Summary
يصف هذا الإجراء مجموعة من مناطق الدماغ المجمدة منفصلة للحصول على بروتين عالي الجودة والجيش الملكي النيبالي باستخدام أدوات غير مكلفة ومتاحة عادة.
Abstract
مع تقدم فهمنا لعلم الأحياء العصبية، غالبًا ما يتم إجراء التحليلات الجزيئية على مناطق الدماغ الصغيرة مثل قشرة الجبهية المتوسطة (mPFC) أو النواة. ويتمثل التحدي في هذا العمل في تشريح المنطقة الصحيحة مع الحفاظ على البيئة الجزئية التي يتعين فحصها. في هذه الورقة، نصف طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة باستخدام الموارد المتاحة بسهولة في معظم المختبرات. تحافظ هذه الطريقة على الحمض النووي والبروتينات من خلال الحفاظ على الأنسجة المجمدة طوال العملية. يتم قطع الأدمغة إلى أقسام 0.5-1.0 مم باستخدام مصفوفة الدماغ ويتم ترتيبها على لوحة زجاجية مجمدة. تتم مقارنة المعالم داخل كل قسم بمرجع ، مثل أطلس دماغ ألن ماوس ، ويتم تشريح المناطق باستخدام مشرط بارد أو لكمة خزعة. ثم يتم تخزين الأنسجة عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. من خلال هذه العملية الفئران والفأرmPFC، نواة accumbens، قرن آمون الظهري والبطني ومناطق أخرى قد تم تحليلها بنجاح باستخدام qRT-PCR والمقالات الغربية. وتقتصر هذه الطريقة على مناطق الدماغ التي يمكن تحديدها من خلال معالم واضحة.
Introduction
يوضح هذا العمل تشريح مناطق الدماغ المجمدة لاستخراج الحمض النووي عالي الجودة أو البروتين باستخدام مرجع ، مثل أطلس دماغ ألن ماوس1، كدليل. في هذه التقنية ، يتم تجميد الأدمغة وتخزينها عند -80 درجة مئوية للتشريح والتشريح في وقت لاحق أثناء الحفاظ عليها في حالة مجمدة. تسمح هذه العملية للباحث بحصاد عدد كبير من الأدمغة في جلسة واحدة ثم تشريحها في وقت لاحق لمجموعة دقيقة من مناطق الدماغ المتعددة.
غالبًا ما يكون الجمع الدقيق لمناطق الدماغ ذات الأهمية مطلوبًا عند الإجابة على الأسئلة المتعلقة بالتعبير الجيني والبروتيني. في حين يمكن استخدام علم الصيدلة والفيزيولوجيا الكهربائية وعلم الوراثة البصرية على البُرُّب أو القوارض المعدلة وراثياً للمساعدة في توضيح التغيرات الجزيئية التي تقوم عليها السلوكيات الملاحظة2،3،4، غالبًا ما يستخدم قياس التغيرات المستحثة في النصوص والبروتيوملدعم لدعم هذه النتائج. تقنيات مثل كمية عكس النسخ البوليميراز سلسلة التفاعل (RT-qPCR), النشاف الغربي, RNAseq5,MAPSeq6 و HPLC7 قوية ومنخفضة نسبيا في التكلفة, السماح للعديد من المختبرات لدراسة التغيرات الجزيئية المستحثة داخل مناطق الدماغ الصغيرة2,,4,,5,,6.
هناك عدة طرق لاستخراج وتنقية الحمض النووي أو البروتين من مناطق الدماغ8،9،10،11،12. العديد من مختبرات حصاد مناطق الدماغ عن طريق تقشعر لها الأبدان وقطع العقول على الجليد في وقت الحصاد9,13. في حين أن هذا النهج يمكن أن يؤدي إلى حمض نوي عالي الجودة والبروتين ، إلا أنه محدود زمنيًا إلى حد ما حيث قد يحدث التدهور داخل البيئة الدقيقة للأنسجة في درجات الحرارة هذه. قد يكون هذا صحيحًا بشكل خاص عند محاولة تشريح عدد كبير من الحيوانات أو ROIs في جلسة واحدة. حفظ العينات المجمدة يساعد على الحفاظ على جزيئات الهدف labile مع توفير وقت الباحث لمقارنة بعناية المعالم على جانبي كل قسم في محاولة لجمع عينات نقية نسبيا. التقاط الليزر هو طريقة أخرى لجمع الأنسجة لالحمض النووي الريبي أو تحليل البروتين من مناطق الدماغ10. هذا الإجراء هو متفوقة على تشريح الميكانيكية في أن يمكن تحديد هاوية صغيرة جدا وغير منتظمة الشكل ومعزولة. ومع ذلك، فإن التقاط الليزر محدود باستخدام المعدات والكواشف باهظة الثمن، وهو يستغرق وقتاً طويلاً وقد يكون أيضاً أكثر عرضة لتدهور العينة.
تشريح Micropunch على الأنسجة المجمدة ليست جديدة. أوراق في وقت مبكر من قبل Miklos Palkovits وغيرها وصف التقنيات الأساسية في التفاصيل14،15. ويتبع هذا العرض إلى حد كبير العمل الأصلي، مع إدخال بعض التحسينات لتيسير الكفاءة وتقليل نفقات المعدات اللازمة. على سبيل المثال، يتم إجراء أقسام الدماغ في كتلة الدماغ المجمدة بدلا من على cryostat. ينتج عن ذلك أقسام أكثر سمكًا مما يقلل من عدد الأقسام اللازمة لجمع عينات عائد الاستثمار. هذا الأسلوب أيضا تشريح عينات على لوحة زجاجية المجمدة التي يجلس على الجليد الجاف داخل مربع معزول. وهذا ينتج مرحلة التجمد الفرعي في مقاعد البدلاء التي للعمل. الأقسام التي يتم تشريحها بهذه الطريقة يمكن التلاعب بها بسهولة ، مما يسمح للباحث بمقارنة كلا الجانبين من كل قسم مع مرجع من أجل الحد من التلوث من المناطق خارج عائد الاستثمار المطلوب.
مزايا هذا البروتوكول هي أن 1) يتم الاحتفاظ الدماغ في حالة المجمدة طوال العملية، مما يساعد على الحفاظ على البروتين والحمض النووي ويعطي الباحث الوقت لحصاد بعناية ROIs، و 2) الكواشف المطلوبة غير مكلفة وتوجد في معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية. في هذه العملية، يتم قسمة الأدمغة الكاملة إلى 0.5-1.0 مم في مصفوفة الدماغ ووضعها على لوحة زجاجية مجمدة مبردة باستمرار بالجليد الجاف. المعالم الموجودة في أطلس الدماغ ألن1 أو الأطالس الدماغ الأخرى16,17 وتستخدم لتحديد المناطق ذات الاهتمام, التي يتم تشريحها بعد ذلك إما لكمة الباردة أو مشرط. نظرًا لعدم إذابة الأنسجة أبدًا ، توفر المناطق التي يتم حصادها بهذه الطريقة الحمض النووي الريبي والبروتين عالي الجودة لتحليل المصب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم التعامل مع الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة بطريقة أخلاقية وإنسانية على النحو المنصوص عليه في لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للرعاية والاستخدام الحيوانية في جامعة إنديانا (IACUC) والمعاهد الوطنية للصحة (NIH).
ملاحظة: يجب غسل جميع الأدوات والأسطح مع مذيب مناسب لإزالة nucleases18 قبل بدء أي عمل.
1. تخزين العقول
- إزالة بسرعة العقول من القتل الرحيم الكبار CD1 الفئران النمط البري يزن ما يقرب من 30 ز باستخدام نهج تقليدي13 وتجميد فلاش لمدة 60 ثانية إما في النيتروجين السائل أو isopentane مبردة مسبقا مع الجليد الجاف.
- تخزين العقول المجمدة في -80 درجة مئوية في رقائق الألومنيوم أو الأنابيب المخروطية حتى الاستخدام.
2. إعداد مصفوفة الدماغ
- قبل 24 ساعة من تشريح الأنسجة ، ضع مصفوفة دماغ نظيفة (انظر جدول المواد)على كومة من حزم التجميد المذابة. شطيرة الجانبين من المصفوفة بين اثنين من حزم الفريزر مع التأكد من ترك ما يقرب من 0.5 سم بين الجزء السفلي من فتحات الحلاقة والجزء العلوي من حزم هلام(الشكل 1A). وضع رقائق الألومنيوم على نهايات للمساعدة في التبريد.
ملاحظة: عند شراء مصفوفة الدماغ، شراء واحدة كبيرة بما يكفي لدائن كامل حجم الدماغ ليتم تشريحها. - ضع الصندوق الذي يحتوي على مصفوفة الدماغ وحزم الفريزر في ثلاجة -20 درجة مئوية مع أعلى ajar بين عشية وضحاها.
3. إعداد لوحة زجاجية مجمدة
ملاحظة: الغرض من هذا الإعداد هو إعداد سطح مجمد ة على تشريح أقسام الدماغ.
- ضع الثلج في صندوق معزول يصل إلى حوالي 5 سم من الأعلى. ثم وضع طبقة 2.5 سم من الجليد الجاف على رأس الجليد وتغطية مع الأغطية البلاستيكية السوداء للمساعدة في تصور العينة(الشكل 1B، الشكل 1C).
- وضع لوحة زجاجية (ينبغي أن يصلح فقط في فتح مربع) على رأس البلاستيك ووضع الجليد الجاف على رأس لوحة في الزوايا البعيدة(الشكل 1C).
- خذ مصفوفة الدماغ المجمدة من الفريزر وأدخل الدماغ لقطع الجانب القشرة. السماح لها لتوازن لدرجة الحرارة في المربع لمدة 10 دقيقة. الحفاظ على الغطاء على مربع خلال هذا الوقت.
- ضبط موقف الدماغ في المصفوفة مع ملقط الباردة بحيث الجيوب الأنفية sagittal والجيوب الأنفية عرضية خط يصل مع الأخادات عمودي من كتلة(الشكل 1D). سيساعد هذا على ضمان الأقسام المتماثلة لتسهيل تشريحها. لمس نصائح من ملقط لتجفيف الجليد لفترة وجيزة للاسترخاء قبل ضبط الدماغ.
- بمجرد أن يكون الدماغ في مكانه، ضع شفرة حلاقة مبردة بالقرب من مركزها واضغط على النصل حوالي 1 مم في الأنسجة. إضافة شفرات مبردة إلى نهايات rostral وcaudal للمساعدة في عقد الدماغ في مكان(الشكل 2A والشكل 2B).
- بدءا من نهاية rostral، إضافة شفرات واحدة في وقت واحد، ووضعها في فتحات والضغط عليها بلطف إلى أسفل في الأنسجة ما يقرب من 1 ملم(الشكل 2B). استمر في إضافة شفرات على فترات 1 مم تعمل نحو النهاية الكودالية.
- تأكد من أن الدماغ لا يتحول خلال هذا الوقت. اصطف ريش أفقيا وعموديا(الشكل 2B). من أجل خفض المقاطع إلى عرض 0.5 مم ، يمكن استخدام شفرات الميكروتومية المنخفضة البروز (انظر جدول المواد). ضع هذه بين شفرات الحلاقة الأكبر(الشكل 2C).
- بمجرد وضع الشفرات في مكانها ، اضغط لأسفل على رأس المجموعة بأصابع أو نخيل أو بعض السطح المسطح الآخر(الشكل 2C، الشكل 2D). صخرة مجموعة من ريش ببطء من جانب إلى آخر لنقلها من خلال الأنسجة.
ملاحظة: قد يستغرق هذا بعض الوقت (1-2 دقيقة) ويتطلب الصبر. يجب أن تكون هناك مقاومة للشفرات تتحرك من خلال الأنسجة. يعني الدخول السهل أن الدماغ يذوب ويجب تبريد الكتلة بالثلج الجاف. - عندما تصل جميع الشفرات إلى الجزء السفلي من فتحات، فهم كل جانب من مجموعة من ريش والعمل خالية من المصفوفة عن طريق هزاز ذهابا وإيابا.
ملاحظة: توخي الحذر لتجنب قطع نفسه على الحواف الحادة للشفرات. - مرة واحدة في المجموعة حرة، ضع المكدس، الجانب rostral، على لوحة زجاجية(الشكل 2E). ضع الثلج الجاف بجوار و/أو فوق المكدس لمزيد من تجميد العينات لتسهيل الفصل.
- ضع المكدس بحواف حادة لأسفل على اللوحة الزجاجية وشفرات منفصلة عن طريق تحويل المكدس بين الإبهام والأصابع. يجب أن تنفصل الشفرات عن بعضها البعض مع أقسام مرفقة.
- اصطف أقسام على لوحة زجاجية من rostral إلى caudal(الشكل 2F).
- نسيج منفصل عن الشفرات عن طريق ثني الشفرات بين الأصابع ، أو عن طريق الفصل مع شفرة حلاقة باردة ثانية(أرقام 2G ، 2H ، 2I).
4. تشريح الأقسام
- افتح أطلس دماغ ألن ماوس أو مرجع آخر وابحث عن المعالم اللازمة لتحديد المناطق ذات الاهتمام. وتشمل بعض المعالم الواضحة commissure الرُعَبَيّ، وكالوسوم الكتوم، والبطينين الجانبيين، وقرن آمون(الشكل 3).
- قم بقلب القسم ليتم قطعه باستخدام ملقط مبردة وتأكد من أن المنطقة التي على وشك جمعها متسقة في جميع أنحاء القسم. أثناء الحصاد، راجع الأطلس المرجعي في كثير من الأحيان للتأكد من الحصول على عائد الاستثمار الصحيح.
ملاحظة: غالبًا ما يكون المجهر المكبر أو التشريح مفيدًا في هذه العملية. الإضاءة الجيدة ضرورية أيضا. يمكن استخدام مصابيح LED منخفضة القوة الكهربائية أو مصباح بارد (انظر جدول المواد)لهذا الغرض. - مع مشرط نظيفة أو لكمة، مقطعة إلى القسم(الشكل 4). بريل كل أداة قبل قطع عن طريق لمسها لفترة وجيزة لتجفيف الجليد. دفع شفرة بلطف ولكن بحزم في الأنسجة، هزاز ذهابا وإيابا لجعل خفض. لا تدفع بقوة أو الأنسجة سوف كسر.
ملاحظة: سوف تدفئ الأدوات بمرور الوقت. يمكن أن تكون الشفرات الدافئة قليلاً مفيدة في إجراء تخفيضات نظيفة ويمكن أن تحد من التكسير ، ولكن كن حريصًا على تجنب ذوبان الأنسجة. الأدوات الباردة بشكل دوري على الجليد الجاف. - بمجرد حصاد عائد الاستثمار ، ضعها في أنابيب تحمل علامة ، 1.5 مل. تخزين الأنسجة حصادها في -80 درجة مئوية حتى الحاجة.
- معالجة الأنسجة المجمدة التي تم جمعها بهذه الطريقة عن طريق إضافة الباردة RIPA المخزن المؤقت (50 mM تريس، الرقم الهيدروجيني 8.0، 150 mM NaCl، 1٪ تريتون X-100، 0.1٪ SDS، 0.5٪ CHAPS وكوكتيل مثبط البروتين (انظر جدول المواد))لاستخراج البروتين، أو المذيبات التي تحتوي على guanidinium (انظر جدول المواد)لاستخراج الحمض النووي الريبي إلى العينة المجمدة وhomogenize على الفور باستخدام إما الوند الزجاج أو المتجانس الميكانيكية (انظر الجدول من المواد). وبهذه الطريقة، يتم وضع مثبطات البروتياز والنوكليس في مكانها مع ارتفاع درجة حرارة العينة لحماية البروتين والأحماض النووية من التدهور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من أجل التحقق من صحة هذه الطريقة ، تم جمع قشرة الجبهية المتوسطة من الفئران الذكور من النوع البري CD1 البالغين وتم استخراج الحمض النووي الريبي والبروتين وتوصيفه. تم تحليل الحمض النووي الريبي بواسطة الكتروفورريس الشعيرات الدموية. يعرض الحمض النووي الريبي المتدهور خسارة في شدة النطاقات الريببوسية 28S و 18S ويعرض أيضًا منتجات التدهور كمسحة بين 25 و 200 نيوكليوتيدات(الشكل 5A، العينة 1). يظهر الحمض النووي الريبي عالي الجودة نطاقات ريببوسية متميزة مع إشارة قليلة أو معدومة في منطقة الوزن الجزيئي السفلي(الشكل 5A، عينة 2). كما يتم إنشاء أرقام تكامل الحمض النووي الريبي (RINs) في هذا التحليل. RINs أعلاه 7 تشير إلى نوعية جيدة الحمض النووي الريبي19. الحمض النووي الريبي معزولة عن العينات باستخدام طريقة تشريح المجمدة عرض النطاقات riبوم القوية وارتفاع قيم RIN مقارنة إيجابية جدا مع الجيش الملكي النيبالي أعدت من الأنسجة الطازجة حصادها(الشكل 5B).
ميزة واحدة من هذه الطريقة هو أن عددا كبيرا من العقول يمكن حصادها بسرعة وتخزينها في جلسة واحدة ليتم تشريحها بعناية في وقت لاحق. ويمكن أيضا أن يتم تخزين الأقراص المدمجة دون أن يتم إذابة الأنسجة. مع هذه الطريقة، يمكن للباحث جمع مجموعة كبيرة ومتنوعة من ROIs التي يمكن الحصول منها على حمض أو بروتين نوي عالي الجودة. ولتأكيد هذه النقطة، تم استخراج الحمض النووي الريبي من الـ mPFC الذي تم تخزينه على مدى عدة أسابيع (تم تخزين الأدمغة المقطوعة لعدة أشهر). أنتجت جميع العينات الجيش الملكي النيبالي عالية الجودة مع النطاقات riبوبال متميزة وRINs أعلاه 8(الشكل 5C).
تم استخدام تحليل لطخة الغربية لتأكيد سلامة البروتين من mPFC تشريح المجمدة كما وصفها سابقا20. تعرض البوات الغربية إشارة أقل من أهداف الوزن الجزيئي العالي عندما يتحلل البروتين. تظهر منتجات التحلل أيضًا كمسحة في الأوزان الجزيئية المنخفضة داخل العمود. لهذا التحليل تم جمع البروتين، ونقلها إلى النيتروسيلولوسي، وبحث مع الأجسام المضادة ضد هدف الوزن الجزيئي عالية، KCC2، وانخفاض البروتين الوزن الجزيئي، أكتين(الشكل 5D). وفي جميع الحالات، كانت النطاقات حادة ومتميزة مع عدم وجود منتجات انهيار ملحوظة إما لKCC2 أو actin. تؤكد هذه التجارب أن تشريح ROIs باستخدام هذه الطريقة يتيح استخراج الحمض النووي الريبي عالي الجودة والبروتين.
الشكل 1: إعداد أسطح العمل المجمدة. (أ)يتم وضع كتلة الدماغ على كومة من حزم هلام داخل مربع معزول ثم تقع بين اثنين من حزم هلام إضافية. يتم تعبئة رقائق الألومنيوم في كل نهاية من الكتلة لتسهيل التبريد أثناء المقاطع. ثم يتم تبريد الصندوق بين عشية وضحاها عند -20 درجة مئوية. (ب)يتم مطابقة لوحة زجاجية لحجم مع فتح مربع معزول. يمكن استخدام صندوق شحن لهذا الغرض. يتم إضافة الثلج إلى الصندوق حتى يكون على بعد حوالي 5 سم من الأعلى. ثم يتم تجميد الصندوق بين عشية وضحاها عند -20 درجة مئوية. (B, C) قبل جمع الأنسجة، يتم وضع طبقة موحدة من الجليد الجاف على قمة الجليد على عمق حوالي 2.5 سم. يتم وضع ورقة من البلاستيك الأسود (للمساعدة في التصور) على الجليد الجاف تليها لوحة زجاجية. يتم وضع الجليد الجاف في الزوايا البعيدة ، مما يبرد الهواء فوق اللوحة. يمكن تبريد الأدوات عن طريق وضعها على اللوحة ، أو عن طريق لمسها لفترة وجيزة إلى الجليد الجاف. (D)لضمان أقسام متناظرة، يجب وضع الدماغ مع ملقط الباردة بحيث الجيوب الأنفية sagittal والجيوب الأنفية عرضية يصطف مع الأخادات المتعامدة من كتلة (السهام البيضاء). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: قسمة الدماغ باستخدام كتلة الدماغ. (أ)يرتكز اتجاه الدماغ عن طريق الجلوس التقليدية ذات الحافة الحلاقة شفرات الحلاقة في القشرة على عمق 1 ملم تقريبا. وضع واحد في الوسط واحد في كل نهاية يساعد على عقد الدماغ في الموقف. (ب)إضافة شفرات واحدة في وقت واحد حتى يتم ملء جميع فتحات. (C)يمكن إدراج شفرات منخفضة الملامح بين الشفرات التقليدية عندما يتم مطلوب أقسام 0.5 مم (السهم الأحمر). (C، D) يتم دفع مجموعة من ريش في الأنسجة المجمدة مع ضغط نزولي معتدل، وذلك باستخدام إما أداة مسطحة أو النخيل أو أصابع اليد. يمكن أن تهتز شفرات ببطء ذهابا وإيابا للمساعدة في تحريكها من خلال الأنسجة. (E)تتم إزالة المقاطع عن طريق الإمساك بجوانب شفرات الحلاقة واستخدام حركة هزازة وضغط تصاعدي ثابت (تحذير: كن حذرا لتجنب نهايات حادة من ريش). رفع المجموعة من كتلة ووضعها الجانب الرضع حتى على لوحة الزجاج المجمدة. ضع الثلج الجاف المجاور للشفرات لتبريد المقاطع تمامًا قبل الفصل. (و)شفرات منفصلة ووضع أقسام في النظام. (G, H) يمكن إزالة المقاطع من الشفرات عن طريق ثني النصل قليلاً بالأصابع في اتجاه الأسهم ودفع القسم بشفرة باردة ثانية. (I)قد تتطلب بعض الأقسام إزالة عن طريق الاحترار قليلا شفرة الحلاقة بين الأصابع والإبهام ومن ثم تشريح بسرعة قبالة القسم المجمدة مع شفرة الباردة الثانية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحديد ROIs باستخدام المعالم وأطلس دماغ ألن ماوس. في هذا المثال، أقسام الدماغ المجمدة على اليسار مع لوحات المقابلة من أطلس دماغ ألان ماوس على اليمين. يتم تحديد ROIs (الخطوط العريضة الحمراء المنقطة) من خلال مقارنة المعالم المرئية (الأشكال السوداء) بأطلس دماغ ألن ماوس. وتشمل المعالم: fa وcc، كوربوس كالوسوم، أكو، المفوض ة anterior، VL، البطين الجانبي، V3، البطين الثالث. مثال ROIs: Pl/Il، قشرة prelimbic وبلا فليم، ACB، نواة accumbens، MOs، قشرة المحرك، CP، caudoputamen، HPF، قرن آمون / دنتيت جيروس. صور أطلس كورونال على الائتمان الصحيح: معهد ألن. الصور هي من لوحات 40 و 44 و 55 و 71 (من أعلى إلى أسفل) وتم الحصول عليها من https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تشريح ROIs. (أ)يتم التعامل مع الأقسام باستخدام ملقط التي يتم تبريدها بشكل دوري على الجليد الجاف. وينبغي مقارنة جانبي كل قسم بصور الأطلس المقابلة قبل تشريحها. (B)تتم إزالة ROIs من أقسام الدماغ مع مشرط الباردة أو(C)لكمة خزعة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحليل الحمض النووي الريبي والبروتين باستخدام طريقة تشريح الدماغ المجمدة. (A)مثال على سوء مقابل نوعية جيدة الجيش الملكي النيبالي. الفصل الكهربائي للعينة 1 يعرض الحمض النووي الريبي المتدهور مع ضعف 28S و 18S النطاقات ومنتجات التحلل بين 25 و 200 النيوكليوتيدات (nt). عينة 2 يظهر الحمض النووي الريبي ذات نوعية جيدة مع نطاقات قوية 28S و 18S وإشارة صغيرة في الأوزان الجزيئية المنخفضة. تعكس أرقام تكامل الحمض النووي الريبي هذا الفرق مع العينة 1، RIN = 2.5 والعينة 2، RIN = 8.6. (ب)مقارنة الحمض النووي الريبي المستخرج من المجمدة مقابل قشرة الجبهية المتوسطة حديثا تشريح الفئران. تم الاحتفاظ بالعينات المجمدة عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر قبل تشريحها. وقد تم تجهيز عينات جديدة بعد الحصاد مباشرة. قيم RIN من العينات التي تم جمعها باستخدام كلا الأسلوبين عالية ، مع نطاقات قوية 18S و 28S تشير إلى أنه تم الحفاظ على الحمض النووي. (C, D)mPFC تم تشريحها من العقول المجمدة وتم استخراج الحمض النووي الريبي أو البروتين. (C)تحليل الحمض النووي الريبي يظهر تم الحصول على الحمض النووي الريبي ذات نوعية جيدة لجميع العينات اثني عشر مع RINs عالية والقليل من الناتج تدهور لوحظ. (D)تم إجراء تحليل لطخة الغربية على البروتين الكلي وتم بحث لوجود قناة KCC2 أيون الوزن الجزيئي العالي (العصابات الحمراء، MW = 130 kDa). الفرقة KCC2 مرئية بوضوح مع عدم وجود انخفاض المنتجات انهيار الوزن الجزيئي لوحظ. كما يظهر جين التدبير المنزلي، أكتين (العصابات الخضراء، MW = 42 كيلو) أيضا. وتسمى عينات mPFC من 12 العقول 1-12. البنك الدولي يقف على السيطرة على الدماغ كله. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا العمل تقنية لعزل مناطق صغيرة ومحددة من الدماغ مع الحد من تدهور الحمض النووي والبروتين. الضرر الذي يلحق بأنسجة الدماغ يحدث بسرعة بمجرد وفاة الكائن الحي. ويرجع ذلك جزئيا إلى تراكم سريع من الغلوتامات خارج الخلية وما ينتج عن ذلك من سمية التي تحدث21. رسول الجيش الملكي النيبالي هو عرضة بشكل خاص للتدهور22,23. يتم تخفيض انهيار البروتين والحمض النووي إلى حد كبير في درجات حرارة منخفضة كما يتضح من مقال صدر مؤخرا يصف النشاط البيولوجي في خلايا الماموث المجمدة في الصقيع الدائم قبل 28،000 سنة24.
مع الطريقة الموضحة هنا ، يتم تجميد العقول ويتم الاحتفاظ بالأدوات والأنسجة تحت التجمد حتى يتم بدء استخراج الحمض النووي أو البروتين. ثم يتم تجانس الرؤوالمجمدة في العازلة التي تحتوي على مثبطات البروتياز والنوكليس، وحماية الجزيئات المستهدفة من التدهور في درجات حرارة أعلى.
في هذه العملية، من المهم تحديد معالم واضحة لتحديد ROIs داخل الأقسام. تعمل الألياف من المفوض اتّصال الرّجل والجسم الكاليوسوم بشكل جيد لهذا الغرض، كما تفعل البطينان. يمكن أيضًا استخدام التغييرات في شكل قرن آمون حيث يتحرك المرء الأمامي إلى الخلف. اعتمادا على مدى توافق الدماغ في المصفوفة، قد تكون المعالم منحرفة، أو مفقودة. وينبغي توخي الحذر قبل جمع ROIs من أقسام مثل هذه المناطق الملوثة قد ينتهي في العينة. قبل التحصيل، يجب التحقق من عائد الاستثمار على جانبي القسم للتأكد من اتساقه في جميع أنحاء القسم. يقتصر تشريح الـ ROIs على مناطق محددة جيدًا من الدماغ أكبر من 1 مم تقريبًا في بُعد x-y.
عند تشريح ROIs ، هناك حاجة للحفاظ على الأنسجة المجمدة دون جعلها هشة للغاية. الأنسجة التي هي باردة جدا سوف كسر عندما يتم تطبيق الضغط مع لكمة أو مشرط. غالباً ما يكون من الصعب تحديد المنطقة ذات الاهتمام من شظايا أخرى عندما يحدث ذلك. إحدى الطرق للتخفيف من هذا هو نقل المقاطع لفترة وجيزة إلى منطقة أكثر دفئًا من اللوحة (بعيدًا عن الجليد الجاف). من المهم أيضا للحفاظ على لوحة زجاجية نظيفة. بمجرد معالجة المقطع ، يجب كشط اللوحة نظيفة بشفرة حلاقة قبل الانتقال إلى المرحلة التالية. مع مرور الوقت، سوف تتكثف المياه على لوحة تشريح من الهواء التي قد تغطي أو تتداخل خلاف ذلك مع التعرف على العينة. يتم تنظيف اللوحة عن طريق كشط الحافة الحادة لشفرة حلاقة عبر سطح الزجاج ومسح الصقيع والحطام الذي تم جمعه. ROIs الصغيرة تصبح لا يمكن تمييزها من شظايا الدماغ غير المرغوب فيها لذلك من المهم جدا للحفاظ على منطقة عمل نظيفة.
تستخدم العديد من المختبرات المنتجات التجارية25 لحماية الحمض النووي الريبي في الأنسجة المقطوعة. في حين يتم الحفاظ على جزيئات اللابيل بشكل جيد بهذه الطريقة ، فإن عيبًا واحدًا هو أن مورفولوجيا الأنسجة تتغير جذريًا. ونتيجة لذلك، قد يكون من الصعب العثور على المناطق ذات الأهمية باستخدام الخرائط المرجعية. تشريح ROIs من العقول المجمدة قبل استخدام هذه المنتجات قد يكون بالتالي خيارا أفضل.
على الرغم من أننا ركزنا على شرائح إكليلية في هذا العمل، يجب أن تعمل هذه الطريقة بشكل جيد للأقسام الأفقية والقوسية. خرائط لهذه التوجهات هي عموما أقل في القرار بالمقارنة مع تلك الخاصة بالمقاطع التاجية. ومع ذلك ، فإن هذا يتغير بسرعة مع مبادرات من مجموعات مثل معهد ألن الدماغ. اعتبار آخر هو عمر الحيوان في الحصاد. وتختلف العقول الحيوانية الشابة اختلافا ً كبيراً عن أدمغة البالغين وستتطلب أطلساً متخصصاً ومصفوفة دماغية مختلفة الحجم. موارد مثل تطوير الماوس الدماغ أطلس26 ضرورية في جمع عينات الدماغ دقيقة من الفئران الأصغر سنا.
يصف هذا العمل عملية يمكن استخدامها لحصاد المناطق الصغيرة من داخل الدماغ القوارض. يتم الحفاظ على مورفولوجيا الأقسام بشكل جيد مع تشريح المجمدة ، وكما يتم الاحتفاظ الأنسجة المجمدة من الحصاد إلى الاستخراج ، ونوعية الحمض النووي والبروتين عالية. هذه العملية لديها ميزة على تشريح الأنسجة التي تم جمعها حديثا كما يمكن جمع العقول عينة من مجموعة كبيرة من الحيوانات بسرعة وتخزينها. ويمكن بعد ذلك تحديد المناطق داخل الأدمغة باستخدام المعالم المحددة في أطالس الدماغ المشتركة وجمعها بوتيرة دقيقة دون فقدان الجزيئات المستهدفة. قد تكون هذه الطريقة خيارًا جيدًا لبعض المختبرات نظرًا لأن الأدوات والحكام اللازمين غير مكلفين ومتاحين بسهولة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة، DA043982 و DA046196.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Mouse coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 505C | Cutting block |
| 0.5 mm Rat coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 705C | Cutting block |
| 1.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-01 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Dot Scientific | 229443 | For storing frozen ROIs |
| 1.5 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-02 | |
| 2.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-03 | |
| 4-12% NuPage gel | Invitrogen | NPO323BOX | protein gradient gel |
| Bioanalyzer System | Agilent | 2100 | RNA analysis system |
| Dounce tissue grinder | Millipore Sigma | D8938 |
Glass tissue homogenizer |
| Dry Ice | |||
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner Industries Inc. | Model 180 | Cool lamp |
| Glass plates | LabRepCo | 11074010 | |
| HALT | ThermoFisher | 78440 | protease inhibitor cocktail |
| Low profile blades | Sakura Finetek USA Inc. | 4689 | |
| mouse anti-actin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | JLA20 | Antibody |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Used in initial RNA purity analysis |
| No. 15 surgical blade | Surgical Design Inc | 17467673 | |
| Odyssey Blocking buffer | LiCor Biosciences | 927-40000 | Western blocking reagent |
| Omni Tissue Master 125 | VWR | 10046-866 | Tissue homogenizer |
| rabbit anti-KCC2 antibody | Cell Signaling Technology | 94725S | Antibody |
| RNA Plus Micro Kit | Qiagen | 73034 | Used to extract RNA from small tissue samples |
| RNaseZap | Life Technologies | AM9780 | |
| Scalpel handle | Excelta Corp. | 16050103 | |
| Standard razor blades | American Line | 66-0362 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | Used to extract RNA from tissue |
References
- Allen Institute. Allen Mouse Brain Atlas. , Available from: https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas (2008).
- Kuleshova, E. P. Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).
- Scanziani, M., Häusser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461, 930 (2009).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome. Cerebral cortex. 25 (10), New York, N.Y. 3743-3757 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Kebschull, J. M., et al. High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA. bioRxiv. , 054312 (2016).
- Mitulović, G., Mechtler, K. HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments. Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).
- Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics. BMC Research Notes. 4, 314 (2011).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. JoVE. (7), e269 (2007).
- Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C. Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. Murran, G. 1723, Humana Press. 2457 (2018).
- Björk, K., et al. Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity. The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).
- Jeong, H., et al. Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia. Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).
- Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics, Neuromethods. Li, K. W. 57, Humana Press. 13-26 (2011).
- Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 59, 449-450 (1973).
- Palkovits, M. Methods in Enzymology. 103, Academic Press. 368-376 (1983).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. , Academic Press. (2001).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. , Academic Press. (1998).
- RNaseZap. Ambion. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ manuals/cms_056889.pdf (2008).
- Mueller, O. L., Samar,, Schroeder,, Andreas, RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf (2016).
- Scheyer, A. F., et al. Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors. Biological Psychiatry. , (2019).
- Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).
- Guhaniyogi, J., Brewer, G. Regulation of mRNA stability in mammalian cells. Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).
- Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PloS One. 8 (2), 56507 (2013).
- Yamagata, K., et al. Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging. Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).
- Ambion. RNAlater® Tissue Collection: RNA Stabilization Solution. ThermoFisher Sci. , Available from: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf (2011).
- Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute. , Available from: https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas (2008).
