Summary
A lesão do balão carótida do rato imita o procedimento clínico de angioplastia realizado para restaurar o fluxo sanguíneo em vasos ateroscleróticos. Este modelo induz a resposta à lesão arterial distending da parede arterial, e desnuding a camada intimal de células endoteliais, causando, em última análise, remodelação e uma resposta hiperplástica intimal.
Abstract
As doenças cardiovasculares continuam sendo a principal causa de morte e incapacidade em todo o mundo, em parte devido à aterosclerose. A placa aterosclerótica reduz a área luminal da superfície nas artérias, reduzindo assim o fluxo sanguíneo adequado para órgãos e tecidos distais. Clinicamente, procedimentos de revascularização, como angioplastia de balão com ou sem colocação de stent, visam restaurar o fluxo sanguíneo. Embora esses procedimentos restabeleçam o fluxo sanguíneo reduzindo a carga da placa, eles danificam a parede do vaso, que inicia a resposta de cura arterial. A resposta de cura prolongada causa restenose arterial, ou re-estreitamento, limitando o sucesso a longo prazo desses procedimentos de revascularização. Portanto, modelos de animais pré-clínicos são fundamentais para analisar os mecanismos fisiodológicos que conduzem a restenose, e proporcionam a oportunidade de testar novas estratégias terapêuticas. Os modelos murinos são mais baratos e fáceis de operar do que os grandes modelos animais. Lesões de balão ou arame são as duas modalidades de lesão comumente aceitas usadas em modelos murinos. Os modelos de lesão de balão, em particular, imitam o procedimento de angioplastia clínica e causam danos adequados à artéria para o desenvolvimento da restenose. Aqui descrevemos os detalhes cirúrgicos para a realização e análise histologicamente do modelo de lesão do balão carótida de rato modificado e controlado por pressão. Além disso, este protocolo destaca como a aplicação periadventicial local da terapêutica pode ser usada para inibir a hiperplasia neointimal. Por fim, apresentamos a microscopia de fluorescência da folha de luz como uma nova abordagem para a imagem e visualização da lesão arterial em três dimensões.
Introduction
A doença cardiovascular (DCV) continua sendo a principal causa de morte em todo o mundo1. A aterosclerose é a causa básica da maior morbidade e mortalidade relacionadas à DCV. Aterosclerose é o acúmulo de placa dentro das artérias que resulta em um lúmen estreito, dificultando a perfusão sanguínea adequada aos órgãos e tecidos distais2. As intervenções clínicas para o tratamento da aterosclerose grave incluem angioplastia de balão com ou sem colocação de stent. Esta intervenção envolve o avanço de um cateter de balão para o local da placa, e a inflação do balão para comprimir a placa até a parede arterial, ampliando a área luminal. Este procedimento danifica a artéria, no entanto, iniciando a resposta da lesão arterial3. A ativação prolongada desta resposta à lesão leva à restenose arterial, ou re-estreitamento, secundária à hiperplasia neointimal e à remodelação do vaso. Durante a angioplastia, a camada intimal é desnudada de células endoteliais que levam ao recrutamento imediato de plaquetas e inflamação local. A sinalização local induz alterações fenotípicas nas células musculares lisas vasculares (VSMC) e nos fibroblastos adventitas. Isso leva à migração e proliferação de VSMC e fibroblastos para dentro do lúmen, levando à hiperplasia neointimal4,5. As células progenitoras circulantes e as células imunes também contribuem para o volume global de restenose6. Quando aplicável, os stents que eluem drogas (DES) são o padrão atual para inibir a restenose7. O DES inibe a re-endotelialização arterial, no entanto, criando assim um ambiente pró-trombótico que pode resultar em trombose tardia do stent8. Portanto, os modelos animais são fundamentais tanto para a compreensão da fisiopatologia da restenose, quanto para o desenvolvimento de melhores estratégias terapêuticas para prolongar a eficácia dos procedimentos de revascularização.
Vários modelos animais grandes e pequenos9 são utilizados para estudar essa patologia. Estes incluem lesão de balão3,10 ou lesão de fio11 do lado luminal de uma artéria, bem como ligadura parcial12 ou colocação de manguito13 ao redor da artéria. A lesão do balão e do arame desnude a camada endotelial da artéria, imitando o que ocorre clinicamente após a angioplastia. Em particular, os modelos de lesão de balão utilizam ferramentas semelhantes às do cenário clínico (ou seja, cateter de balão). A lesão do balão é melhor realizada em modelos de ratos, uma vez que as artérias de rato são um tamanho apropriado para cateteres de balão comercialmente disponíveis. Aqui descrevemos uma lesão arterial segmental controlada por pressão, uma versão bem estabelecida e modificada da lesão do balão da artéria carótida do rato. Esta abordagem controlada por pressão imita de perto o procedimento de angioplastia clínica, e permite a formação de hiperplasia neointimal reprodutível duas semanas após a lesão14,15. Além disso, esta lesão arterial controlada por pressão resulta em restauração completa da camada endotelial por 2 semanas após a cirurgia16. Isso contrasta diretamente com o modelo original de lesão do balão, descrito por Clowes, onde a camada endotelial nunca retorna à cobertura completa3.
Após a cirurgia, a terapêutica pode ser aplicada ou direcionada para a artéria ferida através de várias abordagens. O método descrito aqui usa a aplicação periadventitial de uma pequena molécula embutida em uma solução de gel plurônico. Especificamente, aplicamos uma solução de aldeído cinnâmico de 100 μM em gel plurônico-F127 na artéria imediatamente após lesão para inibir a formação de hiperplasia neointimal15. Pluronic-F127 é um gel termo-reversível não tóxico capaz de entregar drogas localmente de forma controlada17. Enquanto isso, a lesão arterial é local, portanto a administração local permite testar um princípio ativo, minimizando os efeitos fora do alvo. No entanto, a entrega efetiva de um uso terapêutico deste método dependerá da química da pequena molécula ou do uso biológico.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill.
1. Procedimentos pré-operatórios
- Esterilizar instrumentos cirúrgicos. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia. Se realizar múltiplas cirurgias no mesmo dia, esterilize os instrumentos entre as cirurgias utilizando um esterilizador de contas secas.
- Prepare o terapêutico em 25% de gel plurônico-127 (diluído em água destilada estéril).
- Configure um cateter de balão Fogarty 2F no insuflê e coloque a extremidade do balão do cateter em uma seringa de 1 mL cheia de solução salina.
- Induzir anestesia colocando o rato em uma câmara com 5% de isoflurano.
- Retire o rato da câmara e grave o peso do rato. Use cortadores de cabelo para raspar peles na região do pescoço ventral.
- Coloque o rato de volta na câmara com 5% de isoflurano para garantir a indução da anestesia.
- Coloque o supino do rato em uma plataforma cirúrgica, inserindo a face no cone do nariz para que a face do rato esteja em direção ao cirurgião.
- Reduza a anestesia inalatória para 1,5% de isoflurane. Verifique a profundidade da anestesia por um reflexo de dedo do pé nos quatro pés.
- Fita as quatro pernas até a plataforma cirúrgica.
- Ligue a lâmpada de calor.
- Injete atropina (0,01 mg/kg) subcutânea para reduzir as secreções das vias aéreas.
- Injete Carprofen (5 mg/kg) subcutânea para o tratamento da dor profilática. Se os anti-inflamatórios não forem aceitáveis para o experimento, consulte as etapas 3.2.2 e 3.2.3.
- Aplique pomada lubrificante nos olhos em ambos os olhos usando um cotonete estéril para evitar que as córneas sequem durante a cirurgia.
- Cotonete o pescoço três vezes em um movimento circular alternando entre 70% de álcool etílico seguido por Betadine do centro da região raspada para fora para esterilizar o local de incisão.
- Infiltrar-se na linha de incisão s.c. com 0,25% bupivacaína.
- Coloque luvas cirúrgicas estéreis antes de manusear instrumentos cirúrgicos estéreis e suprimentos.
- Coloque todos os instrumentos cirúrgicos autoclavados em uma folha cirúrgica estéril.
- Corte três fios independentes de 1 polegada de sutura estéril 7-0 Prolene.
- Coloque cotonetes e gaze na folha cirúrgica.
- Drape o rato com uma folha cirúrgica estéril que só expõe a região do pescoço esterilizada.
- Corte uma abertura pequena adicional na folha que exponha parte do cone do nariz. Este será o local para gravar o cateter de balão durante a lesão.
2. Procedimentos operacionais
- Durante todo o procedimento cirúrgico, avalie a profundidade da anestesia monitorando a taxa respiratória (a taxa deve ser consistente e considerada normal) bem como por beliscar o dedo do pé a cada 15 minutos. Se a taxa respiratória aumentar ou houver uma resposta ao aperto do dedo do pé, então pausa a manipulação cirúrgica e aumente o isoflurane até 2,5%.
- Expor a artéria carótida comum (CCA).
- Faça uma incisão superficial, reta e longitudinal entre os ossos da mandíbula do rato. A incisão terá aproximadamente 1,5-2 cm de comprimento.
- Faça uma incisão através do tecido conjuntivo sob a pele até que a camada muscular seja exposta. Deslocar as glândulas salivares sob a pele para acessar o tecido muscular.
- Separe sem rodeios o tecido conjuntivo do músculo inserindo uma tesoura fechada entre a camada muscular e o tecido conjuntivo e abrindo suavemente a tesoura enquanto puxa a pele para cima.
- Disseque os dois músculos visíveis (estehisidóide e esternostoide) longitudinalmente ao longo do lado esquerdo da traqueia até que um terceiro músculo (omohyide) que corre perpendicular aos dois músculos superficiais seja observado.
- Use fórceps para criar uma janela que separe este músculo perpendicular (omohyide) do músculo longitudinal (estehiidaide) correndo sobre a traqueia. Realize suavemente esta separação para evitar traumas contundentes na traqueia.
- Atinja fórceps sob o músculo perpendicular e corte para separar os dois músculos longitudinais e expor a CCA.
- Disseca a CCA.
- Disseque a CCA perto da bifurcação até que a artéria carótida interna (ICA) e a artéria carótida externa (ECA) sejam expostas.
- Dissecar a artéria tireoide superior (STA), que se ramifica do TCE.
- Utilizando as suturas prolene pré-cortadas, ligar o STA e o ECA perto de sua respectiva bifurcação. Deixe a maior parte da sutura para um lado do nó e pegue cada sutura com um hemosta curvo.
- Finalize a dissecação ao redor do ICA, alcance fórceps por baixo e ao redor do ICA, e use um grampo vascular não esmagador para obter controle distal. Aperte a artéria occipital junto com o ICA.
- Dissecar o CCA proximal à bifurcação, garantindo separar o nervo vago da CCA.
- Alcance fórceps por baixo e ao redor da CCA e use um grampo vascular não esmagante para obter controle proximal. Coloque o grampo de pelo menos 5 mm da bifurcação.
- Faça lesão no balão.
- Manobrar os hemostatos curvos que seguram cada ramo da artéria ligada para expor a bifurcação entre o TCE e o ramo superior.
- Dissecar suavemente o tecido na bifurcação e, em seguida, fazer uma incisão de arteriotomia entre o ECA e o ramo superior usando tesouras de microdisseção.
- Use um cotonete para empurrar todo o sangue para fora da CCA e limpar o local da arteriotomia.
- Insira o cateter de balão não inflado através da arteriotomia e avance para dentro da CCA até que a extremidade proximal do balão passe da bifurcação.
- Cateter de fita no cone do nariz para que o balão não saia da artéria durante a inflação.
- Infle lentamente o balão a 5 atmosferas de pressão e deixe na CCA por 5 minutos para induzir lesões arteriais. Certifique-se de que a pressão permaneça constante durante todo o 5 min.
- Depois de 5 min, esvazie o balão e retire suavemente da CCA através da arteriotomia.
- Lave a CCA apertando suavemente o grampo na CCA. Não remova o grampo.
- Ligate o ECA proximal à arteriotomia e, em seguida, remova os grampos da CCA e ica para restaurar o fluxo sanguíneo através da CCA para o ICA. Certifique-se de que não há sangramento visível ao redor da arteriotomia e que a CCA está pulsando.
- Aplique 100 μL de veículo de gel terapêutico ou plurônico sozinho periadventitamente ao longo da CCA ferida. Faça isso aplicando 50 μL no lado esquerdo da CCA e, em seguida, 50 μL no lado direito da CCA para garantir o revestimento uniforme da artéria ferida.
- Feche o local da ferida.
- Corte suturas prolene em excesso.
- Feche a ferida usando camadas vicríl interrompidas 4-0 ou 6-0 ao longo do tecido conjuntivo.
- Finalize o fechamento da ferida usando sutura de nylon 4-0 ao longo da pele.
3. Procedimentos pós-operatórios
- Coloque o rato sozinho em uma gaiola limpa com metade da gaiola sob uma lâmpada de aquecimento e monitore até que o rato recupere a consciência suficiente para manter a recumbência severa. Mantenha o rato em uma gaiola separada até que o animal esteja totalmente alerta e móvel antes de ser transferido de volta para sua gaiola original.
- Monitore o rato diariamente pelos próximos três dias e depois três vezes por semana até a eutanásia. Eutanize usando overdose de isoflurane seguido de toracotomia bilateral como descrito abaixo.
- Utilize o Centro Nacional de Requinte e Redução de Animais em Pesquisa (NC3Rs) para identificar os níveis de dor pós-operatório. Se algum animal parece estar sentindo dor ou desenvolvendo qualquer compromisso neurológico, sacrifique imediatamente.
- Para animais que não recebem carprofeno, administre acetaminofeno 6 mg/mL em sua água potável 24h antes da cirurgia através de 48h após a cirurgia. O acetaminofeno fornece analgesia com efeitos anti-inflamatórios mínimos.
- Alternativamente, outras estratégias de analgesia com efeitos anti-inflamatórios mínimos podem ser utilizadas, como buprenorfina ou liberação estendida de buprenorfina. Consulte a equipe veterinária de sua instituição.
4. Colheita e imagem de tecido
- Duas semanas após a cirurgia, eutanize o rato por overdose de anestesia (5% isoflurane). Alternativamente, os ratos eutanizam em um momento anterior para analisar os vários aspectos da resposta à lesão arterial.
- Uma vez que a respiração pára, faça a toracotomia bilateral como um método secundário de eutanásia.
- Faça uma incisão lateral através do abdômen, e depois corte para cima, através do diafragma e costelas, expondo a cavidade torácica.
- Peruuse e conserte as artérias.
- Insira uma cânula de 18 G presa a um sistema de fixação gravitacional de perfusão através do ventrículo esquerdo. Mantenha pressão equivalente entre ratos marcando a altura do sistema de perfusão em relação à bancada (elevação de 120 cm, equivalente a 91 ± 3 mmHg).
- Aperte a cânula junto com o ventrículo usando um hemostato curvo.
- Faça um corte no átrio direito, abrindo o circuito vascular, e comece a perfusão com PBS seguido de 2-4% de paraformaldeído (cerca de 250 mL cada).
- Prepare paraformaldeído diluído na PBS no dia do sacrifício, ou no máximo na noite anterior ao sacrifício. Se se preparar no dia do sacrifício, certifique-se de que o paraformaldeído esfriou à temperatura ambiente antes de iniciar a perfusão. Armazenar paraformaldeído a 4 °C.
- Após a fixação, extraia as artérias carótidas esquerda e direita e armazene a 4 °C por 2h em 2-4% de paraformaldeído.
- Transfira as artérias para 30% de sacarose e armazene durante a noite a 4 °C.
- Após 16-24 h, incorpore as artérias no composto de temperatura de corte ideal (OCT) e congele os blocos de artérias embutidas por OCT.
- Condicionam artérias em OUTUBRO à temperatura ambiente por 10 minutos. Coloque a artéria paralela ao plano da criomolda cheia de OCT, marcando o lado da criomold para a qual a bifurcação arterial está voltada. Congelamento de snap em nitrogênio líquido.
- Armazene blocos congelados a longo prazo a -80 °C.
- Seção blocos congelados usando um criostat.
- Colete seis seções transversais arterials de 5 μm de espessura por slide, com slide 1 começando na bifurcação.
- Seção blocos congelados até que a hiperplasia não seja mais visível (cerca de 100 slides).
- Hematoxylin & eosin (H&E) slides de manchas18
- Encontre a área do ferimento manchando um em cada dez slides ao longo de toda a artéria a partir da bifurcação (por exemplo, slides 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 e 100).
- Manchas adicionais desliza ao redor do local da lesão para encontrar o slide com oclusão de pico (por exemplo, slides 20, 30 e 40 tinham hiperplasia visível, assim manchas desliza 15, 25, 35 e 45).
- Manche e quantifique o slide com oclusão máxima e deslizamentos equidistantes antes e depois do deslizamento de oclusão de pico (por exemplo, oclusão máxima encontrada no slide 35, depois manche e quantifique slides 25, 45, etc.) para um total de 3-10 slides por rato.
- Para imagens de microscopia de fluorescência de folha de luz, armazene as artérias durante a noite a 4 °C após a fixação na etapa 4.4.
- Artéria da sonda com diluição de 1:500 de anticorpo primário anti-CD31 de coelho em diluente (pH 7.4) por 3 dias. Em seguida, a artéria de contra-mancha com diluição de 1:500 do anticorpo secundário Alexa Fluor 647 por 2 dias19.
- Limpe a artéria usando iDISCO+20.
- Imagem da artéria usando um microscópio de fluorescência de folha de luz21. Renderizar imagens usando software (por exemplo, Imaris)19.
- Quantifique a hiperplasia neointimal. Realize a quantificação de forma cega, se possível.
- Use o software ImageJ para traçar o perímetro da lâmina elástica intima, interna elástica (IEL) e lamina elástica externa (EEL) de uma artéria em cada um dos 3-10 slides determinados acima (passo 4.8.3).
- Quantifique a área de cada região traçada em ImageJ e exporte esses valores. O traço intima produz a área de lúmen, o traço IEL produz a área IEL, e o traço EEL produz a área da ENGUIA.
- Média dos valores obtidos dos slides 3-10 para obter a lesão média (% de oclusão, proporção intima:media (I:M), hiperplasia neointimal) por artéria carótida de rato.
Hiperplasia Neointimal = Área IEL - Área de Lumen
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Representative Results
A Figura 1 mostra todos os materiais e ferramentas cirúrgicas utilizados para a realização desta cirurgia. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E) de seções transversais arterials feridas de duas semanas permite uma visualização clara da hiperplasia neointimal. A Figura 2 mostra imagens representativas de seções arterials manchadas de H&E de uma artéria saudável, ferida e tratada. A Figura 2 também descreve como quantificar o nível de hiperplasia neointimal em uma artéria ferida usando imagej, um software de processamento de imagem amplamente utilizado. Utilizando essa abordagem, o perímetro da neointima, bem como a lâmina elástica interna e externa são traçados para quantificar as respectivas áreas. O método de lesão segmentar controlado por pressão que descrevemos resulta em uma proporção intima para a mídia de 0,80 com um desvio padrão de 0,29 (2 cirurgiões diferentes e n=11 ratos). O tratamento com aplicação periadventicial de CA em Pluronic resulta em uma inibição da hiperplasia neointimal, como já mostramos antes (redução de 61% na oclusão percentual)15.
A Figura 3 fornece uma ilustração para a criação de uma arteriotomia ideal na bifurcação do ECA e sta. Por fim, a Figura 4 mostra como a microscopia de fluorescência da folha de luz pode ser usada para visualizar toda a região da lesão ao longo do comprimento da artéria. A coloração CD31 para visualizar as células endoteliais que revestem a camada intimal pode ser realizada em artérias fixas. As artérias podem então ser incorporadas em 1% de agarose e limpas usando o método iDISCO+ para homogeneizar o índice de refração da amostra20. Em seguida, as artérias podem ser imagens em um microscópio de fluorescência de folha de luz e as imagens podem ser renderizadas usando software para quantificar a razão I:M. Usando essa abordagem, obtivemos uma razão de I:M de 0,86, que está de acordo com os resultados de H&E.
| Número da seção | Referência |
| 10 seções | 27 |
| 8 seções | 28 |
| 6-10 seções | 29 |
| 6 seções | 30 |
| 5 seções | 31 |
| 3 seções | 32 |
Mesa 1. Número comumente utilizado de seções transversais arterials para análise de hiperplasia.
Figura 1. Instrumentos cirúrgicos e ferramentas. Na ordem do sentido horário começando no canto superior esquerdo da imagem: (A) Cotonetes de algodão; (B) Solução betadina; (C) Gaze; (D) Solução de álcool etílico de 70%; (E) seringas de 1cc com agulha; (F) Atropina; (G) Retratores; clipes de papel dobrados usados aqui; Rimadyl; (I) Grampo de micro-serrefina aplicando fórceps; (J) Suporte de agulha; (K) 4-0 sutura de nylon; (L) 4-0 sutura vicríl; (M) Cortinas estéreis; (N) Tesoura mayo; (O) Fórceps padrão; (P) Fórceps curvados finos; (Q) Tesoura de microdisseção; (R) Grampos de micro serrefina; (S) Tesoura fina; (T) T-pinos; (U) Hemostats curvos; (V) Três suturas de prolene 7-0 cortadas para aproximadamente 1 polegada; (W) 100 μL de 25% de gel plurônico-127; (X) Pomada ocular lubrificante; (Y) 2 Cateter francês de embolectomia de balão em solução salina estéril; Insufflator. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Hematoxylin & Eosin (H&E) coloração e análise de seções transversais da artéria carótida de rato. (A) Seção transversal da artéria carótida direita saudável e sem ferimentos. IEL = Lamina Elástica Interna, ENGUIA = Lamina Elástica Externa. (B) Seção transversal de duas semanas ferida artéria carótida esquerda tratada com veículo Pluronic-F127. (C) Seção transversal de duas semanas ferida artéria carótida esquerda tratada com aldeído cinnâmico de 100 μM. Barra de escala = 100 μm. (D) Esquema de secção de artérias congeladas para quantificar lesões. O slide 1 começa na bifurcação e seis seções arteriais de 5 μm de largura são tomadas por slide. A secção normalmente continua a deslizar 70, pois a lesão geralmente ocorre antes deste slide. (E) Seção transversal da artéria carótida esquerda ferida tratada com veículo plurônico(B). A linha preta mais interna traça o neointima e delineia a área luminal. A linha amarela média delineia a área da lâmina elástica interna, ou tunica intima. A linha azul exterior delineia a área da lâmina elástica externa, ou tunica adventitia. Barra de escala = 100 μm. (F) Cálculos utilizados para medição percentual de oclusão do vaso e proporção intima:media (I:M) com base nas medições obtidas de (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Criação de arteriotomia. Ilustração dos passos para criar uma arteriotomia adequada, e evitar um trato falso. CCA = Artéria Carótida Comum, ECA = Artéria Carótida Externa, ICA = Artéria Carótida Interna, OA = Artéria Occipital, STA = Artéria Tireoide Superior. Isolar a bifurcação entre os ramos ECA e STA. Disseque essa bifurcação até que a área mude para uma cor mais brilhante, indicando o afinamento da parede arterial e, em seguida, crie uma arteriotomia usando tesouras de microdisseção. Levante a arteriotomia usando fórceps finos para auxiliar na inserção do balão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Microscopia de fluorescência de folha de luz para visualizar lesões arteriais. Seções longitudinais transversais ao longo do comprimento da artéria carótida comum de um rato Sprague Dawley de 14 semanas de idade com uma seção transversal representativa abaixo. As artérias estão manchadas com CD31 e contra-manchadas com AF647. (A) Seções transversais da artéria carótida direita saudável e sem ferimentos. Branco = CD31, Verde = Lamina Elástica, L = Lumen, Barra de Escala = 200-500 μm. (B) Seções transversais da artéria carótida esquerda ferida tratada com veículo Pluronic-F127. Pontas de flecha indicam regiões de hiperplasia neointimal. (C) Proporção intima para mídia (I:M) da artéria carótida não ferida e ferida, com valor exato observado para cada grupo (n=1). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A lesão do balão da artéria carótida de rato é um dos modelos animais de restenose mais utilizados e estudados. Tanto o modelo de lesão do balãooriginal 3 quanto a variação de lesão segmental controlada pela pressão modificada10 informaram muitos aspectos da resposta à lesão arterial que também ocorre em humanos, com as poucas limitações sendo que o trombo rico em fibrina raramente se desenvolve e a inflamação local é mínima em comparação com outros modelos de lesão, como em modelos hipercolesterolômicos ou suínos9,22. Os ratos também podem ser sacrificados em diferentes pontos de tempo para quantificar e analisar os diferentes aspectos da resposta à lesão arterial. Por exemplo, pontos de tempo anteriores podem ser usados para estudar aspectos da resposta precoce a lesões, como a proliferação celular, o interruptor fenotípico das células musculares lisas vasculares e a resposta imune precoce. Já mostramos anteriormente que a infiltração de leucócitos e a proliferação celular são máximas entre 3 dias e 1 semana16. Os pontos de tempo intermediários podem ser usados para avaliar a taxa de reendotelialização. O ponto de tempo de duas semanas é o ponto de tempo mais antigo sugerido para medir a hiperplasia neointimal, pois a artéria é principalmente re-endotelializada neste ponto16. Uma grande limitação para traduzir esse modelo é que a lesão é realizada em artéria saudável, enquanto esse procedimento ocorre em pacientes com doença aterosclerótica. Essa limitação existe em parte devido à falta anterior de aterosclerose de rato disponível modelos23,24. No entanto, os avanços nas tecnologias de edição de genes permitiram o desenvolvimento de modelos de ratos ateroscleróticos confiáveis24, o que pode produzir novas percepções no estudo da fisiopatologia da restenose.
Comparativamente, os ratos machos produzem uma lesão mais robusta do que os ratos fêmeas, que normalmente desenvolvem menos hiperplasia neointimal possivelmente devido a um efeito protetor do estrogênio25. No entanto, o modelo descrito ainda é apropriado para estudar a cicatrização arterial em fêmeas. Ratos machos envelhecendo de 12 a 16 semanas, entre 300-400 g produzem a formação neointimal mais robusta e reprodutível. Podem ser utilizados ratos com menos de 12 semanas de idade; no entanto, as artérias desses ratos mais jovens podem ser muito pequenas para o balão 2F entrar facilmente na artéria, dependendo da cepa de rato. Ratos pesando menos de 200 gramas não devem ser operados com este modelo, pois o balão não se encaixa facilmente através da arteriotomia e pode realmente rasgar a artéria se for forçado. Além disso, o uso de ratos com mais de 16 semanas de idade pode produzir uma resposta variável na formação neointimal. Várias cepas de ratos podem ser usadas para a realização deste modelo de lesão, com os ratos Sprague Dawley sendo os mais utilizados ao longo da literatura26. Para iniciar a cirurgia, primeiro obtenha o alinhamento e orientação adequados do local de incisão no pescoço, sentindo os ossos da mandíbula e usando o nariz de rato para encontrar a linha média. Após a incisão inicial, disseca o tecido até que dois músculos longitudinais (estenóide e esternostoide) correndo paralelamente um ao outro sejam visualizados. Use o músculo do pescoço (masseter) como o limite inferior da janela de operação, em direção à cabeça. Separe os músculos paralelos, que correm em direção ao corpo, um do outro até que um músculo que corre perpendicular a esses dois seja visualizado. Cortar o músculo perpendicular permitirá uma fácil retração dos dois músculos paralelos, expondo a artéria carótida. Como a anatomia pode variar ligeiramente de cada animal, juntamente com seu posicionamento, pode haver um ramo arterial menor que repousa sobre o ICA. Este ramo menor pode ser fixado juntamente com o ICA; no entanto, quando este pequeno ramo não está preso, não deve haver problemas com a realização do procedimento. Além disso, certifique-se de dissecar o nervo vago tanto do ICA quanto da CCA antes que qualquer fixação e sutura ocorra. É importante ser gentil e evitar danos nos nervos neste momento. Se o animal se contrai depois de colocar um grampo que pode ser uma resposta do nervo vago entrando em contato com o grampo metálico; considerar o reajuste do grampo.
Sem dúvida, o passo mais complicado de todo o procedimento é fazer a arteriotomia. Isso porque é possível fazer uma arteriotomia 'falsa', e inserir um balão através dessa arteriotomia 'falsa' fará com que o balão realmente corra acima da artéria, em vez de dentro da artéria. Se isso ocorrer, então fazer uma nova arteriotomia mais perto da bifurcação na CCA é uma solução possível, mas se o balão foi forçado a entrar na artéria, então a cirurgia pode não ser fascinante. Para evitar uma arteriotomia 'falsa'(Figura 3),disseque a camada aventureira no ECA e na bifurcação sta usando fórceps finos até que a aparência seja significativamente mais vermelha do que as regiões próximas, e essa parte da artéria parece se projetar. Posteriormente, use a micro-tesoura para criar a arteriotomia inserindo rapidamente um pino da tesoura na área desmatada na bifurcação e, em seguida, cortando. Depois de fazer a arteriotomia, use os fórceps finos para levantar a abertura da artéria e empurrar o balão para dentro do lúmen. O balão deve deslizar facilmente através da arteriotomia e para dentro da CCA. Dependendo do posicionamento do rato, pode ser útil guiar o balão para dentro da CCA usando fórceps finos para puxar suavemente para cima na parte externa da CCA enquanto guia o cateter de balão para dentro da CCA. Depois que o balão é inserido na CCA, laque o cateter para baixo para que o balão não saia da artéria enquanto está sendo inflado.
A aplicação periadventitial da terapêutica permite a entrega de medicamentos locais e direcionados apenas no local da lesão. Essa abordagem limita potenciais efeitos fora do alvo, bem como limitações de dosagem em comparação com algo entregue sistematicamente por administrações orais, intraperitoneais ou intravenosas. Pluronic-F127 é termo-reversível, o que significa que é líquido a temperatura fria e géis à temperatura ambiente. Isso permite que o terapêutico seja facilmente preparado em uma solução líquida antes dos géis plurônicos, enquanto o gel pode ser aplicado uniformemente na artéria imediatamente após a lesão. Considerando que a parte superior da CCA é facilmente acessível para cobrir efetivamente toda a região da lesão, a CCA deve ser suavemente levantada para revestir a parte inferior da CCA. No entanto, os pesquisadores precisam garantir que o estudo seja adequadamente responsável pela potencial variabilidade entre os animais tratados. É importante ter uma estimativa do tamanho do efeito esperado e do desvio padrão do resultado para alimentar adequadamente o estudo. A limitação do método periadventicial de parto é que não é uma abordagem clinicamente relevante, uma vez que a artéria do paciente não é exposta durante uma angioplastia, que é realizada como um procedimento percutâneo. No entanto, a aplicação periadventitial permite testes preliminares de moléculas e biológicos entregues localmente ao local da lesão15,27,28,29,30.
O método padrão atual de quantificação da hiperplasia neointimal baseia-se na análise morfométrica dos slides manchados de H&E. A artéria carótida ferida é fisicamente seccionada em lâminas em fatias de 5 μm. Esses slides são então manchados usando H&E e as imagens são tiradas usando um microscópio leve. O software ImageJ é então usado para medir as áreas e perímetros delimitados pela lamina intima, interna e lamina externa. Embora tenhamos relatado aumento de precisão usando 10 slides para quantificar a hiperplasia19,não existe consenso na literatura sobre quantos slides medir, com metodologia relatada variando de 3 a 10 seções espaçadas uniformemente(Tabela 1)31,32,33,34,35,36. Uma razão I:M de 0,8 com um desvio padrão de 0,29 (n=11) pode ser esperada usando esta metodologia (Intervalo: 0,54-1,51). Nós e outros já relatamos a microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) fornece uma nova abordagem para visualizar lesões arterials19,37. O LSFM permite a imagem de toda a artéria carótida no plano x, y e z. O LSFM permite que o corte óptico gere seções transversais arterials para análise, produzindo estimativas mais precisas de hiperplasia (coeficiente de variação: 28% por LSFM vs 41% por histologia) do que as abordagens histológicas tradicionais19,37. Como visto na Figura 4, a razão I:M obtida pela LSFM (0,86, n=1) é comparável aos resultados obtidos através da análise histológica clássica (0,8 ± 0,29).
Em conclusão, a lesão segmental controlada por pressão recapitula a resposta da lesão arterial que ocorre após procedimentos clínicos de revascularização, tornando-se um modelo ideal para o estudo da fisiopatologia da restenose. A aplicação de medicamentos periadventiais é um método útil de entrega de prova de conceito para avaliar a eficácia terapêutica da entrega local de medicamentos, e pode informar o desenvolvimento de abordagens de entrega de medicamentos sistêmicos direcionadas.
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Disclosures
Os autores declaram que não há conflitos de interesse em relação à publicação deste manuscrito.
Acknowledgments
A N.E.B. foi apoiada por uma bolsa de treinamento do Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental (5T32ES007126-35, 2018), e uma bolsa de pré-doutorado da American Heart Association (20PRE35120321). E.S.M.B. foi um estudioso da KL2 parcialmente apoiado pelo Programa de Acadêmicos do UnC Clinical and Translational Science Award-K12 (KL2TR002490, 2018), e pelo National Heart, Lung, and Blood Institute (K01HL145354). Os autores agradecem ao Dr. Pablo Ariel, do Laboratório de Serviços de Microscopia da UNC, por ajudar na LSFM. A Microscopia de Fluorescência de Folha de Luz foi realizada no Laboratório de Serviços de Microscopia. O Laboratório de Serviços de Microscopia, Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial, é apoiado em parte pela bolsa de apoio do Centro de Câncer P30 CA016086 ao Centro de Câncer Integral UNC Lineberger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | Fisher | 14955450 | |
| 1 mL Syringe with needle | BD | 309626 | |
| 2 French Fogarty Balloon Embolectomy Catheter | Edwards LifeSciences | 120602F | |
| 4-0 Ethilon (Nylon) Suture | Ethicon Inc | 662H | |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon Inc | J214H | |
| 7-0 Prolene Suture | Ethicon Inc | 8800H | |
| 70% ethyl alcohol | |||
| Anti-Rabbit Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21245 | |
| Atropine Sulfate | Vedco Inc | for veterinary use | |
| Cotton Swabs | Puritan | 806-WC | |
| Curved Hemostats | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Fine Curved Forceps | Fine Science Tools | 11203-25 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Gauze | Covidien | 2252 | |
| IHC-Tek Diluent (pH 7.4) | IHC World | IW-1000 | |
| Insufflator | Merit Medical | IN4130 | |
| Iodine solution | |||
| Lubricating Eye Ointment | Dechra | for veterinary use | |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| Micro-Serrefine Clamp Applying Forceps | Fine Science Tools | 18057-14 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 12003-15 | |
| Pluronic-127 (diluted in sterile water) | Sigma-Aldrich | P2443 | 25% prepared |
| Rabbit Anti-CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Retractor | Bent paper clips work well | ||
| Rimadyl (Carprofen) | Zoetis Inc | for veterinary use | |
| Saline solution | |||
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Sterile Drape | Dynarex | 4410 | |
| T-Pins |
References
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