Summary
此过程描述了离散冷冻大脑区域的收集，以便使用廉价和常用的工具获得高质量的蛋白质和RNA。
Abstract
随着我们对神经生物学的理解不断进步，分子分析通常对小大脑区域进行，如前额叶皮质（mPFC）或核积液。这项工作面临的挑战是解剖正确的区域，同时保留要检查的微观环境。在本文中，我们描述了一种使用大多数实验室中现成的资源的简单、低成本的方法。这种方法通过在整个过程中保持组织冻结来保存核酸和蛋白质。大脑使用大脑矩阵被切成0.5~1.0毫米的部分，并排列在冰冻的玻璃板上。每个部分中的地标都与参考进行比较，例如艾伦老鼠脑图集，并使用冷手术刀或活检冲孔对区域进行解剖。然后，组织在-80°C下储存，直到使用。通过这一过程，利用qRT-PCR和西式测定，成功地分析了大鼠和小鼠mPFC、核积液、背和内膜海马和其他区域。此方法仅限于大脑区域，可以通过清晰的地标识别。
Introduction
本研究说明了用参考（如艾伦小鼠脑图集1）提取高质量核酸或蛋白质的冷冻大脑区域的剖面图。在这种技术中，大脑被闪速冷冻，储存在-80°C，以便以后在冷冻条件下进行解剖和解剖。这个过程允许研究人员在一个会话中收获大量的大脑，然后对其进行解剖，以便准确收集多个大脑区域。
在回答与基因和蛋白质表达有关的问题时，通常需要准确收集感兴趣的大脑区域（ROIs）。虽然药理学、电生理学和光遗传学可用于野生型或转基因啮齿动物，以帮助阐明支持观察到行为22、3、43,4的分子变化，但记录和蛋白酶诱导变化的测量常用于支持这些发现。定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）、西印、RNAseq 5、MAPSeq56和HPLC7等技术稳健，成本相对较低，使许多实验室能够研究小脑区2、4、5、64,5,6中的诱导分子2变化。
有几种方法可以,从大脑区域8、9、10、11、129,10提取和纯化核酸811或12蛋白质。许多实验室在收获99、1313时，通过冷却和在冰上切割大脑来收获大脑区域。虽然这种方法可以产生高质量的核酸和蛋白质，但它在一定程度上是有限度的，因为组织微环境中的降解可能发生在这些温度下。当尝试一次解剖大量动物或ROIs时，情况可能尤其如此。保持样品冷冻有助于保持实验室目标分子，同时为研究人员提供时间仔细比较每个部分两侧的地标，以收集相对纯净的样品。激光捕获是从大脑区域10收集RNA或蛋白质分析组织的另一种方法。此过程优于机械解剖，因为可以识别和隔离非常小且形状不规则的 ROI。然而，激光捕获受到昂贵设备和试剂的使用的限制，非常耗时，而且可能更容易样品降解。
冷冻组织的微冲压解剖并不新鲜。米克洛斯·帕尔科维茨等人的早期论文详细描述了基本技术14、15。,15本演示主要遵循原始工作，并进行了一些改进，以提高效率和降低所需设备的费用。例如，大脑部分是在冰冻的大脑块，而不是在低温。这将生成较厚的部分，从而减少收集 ROI 样本所需的部分数。此方法还解剖了位于绝缘盒内干冰上的冷冻玻璃板上的样品。这将在工作台的长凳上产生一个亚冻结阶段。以这种方式解剖的部分很容易操作，使研究人员能够将每个部分的两侧与参考进行比较，以限制来自所需 ROI 以外的区域的污染。
该协议的优点是：1） 大脑在整个过程中保持冷冻状态，这有助于保存蛋白质和核酸，并给研究人员时间仔细收获ROIs，2） 所需的试剂价格低廉，在大多数分子生物学实验室中都有发现。在这个过程中，整个大脑被分割到0.5~1.0毫米的大脑矩阵中，并放置在一个冷冻玻璃板上，不断用干冰冷却。在艾伦脑图集1或其他大脑地图集16，17,17中发现的地标用于识别感兴趣的区域，然后使用冷拳或手术刀进行解剖。由于组织从未解冻，以这种方式收获的区域为下游分析提供高质量的RNA和蛋白质。
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Protocol
正如印第安纳大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）和国家卫生研究院（NIH）指南所规定的，本研究中使用的动物以合乎道德和人道的方式对待。
注：所有工具和表面在开始任何工作之前，应用适当的溶剂清洗，以去除核酸酶18。
1. 储存大脑
- 使用常规方法13快速从安乐死成人CD1野生小鼠中取出大脑，体重约30克，在液氮或用干冰预冷冻的紫杉子中闪冻60秒。
- 将冷冻的大脑储存在-80°C的铝箔或锥形管中，直到使用。
2. 准备大脑矩阵
- 在解剖组织前24小时，在一叠解冻的冷冻包上放置一个干净的大脑矩阵（见材料表）。将矩阵的两侧夹在两个冷冻包之间，确保在剃须刀槽底部和凝胶包顶部之间留出约 0.5 厘米（图1A）。将铝箔放在末端以帮助冷却。
注意：购买大脑矩阵时，购买足够大的基质，以包裹整个大脑体积进行解剖。 - 将装有大脑矩阵和冰柜包的盒子放入 -20°C 冰柜中，并通宵使用顶部半室。
3. 设置冷冻玻璃板
注：此设置的目的是准备一个冻结的表面，在表上解剖大脑部分。
- 将冰块放入距顶部约 5 厘米的绝缘盒中。然后，在冰顶上放置一块2.5厘米的干冰层，用黑色塑料布盖住，以帮助可视化样品（图1B，图1C）。
- 将玻璃板（应正好适合盒子的开口）放在塑料顶部，并将干冰放在远角的板顶部（图1C）。
- 从冰柜中取出冷冻的大脑矩阵，将大脑插入皮层侧。让它与盒子的温度平衡10分钟。在此期间，请把盖子放在盒子上。
- 用冷力调整大脑在矩阵中的位置，使下垂正子和横向正着肠与块的垂直凹槽排列（图1D）。这将有助于确保对称截面更容易解剖。触摸钳子的提示，在调整大脑之前先将冰短暂干燥以冷却。
- 一旦大脑到位，将一个冷却的剃刀刀片靠近其中心，并将刀片压入组织中约 1 mm。将冷却叶片添加到玫瑰和刀尾，以帮助保持大脑就位（图2A和图2B）。
- 从玫瑰端开始，一次添加一个刀片，将它们放入插槽中，然后轻轻地向下压入大约 1 mm 的组织（图2B）。继续以 1 mm 的间隔向烧刀端添加刀片。
- 确保大脑在此期间不会移动。水平和垂直排列刀片（图2B）。为了将截面切割成 0.5 mm 宽度，可以使用薄型微缩刀片（参见材料表）。将这些放在较大的剃刀刀片之间（图2C）。
- 刀片到位后，用手指、手掌或其他平面向下按压组顶部（图 2C，图 2D）。摇动一组叶片，从一边慢慢移动，使其穿过组织。
注：这可能需要一些时间（1⁄2 分钟），需要耐心。对通过组织的刀片应具有阻力。容易进入意味着大脑正在解冻，块应该用干冰冷却。 - 当所有刀片都到达插槽底部时，抓住刀片组的每一侧，通过来回摇动来摆脱矩阵。
注：注意，避免在刀片的锋利边缘割伤自己。 - 一旦组空闲，将堆叠，玫瑰色侧向上，在玻璃板上（图2E）。将干冰放在堆栈旁边和/或顶部，以进一步冻结样品，以便更容易分离。
- 将具有锋利边缘的堆叠放在玻璃板上，并通过在拇指和手指之间移动堆叠来分隔刀片。刀片应彼此分开，并附加部分。
- 在玻璃板上排列从玫瑰色到玻璃板的部分（图2F）。
- 通过在手指之间弯曲刀片，或用第二把冷剃须刀分离（图2G，2H，2I），将组织与刀片分开。
4. 解剖部分
- 打开艾伦老鼠脑图集或其他参考，并找到识别感兴趣区域所必需的地标。一些明显的地标包括前共性、体积素、侧心室和海马（图3）。
- 翻转要用冰镇钳切割的截面，并确保要收集的区域在整个部分保持一致。在收获期间，经常查阅参考地图集，以确保获得正确的 ROI。
注：放大镜或解剖显微镜在这个过程中通常很有帮助。良好的照明也是必不可少的。低功率 LED 灯或冷灯（参见材料表）可用于此目的。 - 使用干净的手术刀或冲孔，切成部分（图4）。在切割前，先将每个刀具短暂接触到干冰中，然后预热每个工具。轻轻将刀片推入纸巾，来回摇动，进行切割。不要太用力，否则组织会断裂。
注：工具会随着时间的推移而变暖。稍微加热的刀片有助于进行干净的切割，并可以限制压裂，但要小心避免组织解冻。定期在干冰上冷却工具。 - 一旦收割 ROI，将其放入标有预冷的 1.5 mL 管中。将收获的纸巾储存在-80°C，直到需要为止。
- 通过添加冷 RIPA 缓冲液（50 mM Tris， pH 8.0， 150 mM NaCl， 1% Triton X-100， 0.1% SDS， 0.5% CHAPS 和蛋白质抑制剂鸡尾酒 （参见材料表） 用于蛋白质提取， 或含有钛的溶剂 （见材料表） 用于将RNA提取到冷冻样品，并立即使用玻璃脱质或机械均质器进行均质化（参见材料表）。通过这种方式，蛋白酶和核酸抑制剂在样品变暖时就位，以保护蛋白质和核酸免受降解。
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Representative Results
为了验证这种方法，从成年CD1野生型雄性小鼠中前皮层采集，提取和特征蛋白质。RNA通过毛细血管电泳分析。降解RNA显示28S和18S核糖体带的强度损失，也显示降解产物作为25至200核苷酸之间的涂片（图5A，样本1）。优质RNA显示不同的核糖体带，在较低的分子量区域几乎没有或没有信号（图5A，样品2）。在此分析中也生成RNA完整性数 （RIN）。高于7的RIN表示高质量的RNA19。使用冷冻解剖方法从样品中分离的RNA显示强核糖带和高RIN值，与新鲜收获组织制备的RNA相比非常有利（图5B）。
这种方法的一个优点是，大量的大脑可以迅速收获并储存在一个坐，以便稍后仔细解剖。ROIs 也可以存储，无需解冻组织。通过这种方法，研究人员可以收集大量多样的ROIs，从中获得高质量的核酸或蛋白质。为了证实这一点，RNA是从被解剖的mPFC中提取的，这种碳化合物已经储存了几个星期（收获的大脑已经储存了几个月）。所有样品都生产出具有明显核糖带和8号核素的高质量RNA（图5C）。
西方印布分析用于确认冷冻解剖mPFC的蛋白质完整性，如前所述的20。当蛋白质降解时，西方印迹显示高分子量目标信号的降低。降解产物也以较低的分子量出现在柱内。"为进行这种分析，收集、转移到硝基纤维素中，并用抗体对高分子量靶点KCC2和分子量较低的蛋白作用素（图5D）进行探查。在所有情况下，带是尖锐和独特的，没有KCC2或行为的可辨别的分解产品。这些实验证实，使用这种方法对ROIs进行解剖，可以提取高质量的RNA和蛋白质。
图 1：准备冻结的工作表面。（A） 大脑块被放置在绝缘盒内的一叠凝胶包上，然后夹在两个额外的凝胶包之间。铝箔在块的两端被包装，便于在切片过程中冷却。然后，在 -20 °C 下冷却一夜。（B） 玻璃板与绝缘盒的开口尺寸相匹配。装运箱可用于此目的。冰被添加到盒子，直到它从顶部约5厘米。然后，盒子在 -20 °C 下冷冻过夜。（B， C）就在收集组织之前，在冰面上放置了一层均匀的干冰，深度约为2.5厘米。一块黑色塑料（有助于可视化）被放置在干冰上，然后是玻璃板。干冰被放置在远角，冷却板上方的空气。工具可以通过将它们放在板上，或短暂地接触到干冰来冷却。（D） 为了确保对称部分，大脑应用冷力定位，使下垂正子和横向正着声与块的垂直凹槽（白色箭头）排列。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：使用脑块分割大脑。（A） 大脑的方向通过将传统的单刃剃须刀刀片放入大约 1 mm 的皮层中固定，将一根放在中间，在两端放置一个，有助于将大脑固定在位置上。（B） 一次添加一个刀片，直到填充所有插槽。（C） 当需要 0.5 mm 截面（红色箭头）时，可在传统刀片之间插入薄型刀片。（C， D）使用扁平仪器或手掌或手指将刀片组推入具有中等向下压力的冷冻组织。刀片可以缓慢地来回摇动，以帮助它们通过组织移动。（E） 通过抓住剃刀刀片的两侧并使用摇摇运动和坚定的向上压力来移除部分（注意：小心避免刀片的锐端）。将组从方块中提起，并将其放在冰冻玻璃板上的前侧。在分离前，将干冰放在叶片旁边，使部分完全冷却。（F） 分开的刀片和布局部分的顺序。（G， H）可以通过用手指向箭头方向稍微弯曲刀片，用第二个冷刀片推开截面，从刀片上拆下截面。（I） 有些部分可能需要移除，只需在手指和拇指之间稍微加热剃刀刀片，然后用第二根冷刀片快速切掉冻结部分。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 3：使用地标和艾伦鼠标脑图集确定 RO。在此示例中，冷冻的大脑部分在左侧，右侧有来自 Allan 鼠标大脑地图集的相应板。通过将可见地标（黑色形状）与艾伦鼠标脑图集进行比较，可以识别 RO（红色虚线轮廓）。地标包括：法和cc，肉体卡松，阿科，前共，VL，侧心室，V3，第三个心室。示例 ROI： Pl/Il， 前体和下形皮层， ACB， 核积液， MOs， 运动皮层， CP， 胆小子， HPF， 海马/丹酸盐陀螺。科罗纳地图集图像在正确的信用：艾伦研究所。图像来自板 40、44、55 和 71（从上到下），是从https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas获得的。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 4：分解 RO。（A） 部分使用在干冰上定期冷藏的钳子处理。在解剖之前，应将每个部分的两侧与相应的地图集图像进行比较。（B） ROIs 通过冷手术刀或 （C） 活检打孔从脑部被移除.请点击此处查看此图形的较大版本。
图5：使用冷冻脑解剖法分析RNA和蛋白质。（A） 劣质RNA与优质RNA的例子。样品1的电泳分离显示降解RNA与弱28S和18S波段和降解产物之间的25至200核苷酸（nt）。样品2显示质量良好的RNA，具有强28S和18S波段，在低分子量下信号小。RNA完整性数反映样本 1、RIN = 2.5 和样本 2、RIN = 8.6 的这种差异。（B） 从冷冻中提取的RNA与小鼠刚解剖的中前皮层的比较。冷冻样品在-80°C下保存数月，然后进行解剖。收获后立即处理新鲜样品。使用这两种方法采集的样本中的RIN值都很高，强18S和28S波段表明核酸已被保存。（C， D） mPFC 是从冷冻的大脑分离的，RNA或蛋白质被提取。（C） RNA分析表明，所有12个样品均获得高质量的RNA，这些样品的RIN含量高，降解产物很少。（D） 对总蛋白进行了西式斑点分析，并针对高分子量 KCC2 ion 通道（红带、MW = 130 kDa）的存在进行了探测。KCC2 波段清晰可见，未观察到较低的分子量分解产物。还显示了内务基因Actin（绿色带，MW = 42 kDa）。来自12个大脑的mPFC样本被标记为1-12。WB代表整个大脑控制。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
本研究描述了一种分离大脑小而特定区域，同时限制核酸和蛋白质降解的技术。一旦有机体死亡，对脑组织的损伤就会迅速发生。这是部分由于细胞外谷氨酸的快速积累和由此产生的兴奋毒性发生21。信使RNA特别容易受到降解22，23。22,蛋白质和核酸的分解在低温下大大减少，最近一篇文章描述了28，000年前冷冻在永冻层中的巨型细胞的生物活性。
使用本文所述的方法，大脑被卡住冷冻，工具和组织保持在冰点以下，直到开始提取核酸或蛋白质。冷冻ROI随后在含有蛋白酶和核酸酶抑制剂的缓冲液中均质化，保护目标分子在高温下不降解。
在此过程中，必须确定明确的地标，以精确定位各节中的 ROIs。前共和体素的纤维块也适合这一目的，心室也一样。海马区的形状的变化，因为一个人移动到后，也可以使用。根据大脑在矩阵中的对齐程度，地标可能会倾斜或缺失。在从类似部分收集 RO 之前，应小心谨慎，因为污染区域可能最终出现在样品中。在收集之前，应在节的两侧检查 ROI，以确保其在整个部分中保持一致。ROIs 的解剖仅限于在 x-y 维度中大于约 1 mm 的大脑定义良好的区域。
在解剖ROIs时，需要保持组织冻结，而不会使它们太脆。当用打孔或手术刀施加压力时，太冷的组织会断裂。发生这种情况时，通常很难从其他片段中识别感兴趣的区域。缓解这种情况的一个方法是将部分短暂移动到板的较暖区域（远离干冰）。保持玻璃板清洁也很重要。处理一节后，应用剃刀刀片擦去板，然后再移动到下一个。随着时间的推移，水会从空气中凝结到解剖板上，从而覆盖或干扰样品识别。清洁板是通过刮刮剃刀刀片的锋利边缘在玻璃表面，并擦拭收集的霜冻和碎片。小型 RO 变得无法区分到不需要的大脑片段，因此保持一个干净的工作区非常重要。
许多实验室使用商业产品25来保护收获组织中的RNA。虽然实验室分子以这种方式保存完好，但一个缺点是组织的形态发生了根本变化。因此，使用参考地图可能难以找到感兴趣的区域。因此，在使用这些产品之前，从卡扣冻结的大脑中分离ROIs可能是一个更好的选择。
尽管我们在这项工作中重点研究了日冕切片，但这种方法应该适用于地平线和下垂部分。与日冕部分相比，这些方向的地图的分辨率通常较低。然而，随着艾伦大脑研究所等团体的倡议，这种情况正在迅速改变。另一个考虑因素是动物在收获时的年龄。幼动物大脑的形态与成人的形态非常不同，需要专门的地图集和不同大小的脑基质。开发小鼠大脑地图集26等资源对于从年轻小鼠那里收集准确的大脑样本至关重要。
这项工作描述了一个过程，可以用来从啮齿动物的大脑内收获小区域。部分的形态通过冷冻切片保存完好，由于组织从收获到提取都保持冷冻，核酸和蛋白质的质量很高。这个过程比新收集的组织有优势，因为从一大群动物的样本大脑可以快速收集和储存。然后，可以使用常见大脑图集中标识的地标来识别大脑中的区域，并仔细收集，而不会丢失目标分子。对于某些实验室来说，此方法可能是一个不错的选择，因为所需的工具和摄政器价格低廉且随时可用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH、DA043982和DA046196的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Mouse coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 505C | Cutting block |
| 0.5 mm Rat coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 705C | Cutting block |
| 1.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-01 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Dot Scientific | 229443 | For storing frozen ROIs |
| 1.5 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-02 | |
| 2.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-03 | |
| 4-12% NuPage gel | Invitrogen | NPO323BOX | protein gradient gel |
| Bioanalyzer System | Agilent | 2100 | RNA analysis system |
| Dounce tissue grinder | Millipore Sigma | D8938 |
Glass tissue homogenizer |
| Dry Ice | |||
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner Industries Inc. | Model 180 | Cool lamp |
| Glass plates | LabRepCo | 11074010 | |
| HALT | ThermoFisher | 78440 | protease inhibitor cocktail |
| Low profile blades | Sakura Finetek USA Inc. | 4689 | |
| mouse anti-actin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | JLA20 | Antibody |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Used in initial RNA purity analysis |
| No. 15 surgical blade | Surgical Design Inc | 17467673 | |
| Odyssey Blocking buffer | LiCor Biosciences | 927-40000 | Western blocking reagent |
| Omni Tissue Master 125 | VWR | 10046-866 | Tissue homogenizer |
| rabbit anti-KCC2 antibody | Cell Signaling Technology | 94725S | Antibody |
| RNA Plus Micro Kit | Qiagen | 73034 | Used to extract RNA from small tissue samples |
| RNaseZap | Life Technologies | AM9780 | |
| Scalpel handle | Excelta Corp. | 16050103 | |
| Standard razor blades | American Line | 66-0362 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | Used to extract RNA from tissue |
References
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