Summary
Råtta halsartären ballong skada efterliknar kliniska angioplastik förfarande utförs för att återställa blodflödet i åderförkalkning fartyg. Denna modell inducerar kranskärlens skada svar genom att distending kranskärlens väggen, och denuding intimal skiktet av endotelceller, i slutändan orsakar ombyggnad och en intimal hyperplastic svar.
Abstract
Hjärt-kärlsjukdom är fortfarande den främsta dödsorsaken och funktionshinder över hela världen, delvis på grund av åderförkalkning. Atherosclerotic plack smalnar av den luminala ytan i artärer och minskar därmed adekvat blodflöde till organ och distala vävnader. Kliniskt, revascularization förfaranden såsom ballong angioplastik med eller utan stent placering syftar till att återställa blodflödet. Även om dessa förfaranden återupprättar blodflödet genom att minska plackbördan, skadar de kärlväggen, som initierar kranskärlens helande svar. Det långvariga helande svaret orsakar kranskärlens restenosis, eller re-narrowing, vilket i slutändan begränsar den långsiktiga framgången för dessa revascularization förfaranden. Därför är prekliniska djurmodeller integrerade för att analysera de patofysiologiska mekanismerna som driver restenosis, och ger möjlighet att testa nya terapeutiska strategier. Murinmodeller är billigare och lättare att använda än stora djurmodeller. Ballong- eller trådskada är de två allmänt accepterade skademodaliteterna som används i murinmodeller. Ballong skada modeller i synnerhet efterlikna den kliniska angioplastik förfarandet och orsaka adekvat skada på artären för utveckling av restenosis. Häri beskriver vi de kirurgiska detaljerna för att utföra och histologiskt analysera den modifierade, tryckstyrda råtta halsartären ballong skada modell. Dessutom belyser detta protokoll hur lokala periadventitial tillämpning av terapier kan användas för att hämma neointimal hyperplasi. Slutligen presenterar vi ljusplåt fluorescensmikroskopi som ett nytt tillvägagångssätt för bildbehandling och visualisering av kranskärlens skada i tre dimensioner.
Introduction
Hjärt-kärlsjukdom (CVD) är fortfarande den främsta dödsorsaken i världen1. Åderförkalkning är den underliggande orsaken till de flesta CVD-relaterade sjuklighet och dödlighet. Åderförkalkning är uppbyggnaden av plack inuti artärer som resulterar i en smal lumen, vilket hindrar korrekt blodperfusion till organ och distalavävnader 2. Kliniska interventioner för behandling av svår åderförkalkning inkluderar ballong angioplastik med eller utan stent placering. Denna intervention innebär att föra en ballongkateter till plackplatsen och blåsa upp ballongen för att komprimera plack till artärväggen och bredda luminalområdet. Detta förfarande skadar artären, men initierar kranskärlens skaderespons3. Långvarig aktivering av denna skada svar leder till kranskärlens restenosis, eller re-narrowing, sekundärt till neointimal hyperplasi och fartyg ombyggnad. Under angioplastik denuderas intimal skiktet av endotelceller som leder till omedelbar trombocyt rekrytering och lokal inflammation. Lokala signalering inducerar fenotypiska förändringar i vaskulär glatt muskelceller (VSMC) och oavsiktliga fibroblaster. Detta leder till migration och spridning av VSMC och fibroblaster inåt till lumen, vilket leder till neointim hyperplasi4,5. Cirkulerande stamceller och immunceller bidrar också till den totala volymen av restenosis6. I tillämpliga fall är läkemedelsutspänande stentar (DES) den nuvarande standarden för att hämma restenosis7. DES hämmar kranskärlens återendotelisering, vilket skapar en pro-trombotisk miljö som kan resultera i sen in-stent trombos8. Därför är djurmodeller integrerade för att både förstå restosis patofysiologi och för att utveckla bättre terapeutiska strategier för att förlänga effekten av revaskulariseringsprocedurer.
Flera stora och små djurmodeller9 används för att studera denna patologi. Dessa inkluderar ballongskada3,10 eller trådskada11 på den luminala sidan av en artär, liksom partiell ligatur12 eller manschettplacering13 runt artären. Ballong och tråd skada båda förnekar endotel skiktet i gatan, härma vad som uppstår kliniskt efter angioplastik. I synnerhet använder ballongskada modeller liknande verktyg som i den kliniska inställningen (dvs. ballongkateter). Ballongskadan utförs bäst i råttmodeller, eftersom råttartärer är en lämplig storlek för kommersiellt tillgängliga ballongkatetrar. Häri beskriver vi en tryck-kontrollerade segmental kranskärlens skada, en väletablerad, modifierad version av råtta halsartären ballong skada. Detta tryckkontrollerade tillvägagångssätt efterliknar noggrant det kliniska angioplastikförfarandet och möjliggör reproducerbar neointimal hyperplasibildning två veckor efterskada 14,15. Dessutom resulterar denna tryckkontrollerade kranskärlsskada i fullständig endotel skikt restaurering av 2 veckor efter kirurgi16. Detta kontrasterar direkt den ursprungliga ballongskadamodellen, beskriven av Clowes, där det endotelskiktet aldrig återgår till full täckning3.
Efter operationen kan terapier appliceras på eller riktas mot den skadade artären genom flera tillvägagångssätt. Metoden som beskrivs häri använder periadventitial tillämpning av en liten molekyl inbäddad i en pluronic gel lösning. Specifikt applicerar vi en lösning på 100 μM cinnamic aldehyd i 25% Pluronic-F127 gel på artären omedelbart efter skada för att hämma neointimal hyperplasi bildas15. Pluronic-F127 är en giftfri, termo-reversibel gel som kan leverera läkemedel lokalt på ett kontrollerat sätt17. Samtidigt är arteriell skada lokal, därför tillåter lokal administration att testa en aktiv princip samtidigt som man minimerar off-target effekter. Ändå kommer effektiv leverans av en terapeutisk med denna metod att bero på kemin hos den lilla molekylen eller den biologiska som används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of North Carolina at Chapel Hill.
1. Preoperativa förfaranden
- Sterilisera kirurgiska instrument. Autoklav alla kirurgiska instrument före operationen. Om du utför flera operationer samma dag steriliserar du instrument mellan operationer med hjälp av en torr pärlsterilisator.
- Förbered terapeutiskt i 25% Pluronic-127 gel (utspädd i sterilt destillerat vatten).
- Ställ upp en 2F Fogarty ballongkateter på insufflatorn och placera kateterns ballongslut i en 1 ml spruta fylld med saltlösning.
- Framkalla anestesi genom att placera råttan i en kammare med 5% isofluran.
- Ta bort råttan från kammaren och registrera råttans vikt. Använd hårklippare för att raka pälsen på ventralhalsregionen.
- Placera råttan tillbaka i kammaren med 5% isofluran för att säkerställa induktion av anestesi.
- Placera råttans supin på en kirurgisk plattform och sätt in ansiktet i näskonen så att råttansiktet är mot kirurgen.
- Minska inandningsanestesi till 1,5% isofluran. Kontrollera anestesidjupet med en tå-nypa reflex på alla fyra fötterna.
- Tejpa fast alla fyra benen på operationsplattformen.
- Sätt på värmelampan.
- Injicera atropin (0,01 mg/kg) subkutant för att minska luftvägarna sekret.
- Injicera Carprofen (5 mg/kg) subkutant för profylaktisk smärtlindring. Om antiinflammatoriska läkemedel inte är acceptabla för experimentet, se steg 3.2.2 och 3.2.3.
- Applicera smörjmedel ögonsalva på båda ögonen med en steril bomullspinne för att förhindra hornhinnorna från att torka under operationen.
- Svabba nacken tre gånger i en cirkulär rörelse som växling mellan 70% etylalkohol följt av Betadine från mitten av den rakade regionen utåt för att sterilisera snittplatsen.
- Infiltrera snittlinjen s.c. med 0,25% bupivakain.
- Ta på dig sterila kirurgiska handskar innan du hanterar sterila kirurgiska instrument och förnödenheter.
- Lägg ut alla autoklaverade kirurgiska instrument på ett sterilt kirurgiskt ark.
- Skär tre oberoende 1 tums strängar av steril 7-0 Prolene sutur.
- Placera bomullspinne och gasväv på kirurgiskt ark.
- Drapera råttan med ett sterilt kirurgiskt ark som bara exponerar den steriliserade nackregionen.
- Skär en extra liten öppning i ark som exponerar en del av munstyckskonen. Detta kommer att vara platsen för att tejpa ner ballongkatetern under skada.
2. Operativa förfaranden
- Under hela kirurgiska ingreppet, bedöma djupet av anestesi genom att övervaka andningshastigheten (hastigheten bör vara konsekvent och anses normal) samt genom tå nypa var 15: e minut. Om andningshastigheten ökar eller det finns ett svar på tå nypa, pausa sedan kirurgisk manipulation och öka isofluran upp till 2,5%.
- Exponera den gemensamma halspulsådern (CCA).
- Gör ett ytligt, rakt, längsgående halsringningssnitt mellan råttans käkben. Snitten blir cirka 1,5-2 cm långa.
- Gör ett snitt genom bindväven under huden tills muskelskiktet exponeras. Förskjut salivkörtlarna under huden för att komma åt muskelvävnaden.
- Separera bindväven från muskeln genom att sätta in sluten sax mellan muskelskiktet och bindväven och försiktigt öppna saxen samtidigt som huden drar uppåt.
- Dissekera de två synliga musklerna (sternohyoid och sternomastoid) längs luftstrupens vänstra sida tills en tredje muskel (omohyoid) som löper vinkelrätt mot de två ytliga musklerna observeras.
- Använd tång för att skapa ett fönster som skiljer denna vinkelräta muskel (omohyoid) från den längsgående muskeln (sternohyoid) som löper ovanpå luftstrupen. Utför försiktigt denna separation för att förhindra trubbigt trauma mot luftstrupen.
- Nå tång under den vinkelräta muskeln och skär för att separera de två längsgående musklerna och exponera CCA.
- Dissekera CCA.
- Dissekera CCA nära bifurcationen tills den inre halspulsådern (ICA) och den yttre halspulsådern (ECA) exponeras.
- Dissekera den överlägsna sköldkörtelartären (STA), som förgrenar sig från revisionsrätten.
- Använd de förskurna Prolene suturerna, ligate STA och revisionsrätten nära deras respektive bifurcation. Lämna majoriteten av suturen på ena sidan av knuten och ta tag i varje sutur med en krökt hemostat.
- Avsluta dissekering runt ICA, nå tång under och runt ICA och använd en icke-krossande kärlklämma för att uppnå distal kontroll. Spänn fast occipitalartären tillsammans med ICA.
- Dissekera CCA-proximalt till bifurcation, vilket säkerställer att separera vagusnerven från CCA.
- Nå tång under och runt CCA och använd en icke-krossande kärlklämma för att uppnå proximal kontroll. Placera klämman minst 5 mm från bifurcationen.
- Utför ballongskador.
- Manövrera de böjda hemostaterna som håller varje ligaterad artärgren för att exponera bifurcationen mellan revisionsrätten och överlägsen gren.
- Dissekera försiktigt vävnaden vid bifurcationen och gör sedan ett arteriotomi snitt mellan revisionsrätten och överlägsen gren med hjälp av mikrodissektion sax.
- Använd en bomullspinne för att trycka ut allt blod ur CCA och städa upp arteriotomy-platsen.
- För in den oinflerade ballongkatetern genom arteriotomin och avancera in i CCA tills ballongens proximala ände är förbi bifurcationen.
- Tejpkateter till näskonen så att ballongen inte glider ut ur artären under uppblåsning.
- Blås långsamt upp ballongen till 5 atmosfärer av tryck och lämna i CCA i 5 min för att inducera arteriell skada. Se till att trycket förblir konstant under hela 5 minuter.
- Efter 5 min, töm ballongen och försiktigt ta bort från CCA genom arteriotomy.
- Spola CCA genom att försiktigt klämma på klämman vid CCA. Ta inte bort klämman.
- Ligate ECA proximal till arteriotomy och sedan ta bort klämmorna från CCA och ICA för att återställa blodflödet genom CCA till ICA. Se till att det inte finns någon synlig blödning runt arteriotomin och att CCA pulserar.
- Applicera 100 μL terapeutiskt eller pluronic gel fordon ensamt periadventitially längs den skadade CCA. Gör det genom att applicera 50 μL på vänster sida av CCA och sedan 50 μL på höger sida av CCA för att säkerställa jämn beläggning av den skadade artären.
- Stäng sårstället.
- Skär överflödiga Prolene suturer.
- Stäng såret med avbrutna 4-0 eller 6-0 vicrylskikt längs bindväven.
- Avsluta såret med att köra 4-0 nylon sutur längs huden.
3. Postoperativa förfaranden
- Placera råttan ensam i en ren bur med halva buret under en värmelampa och övervaka tills råttan återfår tillräckligt medvetande för att upprätthålla sternal kumbency. Håll råttan i en separat bur tills djuret är helt alert och rörligt innan du överför tillbaka till deras ursprungliga bur.
- Övervaka råttan dagligen under de kommande tre dagarna och sedan tre gånger i veckan fram till dödshjälp. Avliva med isofluranöverdos följt av bilaterala thoracotomy som beskrivs nedan.
- Använd National Centre for the Replacement Refinement & Reduction of Animals in Research (NC3Rs) grimaceskala för att identifiera postoperativa smärtnivåer. Om något djur verkar uppleva smärta eller utveckla någon neurologisk kompromiss, offer omedelbart.
- För djur som inte får karprofen, administrera acetaminophen 6 mg/ml i deras dricksvatten 24 timmar före operation genom 48 h efter operationen. Acetaminophen ger analgesi med minimala antiinflammatoriska effekter.
- Alternativt kan andra analgesistrategier med minimala antiinflammatoriska effekter användas, såsom buprenorfin eller buprenorfinförlängd frisättning. Kontakta veterinärteamet på din institution.
4. Vävnadsskörd och avbildning
- Två veckor efter operationen avlivar råttan genom överdosering av anestesi (5% isofluran). Alternativt avliva råttor vid en tidigare tidpunkt för att analysera de olika aspekterna av arteriell skada svar.
- När andningen slutar utföra bilaterala thoracotomy som en sekundär metod för dödshjälp.
- Gör ett sidosnitt genom buken och skär sedan uppåt, genom membranet och revbenen, vilket exponerar brösthålan.
- Granska och fixa artärerna.
- Sätt in en 18 G kanyl fäst vid ett gravitationsperfusionsfixeringssystem genom vänster ventrikel. Håll motsvarande tryck mellan råttor genom att markera perfusionssystemets höjd i förhållande till bänkskivan (120 cm höjd, motsvarande 91 ± 3 mmHg).
- Kläm ihop kanylen med ventrikeln med hjälp av en böjd hemostat.
- Gör ett snitt i rätt atrium, öppna kärlkretsen och börja perfusion med PBS följt av 2-4% paraformaldehyd (ca 250 mL vardera).
- Förbered paraformaldehyd utspädd i PBS offerdagen, eller högst natten före offer. Om du förbereder dig på offerdagen, se till att paraformaldehyd har svalnat till rumstemperatur innan du börjar perfusionen. Förvara paraformaldehyd vid 4 °C.
- Efter fixering, extrahera vänster och höger halsartärer och lagra vid 4 °C i 2 h i 2-4% paraformaldehyd.
- Överför artärer till 30% sackaros och förvara över natten vid 4 °C.
- Efter 16-24 h, bädda in artärerna i optimal skärtemperatur (OCT) förening och frysa OCT-inbäddade artärblock.
- Kondition artärer i OCT vid rumstemperatur i 10 min. Placera artären parallellt med kryomoldens plan fylld med OCT, vilket markerar den sida av kryomolden som artärbifurkeringen är vänd mot. Snäppa i flytande kväve.
- Förvara frysta block på lång sikt vid -80 °C.
- Sektion frysta block med en cryostat.
- Samla sex 5 μm tjocka arteriella tvärsnitt per bild, med bild 1 som börjar vid bifurcationen.
- Sektion frysta block tills hyperplasi inte längre är synlig (cirka 100 bilder).
- Hematoxylin & eosin (H&E) fläck glider18
- Hitta skadeområdet genom att färga en av tio diabilder längs hela artären från bifurcationen (t.ex. diabilderna 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 och 100).
- Fläcka ytterligare bilder runt platsen för skada för att hitta bilden med topp ocklusion (t.ex. bilder 20, 30 och 40 hade synliga hyperplasi, således fläck bilder 15, 25, 35 och 45).
- Färga och kvantifiera bilden med toppocklusion och ekvivalenter före och efter topp ocklusionsrutschbanan (t.ex. toppocklusion som finns vid bild 35, sedan färga och kvantifiera bilder 25, 45, etc.) för totalt 3-10 bilder per råtta.
- För ljusplåt fluorescensmikroskopi imaging, lagra artärer över natten vid 4 °C efter fixering i steg 4.4.
- Sond gatan med 1:500 utspädning av kanin anti-CD31 primära antikroppar i spädning (pH 7,4) i 3 dagar. Kontrastainartären med 1:500 utspädning av antikanin Alexa Fluor 647 sekundär antikropp i 2 dagar19.
- Rensa artären med iDISCO+20.
- Avbilda artären med hjälp av ett ljust ark fluorescensmikroskop21. Återge bilder med hjälp av programvara (t.ex. Imaris)19.
- Kvantifiera neointim hyperplasi. Utför kvantifiering på ett förblindat sätt om möjligt.
- Använd ImageJ-programvaran för att spåra omkretsen av intima, inre elastiska lamina (IEL) och yttre elastisk lamina (EEL) av en artär på var och en av de 3-10 bilder som bestäms ovan (steg 4.8.3).
- Kvantifiera området för varje spårad region i ImageJ och exportera dessa värden. Intima spår ger lumenområdet, IEL-spår ger IEL-området och EEL-spår ger EEL-området.
- Medelvärdet av de värden som erhålls från 3-10 bilder för att få den genomsnittliga skadan (% ocklusion, intima:media (I:M) förhållandet, neointim hyperplasi) per råtta halsartären.
Neointim hyperplasi = IEL-område - Lumenområdet
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar alla material och kirurgiska verktyg som används för att utföra denna operation. Hematoxylin & eosin (H&E) färgning av två veckors skadade kranskärlens tvärsnitt möjliggör tydlig visualisering av neointimal hyperplasi. Figur 2 visar representativa bilder av H&E-färgade kranskärlens tvärsnitt av en frisk, skadad och behandlad artär. Figur 2 beskriver också hur man kvantifierar nivån av neointim hyperplasi i en skadad artär med ImageJ, en allmänt använd bildbehandlingsprogram. Med hjälp av detta tillvägagångssätt spåras neointimas omkrets, liksom den inre och yttre elastiska lamina för att kvantifiera respektive områden. Den tryckstyrda segmentella skademetoden beskriver vi resulterar i ett intimitets-till-mediaförhållande på 0,80 med en standardavvikelse på 0, 29 (2 olika kirurger och n=11 råttor). Behandling med periadventitial tillämpning av CA i Pluronic resulterar i en hämning av neointim hyperplasi, som vi har visat tidigare (61% minskning av procent ocklusion)15.
Figur 3 ger en illustration för att skapa en optimal arteriotomi vid bifurcation av revisionsrätten och STA. Slutligen visar figur 4 hur ljusplåt fluorescensmikroskopi kan användas för att visualisera hela skadeområdet längs artärens längd. CD31 färgning för att visualisera endotelcellerna som fodrar intimalskiktet kan utföras på fasta artärer. Artärer kan sedan bäddas in i 1% agarose och rensas med hjälp av iDISCO +-metoden för att homogenisera brytningsindexet förprovet 20. Då kan artärerna avbildas i ett fluorescensmikroskop med ljusplåt och bilderna kan återges med hjälp av programvara för kvantifiering av I:M-förhållandet. Med hjälp av detta tillvägagångssätt fick vi ett I:M-förhållande på 0,86, vilket är i linje med H&E-resultaten.
| Avsnittsnummer | Referens |
| 10 sektioner | 27 |
| 8 avsnitt | 28 |
| 6-10 sektioner | 29 |
| 6 avsnitt | 30 |
| 5 sektioner | 31 |
| 3 sektioner | 32 |
Tabell 1. Vanligt förekommande antal kranskärlens tvärsnitt för hyperplasi analys.
Figur 1. Kirurgiska instrument och verktyg. I medurs ordning med början i bildens övre vänstra hörn: (A) Bomullspinne; B)Betadinlösning. c)Gasväv. D)70 % etylalkohollösning, e)1cc sprutor med nål; F)Atropin, g)Upprullningsdon. böjda gem som används här; H)Rimadyl, i)Mikroserrefinklämma som applicerar tång. J)Nålhållare. K)4-0 nylon sutur; l)4-0 vicryl sutur, M)Sterila draperier. N)Mayosax. O)Standardtångar. P)Finböjda tångar. Q)Sax med mikrodissektion. R)Mikroserrefinklämmor. (S)Fin sax; T-stift. U)Böjda hemostater. (V) Tre 7-0 Prolene suturer skär till cirka 1 tum; (W) 100 μL 25% pluronic-127 gel; X)Smörjande ögonsalva. (Y) 2 Fransk ballong embolektomikateter i steril saltlösning. ( Z) Insufflator. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2. Hematoxylin & Eosin (H&E) färgning och analys av råtta halsartären tvärsnitt. A)Tvärsnitt av friska, oskadda högra halspulsådern. IEL = Inre Elastisk Lamina, EEL = Extern Elastisk Lamina. B)Tvärsnitt av två veckors skadad vänster halspulsåder behandlad med Pluronic-F127 fordon. C)Tvärsnitt av två veckors skadad vänster halspulsåder behandlad med 100 μM cinnamic aldehyd. Skalstång = 100 μm.(D)Sektionering av schematiska frysta artärer för kvantifiering av skador. Bild 1 börjar vid bifurcationen och sex arteriella sektioner 5 μm i bredd tas per bild. Sektionering fortsätter vanligtvis att glida 70 eftersom skadan vanligtvis uppstår före den här bilden. E)Tvärsnitt av skadade vänstra halspulsådern som behandlats med Pluronic fordon (B). Den innersta svarta linjen spårar neointima och avgränsar det luminala området. Den mellersta gula linjen avgränsar området för den inre elastiska lamina, eller tunica intima. Den yttre blå linjen avgränsar området för den yttre elastiska lamina eller tunica adventitia. Skala stång = 100 μm. (F) Beräkningar som används för att mäta procentkärlets ocklusion och intima:media (I:M) förhållande baserat på mätningar från (E). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3. Arteriotomi skapelse. Illustration av stegen för att skapa en korrekt arteriotomy, och undvika ett falskt område. CCA = Vanlig halsartär, ECA = Extern halsartär, ICA = Inre halspulsåder, OA = Occipital Artery, STA = Superior Sköldkörtelartär. Isolera bifurcationen mellan revisionsrätten och STA-grenarna. Dissekera denna bifurcation tills området ändras till en ljusare färg, vilket indikerar gallring av artärväggen, och skapa sedan en arteriotomi med hjälp av mikrodissektionssax. Lyft arteriotomin med hjälp av fina tång för att hjälpa till vid ballonginsättning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4. Lätta ark fluorescens mikroskopi för att visualisera kranskärlens skada. Längsgående tvärsnitt längs längden på den gemensamma halsartären från en 14 veckor gammal Sprague Dawley råtta med en representativ tvärgående avsnitt nedan. Artärerna är färgade med CD31 och kontrastained med AF647. A)Tvärsnitt av friska, oskadda högra halspulsådern. Vit = CD31, Grön = Elastisk Lamina, L = Lumen, Skalstång = 200-500 μm. (B) Tvärsnitt av skadad, vänster halspulsåder behandlad med Pluronic-F127 fordon. Pilspetsar anger regioner med neointim hyperplasi. (C) Intima till media (I:M) förhållandet mellan oskadd och skadad halspulsåder, med exakt värde noterat för varje grupp (n=1). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Råttkarotidartärens ballongskada är en av de mest använda och studerade restenosis djurmodellerna. Både den ursprungliga ballongskadamodell 3 och den modifierade tryckstyrda segmental skada variation10 har informerat många aspekter av kranskärlens skada svar som också uppstår hos människor, med de få begränsningarna är att fibrin-rika blodproppar sällan utvecklas och lokal inflammation är minimal jämfört med andra skademodeller såsom i hypercholesterolemic kanin eller svin modeller9,22. Råttorna kan också offras vid olika tidpunkter för att kvantifiera och analysera de olika aspekterna av kranskärlens skaderespons. Till exempel kan tidigare tidpunkter användas för att studera aspekter av tidigt svar på skador som cellproliferation, fenotypisk omkopplare av vaskulär glatt muskelceller och det tidiga immunsvaret. Vi har tidigare visat att leukocyt infiltration och cell spridning är maximal mellan 3 dagar och 1 vecka16. Mellanliggande tidpunkter kan användas för att bedöma frekvensen av re-endothelialization. Två veckors tidpunkt är den tidigaste föreslagna tidpunkten för att mäta neointimal hyperplasi eftersom artären mestadels är re-endothelialized viddenna punkt 16. En stor begränsning för att översätta denna modell är att skadan utförs i en hälsosam artär, medan detta förfarande förekommer hos patienter med åderförkalkning sjukdom. Denna begränsning finns delvis på grund av den tidigare bristen på tillgängliga råtta åderförkalkning modeller23,24. Framsteg inom genredigeringsteknik har dock möjlig för utveckling av tillförlitliga atherosclerotic råtta modeller24, vilket kan ge nya insikter i att studera patofysiologi av restenosis.
Jämförelsevis ger hanråttor en mer robust skada än kvinnliga råttor, som vanligtvis utvecklar mindre neointim hyperplasi möjligen på grund av en skyddande effekt av östrogen25. Den beskrivna modellen är dock fortfarande lämplig för att studera kranskärlens läkning hos kvinnor. Hanråttor som åldras 12-16 veckor, mellan 300-400 g ger den mest robusta och reproducerbara neointimal bildandet. Råttor yngre än 12 veckor får användas. Artärerna hos dessa yngre råttor kan dock vara för små för 2F-ballongen för att enkelt komma in i artären beroende på råttstammen. Råttor som väger under 200 gram bör inte opereras med denna modell eftersom ballongen inte lätt passar genom arteriotomin och faktiskt kan riva artären om den tvingas. Dessutom kan användning av råttor äldre än 16 veckors ålder ge ett varierande svar vid neointimal bildning. Olika råttstammar kan användas för att utföra denna skademodell, där Sprague Dawley råttor är de vanligaste som används i hela litteraturen26. För att starta operationen, få först rätt inriktning och orientering av snittplatsen i nacken genom att känna för käkbenen och använda råttnäsan för att hitta mittlinjen. Efter det första snittet dissekerar vävnaden tills två längsgående muskler (sternohyoid och sternomastoid) som löper parallellt med varandra visualiseras. Använd nackmuskeln (masseter) som den nedre gränsen för operationsfönstret, mot huvudet. Separera de parallella musklerna, som löper mot kroppen, från varandra tills en muskel som löper vinkelrätt mot dessa två visualiseras. Att skära den vinkelräta muskeln gör det möjligt att enkelt dra tillbaka de två parallella musklerna och exponera halspulsådern. Eftersom anatomin kan variera något från varje djur, tillsammans med deras positionering, kan det finnas en mindre arteriell gren som vilar ovanpå ICA. Denna mindre gren kan spännas ihop med ICA; Men när denna lilla gren inte är fastklämd bör det inte vara några problem med att utföra proceduren. Se dessutom till att dissekera vagusnerven från både ICA och CCA innan någon fastspänning och suturing äger rum. Det är viktigt att vara försiktig och att undvika nervskador vid denna tidpunkt. Om djuret rycker efter att ha satt på en klämma som kan vara ett svar på vagusnerven som kommer i kontakt med metallklämman; överväga att justera klämman.
Förmodligen är det svåraste steget i hela proceduren att göra arteriotomin. Detta beror på att det är möjligt att göra en "falsk" arteriotomi, och att sätta in en ballong genom denna "falska" arteriotomi kommer att orsaka ballongen att faktiskt springa över artären, snarare än inuti artären. Om detta inträffar, då göra en ny arteriotomy närmare bifurcation vid CCA är en möjlig lösning, men om ballongen tvingades in i artären, då operationen kanske inte kan räddas. För att förhindra en "falsk" arteriotomi (figur 3), dissekera adventitialskiktet vid ECA och STA-bifurcation med hjälp av fina tång tills utseendet är betydligt rödare än närliggande regioner, och den delen av artären verkar sticka ut. Efteråt, använd mikrosaxen för att skapa arteriotomin genom att snabbt föra in en spets av saxen i det rensade området vid bifurcationen och sedan skära. Efter att ha gjort arteriotomin, använd de fina tångarna för att lyfta artärens öppning och trycka ballongen i lumen. Ballongen ska lätt glida genom arteriotomin och in i CCA. Beroende på råttpositionering kan det vara bra att leda ballongen in i CCA genom att använda fina tångar för att försiktigt dra uppåt på utsidan av CCA medan du leder ballongkatetern in i CCA. När ballongen har satts in i CCA, tejpa ner katetern så att ballongen inte lämnar artären när den blåses upp.
Periadventitial tillämpning av den terapeutiska möjliggör lokal och riktad läkemedelsleverans endast på platsen för skada. Detta tillvägagångssätt begränsar potentiella off-target effekter samt dosering begränsningar jämfört med något levereras systemiskt av muntliga, intraperitoneal eller intravenösa förvaltningar. Pluronic-F127 är termo reversibel, vilket innebär att den är flytande vid kall temperatur och geler vid rumstemperatur. Detta gör det möjligt för den terapeutiska att enkelt förberedas i en flytande lösning före pluronic gelerna, medan gelén kan appliceras jämnt på artären omedelbart efter skada. Toppen av Antarktis är lättillgänglig för att effektivt täcka hela skadeområdet, men Antarktis bör försiktigt lyftas för att täcka den nedre delen av Antarktis. Forskarna måste dock se till att driva studien på lämpligt sätt för att ta hänsyn till potentiell variation mellan behandlade djur. Det är viktigt att ha en uppskattning av den förväntade effektstorleken och standardavvikelsen för resultatet för att driva studien på lämpligt sätt. Begränsningen av periadventitial leveransmetod är att det inte är ett kliniskt relevant tillvägagångssätt eftersom en patients artär inte exponeras under en angioplastik, som utförs som ett perkutan förfarande. Ändå tillåter periadventitial tillämpning för preliminär testning av molekyler och biologiska läkemedel som levereras lokalt tillskadestället 15,27,28,29,30.
Den nuvarande standardmetoden för kvantifiering av neointim hyperplasi är baserad på morfometrisk analys av H&E-färgade diabilder. Den skadade halspulsådern är fysiskt sektionerad på diabilder i 5 μm skivor. Dessa bilder färgas sedan med H&E och bilder tas med hjälp av ett ljusmikroskop. ImageJ-programvaran används sedan för att mäta de områden och omkretsar som avgränsas av intima, interna lamina och yttre lamina. Även om vi har rapporterat ökad precision med 10 bilder för att kvantifiera hyperplasi19, finns det ingen konsensus i litteraturen om hur många bilder som ska mätas, med rapporterad metodik som varierar från 3 till 10 jämnt förrymda avsnitt (Tabell 1)31,32,33,34,35,36. Ett I:M-tal på 0,8 med en standardavvikelse på 0,29 (n=11) kan förväntas med hjälp av denna metod (Intervall: 0,54-1,51). Vi och andra har tidigare rapporterat ljusplåt fluorescensmikroskopi (LSFM) ger ett nytt tillvägagångssätt för att visualisera kranskärlensskada 19,37. LSFM möjliggör avbildning av hela halspulsådern i x-, y- och z-planet. LSFM möjliggör optisk skivning för att generera arteriella tvärsnitt för analys, vilket ger mer exakta uppskattningar av hyperplasi (variationskoefficient: 28% av LSFM jämfört med 41% genom histologi) än traditionella histologiskametoder 19,37. Som visas i figur 4är I:M-förhållandet som erhålls av LSFM (0,86, n=1) jämförbart med de resultat vi erhöll genom klassisk histologisk analys (0,8 ± 0,29).
Sammanfattningsvis rekapitulerar den tryckkontrollerade segmentala skadan det arteriella skadesvaret som uppstår efter kliniska revascularization förfaranden, vilket gör det till en idealisk modell för att studera patofysiologi av restenosis. Periadventitial läkemedelsapplikation är en användbar proof-of-concept leveransmetod för att analysera den terapeutiska effekten av lokal läkemedelsleverans, och kan informera utvecklingen av riktade systemiska drug delivery metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter när det gäller publiceringen av detta manuskript.
Acknowledgments
N.E.B. fick stöd av ett utbildningsbidrag från National Institute of Environmental Health Sciences (5T32ES007126-35, 2018) och american heart association pre-doctoral fellowship (20PRE35120321). E.S.M.B. var en KL2-forskare som delvis stöddes av UNC Clinical and Translational Science Award-K12 Scholars Program (KL2TR002490, 2018) och National Heart, Lung, and Blood Institute (K01HL145354). Författarna tackar Dr Pablo Ariel från UNC Microscopy Services Laboratory för att ha hjälpt till med LSFM. Light Sheet Fluorescence Microscopy utfördes på Microscopy Services Laboratory. Microscopy Services Laboratory, Institutionen för patologi och laboratoriemedicin, stöds delvis av P30 CA016086 Cancer Center Core Support Grant till UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | Fisher | 14955450 | |
| 1 mL Syringe with needle | BD | 309626 | |
| 2 French Fogarty Balloon Embolectomy Catheter | Edwards LifeSciences | 120602F | |
| 4-0 Ethilon (Nylon) Suture | Ethicon Inc | 662H | |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon Inc | J214H | |
| 7-0 Prolene Suture | Ethicon Inc | 8800H | |
| 70% ethyl alcohol | |||
| Anti-Rabbit Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21245 | |
| Atropine Sulfate | Vedco Inc | for veterinary use | |
| Cotton Swabs | Puritan | 806-WC | |
| Curved Hemostats | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Fine Curved Forceps | Fine Science Tools | 11203-25 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Gauze | Covidien | 2252 | |
| IHC-Tek Diluent (pH 7.4) | IHC World | IW-1000 | |
| Insufflator | Merit Medical | IN4130 | |
| Iodine solution | |||
| Lubricating Eye Ointment | Dechra | for veterinary use | |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| Micro-Serrefine Clamp Applying Forceps | Fine Science Tools | 18057-14 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 12003-15 | |
| Pluronic-127 (diluted in sterile water) | Sigma-Aldrich | P2443 | 25% prepared |
| Rabbit Anti-CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Retractor | Bent paper clips work well | ||
| Rimadyl (Carprofen) | Zoetis Inc | for veterinary use | |
| Saline solution | |||
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Sterile Drape | Dynarex | 4410 | |
| T-Pins |
References
- American Heart Association. Cardiovascular Disease: A Costly Burden for America, Projections Through 2035. American Heart Association CVD Burden Report. , (2017).
- Singh, R. B., Mengi, S. A., Xu, Y. J., Arneja, A. S., Dhalla, N. S. Pathogenesis of atherosclerosis: A multifactorial process. Experimental and Clinical Cardiology. 7 (1), 40-53 (2002).
- Clowes, A. W., Reidy, M. A., Clowes, M. M. Mechanisms of stenosis after arterial injury. Laboratory Investigation. 49 (2), 208-215 (1983).
- Clowes, A. W., Reidy, M. A., Clowes, M. M. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. I. Smooth muscle growth in the absence of endothelium. Laboratory Investigation. 49 (3), 327-333 (1983).
- Sartore, S., et al. Contribution of adventitial fibroblasts to neointima formation and vascular remodeling: from innocent bystander to active participant. Circulation Research. 89 (12), 1111-1121 (2001).
- Tanaka, K., et al. Circulating progenitor cells contribute to neointimal formation in nonirradiated chimeric mice. The FASEB Journal. 22 (2), 428-436 (2008).
- Henry, M., et al. Carotid angioplasty and stenting under protection. Techniques, results and limitations. The Journal of Cardiovascular Surgery. 47 (5), Torino. 519-546 (2006).
- Kounis, N. G., et al. Thrombotic responses to coronary stents, bioresorbable scaffolds and the Kounis hypersensitivity-associated acute thrombotic syndrome. Journal of Thoracic Disease. 9 (4), 1155-1164 (2017).
- Jackson, C. L. Animal models of restenosis. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (3), 122-130 (1994).
- Shears, L. L., et al. Efficient inhibition of intimal hyperplasia by adenovirus-mediated inducible nitric oxide synthase gene transfer to rats and pigs in vivo. Journal of the American College of Surgeons. 187 (3), 295-306 (1998).
- Takayama, T., et al. A murine model of arterial restenosis: technical aspects of femoral wire injury. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Zhang, L. N., Parkinson, J. F., Haskell, C., Wang, Y. X. Mechanisms of intimal hyperplasia learned from a murine carotid artery ligation model. Current Vascular Pharmacology. 6 (1), 37-43 (2008).
- Jahnke, T., et al. Characterization of a new double-injury restenosis model in the rat aorta. Journal of Endovascular Therapy. 12 (3), 318-331 (2005).
- Gregory, E. K., et al. Periadventitial atRA citrate-based polyester membranes reduce neointimal hyperplasia and restenosis after carotid injury in rats. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (10), 1419-1429 (2014).
- Buglak, N. E., Jiang, W., Bahnson, E. S. M. Cinnamic aldehyde inhibits vascular smooth muscle cell proliferation and neointimal hyperplasia in Zucker Diabetic Fatty rats. Redox Biology. 19, 166-178 (2018).
- Bahnson, E. S., et al. Long-term effect of PROLI/NO on cellular proliferation and phenotype after arterial injury. Free Radical Biology and Medicine. 90, 272-286 (2016).
- Gilbert, J. C. W., Davies, M. C., Hadgraft, J. The behaviour of Pluronic F127 in aqueous solution studied using fluorescent probes. International Journal of Pharmaceutics. 40 (1-2), 93-99 (1987).
- Tulis, D. A. Histological and morphometric analyses for rat carotid balloon injury model. Methods in Molecular Medicine. 139, 31-66 (2007).
- Buglak, N. E., et al. Light Sheet Fluorescence Microscopy as a New Method for Unbiased Three-Dimensional Analysis of Vascular Injury. Cardiovascular Research. , (2020).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Ariel, P. UltraMicroscope II - A User Guide. , (2018).
- Touchard, A. G., Schwartz, R. S. Preclinical restenosis models: challenges and successes. Toxicologic Pathology. 34 (1), 11-18 (2006).
- Xiangdong, L., et al. Animal models for the atherosclerosis research: a review. Protein Cell. 2 (3), 189-201 (2011).
- Chen, H., Li, D., Liu, M. Novel Rat Models for Atherosclerosis. Journal of Cardiology and Cardiovascular Sceinces. 2 (2), 29-33 (2018).
- Xing, D., Nozell, S., Chen, Y. F., Hage, F., Oparil, S. Estrogen and mechanisms of vascular protection. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (3), 289-295 (2009).
- Tulis, D. A. Rat carotid artery balloon injury model. Methods in Molecular Medicine. 139, 1-30 (2007).
- Pellet-Many, C., et al. Neuropilins 1 and 2 mediate neointimal hyperplasia and re-endothelialization following arterial injury. Cardiovascular Research. 108 (2), 288-298 (2015).
- Wu, B., et al. Perivascular delivery of resolvin D1 inhibits neointimal hyperplasia in a rat model of arterial injury. Journal of Vascular Surgery. 65 (1), 207-217 (2017).
- Tan, J., Yang, L., Liu, C., Yan, Z. MicroRNA-26a targets MAPK6 to inhibit smooth muscle cell proliferation and vein graft neointimal hyperplasia. Scientific Reports. 7, 46602 (2017).
- Pearce, C. G., et al. Beneficial effect of a short-acting NO donor for the prevention of neointimal hyperplasia. Free Radical Biology and Medicine. 44 (1), 73-81 (2008).
- Cao, T., et al. S100B promotes injury-induced vascular remodeling through modulating smooth muscle phenotype. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (11), 2772-2782 (2017).
- Madigan, M., Entabi, F., Zuckerbraun, B., Loughran, P., Tzeng, E. Delayed inhaled carbon monoxide mediates the regression of established neointimal lesions. Journal of Vascular Surgery. 61 (4), 1026-1033 (2015).
- Khurana, R., et al. Angiogenesis-dependent and independent phases of intimal hyperplasia. Circulation. 110 (16), 2436-2443 (2004).
- Tsihlis, N. D., Vavra, A. K., Martinez, J., Lee, V. R., Kibbe, M. R. Nitric oxide is less effective at inhibiting neointimal hyperplasia in spontaneously hypertensive rats. Nitric Oxide. 35, 165-174 (2013).
- Chen, J., et al. Inhibition of neointimal hyperplasia in the rat carotid artery injury model by a HMGB1 inhibitor. Atherosclerosis. 224 (2), 332-339 (2012).
- Mano, T., Luo, Z., Malendowicz, S. L., Evans, T., Walsh, K. Reversal of GATA-6 downregulation promotes smooth muscle differentiation and inhibits intimal hyperplasia in balloon-injured rat carotid artery. Circulation Research. 84 (6), 647-654 (1999).
- Becher, T., et al. Three-Dimensional Imaging Provides Detailed Atherosclerotic Plaque Morphology and Reveals Angiogenesis after Carotid Artery Ligation. Circulation Research. 126 (5), 619-632 (2020).
