = Superieure Schildklierslagader. Isoleer de splitsing tussen de ERK- en STA-takken. Ontleed deze bifurcatie totdat het gebied verandert in een helderdere kleur, wat wijst op dunner worden van de arteriële wand, en maak vervolgens een arteriotomie met behulp van een microdissectieschaar. Til arteriotomie op met fijne tang om te helpen bij het inbrengen van ballonnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Lichtplaatfluorescentiemicroscopie om arteriële verwonding te visualiseren. Longitudinale dwarsdoorsneden over de lengte van de gemeenschappelijke halsslagader van een 14 weken oude Sprague Dawley rat met een representatieve dwarsdoorsnede eronder. Slagaders zijn bevlekt met CD31 en voorzien van AF647. (A) Dwarsdoorsneden van gezonde, niet-gewonde rechter halsslagader. Wit = CD31, Groen = Elastische Lamina, L = Lumen, Schaalbalk = 200-500 μm. (B) Dwarsdoorsneden van gewonde, linker halsslagader behandeld met Pluronisch-F127 voertuig. Pijlpunten geven gebieden van neointimale hyperplasie aan. (C) Intima to media (I:M) verhouding van niet-gewonde en gewonde halsslagader, met exacte waarde genoteerd voor elke groep (n=1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De rat halsslagader ballon letsel is een van de meest gebruikte en bestudeerde restenosis diermodellen. Zowel het oorspronkelijke ballonletselmodel3 als de gewijzigde drukgecontroleerde segmentale verwondingsvariatie10 hebben veel aspecten van de arteriële letselrespons die ook bij mensen optreedt, geïnformeerd, met als enkele beperkingen dat fibrinerijke trombus zich zelden ontwikkelt en lokale ontsteking minimaal is in vergelijking met andere letselmodellen zoals bij hypercholesterolemische konijnen- of varkensmodellen9,22. De ratten kunnen ook op verschillende tijdstippen worden geofferd om de verschillende aspecten van de arteriële letselrespons te kwantificeren en te analyseren. Eerdere tijdspunten kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om aspecten van vroege respons op letsel te bestuderen, zoals celproliferatie, fenotypische schakelaar van vasculaire gladde spiercellen en de vroege immuunrespons. We hebben eerder aangetoond dat leukocyteninfiltratie en celproliferatie maximaal zijn tussen 3 dagen en 1 week16. Tussenliggende tijdspunten kunnen worden gebruikt om de snelheid van re-endothelialisatie te beoordelen. Het tijdspunt van twee weken is het vroegst voorgestelde tijdspunt voor het meten van neointimale hyperplasie, omdat de slagader meestal opnieuw wordt ge-endothelialiseerd op dit punt16. Een belangrijke beperking voor het vertalen van dit model is dat de verwonding wordt uitgevoerd in een gezonde slagader, terwijl deze procedure optreedt bij patiënten met een atherosclerotische ziekte. Deze beperking bestaat gedeeltelijk als gevolg van het eerdere gebrek aan beschikbare rat atherosclerose modellen23,24. De vooruitgang in genbewerkingstechnologieën heeft echter de ontwikkeling mogelijk gemaakt van betrouwbare atherosclerotische rattenmodellen24, die nieuwe inzichten kunnen opleveren bij het bestuderen van de pathofysiologie van restenose.
Relatief gezien veroorzaken mannelijke ratten een robuustere verwonding dan vrouwelijke ratten, die meestal minder neointimale hyperplasie ontwikkelen, mogelijk als gevolg van een beschermend effect van oestrogeen25. Het beschreven model is echter nog steeds geschikt om arteriële genezing bij vrouwen te bestuderen. Mannelijke ratten die 12-16 weken ouder worden, tussen 300-400 g, leveren de meest robuuste en reproduceerbare neointimale vorming op. Ratten jonger dan 12 weken mogen worden gebruikt; de slagaders van deze jongere ratten kunnen echter te klein zijn om de 2F-ballon gemakkelijk in de slagader te laten komen, afhankelijk van de rattenstam. Ratten met een gewicht van minder dan 200 gram mogen niet met dit model worden geopereerd, omdat de ballon niet gemakkelijk door de arteriotomie past en de slagader daadwerkelijk kan scheuren als deze wordt geforceerd. Bovendien kan het gebruik van ratten ouder dan 16 weken een variabele respons opleveren bij neointimale vorming. Verschillende rattenstammen kunnen worden gebruikt voor het uitvoeren van dit verwondingsmodel, waarbij Sprague Dawley-ratten de meest gebruikte zijn in de literatuur26. Om de operatie te starten, krijgt u eerst de juiste uitlijning en oriëntatie van de incisieplaats in de nek door te voelen voor de kaakbotten en de rattenneus te gebruiken om de middellijn te vinden. Na de eerste incisie ontleedt u het weefsel totdat twee longitudinale spieren (sternohyoid en sternomastoid) die parallel aan elkaar lopen, worden gevisualiseerd. Gebruik de nekspier (masseter) als ondergrens van het operatievenster, richting het hoofd. Scheid de parallelle spieren, die naar het lichaam lopen, van elkaar totdat een spier die loodrecht op deze twee loopt, wordt gevisualiseerd. Het snijden van de loodrechte spier zorgt voor een gemakkelijke terugtrekking van de twee parallelle spieren, waardoor de halsslagader wordt blootgelegd. Omdat de anatomie enigszins kan verschillen van elk dier, samen met hun positionering, kan er een kleine arteriële tak zijn die bovenop de ICA rust. Deze kleine tak kan samen met de ICA worden geklemd; wanneer deze kleine tak echter niet wordt geklemd, mogen er geen problemen zijn met het uitvoeren van de procedure. Zorg er bovendien voor dat u de nervus vagus van zowel de ICA als de CCA ontleedt voordat er klemmen en hechten plaatsvindt. Het is belangrijk om voorzichtig te zijn en zenuwschade op dit punt te voorkomen. Als het dier trilt na het aanbrengen van een klem die een reactie kan zijn van de nervus vagus die in contact komt met de metalen klem; overweeg de klem aan te passen.
Misschien wel de lastigste stap van de hele procedure is het maken van de arteriotomie. Dit komt omdat het mogelijk is om een 'valse' slagader te maken, en het inbrengen van een ballon door deze 'valse' slagader zorgt ervoor dat de ballon daadwerkelijk boven de slagader loopt, in plaats van in de slagader. Als dit gebeurt, is het maken van een nieuwe slagader dichter bij de splitsing bij de CCA een mogelijke oplossing, maar als de ballon in de slagader werd geforceerd, is de operatie mogelijk niet te redden. Om een 'valse' arteriotomie (figuur 3) te voorkomen, ontleedt u de adventitiale laag op de ERK en STA-bifurcatie met fijne tang totdat het uiterlijk aanzienlijk roder is dan nabijgelegen gebieden, en dat deel van de slagader lijkt uit te steken. Gebruik daarna de microschaar om de arteriotomie te maken door snel een pen van de schaar in het geruimde gebied bij de bifurcatie te steken en vervolgens te snijden. Gebruik na het maken van de arteriotomie de fijne tang om de opening van de slagader op te tillen en duw de ballon in het lumen. De ballon moet gemakkelijk door de arteriotomie en in de CCA glijden. Afhankelijk van de positie van de rat kan het nuttig zijn om de ballon naar de CCA te leiden door fijne tangen te gebruiken om voorzichtig naar boven te trekken aan de buitenkant van de CCA terwijl u de ballonkatheter naar de CCA leidt. Nadat de ballon in de CCA is gestoken, plakt u de katheter naar beneden zodat de ballon de slagader niet verlaat terwijl deze wordt opgeblazen.
Periadventitial toepassing van de therapeutische maakt lokale en gerichte drug levering alleen op de plaats van letsel. Deze aanpak beperkt potentiële off-target effecten en doseerbeperkingen in vergelijking met iets dat systemisch wordt geleverd door orale, intraperitoneale of intraveneuze toedieningen. Pluronisch-F127 is thermoomkeerbaar, wat betekent dat het vloeibaar is bij koude temperatuur en gels bij kamertemperatuur. Hierdoor kan het therapeutische eenvoudig worden bereid in een vloeibare oplossing vóór de Pluronische gels, terwijl de gel direct na de verwonding gelijkmatig op de slagader kan worden aangebracht. Terwijl de bovenkant van de CCA gemakkelijk toegankelijk is om het hele schadegebied effectief te dekken, moet de CCA voorzichtig worden opgetild om het onderste deel van de CCA te bedekken. Onderzoekers moeten er echter voor zorgen dat de studie op de juiste manier wordt uitgevoerd om rekening te houden met mogelijke variabiliteit tussen behandelde dieren. Het is belangrijk om een schatting te hebben van de verwachte effectgrootte en de standaardafwijking van de uitkomst om de studie op de juiste manier van stroom te voorzien. De beperking van de periadventitiale toedieningsmethode is dat het geen klinisch relevante benadering is, omdat de slagader van een patiënt niet wordt blootgesteld tijdens een angioplastiek, die wordt uitgevoerd als een percutane procedure. Niettemin maakt periadventitial toepassing het mogelijk om moleculen en biologische producten die lokaal op de plaats van verwonding wordengeleverd,voorlopig te testen15,27,28,29,30.
De huidige standaardmethode voor het kwantificeren van neointimale hyperplasie is gebaseerd op morfometrische analyse van H&E-bevlekte dia's. De gewonde halsslagader wordt fysiek in plakjes van 5 μm op dia's gesneden. Deze dia's worden vervolgens bevlekt met behulp van H&E en foto's worden gemaakt met behulp van een lichtmicroscoop. ImageJ-software wordt vervolgens gebruikt om de gebieden en perimeters te meten die worden afgebakend door de intima, interne lamina en externe lamina. Hoewel we een verhoogde precisie hebben gerapporteerd met behulp van 10 dia's om hyperplasie19te kwantificeren , bestaat er in de literatuur geen consensus over het aantal dia 's dat moet worden gemeten, met gerapporteerde methodologie variërend van 3 tot 10 gelijkmatig verdeelde secties (Tabel 1)31,32,33,34,35,36. Een I:M-ratio van 0,8 met een standaarddeviatie van 0,29 (n=11) kan met deze methodologie worden verwacht (Bereik: 0,54-1,51). Wij en anderen hebben eerder gemeld licht blad fluorescentie microscopie (LSFM) biedt een nieuwe benadering van het visualiseren van arteriële letsel19,37. LSFM maakt beeldvorming van de hele halsslagader in het x-, y- en z-vlak mogelijk. LSFM maakt optische snijden mogelijk om arteriële dwarsdoorsneden voor analyse te genereren, wat nauwkeurigere schattingen van hyperplasie oplevert (variatiecoëfficiënt: 28% door LSFM versus 41% door histologie) dan traditionele histologische benaderingen19,37. Zoals te zien is in figuur 4, is de I:M-ratio verkregen door LSFM (0,86, n=1) vergelijkbaar met de resultaten die we verkregen door klassieke histologische analyse (0,8 ± 0,29).
Kortom, de drukgecontroleerde segmentale verwonding herkapitaliseert de arteriële letselrespons die optreedt na klinische revascularisatieprocedures, waardoor het een ideaal model is voor het bestuderen van de pathofysiologie van restenose. Periadventitial drug toepassing is een nuttige proof-of-concept levering methode voor het testen van de therapeutische werkzaamheid van de lokale drug levering, en kan informeren ontwikkeling van gerichte systemische drug levering benaderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn met betrekking tot de publicatie van dit manuscript.
Acknowledgments
N.E.B. werd ondersteund door een opleidingsbeurs van het National Institute of Environmental Health Sciences (5T32ES007126-35, 2018) en een predoctorale fellowship van de American Heart Association (20PRE35120321). E.S.M.B. was een KL2-geleerde die gedeeltelijk werd ondersteund door het UNC Clinical and Translational Science Award-K12 Scholars Program (KL2TR002490, 2018) en het National Heart, Lung, and Blood Institute (K01HL145354). De auteurs danken Dr. Pablo Ariel van het UNC Microscopy Services Laboratory voor zijn hulp bij LSFM. Light Sheet Fluorescence Microscopy werd uitgevoerd in het Microscopy Services Laboratory. Het Microscopy Services Laboratory, Department of Pathology and Laboratory Medicine, wordt gedeeltelijk ondersteund door P30 CA016086 Cancer Center Core Support Grant aan het UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | Fisher | 14955450 | |
| 1 mL Syringe with needle | BD | 309626 | |
| 2 French Fogarty Balloon Embolectomy Catheter | Edwards LifeSciences | 120602F | |
| 4-0 Ethilon (Nylon) Suture | Ethicon Inc | 662H | |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon Inc | J214H | |
| 7-0 Prolene Suture | Ethicon Inc | 8800H | |
| 70% ethyl alcohol | |||
| Anti-Rabbit Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21245 | |
| Atropine Sulfate | Vedco Inc | for veterinary use | |
| Cotton Swabs | Puritan | 806-WC | |
| Curved Hemostats | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Fine Curved Forceps | Fine Science Tools | 11203-25 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Gauze | Covidien | 2252 | |
| IHC-Tek Diluent (pH 7.4) | IHC World | IW-1000 | |
| Insufflator | Merit Medical | IN4130 | |
| Iodine solution | |||
| Lubricating Eye Ointment | Dechra | for veterinary use | |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| Micro-Serrefine Clamp Applying Forceps | Fine Science Tools | 18057-14 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 12003-15 | |
| Pluronic-127 (diluted in sterile water) | Sigma-Aldrich | P2443 | 25% prepared |
| Rabbit Anti-CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Retractor | Bent paper clips work well | ||
| Rimadyl (Carprofen) | Zoetis Inc | for veterinary use | |
| Saline solution | |||
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Sterile Drape | Dynarex | 4410 | |
| T-Pins |
References
- American Heart Association. Cardiovascular Disease: A Costly Burden for America, Projections Through 2035. American Heart Association CVD Burden Report. , (2017).
- Singh, R. B., Mengi, S. A., Xu, Y. J., Arneja, A. S., Dhalla, N. S. Pathogenesis of atherosclerosis: A multifactorial process. Experimental and Clinical Cardiology. 7 (1), 40-53 (2002).
- Clowes, A. W., Reidy, M. A., Clowes, M. M. Mechanisms of stenosis after arterial injury. Laboratory Investigation. 49 (2), 208-215 (1983).
- Clowes, A. W., Reidy, M. A., Clowes, M. M. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. I. Smooth muscle growth in the absence of endothelium. Laboratory Investigation. 49 (3), 327-333 (1983).
- Sartore, S., et al. Contribution of adventitial fibroblasts to neointima formation and vascular remodeling: from innocent bystander to active participant. Circulation Research. 89 (12), 1111-1121 (2001).
- Tanaka, K., et al. Circulating progenitor cells contribute to neointimal formation in nonirradiated chimeric mice. The FASEB Journal. 22 (2), 428-436 (2008).
- Henry, M., et al. Carotid angioplasty and stenting under protection. Techniques, results and limitations. The Journal of Cardiovascular Surgery. 47 (5), Torino. 519-546 (2006).
- Kounis, N. G., et al. Thrombotic responses to coronary stents, bioresorbable scaffolds and the Kounis hypersensitivity-associated acute thrombotic syndrome. Journal of Thoracic Disease. 9 (4), 1155-1164 (2017).
- Jackson, C. L. Animal models of restenosis. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (3), 122-130 (1994).
- Shears, L. L., et al. Efficient inhibition of intimal hyperplasia by adenovirus-mediated inducible nitric oxide synthase gene transfer to rats and pigs in vivo. Journal of the American College of Surgeons. 187 (3), 295-306 (1998).
- Takayama, T., et al. A murine model of arterial restenosis: technical aspects of femoral wire injury. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Zhang, L. N., Parkinson, J. F., Haskell, C., Wang, Y. X. Mechanisms of intimal hyperplasia learned from a murine carotid artery ligation model. Current Vascular Pharmacology. 6 (1), 37-43 (2008).
- Jahnke, T., et al. Characterization of a new double-injury restenosis model in the rat aorta. Journal of Endovascular Therapy. 12 (3), 318-331 (2005).
- Gregory, E. K., et al. Periadventitial atRA citrate-based polyester membranes reduce neointimal hyperplasia and restenosis after carotid injury in rats. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (10), 1419-1429 (2014).
- Buglak, N. E., Jiang, W., Bahnson, E. S. M. Cinnamic aldehyde inhibits vascular smooth muscle cell proliferation and neointimal hyperplasia in Zucker Diabetic Fatty rats. Redox Biology. 19, 166-178 (2018).
- Bahnson, E. S., et al. Long-term effect of PROLI/NO on cellular proliferation and phenotype after arterial injury. Free Radical Biology and Medicine. 90, 272-286 (2016).
- Gilbert, J. C. W., Davies, M. C., Hadgraft, J. The behaviour of Pluronic F127 in aqueous solution studied using fluorescent probes. International Journal of Pharmaceutics. 40 (1-2), 93-99 (1987).
- Tulis, D. A. Histological and morphometric analyses for rat carotid balloon injury model. Methods in Molecular Medicine. 139, 31-66 (2007).
- Buglak, N. E., et al. Light Sheet Fluorescence Microscopy as a New Method for Unbiased Three-Dimensional Analysis of Vascular Injury. Cardiovascular Research. , (2020).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Ariel, P. UltraMicroscope II - A User Guide. , (2018).
- Touchard, A. G., Schwartz, R. S. Preclinical restenosis models: challenges and successes. Toxicologic Pathology. 34 (1), 11-18 (2006).
- Xiangdong, L., et al. Animal models for the atherosclerosis research: a review. Protein Cell. 2 (3), 189-201 (2011).
- Chen, H., Li, D., Liu, M. Novel Rat Models for Atherosclerosis. Journal of Cardiology and Cardiovascular Sceinces. 2 (2), 29-33 (2018).
- Xing, D., Nozell, S., Chen, Y. F., Hage, F., Oparil, S. Estrogen and mechanisms of vascular protection. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (3), 289-295 (2009).
- Tulis, D. A. Rat carotid artery balloon injury model. Methods in Molecular Medicine. 139, 1-30 (2007).
- Pellet-Many, C., et al. Neuropilins 1 and 2 mediate neointimal hyperplasia and re-endothelialization following arterial injury. Cardiovascular Research. 108 (2), 288-298 (2015).
- Wu, B., et al. Perivascular delivery of resolvin D1 inhibits neointimal hyperplasia in a rat model of arterial injury. Journal of Vascular Surgery. 65 (1), 207-217 (2017).
- Tan, J., Yang, L., Liu, C., Yan, Z. MicroRNA-26a targets MAPK6 to inhibit smooth muscle cell proliferation and vein graft neointimal hyperplasia. Scientific Reports. 7, 46602 (2017).
- Pearce, C. G., et al. Beneficial effect of a short-acting NO donor for the prevention of neointimal hyperplasia. Free Radical Biology and Medicine. 44 (1), 73-81 (2008).
- Cao, T., et al. S100B promotes injury-induced vascular remodeling through modulating smooth muscle phenotype. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (11), 2772-2782 (2017).
- Madigan, M., Entabi, F., Zuckerbraun, B., Loughran, P., Tzeng, E. Delayed inhaled carbon monoxide mediates the regression of established neointimal lesions. Journal of Vascular Surgery. 61 (4), 1026-1033 (2015).
- Khurana, R., et al. Angiogenesis-dependent and independent phases of intimal hyperplasia. Circulation. 110 (16), 2436-2443 (2004).
- Tsihlis, N. D., Vavra, A. K., Martinez, J., Lee, V. R., Kibbe, M. R. Nitric oxide is less effective at inhibiting neointimal hyperplasia in spontaneously hypertensive rats. Nitric Oxide. 35, 165-174 (2013).
- Chen, J., et al. Inhibition of neointimal hyperplasia in the rat carotid artery injury model by a HMGB1 inhibitor. Atherosclerosis. 224 (2), 332-339 (2012).
- Mano, T., Luo, Z., Malendowicz, S. L., Evans, T., Walsh, K. Reversal of GATA-6 downregulation promotes smooth muscle differentiation and inhibits intimal hyperplasia in balloon-injured rat carotid artery. Circulation Research. 84 (6), 647-654 (1999).
- Becher, T., et al. Three-Dimensional Imaging Provides Detailed Atherosclerotic Plaque Morphology and Reveals Angiogenesis after Carotid Artery Ligation. Circulation Research. 126 (5), 619-632 (2020).
