Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Indsamling af frosne gnaver brain regioner for downstream analyser

doi: 10.3791/60474 Published: April 23, 2020

Summary

Denne procedure beskriver indsamling af diskrete frosne hjerneregioner for at opnå protein og RNA af høj kvalitet ved hjælp af billige og almindeligt tilgængelige værktøjer.

Abstract

Som vores forståelse af neurobiologi har udviklet sig, molekylære analyser udføres ofte på små hjerneområder såsom den mediale præfrontale cortex (mPFC) eller kerne accumbens. Udfordringen i dette arbejde er at dissekere det korrekte område og samtidig bevare det mikromiljø, der skal undersøges. I dette papir beskriver vi en enkel, billig metode ved hjælp af ressourcer, der er let tilgængelige i de fleste laboratorier. Denne metode bevarer nukleinsyre og proteiner ved at holde vævet frosset gennem hele processen. Hjerner skæres i 0,5-1,0 mm sektioner ved hjælp af en hjernematrix og arrangeres på en frossen glasplade. Landemærker inden for hvert afsnit sammenlignes med en reference, såsom Allen Mouse Brain Atlas, og regioner dissekeres ved hjælp af en kold skalpel eller biopsi punch. Væv opbevares derefter ved -80 °C indtil brug. Gennem denne proces rotte og mus mPFC, kerne accumbens, dorsale og ventrale hippocampus og andre regioner er blevet analyseret med succes ved hjælp af qRT-PCR og vestlige analyser. Denne metode er begrænset til hjerneregioner, der kan identificeres ved klare landemærker.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dette arbejde illustrerer dissektion af frosne hjerne regioner til udvinding af høj kvalitet nukleinsyre eller protein ved hjælp af en reference, såsom Allen Mouse Brain Atlas1, som en guide. I denne teknik, hjerner er flash-frosset og opbevares ved -80 °C til senere skæring og dissektion, mens de opretholdes i en frossen tilstand. Denne proces gør det muligt for forskeren at høste et stort antal hjerner i en session og senere dissekere dem for en nøjagtig samling af flere hjerneregioner.

Den nøjagtige indsamling af hjerneregioner af interesse (ROI'er) er ofte påkrævet, når der besvares spørgsmål relateret til gen- og proteinekspression. Mens farmakologi, elektrofysiologi og optogenetik kan bruges på vilde type eller genetisk modificerede gnavere til at hjælpe med at belyse molekylære ændringer understøtter observeret adfærd2,,3,,4, måling af inducerede ændringer i transkriptioner og proteomes bruges ofte til at støtte disse resultater. Teknikker såsom kvantitativ omvendt transskription polymerase kædereaktion (RT-qPCR), vestlige blotting, RNAseq5, MAPSeq6 og HPLC7 er robuste og relativt lave i omkostninger, så mange laboratorier til at studere inducerede molekylære ændringer inden for små hjerne regioner2,4,5,6.

Der er flere måder at udtrække og rense nukleinsyre eller protein fra hjerneregioner8,9,10,11,12. Mange laboratorier høst er hjerneregioner ved at køle hjerner på is på tidspunktet for høsten9,,13. Mens denne tilgang kan resultere i høj kvalitet nukleinsyre og protein, det er noget tidsbegrænset som nedbrydning inden for mikromiljøet af vævet kan finde sted ved disse temperaturer. Dette kan især være tilfældet, når man forsøger at dissekere et stort antal dyr eller roi'er på ét møde. Holde prøver frosne hjælper med at opretholde labile mål molekyler og samtidig give forskeren tid til omhyggeligt at sammenligne landemærker på begge sider af hver sektion i bestræbelserne på at indsamle relativt rene prøver. Laser capture er en anden måde at indsamle væv til RNA eller protein analyse fra hjernen områder10. Denne procedure er bedre end mekanisk dissektion i, at meget små og uregelmæssigt formede ROI'er kan identificeres og isoleres. Laseropsamling er dog begrænset ved brug af dyrt udstyr og reagenser, er tidskrævende og kan også være mere modtagelig for prøvenedbrydning.

Micropunch dissektion på frosset væv er ikke nyt. Tidlige papirer af Miklos Palkovits og andre beskriver de grundlæggende teknikker i detaljer14,15. Denne præsentation følger i vid udstrækning det oprindelige arbejde, med nogle forbedringer for at lette effektiviteten og mindske bekostning af det nødvendige udstyr. For eksempel er hjerne sektioner lavet i en frossen hjerneblok snarere end på en kryoat. Dette giver tykkere sektioner, hvilket reducerer antallet af sektioner, der er nødvendige for at indsamle ROI-prøver. Denne metode dissekerer også prøver på en frossen glasplade, der sidder på tøris i en isoleret kasse. Dette giver en sub-frysning fase på bænken, som at arbejde. Sektioner dissekeret på denne måde er let manipuleres, så forskeren til at sammenligne begge sider af hvert afsnit med en henvisning for at begrænse forurening fra regioner uden for den ønskede ROI.

Fordele ved denne protokol er, at 1) hjernen holdes i en frossen tilstand i hele processen, som hjælper med at bevare protein og nukleinsyre og giver forskeren tid til omhyggeligt at høste ROI'er, og 2) de nødvendige reagenser er billige og findes i de fleste molekylærbiologiske laboratorier. I denne proces er hele hjerner opdelt til 0,5-1,0 mm i en hjernematrix og placeres på en frossen glasplade, der løbende køles med tøris. Vartegn fundet i Allen Brain Atlas1 eller andre hjerne atlasser16,17 bruges til at identificere regioner af interesse, som derefter dissekeres ved hjælp af enten en kold punch eller skalpel. Fordi vævet aldrig er optøet, regioner høstet på denne måde giver høj kvalitet RNA og protein til downstream analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dyr, der anvendes i denne undersøgelse blev behandlet på en etisk og human måde som fastsat af Indiana University's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og National Institutes of Health (NIH) retningslinjer.

BEMÆRK: Alle værktøjer og overflader skal vaskes med et passende opløsningsmiddel til at fjerne nuklatermer18, før arbejdet påbegyndes.

1. Opbevaring af hjerner

  1. Fjern hurtigt hjernen fra euthaniserede voksne CD1 wildtype mus vejer ca. 30 g ved hjælp af en konventionel tilgang13 og flash-fryse i 60 sekunder i enten flydende nitrogen eller isopentan forkølet med tøris.
  2. Opbevar frosne hjerner ved -80 °C i aluminiumsfolie eller koniske rør indtil brug.

2. Forberedelse af hjernematrixen

  1. Fireogtyve timer før dissekere væv, placere en ren hjerne matrix (se Tabel over materialer) på en stak optøet fryser packs. Klemt matrixens sider mellem to frysepakker i sandwich og sørg for at efterlade ca. 0,5 cm mellem bunden af barberklodserne og toppen af gelpakningerne (Figur 1A). Placer aluminiumsfolie på enderne til støtte i køling.
    BEMÆRK: Når du køber en hjerne matrix, købe en, der er stor nok til at indkapsle hele mængden af hjernen, der skal dissekeret.
  2. Sæt den kasse, der indeholder hjernematrixen og frysepakningerne, i en -20 °C fryser med toppen på klem natten over.

3. Opsætning af en frossen glasplade

BEMÆRK: Formålet med denne opsætning er at forberede en frossen overflade, hvorpå hjernesektioner kan dissekere.

  1. Læg isen i en isoleret kasse op til ca. 5 cm fra toppen. Derefter placeres et 2,5 cm lag tøris oven på isen, og dæk den med sort plastfolie anbringes for at hjælpe med at visualisere prøven (figur 1B, figur 1C).
  2. Placer en glasplade (skal bare passe ind i åbningen af kassen) oven på plastog placere tøris på toppen af pladen i de fjerneste hjørner (Figur 1C).
  3. Tag den frosne hjerne matrix fra fryseren og indsætte hjernen, der skal skæres cortex-side op. Lad den være i ligevægt med temperaturen i kassen i 10 min. Hold låget på kassen i dette tidsrum.
  4. Juster hjernens position i matrixen med kolde pincet, så sagittal sinus og tværgående sinus flugter med blokkens vinkelrette riller (Figur 1D). Dette vil bidrage til at sikre symmetriske sektioner for lettere dissektion. Touch tips af pincet til tøris kort at slappe af, før du justerer hjernen.
  5. Når hjernen er på plads, skal du placere et kølet barberblad i nærheden af midten og trykke klingen ca. 1 mm ind i vævet. Tilsæt kølede knive til rostral- og haleender for at hjælpe med at holde hjernen på plads (figur 2A og figur 2B).
  6. Start på den torrale ende, tilsæt knive en ad gangen, placere dem i slots og trykke dem forsigtigt ned i vævet ca 1 mm (Figur 2B). Fortsæt med at tilføje knive med 1 mm mellemrum, der arbejder mod haleenden.
  7. Sørg for, at hjernen ikke skifter i løbet af denne tid. Line up knive vandret og lodret (Figur 2B). For at skære sektioner i 0,5 mm bredder, lav profil mikrotom blade (se Tabel over materialer) kan anvendes. Placer disse mellem de større barberblade (Figur 2C).
  8. Når knivene er på plads, skal du trykke ned oven på gruppen med fingre, håndflade eller en anden flad overflade (Figur 2C, Figur 2D). Rock gruppen af vinger langsomt fra side til side for at flytte dem gennem vævet.
    BEMÆRK: Dette kan tage lidt tid (1-2 min) og kræver tålmodighed. Der bør være modstand mod knivene, der bevæger sig gennem vævet. Nem indtastning betyder, at hjernen er optøning og blokken skal afkøles med tøris.
  9. Når alle klinger har nået bunden af rillerne, skal du gribe fat i hver side af gruppen af vinger og arbejde uden matrix ved at rokke frem og tilbage.
    BEMÆRK: Vær forsigtig for at undgå at skære sig selv på knivenes skarpe kanter.
  10. Når gruppen er fri, skal stakken, rostralside op, på glaspladen (Figur 2E). Placer tøris ved siden af og/eller oven på stakken for yderligere at fryse prøverne for lettere adskillelse.
  11. Placer stakken med skarpe kanter ned på glaspladen og separate knive ved at flytte stakken mellem tommelfingre og fingre. Knivene skal adskilles fra hinanden med sektioner fastgjort.
  12. Line up sektioner på glaspladen fra rostral til caudal (Figur 2F).
  13. Adskil væv fra knivene ved at bøje knivene mellem fingrene eller ved at adskille med en anden kold barbermaskine (Figur 2G,2H,2I).

4. Dissekering sektioner

  1. Åbn Allen Mouse Brain Atlas eller en anden reference, og find landemærker, der er nødvendige for at identificere interesseområder. Nogle oplagte vartegn omfatter den anterior commissure, corpus callosum, de laterale hjertekamre, og hippocampus (Figur 3).
  2. Vend den sektion, der skal skæres med kølede pincet, og sørg for, at området, der skal indsamles, er ensartet i hele afsnittet. Under høsten konsulteres referenceatlasset ofte for at sikre, at det korrekte investeringsafkast opnås.
    BEMÆRK: Et forstørrelsesglas eller dissekere mikroskop er ofte nyttigt i denne proces. God belysning er også afgørende. LED-lamper med lavt watt-effekt eller en kølig lampe (se Materialebord) kan anvendes til dette formål.
  3. Med en ren skalpel eller punch skæres i afsnittet (Figur 4). Prechill hvert værktøj, før der skæres ved at røre ved det kort at tørre is. Skub klingen forsigtigt, men fast ind i vævet, vuggende det frem og tilbage for at gøre snittet. Tryk ikke for hårdt, ellers brækkes vævet.
    BEMÆRK: Værktøjet vil varme med tiden. Let opvarmede knive kan være nyttige i at gøre rene nedskæringer og kan begrænse frakturering, men vær omhyggelig med at undgå optøning af væv. Periodisk chill værktøjer på tøris.
  4. Når et investeringsafkast er høstet, skal du placere den i mærkede, forkølede 1,5 ml rør. Opbevar høstet væv ved -80 °C, indtil det er nødvendigt.
  5. Forarbejd frosset væv, der opsamles på denne måde, ved at tilsætte kold RIPA-buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% CHAPS og proteininhibitor cocktail (se Materialetabel)) til proteinekstraktion eller et guanidiniumholdigt opløsningsmiddel (se Materialetabel)til RNA-ekstraktion til den frosne prøve og straks homogeniseres ved hjælp af enten en glasset dounce eller mekanisk homogenisator (se Materialetabel). På denne måde er protease og nuclease hæmmere på plads, da prøven varmer for at beskytte protein og nukleinsyrer mod nedbrydning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For at validere denne metode, den mediale præfrontale cortex blev indsamlet fra voksne CD1 wildtype mandlige mus og RNA og protein blev udvundet og karakteriseret. RNA blev analyseret ved kapillær elektroforese. Forringet RNA viser et tab i intensiteten af 28S og 18S ribosomal bands og viser også nedbrydningsprodukter som en smear mellem 25 og 200 nukleotider (Figur 5A, prøve 1). Rna af høj kvalitet viser forskellige ribosombånd med lidt eller intet signal i det lavere molekylvægtområde(figur 5A, prøve 2). RNA-integritetsnumre (RIN'er) genereres også i denne analyse. RIN'er over 7 angiver RNA19af god kvalitet . RNA isoleret fra prøver ved hjælp af den frosne dissektionmetode viser stærke ribosomal striber og høje RIN-værdier, der sammenligner meget positivt med RNA fremstillet af friskhøstet væv (Figur 5B).

En fordel ved denne metode er, at et stort antal hjerner hurtigt kan høstes og opbevares i et møde, der skal omhyggeligt dissekeres på et senere tidspunkt. ROI kan også opbevares, uden at vævene optøes. Med denne metode, en forsker kan indsamle en stor og forskelligartet samling af ROI'er, hvorfra høj kvalitet nukleinsyre eller protein kan opnås. For at bekræfte dette punkt blev RNA udvundet fra den dissekerede mPFC, der var blevet opbevaret over flere uger (høstede hjerner havde været opbevaret i flere måneder). Alle prøver produceret af høj kvalitet RNA med forskellige ribosomal banding og RIN'er over 8 (Figur 5C).

Western blot-analysen blev anvendt til at bekræfte proteinintegriteten af frossen dissekeret mPFC som tidligere beskrevet20. Vestlige blots viser reduceret signal af høj molekylvægt mål, når protein er nedbrudt. Nedbrydningsprodukterne viser sig også som en udtværing ved lavere molekylvægt i kolonnen. Til denne analyse blev protein indsamlet, overført til nitrocellulose og undersøgt med antistoffer mod et højt molekylvægtmål, KCC2, og det lavere molekylvægtprotein, actin (Figur 5D). I alle tilfælde var båndene skarpe og tydelige uden mærkbare opdelingsprodukter til hverken KCC2 eller actin. Disse eksperimenter bekræfter, at dissektion af ROI ved hjælp af denne metode gør det muligt at udtrækning af høj kvalitet RNA og protein.

Figure 1
Figur 1: Forberedelse af frosne arbejdsflader. (A) En hjerneblok placeres på en stak gelpakninger i en isoleret kasse og klemt inde mellem to ekstra gelpakninger. Aluminiumsfolie er pakket i hver ende af blokken for at lette afkøling under skæring. Boksen afkøles derefter natten over ved -20 °C. (B) En glasplade er matchet til størrelse med åbningen af en isoleret kasse. En forsendelseskasse kan bruges til dette formål. Der tilsættes is til kassen, indtil den er ca. 5 cm fra toppen. Boksen fryses derefter natten over ved -20 °C. (B, C) Lige før opsamling af væv placeres et ensartet lag tøris oven på isen i en dybde på ca. 2,5 cm. Et ark sort plast (til støtte i visualisering) er placeret over tøris efterfulgt af glaspladen. Tøris er placeret i de fjerneste hjørner, som køler luften lige over pladen. Værktøj kan afkøles ved at lægge dem på pladen, eller ved kort at røre dem til tøris. (D) For at sikre symmetriske sektioner, hjernen skal placeres med kolde pincet, således at sagittal sinus og tværgående sinus linje op med vinkelret riller af blokken (hvide pile). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Afsnit hjerne ved hjælp af en hjerne blok. (A) Orienteringen af hjernen er forankret ved at sidde konventionelle enkelt kant barberblade i cortex i en dybde på ca 1 mm. Placering en i midten og en i hver ende hjælper med at holde hjernen på plads. (B) Tilføj knivene én ad gangen, indtil alle slidser er fyldt. (C) Lav profil blade kan indsættes mellem konventionelle knive, når 0,5 mm sektioner ønskes (rød pil). c,D) Gruppen af blade skubbes ind i det frosne væv med moderat nedadgående tryk ved hjælp af enten et fladt instrument eller håndfladen eller fingrene på hånden. Klinger kan langsomt vugges frem og tilbage for at hjælpe med at flytte dem gennem vævet. (E) Sektioner fjernes ved at gribe om siderne af barberbladene og ved hjælp af en vuggende bevægelse og fast opadgående tryk (Forsigtig: Vær omhyggelig med at undgå skarpe ender af knivene). Løft gruppen ud af blokken og læg den foran på den frosne glasplade. Placer tøris ved siden af knivene for at køle sektioner helt, før du adskiller. FF) Adskil knive og læg sektioner i orden. (G, H) Sektioner kan fjernes fra knivene ved at bøje klingen en smule med fingrene i pilenes retning og ved at skubbe sektionen af med endnu en kold klinge. (I) Nogle sektioner kan kræve fjernelse ved at opvarme barberbladet en smule mellem fingre og tommelfingre og derefter hurtigt skære den frosne sektion af med endnu et koldt blad. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Bestemmelse af investeringsafkast ved hjælp af landemærker og Allen Mouse Brain Atlas. I dette eksempel er frosne hjernesektioner til venstre med tilsvarende plader fra Allan Mouse Brain Atlas til højre. ROI 'er (røde prikkede konturer) identificeres ved at sammenligne synlige landemærker (sorte figurer) med Allen Mouse Brain Atlas. Landemærker omfatter: fa og cc, corpus callosum, aco, anterior commissur, VL, lateral hjertekammer, V3, tredje venticle. Eksempel ROI' er: Pl/Il, prælimbisk og infralimbic cortex, ACB, nucleus accumbens, MOs, motor cortex, CP, caudoputamen, HPF, hippocampus/dentate gyrus. Coronal atlas billeder på den rigtige kredit: Allen Institute. Billeder er fra plader ne 40, 44, 55 og 71 (fra top til bund) og er hentet fra https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Dissekering af investeringsafkast. (A) Sektioner håndteres ved hjælp af pincet, der nedkøles regelmæssigt på tøris. Begge sider af hver sektion skal sammenlignes med de tilsvarende atlasbilleder før dissektion. (B) ROI fjernes fra hjernesektioner med kold skalpel eller (C) biopsipunch. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Analyse af RNA og protein ved hjælp af frossen hjernedissektionsmetode. (A) Eksempel på dårlig versus god kvalitet RNA. Elektroforetisk adskillelse af prøve 1 viser forringet RNA med svage 28S- og 18S-bånd og nedbrydningsprodukter mellem 25 og 200 nukleotider (nt). Prøve 2 viser god kvalitet RNA med stærke 28S og 18S bands og lidt signal ved lave molekylvægte. RNA-integritetstal afspejler denne forskel med prøve 1, RIN = 2,5 og prøve 2, RIN = 8,6. (B) Sammenligning af RNA udvundet fra frosne versus frisk dissekerede mediale præfrontale cortex af mus. Frosne prøver blev opbevaret ved -80 °C i flere måneder før dissektion. Friske prøver blev behandlet umiddelbart efter høsten. RIN-værdierne fra prøver indsamlet ved hjælp af begge metoder er høje, idet stærke 18S- og 28S-bånd angiver, at nukleinsyre er bevaret. (C, D) mPFC blev dissekeret fra frosne hjerner, og RNA eller protein blev udvundet. (C) RNA-analyse viser, at der blev opnået RNA af god kvalitet for alle tolv prøver med høje RIN'er og kun få observerede nedbrydningsprodukter. (D) Western blot analyse blev udført på det samlede protein og blev undersøgt for tilstedeværelsen af den høje molekylvægt KCC2 ion kanal (røde bånd, MW = 130 kDa). KCC2-båndet er klart synligt uden observerede nedbrydningsprodukter med lavere molekylvægt. Rengøringsgenet Actin (grønne bånd, MW = 42 kDa) vises også. mPFC prøver fra 12 hjerner er mærket 1-12. WB står for hele hjernen kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dette arbejde beskriver en teknik til at isolere små, specifikke områder af hjernen og samtidig begrænse nedbrydningen af nukleinsyre og protein. Skader på hjernevæv sker hurtigt, når en organisme dør. Dette skyldes til dels en hurtig ophobning af ekstracellulær glutamat og den deraf følgende excitotoxicity, der opstår21. Messenger RNA er særligt sårbart over for nedbrydning22,23. Nedbrydning af protein og nukleinsyre er stærkt reduceret ved lave temperaturer, som det fremgår af en nylig artikel, der beskriver biologisk aktivitet i mammutceller frosset i permafrost 28.000 år siden24.

Med den metode, der er beskrevet heri, er hjerner snap frosne og værktøjer og væv holdes under frysepunktet, indtil nukleinsyre eller protein ekstraktion er startet. Frosne ROI'er homogeniseres derefter i buffer, der indeholder protease og nuklaleasehæmmere, og beskytter målmolekyler mod nedbrydning ved højere temperaturer.

I denne proces er det vigtigt at identificere klare landemærker for at lokalisere investeringsafkast i sektionerne. Fiber skrifter af den anterior commissure og corpus callosum fungerer godt til dette formål, som gør hjertekamrene. Ændringer i formen af hippocampus som man bevæger sig foran posterior kan også bruges. Afhængigt af hvor godt hjernen er justeret i matrixen, kan landemærker være skæv, eller mangler. Der bør udvises forsigtighed, før der indsamles roier fra afsnit som denne, da forurenende områder kan ende i prøven. Før afhentning skal et investeringsafkast kontrolleres på begge sider af sektionen for at sikre, at det er ensartet i hele sektionen. Dissektion af ROI er begrænset til veldefinerede områder af hjernen, der er større end ca. 1 mm i x-y-dimensionen.

Når dissekere ROI'er, er der behov for at holde væv frosset uden at gøre dem for sprøde. Væv, der er for koldt vil fraktur, når trykket påføres med en punch eller skalpel. Den interesseregion er ofte svær at identificere fra andre fragmenter, når dette sker. En måde at afbøde dette er at kortvarigt flytte sektioner til et varmere område af pladen (væk fra tøris). Det er også vigtigt at holde glaspladen ren. Når en sektion er behandlet, skal pladen skrabes rent med et barberblad, før du går videre til den næste. Med tiden kondenserer vandet på dissektionspladen fra luften, som kan dække eller på anden måde forstyrre prøvegenkendelsen. Rengøring af pladen sker ved at skrabe den skarpe kant af et barberblad over overfladen af glasset og tørre op den indsamlede frost og snavs. Små ROI'er bliver uadskillelige fra uønskede hjernefragmenter, så det er meget vigtigt at opretholde et rent arbejdsområde.

Mange laboratorier bruger kommercielle produkter25 til at beskytte RNA i høstet væv. Mens labile molekyler er godt bevaret på denne måde, en ulempe er, at morfologi af vævet er radikalt ændret. Som følge heraf kan det være vanskeligt at finde de regioner, der er interessante, ved hjælp af referencekort. Dissekere ROI'er fra snap-frosne hjerner, før du bruger disse produkter kan derfor være en bedre løsning.

Selv om vi har fokuseret på koronale skiver i dette arbejde, bør denne metode fungere godt for horisont-og sagittal sektioner. Kort for disse retningslinjer er generelt lavere i opløsning i forhold til dem for koronale sektioner. Men dette ændrer sig hurtigt med initiativer fra grupper som Allen Brain Institute. En anden overvejelse er dyrets alder ved høsten. Morfologien af unge dyrehjerner er meget forskellig fra den voksnes og vil kræve et specialiseret atlas og en anden størrelse hjernematrix. Ressourcer som Developing Mouse Brain Atlas26 er afgørende for at indsamle nøjagtige hjerneprøver fra yngre mus.

Dette arbejde beskriver en proces, der kan bruges til at høste små regioner inde fra gnaver hjernen. Sektionernes morfologi er velbevaret med frossen udskæring, og da vævene holdes frosset fra høst til ekstraktion, er kvaliteten af nukleinsyre og protein høj. Denne proces har den fordel i forhold til dissektion af frisk indsamlet væv som prøve hjerner fra en stor gruppe af dyr kan hurtigt indsamles og opbevares. Regioner i hjerner kan derefter identificeres ved hjælp af landemærker identificeret i fælles hjerneatlasser og indsamlet i et omhyggeligt tempo uden at miste målmolekyler. Denne metode kan være en god mulighed for nogle laboratorier som de nødvendige værktøjer og regenter er billige og let tilgængelige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH, DA043982 og DA046196.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mm Mouse coronal brain matrice Braintree Scientific BS-SS 505C Cutting block
0.5 mm Rat coronal brain matrice Braintree Scientific BS-SS 705C Cutting block
1.0 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-01
1.5 mL microcentrifuge tubes Dot Scientific 229443 For storing frozen ROIs
1.5 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-02
2.0 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-03
4-12% NuPage gel Invitrogen NPO323BOX protein gradient gel
Bioanalyzer System Agilent 2100 RNA analysis system
Dounce tissue grinder Millipore Sigma
D8938
Glass tissue homogenizer
Dry Ice
Fiber-Lite Dolan-Jenner Industries Inc. Model 180 Cool lamp
Glass plates LabRepCo 11074010
HALT ThermoFisher 78440 protease inhibitor cocktail
Low profile blades Sakura Finetek USA Inc. 4689
mouse anti-actin antibody Developmental Studies Hybridoma Bank JLA20 Antibody
Nanodrop Thermo Scientific 2000C Used in initial RNA purity analysis
No. 15 surgical blade Surgical Design Inc 17467673
Odyssey Blocking buffer LiCor Biosciences 927-40000 Western blocking reagent
Omni Tissue Master 125 VWR 10046-866 Tissue homogenizer
rabbit anti-KCC2 antibody Cell Signaling Technology 94725S Antibody
RNA Plus Micro Kit Qiagen 73034 Used to extract RNA from small tissue samples
RNaseZap Life Technologies AM9780
Scalpel handle Excelta Corp. 16050103
Standard razor blades American Line 66-0362
TRIzol Reagent ThermoFisher Scientific 15596026 Used to extract RNA from tissue

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allen Institute. Allen Mouse Brain Atlas. Available from: https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas (2008).
  2. Kuleshova, E. P. Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49, (2), 169-177 (2019).
  3. Scanziani, M., Häusser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461, 930 (2009).
  4. Shimono, M., Beggs, J. M. Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome. Cerebral cortex. 25, (10), New York, N.Y. 3743-3757 (2015).
  5. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, (1), 57-63 (2009).
  6. Kebschull, J. M., et al. High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA. bioRxiv. 054312 (2016).
  7. Mitulović, G., Mechtler, K. HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments. Briefings in Functional Genomics. 5, (4), 249-260 (2006).
  8. Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics. BMC Research Notes. 4, 314 (2011).
  9. Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. JoVE. (7), e269 (2007).
  10. Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C. Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. Murran, G. 1723, Humana Press. 2457 (2018).
  11. Björk, K., et al. Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity. The FASEB Journal. 20, (11), 1826-1835 (2006).
  12. Jeong, H., et al. Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia. Frontiers in Systems Neuroscience. 12, (63), (2018).
  13. Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics, Neuromethods. Li, K. W. 57, Humana Press. 13-26 (2011).
  14. Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 59, 449-450 (1973).
  15. Palkovits, M. Methods in Enzymology. 103, Academic Press. 368-376 (1983).
  16. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. Academic Press. (2001).
  17. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. Academic Press. (1998).
  18. RNaseZap. Ambion. Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ manuals/cms_056889.pdf (2008).
  19. Mueller, O. L., Samar,, Schroeder,, Andreas, RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control. Available from: https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf (2016).
  20. Scheyer, A. F., et al. Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors. Biological Psychiatry. (2019).
  21. Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13, (1), 171-182 (1990).
  22. Guhaniyogi, J., Brewer, G. Regulation of mRNA stability in mammalian cells. Gene. 265, (1-2), 11-23 (2001).
  23. Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PloS One. 8, (2), 56507 (2013).
  24. Yamagata, K., et al. Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging. Scientific Reports. 9, (1), 4050 (2019).
  25. Ambion. RNAlater® Tissue Collection: RNA Stabilization Solution. ThermoFisher Sci. Available from: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf (2011).
  26. Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute. Available from: https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas (2008).
Indsamling af frosne gnaver brain regioner for downstream analyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. J. Vis. Exp. (158), e60474, doi:10.3791/60474 (2020).More

Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. J. Vis. Exp. (158), e60474, doi:10.3791/60474 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter