Una lesione segmentale del palloncino segmentale controllato dalla pressione carotide del ratto con applicazione terapeutica periadventitiale
Summary
La lesione del palloncino dell’arteria carotide del ratto imita la procedura di angioplastica clinica eseguita per ripristinare il flusso sanguigno nei vasi aterosclerotici. Questo modello induce la risposta alle lesioni arteriose tendendo la parete arteriosa e denudendo lo strato intimale delle cellule endoteliali, causando infine rimodellamento e una risposta iperplastica intimale.
Abstract
Le malattie cardiovascolari rimangono la principale causa di morte e disabilità in tutto il mondo, in parte a causa dell’aterosclerosi. La placca aterosclerotica restringe la superficie luminare nelle arterie riducendo così un adeguato flusso sanguigno agli organi e ai tessuti distali. Clinicamente, le procedure di rivascolarizzazione come l’angioplastica del palloncino con o senza posizionamento dello stent mirano a ripristinare il flusso sanguigno. Sebbene queste procedure ristabiliscono il flusso sanguigno riducendo il carico della placca, danneggiano la parete del vaso, che avvia la risposta di guarigione arteriosa. La risposta curativa prolungata causa la restenosi arteriosa, o restringimento, limitando infine il successo a lungo termine di queste procedure di rivascolarizzazione. Pertanto, i modelli animali preclinici sono parte integrante per l’analisi dei meccanismi fisiopatologici che guidano la restenosi e offrono l’opportunità di testare nuove strategie terapeutiche. I modelli Murine sono più economici e facili da usare rispetto ai grandi modelli animali. Le lesioni da palloncino o filo sono le due modalità di lesione comunemente accettate utilizzate nei modelli murini. I modelli di lesioni da palloncino in particolare imitano la procedura di angioplastica clinica e causano danni adeguati all’arteria per lo sviluppo della restenosi. Qui descriviamo i dettagli chirurgici per eseguire e analizzare istologicamente il modello modificato di lesione del palloncino carotide del ratto controllato a pressione. Inoltre, questo protocollo evidenzia come l’applicazione periadventitiale locale delle terapie può essere utilizzata per inibire l’iperplasia neointimica. Infine, presentiamo la microscopia a fluorescenza della scheda luminosa come un nuovo approccio per l’imaging e la visualizzazione della lesione arteriosa in tre dimensioni.
Introduction
Le malattie cardiovascolari (CVD) rimangono la principale causa di morte in tutto ilmondo 1. L’aterosclerosi è la causa alla base della morbilità e della mortalità legate alla CVD. L’aterosclerosi è l’accumulo di placca all’interno delle arterie che si traduce in un lume ristretto, ostacolando una corretta perfusione sanguigna agli organi e ai tessuti distali2. Gli interventi clinici per il trattamento dell’aterosclerosi grave includono angioplastica a palloncino con o senza posizionamento dello stent. Questo intervento prevede l’avanzamento di un catetere a palloncino verso il sito della placca e l’gonfiamento del palloncino per comprimere la placca alla parete arteriosa, allargando l’area luminare. Questa procedura danneggia l’arteria, tuttavia, avviando la risposta alle lesioni arteriosa3. L’attivazione prolungata di questa risposta alle lesioni porta alla restenosi arteriosa, o restringimento, secondaria all’iperplasia neointimica e al rimodellamento dei vasi. Durante l’angioplastica lo strato intimale viene denudato di cellule endoteliali che portano al reclutamento immediato delle piastrine e all’infiammazione locale. La segnalazione locale induce cambiamenti fenotipiche nelle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) e nei fibroblasti accidentali. Ciò porta alla migrazione e alla proliferazione di VSMC e fibroblasti verso l’interno verso il lume, portando all’iperplasia neointimica4,5. Le cellule progenitrici circolanti e le cellule immunitarie contribuiscono anche al volume complessivo della restenosi6. Se del caso, gli stent di eluizione dei farmaci (DES) sono lo standard attuale per inibire la restenosi7. Il DES inibisce la rialtelializzazione arteriosa, tuttavia, creando così un ambiente pro-trombotico che può causare trombosi late in-stent8. Pertanto, i modelli animali sono parte integrante sia per comprendere la fisiopatologia della restenosi, sia per sviluppare migliori strategie terapeutiche per prolungare l’efficacia delle procedure di rivascolarizzazione.
Diversi modelli animali grandi epiccoli 9 sono utilizzati per studiare questa patologia. Questi includono la lesione delpalloncino 3,10 o lesione delfilo 11 del lato luminare di un’arteria, così come la legatura parziale12 o il posizionamento del polsino13 intorno all’arteria. Il palloncino e la lesione del filo denudano entrambi lo strato endoteliale dell’arteria, imitando ciò che accade clinicamente dopo l’angioplastica. In particolare, i modelli di lesioni da palloncino utilizzano strumenti simili a quello dell’ambiente clinico (ad esempio, catetere a palloncino). La lesione del palloncino è meglio eseguita nei modelli di ratti, poiché le arterie del ratto sono di dimensioni appropriate per i cateteri a palloncino disponibili in commercio. Qui descriviamo una lesione arteriosa segmentale controllata dalla pressione, una versione ben consolidata e modificata della lesione del palloncino dell’arteria carotide del ratto. Questo approccio controllato dalla pressione imita da vicino la procedura di angioplastica clinica e consente la formazione di iperplasia neointimica riproducibile due settimane dopo lalesione 14,15. Inoltre, questa lesione arteriosa controllata dalla pressione si traduce in un completo ripristino dello strato endoteliale entro 2 settimane dall’interventochirurgico 16. Ciò contrasta direttamente con il modello originale di lesione del palloncino, descritto da Clowes, dove lo strato endoteliale non ritorna mai alla coperturacompleta 3.
Dopo l’intervento chirurgico, le terapie possono essere applicate o dirette verso l’arteria ferita attraverso diversi approcci. Il metodo descritto nel presente documento utilizza l’applicazione periadivenzionale di una piccola molecola incorporata in una soluzione di gel pluronico. Nello specifico, applichiamo una soluzione di aldeide cinnamica da 100 μM nel gel Pluronic-F127 al 25% all’arteria immediatamente dopo la lesione per inibire la formazione di iperplasia neointimica15. Pluronic-F127 è un gel atossico e termo-reversibile in grado di fornire farmaci localmente in modo controllato17. Nel frattempo, le lesioni arteriosa sono locali, quindi l’amministrazione locale consente di testare un principio attivo riducendo al minimo gli effetti fuori bersaglio. Tuttavia, l’erogazione efficace di una terapia utilizzando questo metodo dipenderà dalla chimica della piccola molecola o del biologico utilizzato.
Protocol
Representative Results
Discussion
La lesione del palloncino dell’arteria carotide di ratto è uno dei modelli animali di restenosi più ampiamente utilizzati e studiati. Sia la lesione del palloncino originalemodello 3 che la variazione di lesione segmentale controllata dalla pressionemodificata 10 hanno informato molti aspetti della risposta alle lesioni arteriosa che si verifica anche nell’uomo, con le pochelimitazioniche il trombo ricco di fibrina si sviluppa raramente e l’infiamm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
N.E.B. è stato supportato da una borsa di formazione del National Institute of Environmental Health Sciences (5T32ES007126-35, 2018) e da una borsa di studio pre-dottorato dell’American Heart Association (20PRE35120321). E.S.M.B. è stato uno studioso KL2 parzialmente supportato dall’UNC Clinical and Translational Science Award-K12 Scholars Program (KL2TR002490, 2018) e dal National Heart, Lung, and Blood Institute (K01HL145354). Gli autori ringraziano il Dott. Pablo Ariel del Laboratorio servizi di microscopia UNC per l’assistenza con LSFM. La microscopia a fluorescenza a fogli leggeri è stata eseguita presso il Laboratorio servizi di microscopia. Il Laboratorio servizi di microscopia, Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio, è supportato in parte da P30 CA016086 Cancer Center Core Support Grant all’UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.
Materials
| 1 mL Syringe | Fisher | 14955450 | |
| 1 mL Syringe with needle | BD | 309626 | |
| 2 French Fogarty Balloon Embolectomy Catheter | Edwards LifeSciences | 120602F | |
| 4-0 Ethilon (Nylon) Suture | Ethicon Inc | 662H | |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon Inc | J214H | |
| 7-0 Prolene Suture | Ethicon Inc | 8800H | |
| 70% ethyl alcohol | |||
| Anti-Rabbit Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21245 | |
| Atropine Sulfate | Vedco Inc | for veterinary use | |
| Cotton Swabs | Puritan | 806-WC | |
| Curved Hemostats | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Fine Curved Forceps | Fine Science Tools | 11203-25 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Gauze | Covidien | 2252 | |
| IHC-Tek Diluent (pH 7.4) | IHC World | IW-1000 | |
| Insufflator | Merit Medical | IN4130 | |
| Iodine solution | |||
| Lubricating Eye Ointment | Dechra | for veterinary use | |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| Micro-Serrefine Clamp Applying Forceps | Fine Science Tools | 18057-14 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 12003-15 | |
| Pluronic-127 (diluted in sterile water) | Sigma-Aldrich | P2443 | 25% prepared |
| Rabbit Anti-CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Retractor | Bent paper clips work well | ||
| Rimadyl (Carprofen) | Zoetis Inc | for veterinary use | |
| Saline solution | |||
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Sterile Drape | Dynarex | 4410 | |
| T-Pins |
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