Summary
Dieses Verfahren beschreibt die Sammlung diskreter gefrorener Hirnregionen, um hochwertiges Protein und RNA mit kostengünstigen und allgemein verfügbaren Werkzeugen zu erhalten.
Abstract
Im Verlauf unseres Verständnisses der Neurobiologie werden molekulare Analysen häufig an kleinen Hirnbereichen wie dem medialen präfrontalen Kortex (mPFC) oder Nucleus accumbens durchgeführt. Die Herausforderung bei dieser Arbeit besteht darin, den richtigen Bereich zu sezieren und gleichzeitig die zu untersuchende Mikroumgebung zu erhalten. In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache, kostengünstige Methode, bei der Ressourcen verwendet werden, die in den meisten Labors leicht verfügbar sind. Diese Methode bewahrt Nukleinsäure und Proteine, indem das Gewebe während des gesamten Prozesses eingefroren bleibt. Gehirne werden mit einer Hirnmatrix in 0,5-1,0 mm-Abschnitte geschnitten und auf einer gefrorenen Glasplatte angeordnet. Landmarken innerhalb jedes Abschnitts werden mit einer Referenz verglichen, z. B. der Allen Mouse Brain Atlas, und Regionen werden mit einem kalten Skalpell oder Biopsie-Punch seziert. Gewebe wird dann bei -80 °C bis zur Verwendung gelagert. Durch diesen Prozess wurden Ratten- und Maus-mPFC, Nucleus accumbens, dorsaler und ventraler Hippocampus und andere Regionen erfolgreich mit qRT-PCR und Western Assays analysiert. Diese Methode ist auf Hirnregionen beschränkt, die durch klare Landmarken identifiziert werden können.
Introduction
Diese Arbeit veranschaulicht die Zerlegung von gefrorenen Hirnregionen zur Extraktion von hochwertiger Nukleinsäure oder Protein unter Verwendung eines Verweises, wie z. B. des Allen Mouse Brain Atlas1, als Leitfaden. Bei dieser Technik werden Gehirne blitzgefroren und bei -80 °C für spätere Schnitte und Sezieren gelagert, während sie in einem gefrorenen Zustand gehalten werden. Dieser Prozess ermöglicht es dem Forscher, eine große Anzahl von Gehirnen in einer Sitzung zu ernten und sie später für eine genaue Sammlung mehrerer Hirnregionen zu sezieren.
Die genaue Erfassung von Hirnregionen von Interesse (ROIs) ist oft erforderlich, wenn Fragen im Zusammenhang mit Gen- und Proteinexpression beantwortet werden. Während Pharmakologie, Elektrophysiologie und Optogenetik an Wildtypen oder genetisch veränderten Nagetieren verwendet werden können, um molekulare Veränderungen aufzuklären, die den beobachteten Verhaltensweisen2,3,4zugrunde liegen, wird die Messung induzierter Veränderungen in Transkriptomen und Proteomen häufig verwendet, um diese Befunde zu unterstützen. Techniken wie quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR), Western Blotting, RNAseq5, MAPSeq6 und HPLC7 sind robust und relativ kostengünstig, so dass viele Labore induzierte molekulare Veränderungen innerhalb kleinerHirnregionen2,4,5,6untersuchen können.
Es gibt mehrere Möglichkeiten, Nukleinsäure oder Protein aus Hirnregionen8,9,10,11,12zu extrahieren und zu reinigen. Viele Labore ernten Hirnregionen, indem sie gehirnzum Zeitpunkt der Ernte9,,13auf Eis kühlen und schneiden. Während dieser Ansatz zu hochwertiger Nukleinsäure und Protein führen kann, ist er etwas zeitlich begrenzt, da bei diesen Temperaturen ein Abbau innerhalb der Mikroumgebung des Gewebes stattfinden kann. Dies kann insbesondere dann der Fall sein, wenn versucht wird, eine große Anzahl von Tieren oder ROIs in einer Sitzung zu sezieren. Das Einfrieren von Proben hilft dabei, labile Zielmoleküle zu erhalten und bietet dem Forscher Zeit, um Die Sehenswürdigkeiten auf beiden Seiten jedes Abschnitts sorgfältig zu vergleichen, um relativ reine Proben zu sammeln. Laser-Capture ist eine weitere Möglichkeit, Gewebe für RNA- oder Proteinanalyse aus Hirnbereichen zu sammeln10. Dieses Verfahren ist der mechanischen Zerlegung überlegen, da sehr kleine und unregelmäßig geformte ROIs identifiziert und isoliert werden können. Die Lasererfassung wird jedoch durch den Einsatz teurer Geräte und Reagenzien eingeschränkt, ist zeitaufwändig und kann auch anfälliger für Probendegradation sein.
Micropunch-Sektion auf gefrorenen Geweben ist nicht neu. Frühe Arbeiten von Miklos Palkovits und anderen beschreiben die Grundtechniken im Detail14,15. Diese Präsentation folgt weitgehend der ursprünglichen Arbeit, mit einigen Verbesserungen, um die Effizienz zu erleichtern und die Kosten für die benötigte Ausrüstung zu verringern. Zum Beispiel werden Gehirnabschnitte in einem gefrorenen Hirnblock und nicht auf einem Kryostat hergestellt. Dadurch entstehen dickere Abschnitte, wodurch die Anzahl der Abschnitte reduziert wird, die zum Sammeln von ROI-Proben benötigt werden. Diese Methode seziert auch Proben auf einer gefrorenen Glasplatte, die auf Trockeneis in einer isolierten Box sitzt. Dadurch entsteht eine Untergefrierstufe an der Bank, auf der gearbeitet werden kann. Abschnitte, die auf diese Weise seziert werden, sind leicht manipulierbar, so dass der Forscher beide Seiten jedes Abschnitts mit einer Referenz vergleichen kann, um die Kontamination aus Regionen außerhalb des gewünschten ROI zu begrenzen.
Vorteile dieses Protokolls sind, dass 1) das Gehirn während des gesamten Prozesses in einem gefrorenen Zustand gehalten wird, was hilft, Protein und Nukleinsäure zu erhalten und dem Forscher Zeit gibt, ROIs sorgfältig zu ernten, und 2) die erforderlichen Reagenzien sind kostengünstig und finden sich in den meisten molekularbiologischen Labors. Dabei werden ganze Gehirne in einer Hirnmatrix auf 0,5–1,0 mm geschnitten und auf eine gefrorene Glasplatte gelegt, die kontinuierlich mit Trockeneis gekühlt wird. Landmarken, die im Allen Brain Atlas1 oder anderen Hirnatlanten16,17 gefunden werden, werden verwendet, um Interessengebiete zu identifizieren, die dann entweder mit einem kalten Schlag oder Skalpell seziert werden. Da das Gewebe nie aufgetaut wird, bieten auf diese Weise geerntete Regionen hochwertige RNA und Proteine für nachgelagerte Analysen.
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Protocol
Tiere, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden in einer ethischen und humanen Weise behandelt, wie sie von den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) und der National Institutes of Health (NIH) der Indiana University dargelegt wurden.
HINWEIS: Alle Werkzeuge und Oberflächen sollten mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen werden, um Nukleasen zu entfernen18, bevor Sie mit den Arbeiten beginnen.
1. Speichern von Gehirnen
- Entfernen Sie schnell die Gehirne von eingeschläferten erwachsenen CD1-Wildtypmäusen mit einem Gewicht von ca. 30 g mit einem konventionellen Ansatz13 und Blitzeinfrieren für 60 Sekunden entweder in flüssigem Stickstoff oder ist opentane mit Trockeneis vorgekühlt.
- Gefrorene Gehirne bei -80 °C in Aluminiumfolie oder konischen Rohren lagern, bis sie verwendet werden.
2. Vorbereitung der Hirnmatrix
- 24 Stunden vor der Gewebezerse eine saubere Gehirnmatrix (siehe Materialtabelle)auf einen Stapel aufgetauter Gefrierpackungen. Sandwich die Seiten der Matrix zwischen zwei Gefrierpackungen, die sicherstellen, dass ca. 0,5 cm zwischen der Unterseite der Rasierschlitze und der Oberseite der Gelpackungen(Abbildung 1A). Legen Sie Aluminiumfolie auf die Enden, um bei der Kühlung zu helfen.
HINWEIS: Wenn Sie eine Gehirnmatrix kaufen, kaufen Sie eine, die groß genug ist, um das gesamte Volumen des Gehirns einzuschließen, um seziert zu werden. - Legen Sie die Box mit der Hirnmatrix und Gefrierpackungen in einen -20 °C-Gefrierschrank mit dem oberen Ajar über Nacht.
3. Aufstellen einer gefrorenen Glasplatte
HINWEIS: Der Zweck dieses Setups ist es, eine gefrorene Oberfläche vorzubereiten, auf der Gehirnabschnitte seziert werden können.
- Eis in eine isolierte Box bis ca. 5 cm von oben legen. Legen Sie dann eine 2,5 cm Schicht Trockeneis auf das Eis und Decken mit schwarzen Kunststoffplatten, um die Probe zu visualisieren (Abbildung 1B, Abbildung 1C).
- Legen Sie eine Glasplatte (sollte nur in die Öffnung der Box passen) auf die Oberseite des Kunststoffs und legen Sie Trockeneis auf der Platte in den entfernten Ecken(Abbildung 1C).
- Nehmen Sie die eingefrorene Gehirnmatrix aus dem Gefrierschrank und legen Sie das Gehirn ein, um Cortex-Seite nach oben geschnitten zu werden. Lassen Sie es auf die Temperatur in der Box für 10 min ausdemieren. Halten Sie den Deckel auf der Box während dieser Zeit.
- Passen Sie die Position des Gehirns in der Matrix mit kalten Zangen so an, dass sich die sagittale Sinus und die Quersinus mit den senkrechten Nuten des Blocks anstellen (Abbildung 1D). Dadurch wird sichergestellt, dass symmetrische Abschnitte für eine einfachere Zerlegung gewährleistet werden. Berühren Sie Spitzen der Zange, um Eis kurz zu trocknen, um zu kühlen, bevor Sie das Gehirn anpassen.
- Sobald das Gehirn in Position ist, legen Sie eine gekühlte Rasierklinge in der Nähe ihrer Mitte und drücken Sie die Klinge etwa 1 mm in das Gewebe. Fügen Sie gekühlte Klingen zu den rostralen und kaudalen Enden hinzu, um das Gehirn an Ort und Stelle zu halten (Abbildung 2A und Abbildung 2B).
- Beginnend mit dem rostralen Ende, fügen Sie Klingen nacheinander, legen Sie sie in die Schlitze und drücken Sie sie sanft nach unten in das Gewebe etwa 1 mm (Abbildung 2B). Fügen Sie die Klingen in 1 mm Intervallen in Richtung des kaudalen Endes hinzu.
- Stellen Sie sicher, dass sich das Gehirn während dieser Zeit nicht verschiebt. Line-up-Blades horizontal und vertikal(Abbildung 2B). Um Schnitte in 0,5 mm Breite zu schneiden, können Mikrotomklingen mit niedrigem Profil (siehe Materialtabelle)verwendet werden. Platzieren Sie diese zwischen den größeren Rasierklingen (Abbildung 2C).
- Sobald die Klingen an Ort und Stelle sind, drücken Sie mit Denfingern, Handfläche oder einer anderen flachen Oberfläche auf die Gruppe (Abbildung 2C, Abbildung 2D). Schaukeln Sie die Gruppe der Klingen langsam von Seite zu Seite, um sie durch das Gewebe zu bewegen.
HINWEIS: Dies kann einige Zeit in Anspruch nehmen (1–2 min) und erfordert Geduld. Es sollte eine Resistenz gegen die Klingen, die sich durch das Gewebe bewegen, bestehen. Einfacher Einstieg bedeutet, dass das Gehirn auftaut und der Block mit Trockeneis gekühlt werden sollte. - Wenn alle Klingen den Boden der Schlitze erreicht haben, greifen Sie jede Seite der Gruppe von Klingen und arbeiten Frei von der Matrix, indem Sie hin und her schaukeln.
HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, sich an den scharfen Kanten der Klingen zu schneiden. - Sobald die Gruppe frei ist, legen Sie den Stapel, rostralseite nach oben, auf die Glasplatte (Abbildung 2E). Legen Sie Trockeneis neben und/oder auf den Stapel, um die Proben weiter einzufrieren, um die Trennung zu erleichtern.
- Legen Sie den Stapel mit scharfen Kanten nach unten auf die Glasplatte und trennen Sie die Klingen, indem Sie den Stapel zwischen Daumen und Fingern verschieben. Die Klingen sollten sich mit befestigten Abschnitten voneinander trennen.
- Aufderlegen Abschnitte auf der Glasplatte von rostral bis kaudal (Abbildung 2F).
- Trennen Sie Gewebe von den Klingen, indem Sie die Klingen zwischen den Fingern biegen oder durch Trennen mit einem zweiten kalten Rasiermesser(Abbildungen 2G,2H,2I).
4. Abschnitte sezieren
- Öffnen Sie den Allen Mouse Brain Atlas oder eine andere Referenz und finden Sie Sehenswürdigkeiten, die notwendig sind, um Interessengebiete zu identifizieren. Einige offensichtliche Sehenswürdigkeiten sind die vordere Kommissure, das Corpus callosum, die seitlichen Ventrikel und der Hippocampus (Abbildung 3).
- Drehen Sie den Abschnitt, der mit gekühlten Zangen geschnitten werden soll, und stellen Sie sicher, dass die Region, die gesammelt werden soll, während des gesamten Abschnitts konsistent ist. Konsultieren Sie während der Ernte häufig den Referenzatlas, um sicherzustellen, dass der richtige ROI erzielt wird.
HINWEIS: Ein Lupen- oder Sezierendes Mikroskop ist dabei oft hilfreich. Eine gute Beleuchtung ist ebenfalls unerlässlich. Led-Lampen mit niedriger Wattzahl oder eine kühle Lampe (siehe Materialtabelle)können hierfür verwendet werden. - Mit einem sauberen Skalpell oder Schlag, in den Abschnitt schneiden (Abbildung 4). Prechill jedes Werkzeug vor dem Schneiden, indem Sie es kurz zu Trockeneis zu berühren. Drücken Sie die Klinge sanft, aber fest in das Gewebe und schaukeln Sie sie hin und her, um den Schnitt zu machen. Drücken Sie nicht zu hart oder das Gewebe wird brechen.
HINWEIS: Werkzeuge werden sich im Laufe der Zeit erwärmen. Leicht erwärmte Klingen können bei der Herstellung sauberer Schnitte hilfreich sein und das Frakturieren begrenzen, aber seien Sie vorsichtig, um das Auftauen von Gewebe zu vermeiden. Regelmäßig Werkzeuge auf Trockeneis kühlen. - Sobald ein ROI geerntet ist, legen Sie ihn in beschriftete, vorgekühlte 1,5 ml Rohre. Geerntetes Gewebe bei -80 °C lagern, bis es benötigt wird.
- Auf diese Weise gesammeltes gefrorenes Gewebe durch Zugabe von kaltem RIPA-Puffer (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% CHAPS und Proteininhibitor-Cocktail (siehe Materialtabelle)) zur Proteinextraktion oder ein Guanidinium-haltiges Lösungsmittel (siehe Tabelle der Materialien)zur RNA-Extraktion in die gefrorene Probe und sofort homogenisieren deiner Glas-Dounce oder eines mechanischen Homogenisators (siehe Tabelle). Auf diese Weise sind Protease- und Nuklease-Inhibitoren vorhanden, da sich die Probe erwärmt, um Protein- und Nukleinsäuren vor Dementi zu schützen.
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Representative Results
Um diese Methode zu validieren, wurde der mediale präfrontale Kortex von erwachsenen CD1-Wildtyp-Männchenmäusen gesammelt und RNA und Protein extrahiert und charakterisiert. RNA wurde durch kapillare Elektrophorese analysiert. Degradierte RNA zeigt einen Verlust an Intensität der 28S und 18S ribosomalen Bänder und zeigt auch Abbauprodukte als Abstrich zwischen 25 und 200 Nukleotiden(Abbildung 5A, Probe 1). Hochwertige RNA zeigt ausgeprägte ribosomale Bänder mit wenig bis gar keinem Signal im unteren Molekulargewichtsbereich(Abbildung 5A, Probe 2). Rna-Integritätsnummern (RINs) werden in dieser Analyse ebenfalls generiert. RINs über 7 weisen auf eine gute RNA19-Qualität hin. RNA, die aus Proben mit der gefrorenen Seziermethode isoliert wurde, zeigt starke ribosomale Bandierung und hohe RIN-Werte, die sehr günstig mit RNA aus frisch geerntetem Gewebe verglichen werden (Abbildung 5B).
Ein Vorteil dieser Methode ist, dass eine große Anzahl von Gehirnen schnell geerntet und in einer Sitzung gelagert werden kann, um zu einem späteren Zeitpunkt sorgfältig seziert zu werden. ROIs können auch gelagert werden, ohne dass das Gewebe aufgetaut wird. Mit dieser Methode kann ein Forscher eine große und vielfältige Sammlung von ROIs sammeln, aus denen hochwertige Nukleinsäure oder Proteine gewonnen werden können. Um diesen Punkt zu bestätigen, wurde RNA aus dem sezierten mPFC extrahiert, der über mehrere Wochen gespeichert worden war (geerntete Gehirne waren mehrere Monate gelagert worden). Alle Proben produzierten hochwertige RNA mit ausgeprägten ribosomalen Bandierungen und RINs über 8 (Abbildung 5C).
Western Blot Analyse wurde verwendet, um Proteinintegrität von gefrorenen sezierten mPFC wie zuvor beschrieben20zu bestätigen. Westliche Flecken zeigen ein reduziertes Signal von zielen mit hohem Molekulargewicht an, wenn Protein abgebaut wird. Die Abbauprodukte zeigen sich auch als Abstrich bei niedrigeren Molekulargewichten innerhalb der Säule. Für diese Analyse wurde Protein gesammelt, auf Nitrocellulose übertragen und mit Antikörpern gegen ein hochmolekulares Ziel, KCC2, und das niedermolekulare Protein Actin untersucht (Abbildung 5D). In allen Fällen waren die Bänder scharf und deutlich, ohne dass es für KCC2 oder Actin erkennbare Aufschlagprodukte gab. Diese Experimente bestätigen, dass die Sezieren von ROIs mit dieser Methode die Extraktion von hochwertiger RNA und Protein ermöglicht.
Abbildung 1: Vorbereiten eingefrorener Arbeitsflächen. (A) Ein Hirnblock wird auf einen Stapel von Gelpackungen in einer isolierten Box gelegt und dann zwischen zwei zusätzlichen Gelpackungen eingeklemmt. Aluminiumfolie wird an jedem Ende des Blocks verpackt, um die Kühlung während des Schnitts zu erleichtern. Die Box wird dann über Nacht bei -20 °C abgekühlt. (B) Eine Glasplatte ist für die Größe mit dem Öffnen einer isolierten Box abgestimmt. Zu diesem Zweck kann eine Versandbox verwendet werden. Eis wird der Box hinzugefügt, bis es ca. 5 cm von oben entfernt ist. Die Box wird dann über Nacht bei -20 °C eingefroren. (B, C) Kurz vor dem Sammeln von Gewebe wird eine gleichmäßige Schicht Trockeneis in einer Tiefe von ca. 2,5 cm auf das Eis gelegt. Eine Platte aus schwarzem Kunststoff (zur Visualisierung) wird über das Trockeneis gelegt, gefolgt von der Glasplatte. Trockeneis wird in den entfernten Ecken platziert, was die Luft direkt über der Platte kühlt. Werkzeuge können gekühlt werden, indem sie auf die Platte gelegt oder kurz in das Trockeneis berührt werden. (D) Um symmetrische Abschnitte zu gewährleisten, sollte das Gehirn mit kalten Zangen so positioniert werden, dass sich der sagittale Sinus und die Quersinus mit den senkrechten Rillen des Blocks (weiße Pfeile) anrichten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Schnitt gehirn mit einem Gehirnblock. (A) Die Ausrichtung des Gehirns wird durch das Sitzen herkömmlicher Einkantenrasierklingen in der Kortex in einer Tiefe von ca. 1 mm verankert. (B) Fügen Sie Klingen nacheinander hinzu, bis alle Schlitze gefüllt sind. (C) Low-Profile-Blades können zwischen herkömmlichen Klingen eingesetzt werden, wenn 0,5 mm Abschnitte gewünscht werden (roter Pfeil). (C, D) Die Klingengruppe wird mit mäßigem Abwärtsdruck in das gefrorene Gewebe geschoben, entweder mit einem flachen Instrument oder der Handfläche oder den Fingern der Hand. Klingen können langsam hin und her geschaukelt werden, um sie durch das Gewebe zu bewegen. (E) Abschnitte werden entfernt, indem die Seiten der Rasierklingen gegriffen und eine Schaukelbewegung und fester Aufwärtsdruck verwendet werden (Achtung: Achten Sie darauf, scharfe Enden der Klingen zu vermeiden). Heben Sie die Gruppe aus dem Block und legen Sie sie vorderseitig auf die gefrorene Glasplatte. Trockeneis neben den Klingen platzieren, um Abschnitte vollständig abzukühlen, bevor es getrennt wird. (F) Trennen Sie Klingen und Legen von Abschnitten in der Reihenfolge. (G, H) Abschnitte können von den Klingen entfernt werden, indem die Klinge leicht mit den Fingern in Richtung der Pfeile gebeugt und der Abschnitt mit einer zweiten kalten Klinge weggedrückt wird. (I) Einige Abschnitte müssen möglicherweise entfernt werden, indem die Rasierklinge zwischen den Fingern und Daumen leicht erwärmt wird und dann der gefrorene Abschnitt mit einer zweiten kalten Klinge schnell abgetrennt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bestimmung von ROIs mithilfe von Landmarken und dem Allen Mouse Brain Atlas. In diesem Beispiel befinden sich eingefrorene Hirnabschnitte auf der linken Seite mit entsprechenden Platten aus dem Allan Mouse Brain Atlas auf der rechten Seite. ROIs (rot gepunktete Umrisse) werden durch den Vergleich sichtbarer Landmarken (schwarze Formen) mit dem Allen Mouse Brain Atlas identifiziert. Wahrzeichen sind: Fa und cc, Corpus callosum, aco, vorderer Kommissar, VL, seitlicher Ventrikel, V3, dritter Ventus. Beispiel ROIs: Pl/Il, prälimbischer und infralimbischer Kortex, ACB, Nucleus accumbens, MOs, Motorkortex, CP, Caudoputamen, HPF, Hippocampus/Dentatgyrus. Coronal Atlas Bilder auf der rechten Seite Kredit: Allen Institute. Die Bilder stammen von den Platten 40, 44, 55 und 71 (von oben nach unten) und wurden von https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Sezieren von ROIs. (A) Abschnitte werden mit Zangen behandelt, die regelmäßig auf Trockeneis gekühlt werden. Beide Seiten jedes Abschnitts sollten vor der Zerlegung mit den entsprechenden Atlasbildern verglichen werden. (B) ROIs werden aus Gehirnabschnitten mit kaltem Skalpell oder (C) Biopsie-Punch entfernt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Analyse von RNA und Protein mit gefrorener Hirnsektionsmethode. (A) Beispiel für schlechte oder qualitativ hochwertige RNA. Die elektrophoretische Trennung von Probe 1 zeigt degradierte RNA mit schwachen 28S- und 18S-Bändern und Abbauprodukten zwischen 25 und 200 Nukleotiden (nt). Probe 2 zeigt eine gute RNA-Qualität mit starken 28S- und 18S-Bändern und wenig Signal bei niedrigen Molekulargewichten. DIE RNA-Integritätszahlen spiegeln diesen Unterschied mit Probe 1, RIN = 2,5 und Probe 2, RIN = 8,6 wider. (B) Vergleich der rna, die aus gefrorenem mit frisch seziertem medialen präfrontalen Kortex von Mäusen extrahiert wurde. Gefrorene Proben wurden mehrere Monate vor der Zerlegung bei -80 °C aufbewahrt. Frische Proben wurden unmittelbar nach der Ernte verarbeitet. Die RIN-Werte aus Proben, die mit beiden Methoden gesammelt wurden, sind hoch, wobei starke 18S- und 28S-Bänder darauf hindeuten, dass Nukleinsäure erhalten geblieben ist. (C, D) mPFC wurde aus gefrorenen Gehirnen seziert und RNA oder Protein extrahiert. (C) Die RNA-Analyse zeigt, dass für alle zwölf Proben mit hohem RINs und wenig Abbauprodukt eine qualitativ hochwertige RNA erhalten wurde. (D) Die Western Blot-Analyse wurde auf das Gesamtprotein untersucht und auf das Vorhandensein des hochmolekularen KCC2-Ionenkanals (rote Bänder, MW = 130 kDa) untersucht. Das KCC2-Band ist deutlich sichtbar, ohne dass abbaubare Produkte mit niedrigerem Molekulargewicht beobachtet werden. Das Housekeeping-Gen Actin (grüne Bänder, MW = 42 kDa) wird ebenfalls angezeigt. mPFC-Proben von 12 Gehirnen sind als 1-12 gekennzeichnet. WB steht für die gesamte Hirnkontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Diese Arbeit beschreibt eine Technik, um kleine, spezifische Regionen des Gehirns zu isolieren und gleichzeitig den Abbau von Nukleinsäure und Protein zu begrenzen. Schäden am Hirngewebe passieren schnell, sobald ein Organismus stirbt. Dies ist teilweise auf eine schnelle Anhäufung von extrazellulärem Glutamat und die daraus resultierende Exzitotoxizität zurückzuführen, die21auftritt. Messenger RNA ist besonders anfällig für Degradation22,23. Der Abbau von Protein und Nukleinsäure wird bei niedrigen Temperaturen stark reduziert, wie ein kürzlich erschienener Artikel zeigt, der die biologische Aktivität in Mammutzellen beschreibt, dievor28.000 Jahren im Permafrost eingefroren waren.
Mit der hier beschriebenen Methode werden Gehirne eingefroren und Werkzeuge und Gewebe unter dem Gefrierpunkt gehalten, bis Nukleinsäure oder Proteinextraktion gestartet wird. Gefrorene ROIs werden dann in Puffern homogenisiert, die Protease- und Nuklease-Inhibitoren enthalten und Zielmoleküle vor dem Abbau bei höheren Temperaturen schützen.
In diesem Prozess ist es wichtig, klare Markierungen zu identifizieren, um ROIs innerhalb der Abschnitte zu ermitteln. Fasertrakte der vorderen Kommissure und des Corpus callosum funktionieren zu diesem Zweck gut, ebenso wie die Ventrikel. Veränderungen in der Form des Hippocampus, wenn man sich vorder nach hintergründ bewegt, können auch verwendet werden. Je nachdem, wie gut das Gehirn in der Matrix ausgerichtet ist, können Landmarken verzerrt sein oder fehlen. Vor dem Sammeln von ROIs aus Abschnitten wie diesem ist Vorsicht geboten, da kontaminierende Regionen in der Stichprobe landen können. Vor der Erfassung sollte ein ROI auf beiden Seiten des Abschnitts überprüft werden, um sicherzustellen, dass er während des gesamten Abschnitts konsistent ist. Die Dissektion von ROIs ist auf gut definierte Bereiche des Gehirns beschränkt, die in der x-y-Dimension größer als etwa 1 mm sind.
Bei der Sezieren von ROIs ist es notwendig, Gewebe gefroren zu halten, ohne sie zu spröde zu machen. Zu kaltes Gewebe bricht, wenn Druck mit einem Schlag oder Skalpell ausgeübt wird. Die Region von Interesse ist oft schwer von anderen Fragmenten zu identifizieren, wenn dies geschieht. Eine Möglichkeit, dies zu mildern, besteht darin, die Abschnitte kurzzeitig in einen wärmeren Bereich der Platte (weg vom Trockeneis) zu verschieben. Es ist auch wichtig, die Glasplatte sauber zu halten. Sobald ein Abschnitt verarbeitet ist, sollte die Platte sauber mit einer Rasierklinge geschabt werden, bevor sie zum nächsten übergeht. Im Laufe der Zeit kondensiert Wasser aus der Luft auf die Sezierplatte, die die Probenerkennung abdecken oder anderweitig stören kann. Die Reinigung der Platte erfolgt, indem die scharfe Kante einer Rasierklinge über die Oberfläche des Glases geschabt und der gesammelte Frost und Die Trümmer abgelöscht werden. Kleine ROIs sind nicht von unerwünschten Gehirnfragmenten zu unterscheiden, so dass es sehr wichtig ist, einen sauberen Arbeitsbereich zu erhalten.
Viele Labore verwenden kommerzielle Produkte25, um RNA in geernteten Geweben zu schützen. Während Labile Moleküle auf diese Weise gut erhalten sind, ist ein Nachteil, dass die Morphologie des Gewebes radikal verändert wird. Daher kann es schwierig sein, die Interessengebiete anhand von Referenzkarten zu finden. Die Sezieren von ROIs aus snap-frozen Gehirnen vor der Verwendung dieser Produkte kann daher eine bessere Option sein.
Obwohl wir uns in dieser Arbeit auf koronare Scheiben konzentriert haben, sollte diese Methode gut für horizontale und sagittale Abschnitte funktionieren. Karten für diese Ausrichtungen sind in der Regel niedriger in der Auflösung im Vergleich zu denen für koronare Abschnitte. Dies ändert sich jedoch schnell mit Initiativen von Gruppen wie dem Allen Brain Institute. Eine weitere Überlegung ist das Alter des Tieres bei der Ernte. Die Morphologie der jungen tierischen Gehirne unterscheidet sich stark von der des Erwachsenen und erfordert einen speziellen Atlas und eine andere Größe Gehirnmatrix. Ressourcen wie der Developing Mouse Brain Atlas26 sind wichtig, um genaue Hirnproben von jüngeren Mäusen zu sammeln.
Diese Arbeit beschreibt einen Prozess, der verwendet werden kann, um kleine Regionen aus dem Nagetierhirn zu ernten. Die Morphologie der Abschnitte ist gut mit gefrorenem Schneiden erhalten, und da die Gewebe von der Ernte bis zur Extraktion gefroren gehalten werden, ist die Qualität von Nukleinsäure und Protein hoch. Dieser Prozess hat den Vorteil gegenüber der Zerlegung von frisch gesammeltem Gewebe, da Probengehirne einer großen Gruppe von Tieren schnell gesammelt und gespeichert werden können. Regionen innerhalb des Gehirns können dann anhand von Landmarken identifiziert werden, die in gemeinsamen Hirnatlanten identifiziert und in einem vorsichtigen Tempo gesammelt werden, ohne Zielmoleküle zu verlieren. Diese Methode kann eine gute Option für einige Labore sein, da die benötigten Werkzeuge und Regenten kostengünstig und leicht verfügbar sind.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der NIH, DA043982 und DA046196 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Mouse coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 505C | Cutting block |
| 0.5 mm Rat coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 705C | Cutting block |
| 1.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-01 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Dot Scientific | 229443 | For storing frozen ROIs |
| 1.5 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-02 | |
| 2.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-03 | |
| 4-12% NuPage gel | Invitrogen | NPO323BOX | protein gradient gel |
| Bioanalyzer System | Agilent | 2100 | RNA analysis system |
| Dounce tissue grinder | Millipore Sigma | D8938 |
Glass tissue homogenizer |
| Dry Ice | |||
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner Industries Inc. | Model 180 | Cool lamp |
| Glass plates | LabRepCo | 11074010 | |
| HALT | ThermoFisher | 78440 | protease inhibitor cocktail |
| Low profile blades | Sakura Finetek USA Inc. | 4689 | |
| mouse anti-actin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | JLA20 | Antibody |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Used in initial RNA purity analysis |
| No. 15 surgical blade | Surgical Design Inc | 17467673 | |
| Odyssey Blocking buffer | LiCor Biosciences | 927-40000 | Western blocking reagent |
| Omni Tissue Master 125 | VWR | 10046-866 | Tissue homogenizer |
| rabbit anti-KCC2 antibody | Cell Signaling Technology | 94725S | Antibody |
| RNA Plus Micro Kit | Qiagen | 73034 | Used to extract RNA from small tissue samples |
| RNaseZap | Life Technologies | AM9780 | |
| Scalpel handle | Excelta Corp. | 16050103 | |
| Standard razor blades | American Line | 66-0362 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | Used to extract RNA from tissue |
References
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