Summary
הליך זה מתאר את אוסף אזורי המוח קפוא בנפרד כדי להשיג חלבון באיכות גבוהה ו-RNA באמצעות כלים זולים וזמינים בדרך כלל.
Abstract
כמו ההבנה שלנו של נוירוביולוגיה התקדמה, ניתוחים מולקולריים מבוצעים לעתים קרובות על אזורים במוח קטן כגון קליפת האמצעי המדינטלית (mPFC) או גרעין accumbens. האתגר בעבודה זו הוא לנתח את השטח הנכון תוך שמירה על המיקרו-סביבה להיבדק. במאמר זה, אנו מתארים שיטה פשוטה, בעלות נמוכה באמצעות משאבים זמינים ברוב המעבדות. שיטה זו שומרת על חומצת גרעין וחלבונים על ידי שמירה על הרקמה הקפואה לאורך כל התהליך. המוח הם חתכו לתוך 0.5 – 1.0 מקטעים באמצעות מטריצה המוח מסודרים על צלחת זכוכית קפואה. ציוני דרך בכל מקטע מושווים להפניה, כגון אטלס המוח של אלן העכבר, והאזורים הם גזור באמצעות איזמל קר או אגרוף ביופסיה. הרקמה מאוחסנת לאחר מכן ב-80 ° צ' עד השימוש. באמצעות זה עכברוש ועכבר התהליך mPFC, גרעין accumbens, ההיפוקמפוס והיפוגולי ואזורים אחרים נותחו בהצלחה באמצעות רביעיית-PCR ומערב assays. שיטה זו מוגבלת לאזורי מוח שניתן לזהותה באמצעות ציוני דרך ברורים.
Introduction
עבודה זו ממחישה את הניתוח של אזורי המוח קפוא להפקת חומצה גרעין באיכות גבוהה או חלבון באמצעות התייחסות, כגון המוח העכבר אלן אטלס1, כמדריך. בטכניקה זו, המוחות מוקפאים ומאוחסנים ב-80 ° c לצורך הצבה מאוחרת יותר ולאחר החיתוך תוך כדי תחזוקה במצב קפוא. תהליך זה מאפשר לחוקר לקצור מספר רב של מוחות בפגישה אחת ולאחר מכן לנתח אותם לאוסף מדויק של אזורי מוח מרובים.
האוסף המדויק של אזורי המוח המעניינים (ROIs) נדרש לעתים קרובות כאשר מענות על שאלות הקשורות לביטוי הגן והחלבון. בעוד פרמקולוגיה, אלקטרופיזיולוגיה ו אלקטרואופטיקה ניתן להשתמש על סוג wildtype מכרסמים מהונדסים גנטית כדי לעזור להבהיר שינויים מולקולריים הצמדת התנהגויות שנצפו2,3,4, המדידה של שינויים המושרה ב transcript ו פרוטמס משמש לעתים קרובות כדי לתמוך בממצאים אלה. טכניקות כגון שעתוק הפוכה כמותית תגובת שרשרת פולימראז (RT-qPCR), בלוק מערבי, RNAseq5, mapseq6 ו כדיקות7 הם חזקים יחסית נמוך בעלות, המאפשר מעבדות רבות ללמוד שינויים מולקולריים המושרה בתוך מחוזות המוח הקטן2,4,5,6.
ישנן מספר דרכים כדי לחלץ ולטהר חומצות גרעין או חלבון מאזורי המוח8,9,10,11,12. מעבדות רבות הקציר אזורי המוח על ידי מצמרר וחיתוך המוח על הקרח בזמן הקציר9,13. בעוד גישה זו יכולה לגרום חומצה גרעין באיכות גבוהה וחלבון, זה קצת זמן מוגבל כמו השפלה בתוך מיקרוסביבה של הרקמה עשויה להתרחש בטמפרטורות אלה. זה יכול להיות נכון במיוחד כאשר מנסים לנתח מספר גדול של בעלי חיים או ROIs בישיבה אחת. שמירה על דגימות קפוא מסייע לשמור יציב משך מולקולות היעד תוך מתן זמן החוקר להשוות בקפידה ציוני דרך משני הצדדים של כל קטע במאמץ לאסוף דגימות טהור יחסית. לכידת לייזר היא דרך נוספת לאסוף רקמות עבור RNA או ניתוח חלבון מאזורי המוח10. הליך זה הוא מעולה לניתוח מכני באותו ROIs קטן מאוד בצורה לא סדירה ניתן לזהות ולבודד. עם זאת, לכידת לייזר מוגבל על ידי שימוש של ציוד יקר ריאגנטים, הוא זמן רב ועלול גם להיות פגיע יותר לירידה במדגם.
ניתוח micropunch ' על רקמות קפואות הוא לא חדש. מאמרים מוקדמים של מיקלוס פאלקוביץ ' ואחרים מתארים את הטכניקות הבסיסיות בפירוט14,15. מצגת זו בעיקר לאחר העבודה המקורית, עם כמה שיפורים כדי להקל על היעילות ולהקטין את ההוצאות של הציוד הדרוש. למשל, מקטעים מהמוח נעשים בבלוק מוחי קפוא ולא בקריוסטט. זה מייצר סעיפים עבה יותר אשר מפחית את מספר הסעיפים הדרושים כדי לאסוף דגימות ROI. שיטה זו גם מבתר דגימות על צלחת זכוכית קפואה שיושבת על קרח יבש בתוך קופסה מבודדת. זה יוצר שלב מקפיא בספסל שעליו לעבוד. מקטעים גזור בדרך זו הם מניקל בקלות לתרגום, המאפשר לחוקר להשוות את שני הצדדים של כל מקטע עם התייחסות על מנת להגביל את הזיהום מאזורים מחוץ ROI הרצוי.
היתרונות של פרוטוקול זה הם 1) המוח נשמר במצב קפוא לאורך כל התהליך, אשר מסייע לשמר את חומצות החלבון והגרעין ונותן את הזמן החוקר ROIs הקציר בזהירות, ו 2) ריאגנטים נדרש הם זולים נמצאים במעבדות הביולוגיה המולקולרית ביותר. בתהליך זה, מוחות שלמים מנות עד 0.5-1.0 מ"מ במטריצת מוח ומניחים על צלחת זכוכית קפואה כי הוא מקורר ברציפות עם קרח יבש. ציוני דרך שנמצאו במוח אלן אטלס1 או אטלסים המוח אחרים16,17 משמשים כדי לזהות אזורים של עניין, אשר לאחר מכן לגזור באמצעות אגרוף קר או אזמל. כי הרקמה מעולם לא הופפה, אזורים שנקטפו באופן זה לספק באיכות גבוהה RNA וחלבונים עבור ניתוחי במורד הזרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
בעלי חיים המשמשים במחקר זה טופלו בצורה אתית והומאני כפי שנקבעו על ידי בעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת אינדיאנה והשתמש הוועדה (IACUC) והמכון הלאומי לבריאות (NIH) הנחיות.
הערה: כל הכלים והמשטחים צריך להיות שטף עם הממס המתאים כדי להסיר נוקלאוסים18 לפני תחילת כל עבודה.
1. אחסון מוחות
- במהירות להסיר את המוחות מCD1 מורדמים עכברים מסוג wildtype במשקל כ 30 g באמצעות גישה קונבנציונלית13 ו-flash הקפאה עבור 60 שניות בחנקן נוזלי או איזופנטאן pre-מקורר עם קרח יבש.
- אחסן מוחות קפואים ב-80 ° צ' ברדיד אלומיניום או בצינורות חרוטיים עד השימוש.
2. הכנת מטריצת המוח
- עשרים וארבע שעות לפני שהוא מבתר את הרקמה, מניחים מטריצת מוח נקיה (ראו לוח חומרים) על ערימת חבילות הקפאה מופשרים. כריך את הצדדים של המטריצה בין שתי חבילות המקפיא מוודאים לעזוב כ 0.5 ס מ בין החלק התחתון של חריצי תער לבין החלק העליון של חבילות ג'ל (איור 1A). מניחים רדיד אלומיניום על הקצוות כדי לסייע בקירור.
הערה: בעת רכישת מטריצת מוח, קנה אחת שהיא גדולה מספיק כדי לאפשר במקרה את נפח המוח כולו כדי לגזור. - מניחים את התיבה המכילה את מטריצת המוח ואת חבילות ההקפאה במקפיא של 20 ° c עם הטופ אג'ר בן לילה.
3. הגדרת צלחת זכוכית קפואה
הערה: מטרת ההתקנה היא להכין משטח קפוא שעליו לנתח את חתכי המוח.
- מניחים קרח בקופסה מבודדת עד כ 5 ס מ מלמעלה. ואז מניחים שכבה 2.5 ס מ של קרח יבש על גבי הקרח וכיסוי עם יריעות פלסטיק שחור כדי לסייע בהמחיש את המדגם (איור 1B, איור 1b).
- מניחים צלחת זכוכית (צריך רק להתאים את הפתיחה של התיבה) על גבי פלסטיק ומניחים קרח יבש על גבי הצלחת בפינות הרחוק (איור 1C).
- לקחת את מטריצת המוח קפוא מהמקפיא ולהכניס את המוח כדי לחתוך את הקליפה בצד. אפשר לו לשנות את הטמפרטורה בתיבה במשך 10 דקות. שמור את המכסה על התיבה בזמן זה.
- כוונן את מיקומו של המוח במטריצה עם מלקחיים קרים כך שסינוס המשונן והסינוס הרוחבי יהיו בשורה עם החריצים הניצבים בגוש הבלוק (איור 1D). פעולה זו תסייע להבטיח מקטעים סימטריים עבור ניתוח קל יותר. לגעת קצות מלקחיים לקרח יבש לזמן קצר לפני התאמת המוח.
- לאחר המוח נמצא בעמדה, המקום להב תער מקורר ליד המרכז שלו ולחץ על הלהב כ 1 מ"מ לתוך הרקמה. הוסף להבים מקורר לקצוות rostral ו caudal כדי לעזור להחזיק את המוח במקום (איור 2A ואיור 2a).
- החל מהקצה הrostral, הוסף להבים אחד בכל פעם, הצבת אותם לתוך החריצים והקשה עליהם בעדינות למטה לתוך הרקמה כ 1 מ"מ (איור 2B). המשך להוסיף להבים במרווחי זמן של 1 מ"מ העובדים לקראת סוף caudal.
- תוודא שהמוח לא משתנה. בזמן הזה בשורה להבים אופקית ואנכית (איור 2B). כדי לגזור סעיפים לרוחב 0.5 מ"מ, פרופיל נמוך להבי מיקרוטומה (ראה טבלת חומרים) ניתן להשתמש. הניחו אותם בין סכיני גילוח גדולים יותר (איור 2 ג).
- ברגע שלהבים נמצאים במקומם, לחץ על החלק העליון של הקבוצה עם האצבעות, כף היד או משטח שטוח אחר (איור 2C, איור 2c). רוק את קבוצת להבים לאט מצד לצד כדי להעביר אותם דרך הרקמה.
הערה: הדבר עשוי להימשך זמן מה (1 – 2 דקות) ודורש סבלנות. צריכה להיות התנגדות ללהבים. שזזות דרך הרקמה כניסה קלה פירושה המוח הוא הפשרה ואת הבלוק צריך להיות מקורר עם קרח יבש. - כאשר כל הלהבים הגיעו לתחתית החריצים, אחוז בכל צד של קבוצת הלהבים והעבודה החופשית של המטריצה על ידי הנדנדה הלוך ושוב.
הערה: תרגיל זהירות כדי להימנע מגזירת עצמך על הקצוות החדים של הלהבים. - לאחר הקבוצה היא חופשית, למקם את הערימה, rostral בצד למעלה, על צלחת הזכוכית (איור 2E). הניחו קרח יבש לצד ו/או על גבי המחסנית כדי להקפיא עוד יותר את הדגימות לצורך הפרדה קלה יותר.
- מניחים את המחסנית עם קצוות חדים על צלחת הזכוכית ועל להבים נפרדים על ידי העברת המחסנית בין האגודלים והאצבעות. הלהבים צריכים להיפרד זה מזה עם מקטעים מחוברים.
- השורה סעיפים על צלחת זכוכית מ rostral כדי caudal (איור 2F).
- רקמה נפרדת מהלהבים על ידי להבים מכבישה בין אצבעות, או על ידי הפרדה עם תער קר שני (דמויות 2G, 2G, 2G).
4. חתכי ניתוח
- פתח את המוח אלן עכבר אטלס או הפניה אחרת ולמצוא ציוני דרך הנחוצים כדי לזהות אזורים של עניין. כמה מהאתרים הבולטים כוללים את המנה הקדמית של המזנון, את מספר החדרים לרוחב, ואת ההיפוקמפוס (איור 3).
- הפוך את המקטע לגזור עם מלקחיים מקורר ולוודא שהאזור שעומד לאסוף הוא עקבי לאורך כל הקטע. במהלך הקציר, להתייעץ אטלס התייחסות לעתים קרובות כדי לוודא את ההחזר הנכון מושגת.
הערה: זכוכית מגדלת או מיקרוסקופ מבתר מועילים לעתים קרובות בתהליך זה. גם תאורה טובה הכרחית. מנורות LED בהספק נמוך או מנורה קרירה (ראה טבלת חומרים) יכולה לשמש למטרה זו. - עם אזמל נקי או פונץ ', חותכים לתוך המקטע (איור 4). Prechill כל כלי לפני חיתוך על ידי נגיעה בו לזמן קצר כדי קרח יבש. דחפו את הלהב בעדינות אך בחוזקה לתוך הרקמה, מטלטל אותו הלוך ושוב כדי לבצע את החיתוך. אל תדחפי חזק מדי או שרקמת העור תהיה בסדר.
הערה: כלים יתחממו לאורך זמן. להבי מחומם מעט יכול להועיל בעשיית חתכים נקיים והוא יכול להגביל שבירה, אבל להיות זהירים כדי למנוע היפיית הרקמה. מדי פעם מקררים כלים על קרח יבש. - לאחר ההחזר הוא נקצרו, מניחים אותו לתוך תווית, מקורר 1.5 mL צינורות. אחסן רקמות שנקטפו ב-80 ° צ' עד הצורך.
- לעבד רקמה קפואה שנאסף באופן זה על ידי הוספת מאגר ריפה קר (50 mM טריס, pH 8.0, 150 מ"מ הנאל, 1% טריטון X-100, 0.1% SDS, 0.5% ברנשים ומעכבי החלבון קוקטייל (ראה טבלת חומרים)) עבור חילוץ חלבונים, או guanidinium-מכיל ממיס (ראה טבלת חומרים) להפקת RNA למדגם קפוא המהגון מיידית באמצעות dounce זכוכית או הומוגנגניצר מכני (ראה לוח חומרים). בדרך זו, מעכבי פרוטאז ו נוקלאז הם במקום כמו המדגם מחמם כדי להגן על חומצות חלבון וגרעין מפני השפלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על מנת לאמת את השיטה, הקליפה הפרונטלית המדידית נאסף מן המבוגר CD1 wildtype עכברים זכרים ו-RNA וחלבונים חולצו ומאופיין. רנ א נותח על ידי אלקטרופורזה קפילר. מושפל RNA מציג אובדן באינטנסיביות של להקות הריבוזומבית 28S ו-18S ומציג גם מוצרי השפלה ככתם בין 25 ו 200 נוקלאוטידים (איור 5A, לדוגמה 1). באיכות גבוהה RNA מראה להקות ריבוזומטיות נפרדות עם מעט לא אות באזור המשקל המולקולרי התחתון (איור 5A, מדגם 2). מספרי שלמות RNA (RINs) נוצרים גם הם בניתוח זה. RINs מעל 7 מצביעים על איכות טובה RNA19. RNA מבודד מדגימות באמצעות שיטת החיתוך הקפואה להציג פסים חזקים הריבוזומבית וערכי RIN גבוה השוואת לטובה מאוד עם RNA המוכן מרקמת שנקטפו טרי (איור 5B).
אחד היתרונות של שיטה זו הוא כי מספר גדול של מוחות ניתן לקצור במהירות ומאוחסן באחד יושב להיות גזור בזהירות במועד מאוחר יותר. ROIs יכול גם להיות מאוחסן ללא הרקמות להיות מופשרים. עם שיטה זו, חוקר יכול לאסוף אוסף גדול ומגוון של ROIs שממנו חומצה גרעין באיכות גבוהה או חלבון ניתן להשיג. כדי לאשר את הנקודה הזו, רנ א הופק mPFC גזור כי היה מאוחסן במשך מספר שבועות (המוח שנקטפו היה מאוחסן במשך כמה חודשים). כל הדגימות המיוצר RNA באיכות גבוהה עם פסים וריבוזומבית ברורים RINs מעל 8 (איור 5C).
ניתוח כתמי מערביות שימש כדי לאשר את שלמות החלבון של גזור mPFC קפוא כפי שתיאר בעבר20. הכלים מערביים להציג אות מופחתת של מטרות משקל מולקולרי גבוה כאשר החלבון מושפל. מוצרי השפלה מופיעים גם ככתם במשקולות מולקולריות נמוכות יותר בתוך הטור. עבור ניתוח זה חלבון שנאסף, הועבר ניטרוצלולוזה, ובחן עם נוגדנים נגד מטרה מולקולרית גבוהה משקל, KCC2, ואת החלבון משקל מולקולרי נמוך, אקטין (איור 5d). בכל המקרים, הלהקות היו חדות וברורות ללא מוצרי התמוטטות KCC2 או actin. ניסויים אלה מאשרים כי הניתוח של ROIs באמצעות שיטה זו מאפשר הפקת RNA וחלבון באיכות גבוהה.
איור 1: הכנת משטחי עבודה קפואים. (א) בלוק מוח מוצב על ערימת חבילות ג'ל בתוך קופסה מבודדת ולאחר מכן הוא דחוקה בין שתי חבילות ג'ל נוספות. רדיד אלומיניום הוא ארוז בכל קצה של הבלוק כדי להקל על הקירור במהלך הזמן. התיבה מקורר לאחר הלילה ב-20 ° c. (ב) צלחת זכוכית מתאימה לגודל עם פתיחת קופסה מבודדת. ניתן להשתמש בתיבת משלוח למטרה זו. קרח מתווסף לתיבה עד שהוא כ 5 ס מ מלמעלה. לאחר מכן התיבה קפואה למשך הלילה ב-20 ° c. (ב, ג) ממש לפני איסוף הרקמה, שכבה אחידה של קרח יבש מונחת על גבי הקרח בעומק של כ 2.5 ס מ. גיליון של פלסטיק שחור (כדי לסייע בהדמיה) ממוקם על הקרח היבש ואחריו צלחת הזכוכית. קרח יבש ממוקם בפינות הרחוק, אשר מתקרר את האוויר ממש מעל הצלחת. כלים יכולים להיות מקורר על ידי הנחת אותם על הצלחת, או על ידי נגיעה בזמן קצר לקרח יבש. (ד) כדי להבטיח סעיפים סימטריים, המוח צריך להיות ממוקם עם מלקחיים קר כך את הסינוס המשונן ואת הסינוס הרוחבי למעלה עם חריצים הניצב של הבלוק (חיצים לבנים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: המוח החוסם באמצעות מחסום מוח. (א) התמצאות המוח מעוגנת על ידי מקומות ישיבה קונבנציונליים להבים הקצה היחיד לתוך הקליפה בעומק של כ 1 מ"מ. מיקום אחד באמצע ואחד בכל קצה מסייע להחזיק את המוח במקומו. (ב) הוסף להבים אחד בכל פעם עד שכל החריצים מתמלאים. (ג) להבים לפרופיל נמוך ניתן להוסיף בין להבים קונבנציונליים כאשר מקטעים 0.5 מ"מ רצוי (חץ אדום). (ג, ד) קבוצת הלהבים נדחפה לתוך הרקמה הקפואה עם לחץ כלפי מטה מתון, תוך שימוש בכלי שטוח או בכף היד או באצבעות ידו. להבים יכול להיות באיטיות התנדנד הלוך ושוב כדי לעזור להעביר אותם דרך הרקמה. (ה) סעיפים מוסרים על ידי האוחז בדפנות סכיני הגילוח ובאמצעות תנועה מתנדנדת ולחץ כלפי מעלה (שים לב: היזהר להימנע מקצוות חדים של הלהבים). להרים את הקבוצה מתוך הבלוק ולמקם אותו בצד הקדמי על צלחת זכוכית קפואה. הניחו קרח יבש סמוך ללהבים כדי לצנן את החלקים לפני הפרדה. (ו) להפריד להבים ולהניח חלקים בסדר. (ז, ח) מקטעים ניתן להסיר מלהבים על ידי להב מכבישה מעט עם אצבעות לכיוון החצים ודוחף את הקטע עם להב קר שני. (I) חלק מהסעיפים עשויים לדרוש הסרה על ידי התחממות מעט להב תער בין האצבעות ואת האגודלים ולאחר מכן במהירות לחתוך את החלק הקפוא עם להב קר שני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: קביעת ROIs באמצעות ציוני דרך ואת המוח אלן העכבר אטלס. בדוגמה זו, מקטעי המוח קפוא הם בצד שמאל עם לוחות המתאימים של המוח העכבר של אלן אטלס בצד ימין. ROIs (קווי מתאר אדומים מנוקדים) מזוהים על ידי השוואת ציוני דרך גלויים (צורות שחורות) אל אטלס המוח של העכבר אלן. ציוני דרך כוללים: פא ו-cc, קורפוס callosum, aco, comm, הקדמי, השישי, החדר הצדדי, V3, שלישי venticle. לדוגמה ROIs: Pl/Il, קליפת המוח הלימבית והפרטי, ACB, גרעין accumbens, MOs, קליפת המנוע, CP, cauutamen, HPF, ההיפוקמפוס/משחק gyrus. תמונות אטלס הקורואליות על הזכות הנכונה: מכון אלן. תמונות הן מצלחות 40, 44, 55 ו 71 (מלמעלה למטה) והתקבלו מ https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מתנגדים rois. (א) סעיפים מטופלים באמצעות מלקחיים הצוננים מעת לעת על קרח יבש. שני הצדדים של כל קטע צריך להיות מושווה עם תמונות אטלס המקביל לפני הקרע. (ב) rois מוסרים מסעיפים המוח עם אזמל קר או (ג) ביופסיה אגרוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח RNA וחלבון באמצעות שיטת ניתוח המוח הקפואה. (א) דוגמה לעניים לעומת RNA באיכות טובה. הפרדה אלקטרופיניטית של דוגמה 1 מציג את ה-RNA עם הרצועות החלשות של 28 ו-18S ומוצרי השפלה בין 25 ל-200 נוקלאוטידים (nt). לדוגמה 2 מציגה באיכות טובה RNA עם להקות 28S חזק ו-18S וסימן קטן במשקולות מולקולריות נמוכות. מספרי שלמות RNA משקפים הבדל זה עם מדגם 1, RIN = 2.5 ומדגם 2, רין = 8.6. (ב) השוואה של RNA שהופק מקפואה לעומת קליפת המוח הקדם-פרונטלית הטרייה של עכברים. דגימות קפואות נשמרו ב-80 ° c במשך מספר חודשים לפני הניתוח. דגימות טריות עובדו מיד לאחר המסיק. הערכים רין מדגימות שנאספו באמצעות שתי השיטות הן גבוהות, עם חזק 18S ו-28 להקות המציינות כי חומצת גרעין נשמר. (ג, ד) mpfc היה גזור מהמוח קפוא ו-RNA או חלבון חולצו. (ג) ניתוח rna מראה איכות טובה RNA הושגה עבור כל שנים עשר דגימות עם rins גבוהה ומוצר השפלה קטן נצפתה. (ד) ניתוח כתמי מערבי נעשה על חלבון מוחלט היה נחקר לנוכחות של המשקל המולקולרי הגבוה KCC2 ion ערוץ (להקות אדומות, MW = 130 kda). הלהקה KCC2 בבירור גלוי ללא התמוטטות מולקולרית משקל נמוך התפלגות מוצרים שנצפו. הגן משק הבית, Actin (ירוק להקות, MW = 42 kDa) מוצג גם. mPFC דגימות מ 12 מוחות מסומנים 1-12. WB מייצג שליטה מוחית כולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבודה זו מתארת טכניקה לבודד אזורים קטנים וספציפיים של המוח תוך הגבלת השפלה של חומצת גרעין וחלבונים. נזק לרקמות המוח קורה. במהירות ברגע שאורגניזם מת זה באופן חלקי בשל הצטברות מהירה של גלוטמט החילוץ ואת ההתרגשות הנובעת שמתרחשת21. שליח RNA פגיע במיוחד להשפלה22,23. פירוט של חומצות חלבון וגרעין מופחת מאוד בטמפרטורות נמוכות כפי שמעידים על ידי המאמר האחרון המתאר פעילות ביולוגית בתאים ממותה קפוא בתוך קפואה 28,000 שנים לפני24.
עם השיטה המתוארת לעיל, המוח הם הצמד קפוא כלים ורקמות נשמרים מתחת לקפוא עד חומצות גרעין או חילוץ החלבון הוא התחיל. Rois קפוא ואז הומוגניים במאגר המכיל פרוטאז ו נוקלאז מעכבי, הגנה על מולקולות היעד מפני השפלה בטמפרטורות גבוהות יותר.
בתהליך זה, חשוב לזהות ציוני דרך ברורים כדי לאתר את ROIs בתוך המקטעים. שולי הסיבים הקדמי של המנה הקדמית של המזנון וה, העבודה הטובה ביותר למטרה זו, כמו החדרים. שינויים בצורה של ההיפוקמפוס כמו אחד מהלכים הקדמי לאחורי יכול לשמש גם. תלוי כמה טוב המוח מיושר במטריצה, ציוני דרך עשויים להיות מוטה, או חסר. יש לנקוט זהירות לפני איסוף ROIs ממקטעים כאלה כאזורים מזהם עלולים להסתיים במדגם. לפני האיסוף, יש לבדוק את התשואה על שני צידי המקטע כדי לוודא שהוא עקבי בכל המקטע. החיתוך של ROIs מוגבל לאזורים מוגדרים היטב של המוח, כי הם גדולים יותר מ-1 מ"מ בממד x-y.
כאשר מבתר ROIs, יש צורך לשמור על הרקמות קפוא מבלי להפוך אותם שבירים מדי. כאשר הלחץ מוחל. עם מהלומה או סכין לעתים קרובות קשה לזהות את אזור העניין מקטעים אחרים כאשר זה קורה. דרך אחת להמתיק זאת היא להעביר בקצרה את המקטעים לאזור חם יותר של הצלחת (הרחק מהקרח היבש). חשוב גם להשאיר את צלחת הזכוכית נקייה. לאחר מעבד קטע, הצלחת צריך להיות מגורד נקי עם סכין גילוח לפני שהוא ממשיך הלאה. עם הזמן, מים יהיה לדחוס את לוחית החיתוך מן האוויר אשר עשוי לכסות או להפריע בזיהוי לדוגמה. ניקוי הצלחת נעשית על ידי גירוד הקצה החד של להב תער על פני השטח של הזכוכית ומנגב את הכפור ופסולת שנאספו. ROIs קטן להיות זהה שברי מוח בלתי רצויים כך חשוב מאוד לשמור על שטח עבודה נקי.
מעבדות רבות להשתמש מוצרים מסחריים25 כדי להגן על RNA ברקמות שנקטפו. בעוד מולקולות יציב משך שמורים היטב בדרך זו, חיסרון אחד הוא כי המבנה של הרקמה השתנתה באופן רדיקלי. כתוצאה מכך, ייתכן שיהיה קשה למצוא את אזורי העניין באמצעות מפות התייחסות. מבתר ROIs מ הצמד מוחות קפואים לפני השימוש במוצרים אלה עשוי להיות אופציה טובה יותר.
למרות שאנחנו מתמקדים בפרוסות ילתית בעבודה זו, שיטה זו אמורה לפעול היטב עבור אופק ו משונן מקטעים. מפות עבור כיוונים אלה הם בדרך כלל נמוך יותר ברזולוציה לעומת אלה עבור סעיפים ילתית. עם זאת, זה משתנה במהירות עם יוזמות מקבוצות כמו מכון המוח אלן. שיקול נוסף הוא גיל החיה בקציר. המבנה של מוחות בעלי חיים צעירים הוא שונה מאוד מזה של המבוגר ידרוש אטלס מיוחד מטריקס המוח בגודל שונה. משאבים כמו מפתח המוח העכבר אטלס26 חיוניים באיסוף דגימות מוח מדויק של עכברים צעירים.
עבודה זו מתארת תהליך שניתן להשתמש בו כדי לקצור אזורים קטנים מתוך המוח מכרסם. המבנה של סעיפים נשמר היטב עם חיתוך קפוא, כמו הרקמות נשמרות קפוא מקציר לחילוץ, האיכות של חומצות גרעין וחלבון הוא גבוה. תהליך זה יש את היתרון על הניתוח של רקמות שנאספו טרי כמו מוח לדוגמה מקבוצה גדולה של בעלי חיים ניתן לאסוף ולאחסן במהירות. אזורים בתוך המוח יכולים להיות מזוהים באמצעות ציוני דרך המזוהים ב-אטלסים המוח המשותף ונאסף בקצב זהיר מבלי לאבד מולקולות היעד. שיטה זו עשויה להיות אופציה טובה עבור מעבדות מסוימות כמו כלים וההנהלה צורך הם זולים וזמינים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי ה-NIH, DA043982 ו-DA046196.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Mouse coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 505C | Cutting block |
| 0.5 mm Rat coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 705C | Cutting block |
| 1.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-01 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Dot Scientific | 229443 | For storing frozen ROIs |
| 1.5 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-02 | |
| 2.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-03 | |
| 4-12% NuPage gel | Invitrogen | NPO323BOX | protein gradient gel |
| Bioanalyzer System | Agilent | 2100 | RNA analysis system |
| Dounce tissue grinder | Millipore Sigma | D8938 |
Glass tissue homogenizer |
| Dry Ice | |||
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner Industries Inc. | Model 180 | Cool lamp |
| Glass plates | LabRepCo | 11074010 | |
| HALT | ThermoFisher | 78440 | protease inhibitor cocktail |
| Low profile blades | Sakura Finetek USA Inc. | 4689 | |
| mouse anti-actin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | JLA20 | Antibody |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Used in initial RNA purity analysis |
| No. 15 surgical blade | Surgical Design Inc | 17467673 | |
| Odyssey Blocking buffer | LiCor Biosciences | 927-40000 | Western blocking reagent |
| Omni Tissue Master 125 | VWR | 10046-866 | Tissue homogenizer |
| rabbit anti-KCC2 antibody | Cell Signaling Technology | 94725S | Antibody |
| RNA Plus Micro Kit | Qiagen | 73034 | Used to extract RNA from small tissue samples |
| RNaseZap | Life Technologies | AM9780 | |
| Scalpel handle | Excelta Corp. | 16050103 | |
| Standard razor blades | American Line | 66-0362 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | Used to extract RNA from tissue |
References
- Allen Institute. Allen Mouse Brain Atlas. , Available from: https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas (2008).
- Kuleshova, E. P. Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).
- Scanziani, M., Häusser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461, 930 (2009).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome. Cerebral cortex. 25 (10), New York, N.Y. 3743-3757 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Kebschull, J. M., et al. High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA. bioRxiv. , 054312 (2016).
- Mitulović, G., Mechtler, K. HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments. Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).
- Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics. BMC Research Notes. 4, 314 (2011).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. JoVE. (7), e269 (2007).
- Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C. Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. Murran, G. 1723, Humana Press. 2457 (2018).
- Björk, K., et al. Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity. The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).
- Jeong, H., et al. Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia. Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).
- Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics, Neuromethods. Li, K. W. 57, Humana Press. 13-26 (2011).
- Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 59, 449-450 (1973).
- Palkovits, M. Methods in Enzymology. 103, Academic Press. 368-376 (1983).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. , Academic Press. (2001).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. , Academic Press. (1998).
- RNaseZap. Ambion. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ manuals/cms_056889.pdf (2008).
- Mueller, O. L., Samar,, Schroeder,, Andreas, RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf (2016).
- Scheyer, A. F., et al. Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors. Biological Psychiatry. , (2019).
- Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).
- Guhaniyogi, J., Brewer, G. Regulation of mRNA stability in mammalian cells. Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).
- Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PloS One. 8 (2), 56507 (2013).
- Yamagata, K., et al. Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging. Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).
- Ambion. RNAlater® Tissue Collection: RNA Stabilization Solution. ThermoFisher Sci. , Available from: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf (2011).
- Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute. , Available from: https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas (2008).
